第38讲 基因工程
第1课时 基因工程的基本
工具和基本操作程序
考点一
● 必备知识
1.基因重组 受体 DNA分子 遗传性状
2.(1)原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 (2)磷酸二酯键 大肠杆菌 平末端 平末端 (3)质粒 限制酶切割位点
【考点易错】
(1)× (2)× (3)× (4)× (5)× (6)×
[解析] (1)大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。(2)此时该限制酶会对进入该受体细菌的重组质粒进行切割,不利于其保持结构稳定。(3)DNA连接酶连接的是磷酸二酯键。(4)酶具有专一性,限制酶只能识别和切割DNA。(5)两种限制酶的识别序列相同,若切点不同,形成的末端将不能正常配对,故不一定能通过DNA连接酶相互连接。(6)限制酶切割2次,共产生4个游离的磷酸基团。
【长句拓展】
1.原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
2.游离的DNA片段进入受体细胞,一般会直接被分解;即使不分解也无法随着细胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因
3.对靶细胞具有较高的转化效率,不能增殖,对细胞无害,在宿主细胞中引起的免疫反应较弱
● 典型例题
1.A [解析] 限制酶主要从原核生物中分离纯化得到,原核生物没有核膜包被的细胞核,A正确;限制酶识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,B错误;限制酶起催化作用,作用机理为降低化学反应所需的活化能,但不提供能量,C错误;DNA分子经限制酶切割后可形成黏性末端或平末端,产生平末端的限制酶不存在同尾酶,D错误。
2.C [解析] 酶3切割产生的是平末端,E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4DNA连接酶,A错误;酶3和酶1切割产生的末端不互补,在DNA连接酶的作用下不能连接,B错误;T4DNA连接酶可以连接黏性末端和平末端,质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后,再用T4DNA连接酶连接,可以防止目的基因自身环化或反向连接,也可防止切割后的质粒再次环化,是效率比较高的选择,C正确;酶4会破坏抗生素抗性基因,即破坏了标记基因,且酶2和酶4切割得到的黏性末端相同,目的基因会发生自身环化或反向连接,切割后的质粒也易发生环化,D错误。
考点二
● 必备知识
1.(1)①受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 ②结构和功能清晰 序列数据库和序列比对工具 ③PCR获取和扩增 人工合成 (2)①聚合酶链式反应 ②DNA半保留复制 ⑤DNA母链 4种脱氧核苷酸 耐高温的DNA聚合酶 DNA母链的一段碱基序列 Mg2+ Mg2+ ⑥两种引物 碱基互补配对 耐高温的DNA聚合酶 ⑧琼脂糖凝胶电泳
2.(1)稳定存在、遗传、表达和发挥作用 (2)RNA聚合酶 转录 抗生素抗性 重组DNA分子 (3)产生相同末端 目的基因 DNA连接酶
3.目的基因 花粉管通道 体细胞或受精卵 显微注射 受精卵 Ca2+ 将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA上 插入目的基因的T-DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上 将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌 含目的基因的T-DNA导入受体细胞
4.(1)稳定维持和表达其遗传特性
【考点易错】
(1)× (2)√ (3)√ (4)× (5)× (6)× (7)×
[解析] (1)启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA。(4)农杆菌可以侵染双子叶植物和裸子植物,对大多数单子叶植物没有侵染能力。(5)外源基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行转录。(6)蛋白质的检测用抗原—抗体杂交法。(7)转基因植物的受体细胞可以是体细胞,也可以是受精卵。
【长句拓展】
1.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,从而延伸DNA子链 基因的两条链都作为模板,其碱基序列不同,且DNA聚合酶只能从引物的3'端延伸子链,用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增 2.防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接 3.降低害虫种群中抗性基因频率的增长速率
● 典型例题
1.D [解析] Taq DNA聚合酶只能从引物的3'端开始延伸DNA子链,所以两条子链合成一定都是从5'端向3'端延伸,A正确;题图中引物与模板链碱基互补配对,故该图表示复性阶段,该过程的温度与引物的长短、碱基组成等有关,引物长度越长或者G、C碱基含量越高,则复性的温度越高,B正确;经过5次循环后会产生25个DNA分子,其中双链不等长的DNA分子有2×5=10(个),因此经过5次复制产生的目标产物有25-10=22(个),C正确;PCR所需要的引物和原料是一次性添加的,在实验过程中不需要补充,D错误。
2.C [解析] DNA子链合成的方向为5'端到3'端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4,A错误;复性过程中引物与模板链结合,G、C碱基含量越高,碱基对间氢键的含量越多,复性的温度越高,B错误;根据题意和图示可知,DNA分子被限制酶切割,然后环化并加入根据已知序列合成的引物,再通过PCR扩增得到的是中间是未知序列、两侧是已知序列的DNA分子,故PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子,C正确;整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,不需要逆转录酶,D错误。
3.C [解析] 使用限制酶 Ⅱ 会破坏Vir区的基因,Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,因此不能选限制酶 Ⅱ ,A错误;使用PCR技术扩增抗冻基因,只需要知道抗冻基因两端碱基序列并据此设计引物即可,B错误;农杆菌侵染植物细胞后,Ti质粒上的T-DNA能转移到被侵染的细胞,并整合到该细胞的染色体DNA上,所以Vir区基因活化可促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上,C正确;转化成功的植物细胞染色体DNA上只整合了T-DNA片段,T-DNA上含有四环素抗性基因,不含卡那霉素抗性基因,可利用含四环素的培养基筛选成功导入抗冻基因的千禧果细胞,D错误。
4.B [解析] 根据GNA-ACA融合基因的两端序列设计合适的引物,可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞,A正确;由于重组质粒含有卡那霉素抗性基因,故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞,B错误;雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)均有限制酶BsaB Ⅰ 的酶切位点,所以用限制酶 BsaB Ⅰ 和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因,C正确;题图中载体与ACA-GNA上都含有Kpn Ⅰ 和Xho Ⅰ 的酶切位点,与只用Kpn Ⅰ 相比,Kpn Ⅰ 和Xho Ⅰ 联合处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确,D正确。
经典真题·明考向
1.B [解析] 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时会有部分DNA被酶切,应调整反应条件如温度、pH等,B项错误;质粒DNA突变导致限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒,C项正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对 DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。
2.D [解析] 由题干信息可知,解答本题的关键是要找到反应管中的引物和模板。结合表中信息,可推测只有单链DNA的反应管中,单链DNA既作模板,也作引物;而有2种单链的反应管中,它们之间可互为引物、模板,或每种单链DNA既作模板,也作引物。根据题干信息“已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区”,可排除发夹结构和非连续配对的情况。结合PCR技术中DNA聚合酶的作用,构建模型如下:
在反应管①中,2条单链DNA的互补配对情况如下图所示。
反应管①中的单链DNA本身不能碱基互补配对,因此不能既作模板也作引物。因为DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的3'端,而本管中的2条单链DNA配对后,露出的是3'黏性末端,所以该反应管得不到带有荧光标记的DNA探针,不符合题目要求。
同理可知,在反应管②中,单链DNA既作模板也作引物,互补配对情况如下图所示。
复制过程中添加上的脱氧核苷酸只有dTTP和dCTP,但具有荧光标记只有dATP,所以该反应管得不到带有荧光标记的DNA探针,不符合题目要求。
在反应管③中,2种单链DNA的互补配对情况如下图所示。
反应管③中的同种单链DNA间不能碱基互补配对,因此不能既作模板也作引物。但反应管③中2种单链DNA能互为模板和引物进行复制,且复制过程中能添加有荧光标记的dATP,所以该反应管能得到带有荧光标记的DNA探针,符合题目要求。
在反应管④中,单链DNA既作模板也作引物,互补配对情况如下图所示。
且复制过程中能添加具有荧光标记的dATP,所以该反应管能得到带有荧光标记的DNA探针,符合题目要求。
综上可知,能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管是③和④。因此D选项符合题目要求。
3.(1)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ (2)CaCl2 卡那霉素 S-F和E-R (3)启动子 C
(4)SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多 高温使蛋白质变性而沉淀 低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持
[解析] (1)目的基因应插入启动子和终止子之间,结合题意可知,ELP50应插入pET-SOD的SOD之后、终止子之前,由图可知,限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ。(2)将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌,使其处于感受态。由图可知,重组质粒含有标记基因卡那霉素抗性基因,所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌同时含有SOD和ELP50,结合图示可知,应选引物S-F和E-R,利用PCR技术进行筛选。(3)RNA聚合酶与启动子结合后,驱动转录。由图可知,决定SOD-ELP50融合蛋白的基因长度为462+750=1212 bp,可编码1212÷3=404(个)氨基酸,已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa,则融合蛋白的相对分子质量约为404×0.11 kDa=44.44 kDa,电泳后应该为图乙中条带C。(4)(ⅰ)由图可知,20 ℃时,较不加NaCl组,加入NaCl后SOD-ELP50组纯化蛋白数量更多。(ⅱ)100 ℃时,温度过高,导致蛋白质变性而沉淀。(ⅲ)20 ℃,加入NaCl时,相比SOD组,SOD-ELP50组沉淀中蛋白质相对含量较高,说明低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化,杂蛋白较少,有利于酶活性的保持。第38讲 基因工程
