微专题9 PCR中的引物和计算
一、(1)2 引物与DNA模板链通过碱基互补配对结合,使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,从而延伸DNA子链 (2)引物 (3) Ⅱ 、 Ⅲ
[解析] 由于DNA子链从5'端向3'端延伸,引物需要互补结合在模板链的3'端,即—OH端,则据图分析,选择的引物是 Ⅱ 、 Ⅲ 。
● 典型例题
1.A [解析] 引物结合在模板链的3'端,通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3,A正确;引物结合在模板链的3'端,检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物2 和引物4进行PCR,B错误;若设计的引物与模板不完全配对,可适当降低 PCR 复性的温度,以便引物与模板链结合,C错误;DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的3'端连接脱氧核苷酸,D错误。
2.(1)四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐高温的DNA聚合酶、(含Mg2+的)缓冲液
(2)引物特异