第1课时 基因工程的基本工具和基本操作程序
课标 要求 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤
考点一重组DNA技术的基本工具(固本·识记类)
1.基因工程
(1)概念理解
(2)基因工程能够实现的理论基础
项目 理论基础
外源基因 在受体细 胞内表达 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位 ②遗传信息的传递都遵循中心法则 ③生物界共用一套遗传密码
基因拼接 ①DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸 ②DNA分子的复制都遵循碱基互补配对原则 ③双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构
2.重组DNA技术的基本工具
(1)“分子手术刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)
(2)“分子缝合针”——DNA连接酶
(3)“分子运输车”——载体
考点易错·明辨析
(1)切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。()
(2)若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶,则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定。()
(3)DNA连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。()
(4)限制酶可以识别和切割RNA。()
(5)若两种限制酶的识别序列相同,则形成的末端一定能通过DNA连接酶相互连接。()
(6)获取一个目的基因需限制酶切割2次,共产生2个游离的磷酸基团。()
长句拓展·练思维
1.[选择性必修3P74“拓展应用”]限制酶来源于原核生物,不切割自己的DNA分子的原因是 。
2.不能直接把目的基因导入受体细胞而要用载体的原因是 。
3.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具,除具备普通“质粒载体”的条件外,还应具有的条件是 (答出两点即可)。
1.[2024·辽宁沈阳二模]同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但切割后产生相同黏性末端的限制酶,依靠同尾酶的这种特性,可以根据需要将不同的DNA片段进行灵活重组。下列叙述正确的是()
A.产生限制酶的生物大多没有核膜包被的细胞核
B.限制酶能识别DNA和RNA中特定的核苷酸序列
C.限制酶可为磷酸二酯键水解提供所需活化能
D.同尾酶是一类限制酶,每种限制酶都存在其同尾酶
2.[2023·新课标全国卷]某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具,将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接,以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是()
A.质粒和目的基因都用酶3切割,用E.coliDNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割,用T4DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割,用T4DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割,用E.coliDNA连接酶连接
与DNA有关的几种酶的比较
酶种类 作用底物 作用部位 作用结果
限制酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA切成两个或多个片段
DNA 连接酶 DNA 分子片段 磷酸 二酯键 将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA 聚合酶 脱氧 核苷酸 磷酸 二酯键 以DNA单链为模板,将单个脱氧核苷酸依次连接到已有的DNA片段末端
解旋酶 DNA 分子 碱基对 中的氢键 将双链DNA分子局部解旋为单链
DNA 水解酶 DNA 分子 磷酸 二酯键 将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
考点二基因工程的基本操作程序(固本·应用类)
1.目的基因的筛选与获取
(1)筛选合适的目的基因
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变 或获得 等的基因。主要是指 的基因。
②筛选目的基因:
a.从相关的已知 的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
b.利用 进行筛选。
③获取目的基因的方法: 、 、构建基因文库。
(2)利用PCR获取和扩增目的基因
①名称: 。
②原理: 。
③仪器:PCR扩增仪。
④特点:使DNA复制在体外反复进行,特异性地快速扩增目的基因。
⑤条件
模板
原料
酶 (TaqDNA聚合酶)
引物 一小段能与 互补配对的短单链核酸,需2种引物
缓冲液 含 (真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要 激活)
⑥过程
⑦结果:扩增两引物之间的DNA片段。
⑧鉴定: 法。
PCR技术和体内DNA复制的比较
PCR技术 DNA复制
场所 体外(PCR扩增仪中) 细胞内(主要是细胞核内)
解旋 方式 DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化
酶 耐高温的DNA聚合酶 解旋酶、DNA聚合酶
温度 条件 在较高温度下进行,需控制温度 细胞内温和条件
合成 对象 DNA片段 DNA分子
相同点 均需要模板、原料(四种脱氧核苷酸)、能量
2.基因表达载体的构建(核心步骤)
(1)目的:让基因在受体细胞中 。
(2)组成
[辨析]区分启动子、终止子、起始密码子、终止密码子
项目 位置 功能
启动子(其上有一个重要的位点:RNA聚合酶结合位点) DNA 驱动转录
起始密码子 mRNA 驱动翻译
终止子 DNA 终止转录
终止密码子 mRNA 终止翻译
(3)构建过程
用同种限制酶或能 的限制酶切割基因表达载体和含 的DNA片段,再利用 连接。
3.将目的基因导入受体细胞
生物 种类 常用 方法 转化过程 受体 细胞
植物 农杆菌 转化法 将① 插入Ti质粒的T-DNA中→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→在体细胞或受精卵中表达 ③
② 法 a.用微量注射器将含目的基因的DNA溶液(直接)注入子房中 b.可以在植物受粉后的一定时间内,剪去柱头,将DNA溶液滴加在花柱切面上,使目的基因借助花粉管通道进入胚囊
动物 ④ 法 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 ⑤
微生 物 ⑥ 处理法 Ca2+处理细胞→细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态→基因表达载体导入 原核细胞
[注意]农杆菌转化法的两次拼接和两次导入
第一次拼接:;
第二次拼接(非人工操作): ;
第一次导入: ;
第二次导入(非人工操作): 。
4.目的基因的检测与鉴定
(1)检测与鉴定的目的:检测和鉴定目的基因进入受体细胞后,是否 。
(2)检测与鉴定的方法
类型 检测与鉴定内容 方法
分子水 平检测 目的基因是否插入转基因生物的DNA上 PCR技术、抗原—抗体杂交等
目的基因是否转录出mRNA
目的基因是否翻译成蛋白质
个体生 物学水 平鉴定 是否具有抗性及抗性程度等 对转基因生物进行抗虫或抗病的接种实验
基因工程产品与天然产品的功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然产品的功能活性
考点易错·明辨析
(1)启动子位于基因的上游,是DNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录出mRNA。()
(2)标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。()
(3)用PCR技术扩增目的基因时,要有一段已知目的基因的核苷酸序列,以便合成引物。()
(4)农杆菌可以侵染双子叶和单子叶植物,对大多数裸子植物没有侵染能力。()
(5)外源基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。()
(6)可通过PCR技术检测目的基因是否成功插入或目的基因是否转录出了mRNA,也可以检测目的基因是否翻译成蛋白质。()
(7)为培育抗除草剂的作物新品种,导入抗除草剂基因时只能以受精卵为受体。()
长句拓展·练思维
1.PCR过程中需要引物的原因是 。
需要设计两种引物的原因是 。
2.构建基因的表达载体时使用不同的限制酶切割目的基因和质粒的两端的原因是 。
3.生产上常将获得的转基因抗虫棉与普通棉花混合播种,其目的是 。
命题角度一考查PCR技术及其应用
1.[2024·江苏盐城模拟]PCR引物的3'端有结合模板DNA的关键碱基,5'端无严格限制,可用于添加限制酶识别序列。下列相关叙述错误的是()
A.图中两条子链合成一定都是从5'端向3'端延伸
B.图示表示复性阶段,该过程的温度与引物的长短有关
C.用图示引物扩增5次后,可以产生22个目标产物
D.PCR每次循环都消耗引物和原料,在实验过程中需要及时补充
2.[2025·浙江杭州模拟]反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是()
A.应选择引物2和引物3进行PCR扩增
B.设计的引物中G、C碱基含量越高,变性的温度越高
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
命题角度二考查基因工程的基本操作程序
3.[2024·福建福州联考]科研人员将寒带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果细胞中,成功培育出抗冻千禧果。下图为培育过程中使用的Ti质粒示意图,其中Vir区的基因活化能促进T-DNA的加工和转移,下列叙述正确的是()
A.构建基因表达载体时,最好选择限制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
B.利用PCR扩增抗冻基因,需提前检测抗冻基因的全部碱基序列
C.Vir区的基因活化促进抗冻基因整合到千禧果细胞的染色体DNA上
D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出成功导入抗冻基因的千禧果细胞
4.[2024·湖北黄石一模]如图所示,研究人员将雪花莲凝集素基因(GNA)和尾穗苋凝集素基因(ACA)与载体(pB1121)结合,然后导入棉花细胞。下列操作不符合实验目的的是()
A.用PCR技术可检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中
B.将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
C.用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA-ACA融合基因
D.与只用KpnⅠ相比,KpnⅠ和XhoⅠ联合处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确
限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图Ⅰ可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图Ⅰ不能选择SmaⅠ。
(2)根据常规质粒的结构确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致,以确保产生相同的黏性末端。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图Ⅰ也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点)。
(3)若质粒上标出T-DNA片段,则所选限制酶切割位点应位于T-DNA片段中。设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则下图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取,而丙Ti质粒宜选取,分析如下:
经典真题·明考向
1.[2024·湖南卷]某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是()
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
2.[2024·山东卷]制备荧光标记的DNA探针时,需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大肠杆菌DNA聚合酶、扩增缓冲液、H2O和4种脱氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和碱基被荧光标记的dATP)的反应管①~④中,分别加入如表所示的适量单链DNA。已知形成的双链DNA区遵循碱基互补配对原则,且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区。能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有()
反应管 加入的单链DNA
① 5'-GCCGATCTTTATA-3' 3'-GACCGGCTAGAAA-5'
② 5'-AGAGCCAATTGGC-3'
③ 5'-ATTTCCCGATCCG-3' 3'-AGGGCTAGGCATA-5'
④ 5'-TTCACTGGCCAGT-3'
A.①②B.②③
C.①④D.③④
3.[2024·江苏卷]为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD),科研人员将ELP50片段插入pET-SOD构建重组质粒pET-SOD-ELP50,以融合表达SOD-ELP50蛋白,过程如图甲。其中,ELP50是由人工合成的DNA片段,序列为限制酶a识别序列—(GTTCCTGGTGTTGGC)50—限制酶b识别序列,50为重复次数。请回答下列问题:
(1)步骤①双酶切时,需使用的限制酶a和限制酶b分别是 。
(2)步骤②转化时,科研人员常用 处理大肠杆菌,使细胞处于感受态;转化后的大肠杆菌采用含有 的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET-SOD-ELP50的大肠杆菌,应选用的一对引物是 。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与 结合,驱动转录,翻译SOD-ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11kDa,将表达的蛋白质先进行凝胶电泳,然后用SOD抗体进行杂交,显示的条带应是 (从图乙的“A~D”中选填)。
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD-ELP50蛋白的方法,科研人员研究了温度、NaCl对SOD-ELP50蛋白纯化效果的影响,部分结果如图丙。
(ⅰ)20℃时,加入NaCl后实验结果是 。
(ⅱ)100℃时,导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是 。
(ⅲ)据图分析,融合表达SOD-ELP50蛋白的优点有 。(共130张PPT)
第38讲
基因工程
第1课时
基因工程的基本工具和基本操
作程序
考点一 重组技术的基本工具（固本·识记类）
考点二 基因工程的基本操作程序（固本·应用类）
经典真题·明考向
作业手册
备用习题
答案速查【听】
答案速查【作】
课标要求
考点一 重组 技术的基本工具（固本·识记类）
1.基因工程
（1）概念理解
基因重组
受体
分子
遗传性状
（2）基因工程能够实现的理论基础
项目 理论基础
外源基因 在受体细 胞内表达 ①基因是控制生物性状的遗传物质的结构和功能单位
②遗传信息的传递都遵循中心法则
③生物界共用一套遗传密码
基因拼接
2.重组 技术的基本工具
（1）“分子手术刀”——限制性内切核酸酶（限制酶）
原核生物
数千
特定核苷酸序列
磷酸二酯键
黏性末端
（2）“分子缝合针” 连接酶
磷酸二酯键
大肠杆菌
平末端
平末端
（3）“分子运输车”——载体
质粒
限制酶切割位点
【考点易错】（明辨析）
（1）切割质粒的限制性内切核酸酶均能特异性地识别6个核苷酸序列。
（ ）
×
[解析] 大多数限制酶的识别序列由6个核苷酸组成,也有少数限制酶
的识别序列由4个、8个或其他数量的核苷酸组成。
（2）若受体大肠杆菌含有构建重组质粒时用到的限制性内切核酸酶,
则一定有利于该重组质粒进入受体并保持结构稳定。（ ）
×
[解析] 此时该限制酶会对进入该受体细菌的重组质粒进行切割,不利
于其保持结构稳定。
（3） 连接酶能将两碱基通过氢键连接起来。（ ）
×
[解析] 连接酶连接的是磷酸二酯键。
（4）限制酶可以识别和切割 。（ ）
×
[解析] 酶具有专一性,限制酶只能识别和切割 。
（5）若两种限制酶的识别序列相同,则形成的末端一定能通过 连
接酶相互连接。（ ）
×
[解析] 两种限制酶的识别序列相同,若切点不同,形成的末端将不能正
常配对,故不一定能通过 连接酶相互连接。
（6）获取一个目的基因需限制酶切割2次,共产生2个游离的磷酸基团。
（ ）
×
[解析] 限制酶切割2次,共产生4个游离的磷酸基团。
【长句拓展】（练思维）
1.［选择性必修 “拓展应用”］ 限制酶来源于原核生物,不切割自
己的 分子的原因是________________________________________
_____________________。
原核生物分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
2.不能直接把目的基因导入受体细胞而要用载体的原因是___________
____________________________________________________________
________________________________________________。
游离的片段进入受体细胞,一般会直接被分解；即使不分解也无法随着细胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因
3.实践中常用某些病毒载体作为基因工程工具,除具备普通“质粒载体”
的条件外,还应具有的条件是____________________________________
___________________________________________（答出两点即可）。
对靶细胞具有较高的转化效率,不能增殖, 对细胞无害，在宿主细胞中引起的免疫反应较弱
1.[2024·辽宁沈阳二模] 同尾酶是一类识别不同核苷酸序列但切割后产
生相同黏性末端的限制酶，依靠同尾酶的这种特性，可以根据需要将
不同的 片段进行灵活重组。下列叙述正确的是（ ）
A.产生限制酶的生物大多没有核膜包被的细胞核
B.限制酶能识别和 中特定的核苷酸序列
C.限制酶可为磷酸二酯键水解提供所需活化能
D.同尾酶是一类限制酶，每种限制酶都存在其同尾酶
√
[解析] 限制酶主要从原核生物中分离纯化得到，原核生物没有核膜
包被的细胞核，A正确；限制酶识别双链 分子的特定核苷酸序列，
B错误；限制酶起催化作用，作用机理为降低化学反应所需的活化能，
但不提供能量，C错误； 分子经限制酶切割后可形成黏性末端或
平末端，产生平末端的限制酶不存在同尾酶，D错误。
2.［2023· 新课标全国卷］ 某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶
4）、 连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序
列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制
酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用 连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用 连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用 连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用 连接酶连接
√
[解析] 酶3切割产生的是平末端， 连接酶连接具有平末端
的片段的效率要远远低于 连接酶，A错误；酶3和酶1切
割产生的末端不互补，在 连接酶的作用下不能连接，B错误；
连接酶可以连接黏性末端和平末端，质粒和目的基因都用酶1
和酶2切割后，再用 连接酶连接，可以防止目的基因自身环化
或反向连接，也可防止切割后的质粒再次环化，是效率比较高的选
择，C正确；酶4会破坏抗生素抗性基因，即破坏了标记基因，且酶2
和酶4切割得到的黏性末端相同，目的基因会发生自身环化或反向连
接，切割后的质粒也易发生环化，D错误。
与有关的几种酶的比较
酶种类 作用底物 作用部位 作用结果
限制酶 磷酸二酯键
磷酸二酯键
脱氧核苷酸 磷酸二酯键
[题后归纳]
酶种类 作用底物 作用部位 作用结果
解旋酶 碱基对中的 氢键
磷酸二酯键
（续表）
考点二 基因工程的基本操作程序（固本·应用类）
1.目的基因的筛选与获取
（1）筛选合适的目的基因
①目的基因:在基因工程的设计和操作中,用于改变______________或
获得______________等的基因。主要是指____________的基因。
受体细胞性状
预期表达产物
编码蛋白质
②筛选目的基因:
.从相关的已知________________的基因中进行筛选是较为有效的方
法之一。
.利用__________________________进行筛选。
结构和功能清晰
序列数据库和序列比对工具
③获取目的基因的方法：_______________、__________、构建基因
文库。
获取和扩增
人工合成
（2）利用 获取和扩增目的基因
①名称：________________。
②原理：________________。
③仪器： 扩增仪。
④特点：使 复制在体外反复进行，特异性地快速扩增目的基因。
聚合酶链式反应
半保留复制
⑤条件
模板 __________
原料 _______________
酶
引物 一小段能与________________________互补配对的短单链
核酸，需2种引物
缓冲液
母链
4种脱氧核苷酸
耐高温的聚合酶
母链的一段碱基序列
⑥过程
两种引物
碱基互补配对
耐高温的聚合酶
⑦结果：扩增两引物之间的 片段。
⑧鉴定：________________法。
琼脂糖凝胶电泳
技术和体内复制的比较
场所 细胞内（主要是细胞核
内）
解旋方式 解旋酶催化
酶
温度条件 在较高温度下进行，需控制 温度 细胞内温和条件
合成对象
相同点 均需要模板、原料（四种脱氧核苷酸）、能量 [重点拓展]
2.基因表达载体的构建（核心步骤）
（1）目的：让基因在受体细胞中________________________________。
稳定存在、遗传、表达和发挥作用
（2）组成
聚合酶
转录
抗生素抗性
重组
分子
［辨析］区分启动子、终止子、起始密码子、终止密码子
项目 位置 功能
驱动转录
起始密码子 驱动翻译
终止子 终止转录
终止密码子 终止翻译
（3）构建过程
用同种限制酶或能______________的限制酶切割基因表达载体和含
__________的 片段，再利用____________连接。
产生相同末端
目的基因
连接酶
3.将目的基因导入受体细胞
生物 种类 常用 方法 转化过程 受体
细胞
植物 农杆 菌转 化法 ③___________________
②___ _____ _____ 法 目的基因
花粉管通道
体细胞或受精卵
生物 种类 常用 方法 转化过程 受体
细胞
动物 ④___ _____ ____ 法 ⑤___
_____
微生 物 ⑥___ ___处 理法 原核
细胞
显微注射
受精卵
（续表）
［注意］农杆菌转化法的两次拼接和两次导入
第一次拼接: ___________________________________;
第二次拼接（非人工操作）:____________________________________
________________；
第一次导入：_______________________________;
第二次导入（非人工操作）：_________________________________。
将目的基因拼接到质粒的上
插入目的基因的拼接到受体细胞的染色体上
将含目的基因的质粒导入农杆菌
含目的基因的导入受体细胞
4.目的基因的检测与鉴定
（1）检测与鉴定的目的：检测和鉴定目的基因进入受体细胞后，是
否__________________________.
稳定维持和表达其遗传特性
（2）检测与鉴定的方法
类型 检测与鉴定内容 方法
分子水平检 测
目的基因是否翻译成蛋白质 个体生物学 水平鉴定 是否具有抗性及抗性程度等 对转基因生物进行抗虫或
抗病的接种实验
基因工程产品与天然产品的 功能活性是否相同 比较基因工程产品与天然
产品的功能活性
【考点易错】（明辨析）
（1）启动子位于基因的上游，是 聚合酶识别和结合的部位，驱
动基因转录出 。（ ）
×
[解析] 启动子位于基因的上游，是 聚合酶识别和结合的部位，
驱动基因转录出 。
（2）标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将
含有目的基因的细胞筛选出来。（ ）
√
（3）用 技术扩增目的基因时，要有一段已知目的基因的核苷酸序
列，以便合成引物。（ ）
√
（4）农杆菌可以侵染双子叶和单子叶植物，对大多数裸子植物没有
侵染能力。（ ）
×
[解析] 农杆菌可以侵染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植
物没有侵染能力。
（5）外源基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复
制。（ ）
×
[解析] 外源基因必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行
转录。
（6）可通过 技术检测目的基因是否成功插入或目的基因是否转录
出了 ，也可以检测目的基因是否翻译成蛋白质。 （ ）
×
[解析] 蛋白质的检测用抗原—抗体杂交法。
（7）为培育抗除草剂的作物新品种，导入抗除草剂基因时只能以受
精卵为受体。（ ）
×
[解析] 转基因植物的受体细胞可以是体细胞，也可以是受精卵。
【长句拓展】（练思维）
1. 过程中需要引物的原因是_________________________________
_____________________________________________________。
需要设计两种引物的原因是____________________________________
____________________________________________________________
________________________。
聚合酶不能从头开始合成，只能从引物的端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸子链
基因的两条链都作为模板，其碱基序列不同，且聚合酶只能从引物的端延伸子链，用两种引物才能确保两条链同时被扩增
3.生产上常将获得的转基因抗虫棉与普通棉花混合播种，其目的是
______________________________________。
降低害虫种群中抗性基因频率的增长速率
2.构建基因的表达载体时使用不同的限制酶切割目的基因和质粒的两
端的原因是__________________________________________________
_________。
防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接
命题角度一 考查 技术及其应用
1.[2024·江苏盐城模拟] 引物的
端有结合模板的关键碱基， 端
A.图中两条子链合成一定都是从端向 端延伸
B.图示表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短有关
C.用图示引物扩增5次后，可以产生22个目标产物
D. 每次循环都消耗引物和原料，在实验过程中需要及时补充
无严格限制，可用于添加限制酶识别序列。下列相关叙述错误的是
（ ）
√
[解析] 聚合酶只能从引物
的端开始延伸 子链，所以两条
子链合成一定都是从端向 端延伸，A正确；题图中引物与模板链
碱基互补配对，故该图表示复性阶段，该过程的温度与引物的长短、
碱基组成等有关，引物长度越长或者 、C碱基含量越高，则复性的
温度越高，B正确；经过5次循环后会产生个 分子，其中双链
不等长的分子有 （个），因此经过5次复制产生的目
标产物有（个），C正确； 所需要的引物和原料是
一次性添加的，在实验过程中不需要补充，D错误。
2.[2025·浙江杭州模拟] 反向 是一种通过已知序列设计引物对未知
序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述正确的是
（ ）
A.应选择引物2和引物3进行 扩增
B.设计的引物中 、C碱基含量越高，变性的温
度越高
C. 产物是包含所有已知序列和未知序列的
链状 分子
D.整个过程需用到限制酶、 连接酶、耐高
温的 聚合酶及逆转录酶
√
[解析] 子链合成的方向为端到 端，因
此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩
增应选择引物1和引物4，A错误；复性过程中
引物与模板链结合， 、C碱基含量越高，碱基
对间氢键的含量越多，复性的温度越高，B错
误；根据题意和图示可知， 分子被限制酶
切割，然后环化并加入根据已知序列合成的引物，
再通过 扩增得到的是中间是未知序列、两侧是已知序列的分子，故 产物是包含所有已知序列和未知序列的链状 分子，C正确；整个过程需用到限制酶、连接酶和耐高温的 聚合酶，不需要逆转录酶，D错误。
命题角度二 考查基因工程的基本操作程序
3.[2024·福建福州联考] 科研人员将寒
带地区海鱼中的抗冻基因转入千禧果
细胞中，成功培育出抗冻千禧果。下
图为培育过程中使用的 质粒示意图，
其中区的基因活化能促进
的加工和转移，下列叙述正确的是（ ）
A.构建基因表达载体时，最好选择限
制酶Ⅱ和Ⅲ来切割质粒
B.利用 扩增抗冻基因，需提前检测
抗冻基因的全部碱基序列
C. 区的基因活化促进抗冻基因整合
到千禧果细胞的染色体 上
D.利用含卡那霉素的培养基可筛选出
成功导入抗冻基因的千禧果细胞
√
[解析] 使用限制酶 Ⅱ 会破坏 区的基
因，区的基因活化能促进 的加
工和转移，因此不能选限制酶 Ⅱ，A错误；
使用 技术扩增抗冻基因，只需要知道抗
冻基因两端碱基序列并据此设计引物即可，B错误；农杆菌侵染植物
细胞后，质粒上的 能转移到被侵染的细胞,并整合到该细
胞的染色体上，所以 区基因活化可促进抗冻基因整合到千禧
果细胞的染色体上，C正确；转化成功的植物细胞染色体 上
只整合了片段， 上含有四环素抗性基因，不含卡那
霉素抗性基因，可利用含四环素的培养基筛选成功导入抗冻基因的
千禧果细胞，D错误。
4.[2024·湖北黄石一模] 如图所示，研究
人员将雪花莲凝集素基因 和尾穗苋
凝集素基因（）与载体 结
合，然后导入棉花细胞。下列操作不符
合实验目的的是（ ）
A.用技术可检测和 基因是否导入棉花细胞中
B.将棉花细胞接种在含氨苄青霉素的培养基上可筛选出转基因细胞
C.用限制酶Ⅰ和连接酶处理两种基因可获得 融合
基因
D.与只用 Ⅰ 相比， Ⅰ 和 Ⅰ 联合处理融合基因和载体可保
证基因转录方向正确
√
[解析] 根据 融合基因的两端
序列设计合适的引物，可以利用 技
术检测和 基因是否导入棉花细
胞，A正确；由于重组质粒含有卡那霉
素抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出
转基因细胞，B错误；雪花莲凝集素基因 和尾穗苋凝集素基因
均有限制酶Ⅰ 的酶切位点，所以用限制酶 Ⅰ 和 连
接酶处理两种基因可获得 融合基因，C正确；题图中载
体与上都含有 Ⅰ 和 Ⅰ 的酶切位点，与只用
Ⅰ 相比， Ⅰ 和 Ⅰ 联合处理融合基因和载体可保证基因转录
方向正确，D正确。
限制酶的选择原则
（1）根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图 Ⅰ 可选择 Ⅰ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，如图 Ⅰ 不能选择
Ⅰ。
[题后归纳]
（2）根据常规质粒的结构确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保产生相同的黏
性末端。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限
制酶切割目的基因和质粒，如图 Ⅰ 也可选择用 Ⅰ 和 Ⅰ 两种限
制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切割位点）。
（3）若质粒上标出 片段,
则所选限制酶切割位点应位于
片段中。设切割目的基因
的限制酶为 Ⅰ 和 Ⅰ ,则下
图中甲、乙、丁 质粒均不宜选取,
而丙 质粒宜选取,分析如下:
经典真题·明考向
1.[2024·湖南卷] 某同学将质粒进行限制酶酶切时，发现 完全
没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是
（ ）
A.限制酶失活，更换新的限制酶
B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒
D.酶切位点被甲基化修饰，换用对 甲基化不敏感的限制酶
√
[解析] 限制酶失活会使 完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A
项正确;酶切条件不合适通常会使切割效果下降,此时会有部分 被
酶切，应调整反应条件如温度、等，B项错误;质粒 突变导致
限制酶识别位点缺失,会造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常
质粒,C项正确;质粒上酶切位点被甲基化修饰,会导致对 甲基
化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对 甲基化不敏感的
限制酶,D项正确。
2.[2024·山东卷] 制备荧光标记的探针时，需要模板、引物、
聚合酶等。在只含大肠杆菌聚合酶、扩增缓冲液、 和4种脱氧
核苷酸、、和碱基被荧光标记的 的反应管①~
④中，分别加入如表所示的适量单链。已知形成的双链 区遵
循碱基互补配对原则，且在本实验的温度条件下不能产生小于9个连
续碱基对的双链区。能得到带有荧光标记的 探针的反应管有
（ ）
反应管
①
②
③
④
A.①② B.②③ C.①④ D.③④
√
[解析] 由题干信息可知，解答本题的关键是要找到反应管中的引物
和模板。结合表中信息，可推测只有单链 的反应管中，单链
既作模板，也作引物;而有2种单链的反应管中，它们之间可互
为引物、模板，或每种单链 既作模板，也作引物。根据题干信
息“已知形成的双链 区遵循碱基互补配对原则，且在本实验的温
度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链 区”，可排除发夹
结构和非连续配对的情况。结合技术中 聚合酶的作用，构建
模型如下:
在反应管①中，2条单链 的互补配对情况如下图所示。
反应管①中的单链 本身不能碱基互补配对，因此不能既作模板
也作引物。因为聚合酶将脱氧核苷酸加到引物的 端，而本管
中的2条单链配对后，露出的是 黏性末端，所以该反应管得不
到带有荧光标记的 探针，不符合题目要求。
同理可知，在反应管②中，单链 既作模板也作引物，互补配对
情况如下图所示。
复制过程中添加上的脱氧核苷酸只有和 ，但具有荧光标记
只有，所以该反应管得不到带有荧光标记的 探针，不符合
题目要求。
在反应管③中，2种单链 的互补配对情况如下图所示。
反应管③中的同种单链 间不能碱基互补配对,因此不能既作模板
也作引物。但反应管③中2种单链 能互为模板和引物进行复制，
且复制过程中能添加有荧光标记的 ，所以该反应管能得到带有
荧光标记的 探针，符合题目要求。
在反应管④中，单链 既作模板也作引物，互补配对情况如下图所示。
且复制过程中能添加具有荧光标记的 ,所以该反应管能得到带有
荧光标记的 探针，符合题目要求。
综上可知，能得到带有荧光标记的 探针的反应管是③和④。因
此D选项符合题目要求。
3.[2024·江苏卷] 为了高效纯化超氧化物歧
化酶，科研人员将 片段插入
构建重组质粒
，以融合表达
蛋白，过程如图甲。其中，
是由人工合成的 片段，序列为限
制酶 识别序列
限制酶 识别
序列，50为重复次数。请回答下列问题：
（1）步骤①双酶切时，需使用的限制酶
和限制酶 分别是_______________。
Ⅰ、Ⅲ
[解析] 目的基因应插入启动子和终止子
之间，结合题意可知， 应插入
的 之后、终止子之前，
由图可知，限制酶和限制酶 分别是
Ⅰ、 Ⅲ。
（2）步骤②转化时，科研人员常用_____处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有__________的培养基进行筛选。用 技术筛选成功导入 的大肠杆菌，应选用的一对引物是_____________。
卡那霉素
和
[解析] 将目的基因导入细菌时常用
处理细菌，使其处于感受态。由图可知，
重组质粒含有标记基因卡那霉素抗性基因，
所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素
的培养基进行筛选。成功导入
的大肠杆菌同时含有
和 ，结合图示可知，应选引物
和，利用 技术进行筛选。
（3）步骤③大肠杆菌中 聚合酶与________
结合，驱动转录，翻译 蛋白。已知
蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为
，将表达的蛋白质先进行凝胶电泳，然
后用 抗体进行杂交，显示的条带应是___
（从图乙的“ ”中选填）。
启动子
C
[解析] 聚合酶与启动子结合后，驱动转录。
由图可知，决定 融合蛋白的基因长
度为 ，可编码
（个）氨基酸，已知蛋白质中
氨基酸残基的平均相对分子质量约为 ，
则融合蛋白的相对分子质量约为
，电泳后应该为图
乙中条带C。
（4）步骤④为探寻高效纯化
蛋白的方法，科研人员研究了温度、
对 蛋白纯化效果的影响，部
分结果如图丙。
（ⅰ）时，加入 后实验结果是
_______________________________。
组纯化蛋白数量更多
[解析] 由图可知，时，较不加
组，加入后 组纯化蛋白数量更多。
（ⅱ） 时，导致各组中所有蛋白
都沉淀的原因是___________________
_____。
高温使蛋白质变性而沉淀
[解析] 时，温度过高，导致蛋
白质变性而沉淀。
（ⅲ）据图分析，融合表达
蛋白的优点有__________
_________________________________
_________________________。
低温下添加有利于蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持
[解析] ，加入 时，相比
组， 组沉淀中蛋白
质相对含量较高，说明低温下添加
有利于 蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持。
备用习题
1.农杆菌Ti质粒上的T-DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将下图中被侵染植物的DNA片段连接成环,并以此环为模板进行PCR,扩增出T-DNA插入位置两侧的未知序列,以此可确定T-DNA插入的具体位置。下列相关叙述错误的是 ( )
A.PCR技术依据的原理是DNA半保留复制
B.PCR技术需要解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
C.选择图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列
D.通过与受体细胞的基因组序列比对来确定插入位置
√
[解析] PCR技术需要耐高温的DNA聚合酶,但不需要解旋酶,高温下双螺旋可以打开;DNA的两条链反向平行,子链从引物的3'端开始延伸,利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列。故选B。
作业手册
（限时：30分钟）
题组一 重组DNA技术的基本工具
1.[2024·陕西西安期末] 在基因工程的操作中，需要三种工具，分别是
“分子手术刀”“分子缝合针”和“分子运输车”，关于这三种工具的叙述，
正确的是（ ）
A.“分子手术刀”指的是限制性内切核酸酶，可以断开和 的磷
酸二酯键
B.“分子缝合针”指的是 聚合酶，可以催化生成磷酸二酯键
C.“分子运输车”指的是载体，常用的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体
D.所有载体的化学本质一定是核酸
√
[解析] “分子手术刀”是限制性内切核酸酶，能识别双链 分子的
特定核苷酸序列，并在特定的位点切割使磷酸二酯键断裂，A错误；
“分子缝合针”是 连接酶，能恢复被限制酶切开的磷酸二酯键，B
错误；基因工程中的“分子运输车”指载体，有质粒、动植物病毒、
噬菌体，其中质粒是基因工程中最常用的载体，物质跨膜运输过程
中需要的载体的本质是蛋白质，C正确，D错误。
2.[2024·湖北武汉期末] 某细菌分子上有4个 Ⅰ 的酶切位点，
经 Ⅰ 处理后会形成4个大小不同的片段。若是用 Ⅰ
处理，则只会形成2个大小不同的片段。Ⅰ和 Ⅰ的识别
序列及切割位点如表所示。下列叙述错误的是（ ）
限制酶名称 识别序列及切割位点
限制酶名称 识别序列及切割位点
A.若用两种酶共同处理，会形成6个大小不同的 片段
B.上述两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端
C.该分子上有两个 Ⅰ 的酶切位点
D.该细菌 分子是环状的
√
[解析] 分析题表信息可知，Ⅰ识别序列中包含 Ⅰ 的识别
序列，所以同时用两种酶处理，不会形成6个大小不同的 片段，
A错误；Ⅰ 和 Ⅰ 两种限制酶切割后形成的黏性末端均为
，B正确；该分子上有4个Ⅰ 的酶切位点，经 Ⅰ
处理后形成4个片段，可知该分子为环状，用 Ⅰ
处理后，得到2个片段，说明该分子上有两个 Ⅰ 的酶
切位点，C、D正确。
3.[2024·广东广州期末] 研究表明，连接酶能够封闭 双螺旋骨
架上的切口（图甲），却无法封闭缺口（图乙），下列相关叙述正确
的是（ ）
A.DNA连接酶的封闭是指催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成
B.单链发生缺失，在聚合酶作用下沿缺口 方向修复
C.连接酶可以将来源不同的片段拼接成新的 分子
D.连接酶封闭切口时，需要识别 片段特定的核苷酸序列
√
[解析] 连接酶的封闭是指催化脱氧核糖核苷酸之间磷酸二酯键
的形成，A错误；单链发生缺失，在 聚合酶作用下沿缺口
方向修复，B错误； 分子的空间结构都是相同的，所以
连接酶可以将来源不同的片段拼接成新的 分子，形成
重组，C正确；连接酶封闭切口时，不需要识别 片段特
定的核苷酸序列，D错误。
4.[2024·福建厦门模拟] Ⅰ、 Ⅰ、 Ⅰ三种限制酶的识别序列
和切割位点依次为 。下图表示某
片段的部分碱基序列，已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。
下列叙述正确的是（ ）
A.若用 Ⅰ 完全切割该，则其产物的长度为、 、
B.若虚线方框内的碱基对被替换，则用Ⅰ 完全切割该 可
产生3种片段
C.若用 Ⅰ 和Ⅰ 切割 ，可形成相同的黏性末端
D.用Ⅰ 切割产生的片段，不可用E. 连接酶重新将其连接
√
[解析] 限制酶Ⅰ的酶切位点是 ，在题图中有
两个限制酶 Ⅰ 的酶切位点， 将被切割成三个片段，结合图
解，三个片段的长度分别是、、 ，A错误；发生
碱基对替换后，该片段中只有一个限制酶Ⅰ的酶切位点，用
Ⅰ 完全切割后会出现两种长度的片段，B错误；由 Ⅰ 和 Ⅰ
的识别序列及切割位点可知，若用 Ⅰ 和Ⅰ 切割 ，可
形成相同的黏性末端，C正确；用Ⅰ 切割 产生的片段具有平
末端，连接酶既能连接具有黏性末端的 片段，也能连
接具有平末端的 片段，D错误。
题组二 基因工程的基本操作程序
5.除草剂的有效成分草甘膦能够专一性抑制 合酶的作用，从而使
植物体内多种代谢途径受影响而导致植物死亡，草甘膦除掉杂草的同
时也会使作物受损，培育抗草甘膦的作物是解决办法之一。下列关于
转入外源 合酶基因使矮牵牛抗草甘膦流程的叙述正确的是
（ ）
A.可以通过在逆转录酶的作用下构建，从而获取 合酶
基因
B.用限制酶和连接酶处理目的基因和 质粒，仅涉及磷酸二酯键
的断裂和形成
C.基因表达载体组件中的起始密码子是 聚合酶识别和结合的部位，
驱动基因转录
D.农杆菌的转化使受体植物细胞都能培育成转基因植株
√
[解析] 用限制酶和连接酶处理目的基因和 质粒，涉及碱基之
间的氢键和 片段之间的磷酸二酯键的断裂和形成，B错误；起始
密码子位于上， 聚合酶识别和结合的位点是基因表达载体
中的启动子，C错误； 可转移到受体细胞并整合到受体细胞
染色体的上，但不能保证目的基因的导入率为 ，所以农杆
菌的转化不一定能使所有受体细胞都能培育成转基因植株，D错误。
6.[2025·山东临沂月考] 是
一种高效的基因组编辑技术， 基因
表达的 蛋白像一把“分子剪刀”，在
单链向导 引导下，切割
双链以敲除目标基因或插入新的基
因。 基因组编辑技术的工作原理如图所示，下列叙述错
误的是（ ）
A.过程①中，插入特定 编码序列
的时需要用到 连接酶
B.过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌
细胞的方法是农杆菌转化法
C.过程④中， 可识别并与目标
序列特异性结合，遵循了碱基互补配对的原则
D.过程⑤中，蛋白可切割目标 特定核苷酸序列
√
[解析] 过程②指的是将目的基因导入大肠杆菌细胞，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 处理法，B错误。
7.[2025·四川成都月考] 某科研小组采用 技术构建了红色荧光蛋白基因和 淀粉酶基因的融合基因 ，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列（黑色区域）可互补配对。下列说法错误的是（ ）
A.利用技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 双链
B.不能在同一反应体系中进行基因和 基因的扩增
C.基因和 基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D.杂交链延伸得到 融合基因的过程不需要加引物
√
[解析] 利用 技术扩增基因时，高温使
双链解旋，不需要解旋酶来打开
双链，A正确；引物之间的结合会干扰引
物和模板链的结合，从而影响 过程，
因此不能在同一个反应体系中进行
基因和基因的扩增，B正确；基因和 基因
混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；杂交链延伸得到
融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的
端的碱基序列即为引物，D正确。
8.[2024·江西南昌模拟] 普通棉花中
甘露糖苷酶 基因表
达出的 能催化半纤维素降
解，使棉纤维长度变短。为了培育
长绒棉，科研人员构建了反义 基因表达载体
（将正义 基因与载体反向连接），获得了转基因长绒棉新品
种，具体过程如图所示。用 Ⅰ和 Ⅰ切割某正义表达载体可获得
、、、种长度的 片段。下列叙述正确的是
（ ）
注： 表示启动子的启动方向，、分别表示 的左右边界。
A.正义 基因的转录方向是
B.①过程所得到的表达载体均为反
义表达载体
C.反义 基因可能通过抑制
基因的翻译来保证棉纤维
长度
D.用 Ⅰ 切割反义表达载体获得
的片段的长度为和
√
[解析] 由题图可知， Ⅰ的酶
切位点靠近 基因转录
的起始端，其转录方向是 ，
A错误；①过程得到的表达载体
可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误；反义 基因转录出来的与正常转录的 互补，从而阻止后者与核糖体结合，即反义基因可能通过抑制 基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确；
用 Ⅰ 和 Ⅰ 切割正义表达
载体可获得、、、
种长度的 片段，据此
判断正义表达载体的左侧 Ⅰ
和 Ⅰ 之间的长度是 ，A位置处的 Ⅰ 和右侧 Ⅰ 之间的长度是，B位置处的 Ⅰ 和其左侧 Ⅰ 之间的长度是，右上角位置处的Ⅰ和上方 Ⅰ之间的长度是，故用Ⅰ切割反义表达载体获得的 片段的长度应分别为和 ，D错误。
9.[2024·浙江金华模拟] 大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因和
基因， 基因编码的产物半乳糖苷酶能催化无色的 生成蓝
色沉淀，使菌落呈现蓝色，目的基因插入 基因中则菌落呈现白
色，该过程称为蓝白斑筛选。下列叙述正确的是（ ）
A.蓝白斑筛选属于个体水平上的操作
B.溶液处理的大肠杆菌能吸收周围 从而完成转化
C.平板中加入青霉素筛选出的都是成功导入重组质粒的大肠杆菌
D.将完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生蓝色斑菌落
√
[解析] 蓝白斑筛选属于分子水平上的操作，A错误；转化过程中，
大肠杆菌通常用溶液处理，使其处于能吸收周围 的状态，
从而完成转化，B正确；大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因，平
板中加入青霉素筛选出来的菌可能是含有重组质粒的大肠杆菌，也
可能是含空载质粒的大肠杆菌，C错误；完成转化的大肠杆菌是带有
目的基因的大肠杆菌，目的基因的插入破坏了 基因，因此，完
成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生白色斑菌落，D错误。
综合应用练
10.[2024·辽宁大连一模] 从健康人的血浆中分离提取的人血清白蛋白
在临床上需求量很大，具有重要的医用价值。研究人员将
基因转入水稻细胞中，培育转基因植物。图甲为 基因的部分片段，
图乙是获得转基因植物的流程图，其中报告基因表达的产物能催化无
色物质 反应生成蓝色物质。据图回答下列问题：
注：外显子指基因中编码蛋白质的片段，内含子指基因中不编码蛋白质的片段。
（1）科研人员获取基因后，可用 技术进行扩增，该技术的原
理是__________________，操作的每个循环都包括变性、复性和延伸
三步，其中温度最高的步骤为______。据图甲分析，若要扩增出只含
有内含子2和外显子3的 片段，应选择的引物是_______________。
的半保留复制
变性
引物4和引物5
[解析] 是一项体外扩增的技术，其原理是 的半保留复
制；每个循环都包括变性以上、复性左右 和延伸
左右 三步，其中温度最高的步骤为变性；引物需要与模板的
端结合，据题图甲分析，若要扩增出只含有内含子2和外显子3的
片段，应选择的引物是引物4和引物5。
（2）构建重组 质粒过程中，为了保证连接的准确性，需要选择___
种限制酶对目的基因和质粒进行切割。一个重组 质粒的组成，除
图中所示外，还必须包含________________等。
2
启动子、终止子
[解析] 为避免反向连接和自身环化，需要用2种限制酶对目的基因和
质粒进行切割；一个重组 质粒的组成，除题图中所示
（标记基因、目的基因、限制酶切割位点）外，还必须包含启动子、
终止子，以保证转录的正常进行。
（3）过程①中需将植物细胞与农杆菌混合培养，旨在使 进入
植物细胞；除尽农杆菌后，需将植物细胞转接到含___________的培
养基上筛选出转化成功的细胞。
无色物质
[解析] 分析题意可知，报告基因表达的产物能催化无色物质 反应
生成蓝色物质，故过程①除尽农杆菌后，需将植物细胞转接到含无
色物质 的培养基上筛选出转化成功的细胞。
（4）检测发现 基因成功导入植物受体细胞，但仍不能确定转基因
水稻是否培育成功，理由是____________________________________
______________。
基因在转基因植物细胞中不一定转录, 也不一定翻译
[解析] 基因指导蛋白质的合成包括转录和翻译过程， 基因在转
基因植物细胞中不一定转录,也不一定翻译，故检测发现 基因成
功导入植物受体细胞，但仍不能确定转基因水稻是否培育成功。
（5）为检测 基因的表达情况，可提取受体细胞中的蛋白质，与
______________________进行抗原—抗体杂交实验。
抗人血清白蛋白的抗体
[解析] 抗原与抗体的结合具有特异性，为检测 基因的表达情况，
可提取受体细胞中的蛋白质，与抗人血清白蛋白的抗体进行抗原—
抗体杂交实验。
11.[2025·重庆沙坪坝区月考] 农杆菌中存在的天然 质粒相对分子质
量往往较大，在基因工程中，导入农杆菌的成功率较低。因此，需对
天然 质粒进行测序并改造，以提高农杆菌转化法的成功率。请回答
下列问题：
（1）对进行测序，需将限制酶的切割位点在 上定位，即进行
限制酶图谱的构建。科研人员用不同限制酶单独或联合切割某天然
质粒，所用限制酶种类及切割后的 片段长度如下表所示。请在图
Ⅰ 的质粒上画出Ⅰ、 Ⅰ、 Ⅲ的切割位点并标出酶切位点间
的长度：
组别 添加限制酶
①
②
③
④
[答案]
[解析] 据表格数据可知， Ⅰ切割质粒后的片段
长度为 ，说明该酶在质粒上只有一个酶切位
点且质粒长度为。 Ⅰ 酶切割质粒后的片
段长度为、 ，说明该酶在质粒上有两个
酶切位点。同时用Ⅰ 和 Ⅰ 切割质粒后获得的片段长度为 、、，说明Ⅰ 的切割位点位于 Ⅰ 切割后两个片段中的长片段上。Ⅰ 、 Ⅰ 和 Ⅲ 同时切割质粒后获得的片段长度为、、、 ，说明Ⅲ 有一个切割位点，且该位点刚好在 Ⅰ 和 Ⅰ 同时切割时得到的长度为 的片段中点。综合以上分析，三种酶的切割位点在质粒上的定位见答案。
（2）对质粒进行测序可使用不对称 技术，“不对称”体现在一对
引物的含量上。含量较少的引物称作限制性引物，较多的称作非限制
性引物。假设在的最初10个循环中，扩增产物是双链 ，当限
制性引物消耗完后，在非限制性引物作用下会产生大量的单链
。若图 Ⅱ 中甲链的部分碱基序列为
，则获得的 对应的部分碱基序
列为 ______________。若反应体系中原来有
个模板 ，经10个循环消耗完限制性引物后继续扩增10个循环，后
10个循环中需要非限制性引物_____________个。
[解析] 据图Ⅱ可知，甲链和乙链是互补链，非限制性引物与乙链互补，故甲链与非限制性引物碱基序列相同。 是指以非限制性引物引导合成的单链 ，非限制性引物与对应的甲链碱基序列相同，故获得的 对应的部分碱基序列也为
。反应体系中原来有 个模板，故循环10次后，产物为个 。后10个循环是以前10次循环的产物为模板，因合成的是单链 ，每个产物消耗一个非限制性引物，故后10个循环中需要非限制性引物数目为 个。
（3）质粒上有区和区，区决定 的转移。受伤植物伤口分泌的酚类物质可诱导基因的表达，进而诱导 质粒产生一条新的单链分子，单链分子从 质粒上脱离后，在蛋白的引导下穿过植物细胞并随机整合到其染色体 上。从农杆菌转化植物细胞的机制分析，基因与 在同一质粒上______（填“是”或“不是”）成功转化的必备条件，基于以上分析，提出一个提高农杆菌转化成功率的思路： _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
不是
在农杆菌中导入两个改造后的质粒，一个质粒上含（结合有目的基因）却不含 基因，另一个质粒上仅含基因却不含（或利用一个质粒上的 基因诱导另一个质粒上的 转移）
[解析] 依题意，区的基因表达出蛋白，在 蛋白引导下，新合成的单链转移到植物细胞的染色体上。因此， 基因不一定要与在同一质粒上，只要 基因表达的蛋白质能对新合成的单链起作用就行。依题意，农杆菌中存在的天然 质粒相对分子质量往往较大，在基因工程中，导入农杆菌的成功率较低。基于以上的分析，可以在农杆菌中导入两个改造后的 质粒，一个质粒上含（结合有目的基因）却不含 基因，另一个质粒上仅含基因却不含，即利用一个质粒协助质粒 上的基因诱导另一个质粒（微型质粒）上的 转移，通过这种办法，降低改造后的质粒的相对分子质量，提高农杆菌转化的成功率。
快速核答案
考点一 重组技术的基本工具（固本·识记类）
必备知识 精梳理
1.基因重组 受体 分子 遗传性状 2.（1）原核生物 数千 特定核苷酸序列 磷酸二酯键 黏性末端 （2）磷酸二酯键 大肠杆菌 平末端 平末端 （3）质粒 限制酶切割位点
考点易错·明辨析
（1）× （2）× （3）× （4）× （5）× （6）×
长句拓展·练思维
1.原核生物分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰 2.游离的片段进入受体细胞,一般会直接被分解；即使不分解也无法随着细胞分裂而进行复制,导致子代细胞中不再含有目的基因 3.对靶细胞具有较高的转化效率,不能增殖,对细胞无害，在宿主细胞中引起的免疫反应较弱
典型例题 提能力
1.A 2.C
考点二 基因工程的基本操作程序（固本·应用类）
必备知识 精梳理
1.（1）①受体细胞性状 预期表达产物 编码蛋白质 ②结构和功能清晰 序列数据库和序列比对工具 ③获取和扩增 人工合成 （2）聚合酶链式反应 半保留复制 母链 4种脱氧核苷酸 耐高温的聚合酶 母链的一段碱基序列 两种引物 碱基互补配对 耐高温的聚合酶 琼脂糖凝胶电泳
2.（1）稳定存在、遗传、表达和发挥作用 （2）聚合酶 转录 抗生素抗性 重组分子 （3）产生相同末端 目的基因 连接酶
3.目的基因 花粉管通道 体细胞或受精卵 显微注射 受精卵 将目的基因拼接到质粒的上 插入目的基因的拼接到受体细胞的染色体上 将含目的基因的质粒导入农杆菌 含目的基因的导入受体细胞 4.稳定维持和表达其遗传特性
考点易错·明辨析
（1）× （2）√ （3）√ （4）× （5）× （6）× （7）×
长句拓展·练思维
1.聚合酶不能从头开始合成，只能从引物的端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸子链,基因的两条链都作为模板，其碱基序列不同，且聚合酶只能从引物的端延伸子链，用两种引物才能确保两条链同时被扩增
2.防止质粒和目的基因的自身环化以及目的基因与载体的反向连接
3.降低害虫种群中抗性基因频率的增长速率
典型例题 提能力
命题角度一 考查技术及其应用
1.D 2.C
命题角度二 考查基因工程的基本操作程序
3.C 4.B
经典真题·明考向
1.B 2.D 3.（1）Ⅰ、Ⅲ （2） 卡那霉素
和 （3）启动子 C （4）（ⅰ）组纯化蛋白数量更多 （ⅱ）高温使蛋白质变性而沉淀 （ⅲ）低温下添加有利于蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持
题组一 重组DNA技术的基本工具
1.C 2.A 3.C 4.C
题组二 基因工程的基本操作程序
5.A 6.B 7.C 8.C 9.B
综合应用练
10.（1）的半保留复制 变性 引物 4和引物5 （2）2 启动子、终止子 （3）无色物质 （4）基因在转基因植物细胞中不一定转录,也不一定翻译 （5）抗人血清白蛋白的抗体
11.（1） （2）
（3）不是 在农杆菌中导入两个改造后的质粒，一个质粒上含（结合有目的基因）却不含基因，另一个质粒上仅含基因却不含（或利用一个质粒上的基因诱导另一个质粒上的
转移）课时作业(五十四) 基因工程的基本工具和基本操作程序
1.C [解析] “分子手术刀”是限制性内切核酸酶,能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并在特定的位点切割使磷酸二酯键断裂,A错误;“分子缝合针”是DNA连接酶,能恢复被限制酶切开的磷酸二酯键,B错误;基因工程中的“分子运输车”指载体,有质粒、动植物病毒、噬菌体,其中质粒是基因工程中最常用的载体,物质跨膜运输过程中需要的载体的本质是蛋白质,C正确,D错误。
2.A [解析] 分析题表信息可知,BamH Ⅰ识别序列中包含Sau3A Ⅰ 的识别序列,所以同时用两种酶处理,不会形成6个大小不同的DNA片段,A错误;BamH Ⅰ 和Sau3A Ⅰ 两种限制酶切割后形成的黏性末端均为GATC,B正确;该DNA分子上有4个Sau3A Ⅰ 的酶切位点,经Sau3A Ⅰ 处理后形成4个DNA片段,可知该DNA分子为环状DNA,用BamH Ⅰ 处理后,得到2个DNA片段,说明该DNA分子上有两个BamH Ⅰ 的酶切位点,C、D正确。
3.C [解析] DNA连接酶的封闭是指催化脱氧核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成,A错误;DNA单链发生缺失,在DNA聚合酶作用下沿缺口5'→3'方向修复,B错误;DNA分子的空间结构都是相同的, 所以DNA连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的DNA分子,形成重组DNA,C正确;DNA连接酶封闭切口时,不需要识别DNA片段特定的核苷酸序列,D错误。
4.C [解析] 限制酶SmaⅠ的酶切位点是↓5'-CCCGGG-3',在题图中有两个限制酶Sma Ⅰ 的酶切位点,DNA将被切割成三个片段,结合图解,三个片段的长度分别是637 bp、890 bp、761 bp,A错误;发生碱基对替换后,该片段中只有一个限制酶SmaⅠ的酶切位点,用Sma Ⅰ 完全切割后会出现两种长度的片段,B错误;由Mbo Ⅰ 和BamH Ⅰ 的识别序列及切割位点可知,若用Mbo Ⅰ 和BamH Ⅰ 切割DNA,可形成相同的黏性末端,C正确;用SmaⅠ 切割DNA产生的片段具有平末端,E.coliDNA连接酶既能连接具有黏性末端的DNA片段,也能连接具有平末端的DNA片段,D错误。
5.A [解析] 用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和Ti质粒,涉及碱基之间的氢键和DNA片段之间的磷酸二酯键的断裂和形成,B错误;起始密码子位于mRNA上,RNA聚合酶识别和结合的位点是基因表达载体中的启动子,C错误;T-DNA可转移到受体细胞并整合到受体细胞染色体的DNA上,但不能保证目的基因的导入率为100%,所以农杆菌的转化不一定能使所有受体细胞都能培育成转基因植株,D错误。
6.B [解析] 过程②指的是将目的基因导入大肠杆菌细胞,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是Ca2+处理法,B错误。
7.C [解析] 利用PCR 技术扩增基因时,高温使DNA双链解旋,不需要解旋酶来打开 DNA 双链,A正确;引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合,从而影响PCR过程,因此不能在同一个反应体系中进行dsred2 基因和amy基因的扩增,B正确;dsred2基因和amy 基因混合可以得到两种类型的杂交链,C错误;杂交链延伸得到 dsred2-amy融合基因的过程中,不需要加入引物,两条母链的3'端的碱基序列即为引物,D正确。
8.C [解析] 由题图可知,Not Ⅰ的酶切位点靠近GhMnaA2基因转录的起始端,其转录方向是A→B,A错误;①过程得到的表达载体可能为反义表达载体,也可能为正义表达载体,B错误;反义GhMnaA2基因转录出来的mRNA与正常转录的mRNA互补,从而阻止后者与核糖体结合,即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度,C正确;用Sma Ⅰ 和Not Ⅰ 切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段,据此判断正义表达载体的左侧Sma Ⅰ 和Not Ⅰ 之间的长度是59 kb,A 位置处的Sma Ⅰ 和右侧Not Ⅰ 之间的长度是3 kb,B位置处的Sma Ⅰ 和其左侧Not Ⅰ 之间的长度是18 kb,右上角E6位置处的SmaⅠ和上方NotⅠ之间的长度是28 kb,故用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18+28=46 kb和3+59=62 kb,D错误。
9.B [解析] 蓝白斑筛选属于分子水平上的操作,A错误;转化过程中,大肠杆菌通常用CaCl2溶液处理,使其处于能吸收周围DNA的状态,从而完成转化,B正确;大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因,平板中加入青霉素筛选出来的菌可能是含有重组质粒的大肠杆菌,也可能是含空载质粒的大肠杆菌,C错误;完成转化的大肠杆菌是带有目的基因的大肠杆菌,目的基因的插入破坏了LacZ 基因,因此,完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生白色斑菌落,D错误。
10.(1)DNA 的半保留复制 变性 引物 4和引物5
(2)2 启动子、终止子
(3)无色物质K
(4)HSA基因在转基因植物细胞中不一定转录,也不一定翻译
(5)抗人血清白蛋白的抗体
[解析] (1)PCR是一项体外扩增DNA的技术,其原理是DNA 的半保留复制;每个循环都包括变性(90 ℃以上)、复性(50 ℃左右)和延伸(72 ℃左右)三步,其中温度最高的步骤为变性;引物需要与模板的3'端结合,据题图甲分析,若要扩增出只含有内含子2和外显子3的DNA片段,应选择的引物是引物 4和引物5。(2)为避免反向连接和自身环化,需要用2种限制酶对目的基因和Ti质粒进行切割;一个重组Ti质粒的组成,除题图中所示(标记基因、目的基因、限制酶切割位点)外,还必须包含启动子、终止子,以保证转录的正常进行。(3)分析题意可知,报告基因表达的产物能催化无色物质K反应生成蓝色物质,故过程①除尽农杆菌后,需将植物细胞转接到含无色物质K的培养基上筛选出转化成功的细胞。(4)基因指导蛋白质的合成包括转录和翻译过程,HSA基因在转基因植物细胞中不一定转录,也不一定翻译,故检测发现HSA基因成功导入植物受体细胞,但仍不能确定转基因水稻是否培育成功。(5)抗原与抗体的结合具有特异性,为检测HSA基因的表达情况,可提取受体细胞中的蛋白质,与抗人血清白蛋白的抗体进行抗原—抗体杂交实验。
11.(1)
(2)TAGAATTCAG 10×m×210
(3)不是 在农杆菌中导入两个改造后的Ti质粒,一个质粒上含T-DNA(结合有目的基因)却不含Vir基因,另一个质粒上仅含Vir基因却不含T-DNA(或利用一个质粒上的Vir基因诱导另一个质粒上的T-DNA转移)
[解析] (1)据表格数据可知,EcoR Ⅰ切割质粒后的片段长度为160 kb,说明该酶在质粒上只有一个酶切位点且质粒长度为160 kb。Mbo Ⅰ 酶切割质粒后的片段长度为35 kb、125 kb,说明该酶在质粒上有两个酶切位点。同时用EcoR Ⅰ 和Mbo Ⅰ 切割质粒后获得的片段长度为35 kb、55 kb、70 kb,说明EcoR Ⅰ 的切割位点位于Mbo Ⅰ 切割后两个片段中的长片段上。EcoR Ⅰ 、Mbo Ⅰ 和Hind Ⅲ 同时切割质粒后获得的片段长度为35 kb、55 kb、35 kb、35 kb,说明Hind Ⅲ 有一个切割位点,且该位点刚好在EcoR Ⅰ 和Mbo Ⅰ 同时切割时得到的长度为70 kb的片段中点。综合以上分析,三种酶的切割位点在质粒上的定位见答案。(2)据图Ⅱ可知,甲链和乙链是互补链,非限制性引物与乙链互补,故甲链与非限制性引物碱基序列相同。ssDNA是指以非限制性引物引导合成的单链DNA,非限制性引物与对应的甲链碱基序列相同,故获得的ssDNA对应的部分碱基序列也为5'-……TAGAATTCAG……-3'。PCR反应体系中原来有m个模板DNA,故循环10次后,产物为m×210个DNA。后10个循环是以前10次循环的产物为模板,因合成的是单链DNA,每个产物消耗一个非限制性引物,故后10个循环中需要非限制性引物数目为10×m×210个。(3)依题意,Vir区的Vir基因表达出Vir蛋白,在Vir蛋白引导下,新合成的T-DNA单链转移到植物细胞的染色体上。因此,Vir基因不一定要与T-DNA在同一质粒上,只要Vir基因表达的蛋白质能对新合成的T-DNA单链起作用就行。依题意,农杆菌中存在的天然Ti质粒相对分子质量往往较大,在基因工程中,导入农杆菌的成功率较低。基于以上的分析,可以在农杆菌中导入两个改造后的Ti质粒,一个质粒上含T-DNA(结合有目的基因)却不含Vir基因,另一个质粒上仅含Vir基因却不含T-DNA,即利用一个质粒(Ti协助质粒)上的Vir基因诱导另一个质粒(微型Ti质粒)上的T-DNA转移,通过这种办法,降低改造后的质粒的相对分子质量,提高农杆菌转化的成功率。课时作业(五十四) 基因工程的基本工具和基本操作程序
题组一 重组DNA技术的基本工具
1.[2024·陕西西安期末] 在基因工程的操作中,需要三种工具,分别是“分子手术刀”“分子缝合针”和“分子运输车”,关于这三种工具的叙述,正确的是 ( )
A.“分子手术刀”指的是限制性内切核酸酶,可以断开DNA和RNA的磷酸二酯键
B.“分子缝合针”指的是DNA聚合酶,可以催化生成磷酸二酯键
C.“分子运输车”指的是载体,常用的载体有质粒、动植物病毒和噬菌体
D.所有载体的化学本质一定是核酸
2.[2024·湖北武汉期末] 某细菌DNA分子上有4个Sau3A Ⅰ 的酶切位点,经 Sau3A Ⅰ 处理后会形成4个大小不同的DNA片段。若是用 BamH Ⅰ 处理,则只会形成2个大小不同的DNA片段。Sau3A Ⅰ和BamH Ⅰ的识别序列及切割位点如表所示。下列叙述错误的是 ( )
限制酶名称 识别序列及切割位点
BamH Ⅰ ↓ GGATCC
Sau3A Ⅰ ↓ GATC
A.若用两种酶共同处理,会形成6个大小不同的DNA片段
B.上述两种限制酶切割后可形成相同的黏性末端
C.该DNA 分子上有两个BamH Ⅰ 的酶切位点
D.该细菌 DNA 分子是环状的
3.[2024·广东广州期末] 研究表明,DNA 连接酶能够封闭DNA双螺旋骨架上的切口(图甲),却无法封闭缺口(图乙),下列相关叙述正确的是 ( )
A.DNA 连接酶的封闭是指催化核糖核苷酸之间磷酸二酯键的形成
B.DNA 单链发生缺失,在DNA 聚合酶作用下沿缺口3'→5'方向修复
C.DNA 连接酶可以将来源不同的DNA片段拼接成新的 DNA 分子
D.DNA 连接酶封闭切口时,需要识别DNA 片段特定的核苷酸序列
4.[2024·福建厦门模拟] BamH Ⅰ、Mbo Ⅰ、SmaⅠ三种限制酶的识别序列和切割位点依次为↓ 5'-GGATCC-3'、↓ 5'-GATC-3'、↓5'-CCCGGG-3'。下图表示某DNA片段的部分碱基序列,已知其余序列不含这三种限制酶的识别序列。下列叙述正确的是 ( )
A.若用Sma Ⅰ 完全切割该DNA,则其产物的长度为634 bp、896 bp、758 bp
B.若虚线方框内的碱基对被T—A替换,则用SmaⅠ 完全切割该DNA可产生3种片段
C.若用Mbo Ⅰ 和BamH Ⅰ 切割DNA,可形成相同的黏性末端
D.用SmaⅠ 切割DNA产生的片段,不可用E.coliDNA连接酶重新将其连接
题组二 基因工程的基本操作程序
5.除草剂的有效成分草甘膦能够专一性抑制EPSP合酶的作用,从而使植物体内多种代谢途径受影响而导致植物死亡,草甘膦除掉杂草的同时也会使作物受损,培育抗草甘膦的作物是解决办法之一。下列关于转入外源 EPSP 合酶基因使矮牵牛抗草甘膦流程的叙述正确的是 ( )
A.可以通过mRNA在逆转录酶的作用下构建DNA,从而获取EPSP合酶基因
B.用限制酶和DNA连接酶处理目的基因和 Ti质粒,仅涉及磷酸二酯键的断裂和形成
C.基因表达载体组件中的起始密码子是RNA 聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录
D.农杆菌的转化使受体植物细胞都能培育成转基因植株
6.[2025·山东临沂月考] CRISPR/Cas9是一种高效的基因组编辑技术,Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA(SgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术的工作原理如图所示,下列叙述错误的是 ( )
A.过程①中,插入特定SgRNA编码序列的DNA时需要用到DNA连接酶
B.过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是农杆菌转化法
C.过程④中,SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,遵循了碱基互补配对的原则
D.过程⑤中,Cas9蛋白可切割目标DNA特定核苷酸序列
7.[2025·四川成都月考] 某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α-淀粉酶基因(amy)的融合基因(dsred2-amy),其过程如图所示,其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是 ( )
A.利用PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链
B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D.杂交链延伸得到 dsred2-amy融合基因的过程不需要加引物
8.[2024·江西南昌模拟] 普通棉花中β-甘露糖苷酶(GhMnaA2)基因表达出的GhMnaA2能催化半纤维素降解,使棉纤维长度变短。为了培育长绒棉,科研人员构建了反义GhMnaA2基因表达载体(将正义GhMnaA2基因与载体反向连接),获得了转基因长绒棉新品种,具体过程如图所示。用Sma Ⅰ和Not Ⅰ切割某正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段。下列叙述正确的是 ( )
注:→表示启动子的启动方向,LB、RB分别表示T-DNA的左右边界。
A.正义GhMnaA2基因的转录方向是B→A
B.①过程所得到的表达载体均为反义表达载体
C.反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度
D.用Not Ⅰ 切割反义表达载体获得的DNA片段的长度为21 kb和87 kb
9.[2024·浙江金华模拟] 大肠杆菌的质粒上含有青霉素抗性基因和LacZ 基因,LacZ 基因编码的产物β-半乳糖苷酶能催化无色的Xgal生成蓝色沉淀,使菌落呈现蓝色,目的基因插入 LacZ基因中则菌落呈现白色,该过程称为蓝白斑筛选。下列叙述正确的是( )
A.蓝白斑筛选属于个体水平上的操作
B.CaCl2溶液处理的大肠杆菌能吸收周围DNA从而完成转化
C.平板中加入青霉素筛选出的都是成功导入重组质粒的大肠杆菌
D.将完成转化的大肠杆菌涂布到平板上将产生蓝色斑菌落
综合应用练
10.[2024·辽宁大连一模] 从健康人的血浆中分离提取的人血清白蛋白(HSA)在临床上需求量很大,具有重要的医用价值。研究人员将HSA基因转入水稻细胞中,培育转基因植物。图甲为HSA基因的部分片段,图乙是获得转基因植物的流程图,其中报告基因表达的产物能催化无色物质K反应生成蓝色物质。据图回答下列问题:
注:外显子指基因中编码蛋白质的片段,内含子指基因中不编码蛋白质的片段。
(1)科研人员获取HSA基因后,可用PCR技术进行扩增,该技术的原理是 ,操作的每个循环都包括变性、复性和延伸三步,其中温度最高的步骤为 。据图甲分析,若要扩增出只含有内含子2和外显子3的DNA片段,应选择的引物是 。
(2)构建重组Ti质粒过程中,为了保证连接的准确性,需要选择 种限制酶对目的基因和Ti质粒进行切割。一个重组Ti质粒的组成,除图中所示外,还必须包含 等。
(3)过程①中需将植物细胞与农杆菌混合培养,旨在使T-DNA进入植物细胞;除尽农杆菌后,需将植物细胞转接到含 的培养基上筛选出转化成功的细胞。
(4)检测发现HSA基因成功导入植物受体细胞,但仍不能确定转基因水稻是否培育成功,理由是 。
(5)为检测HSA基因的表达情况,可提取受体细胞中的蛋白质,与 进行抗原—抗体杂交实验。
11.[2025·重庆沙坪坝区月考] 农杆菌中存在的天然Ti质粒相对分子质量往往较大,在基因工程中,导入农杆菌的成功率较低。因此,需对天然Ti质粒进行测序并改造,以提高农杆菌转化法的成功率。请回答下列问题:
(1)对DNA进行测序,需将限制酶的切割位点在DNA上定位,即进行限制酶图谱的构建。科研人员用不同限制酶单独或联合切割某天然Ti质粒,所用限制酶种类及切割后的DNA片段长度如下表所示。请在图 Ⅰ 的质粒上画出EcoR Ⅰ、Mbo Ⅰ、Hind Ⅲ的切割位点并标出酶切位点间的长度:
组别 添加限制酶 DNA片段长度 (1 kb=1000个碱基对)
① EcoR Ⅰ 160 kb
② Mbo Ⅰ 35 kb、125 kb
③ EcoR Ⅰ+Mbo Ⅰ 35 kb、55 kb、70 kb
④ EcoR Ⅰ+Mbo Ⅰ+Hind Ⅲ 35 kb、55 kb、35 kb、35 kb
(2)对Ti质粒进行测序可使用不对称PCR技术,“不对称”体现在一对引物的含量上。含量较少的引物称作限制性引物,较多的称作非限制性引物。假设在PCR的最初10个循环中,扩增产物是双链DNA,当限制性引物消耗完后,在非限制性引物作用下会产生大量的单链DNA(ssDNA)。若图 Ⅱ 中甲链的部分碱基序列为5'-……TAGAATTCAG……-3',则获得的ssDNA对应的部分碱基序列为5'-…… ……-3'。若PCR反应体系中原来有m个模板DNA,经10个循环消耗完限制性引物后继续扩增10个循环,后10个循环中需要非限制性引物 个。
(3)Ti质粒上有Vir区和T-DNA区,Vir区决定T-DNA的转移。受伤植物伤口分泌的酚类物质可诱导Vir基因的表达,进而诱导Ti质粒产生一条新的T-DNA单链分子,T-DNA单链分子从Ti质粒上脱离后,在Vir蛋白的引导下穿过植物细胞并随机整合到其染色体DNA上。从农杆菌转化植物细胞的机制分析,Vir基因与T-DNA在同一质粒上 (填“是”或“不是”)成功转化的必备条件,基于以上分析,提出一个提高农杆菌转化成功率的思路: 。
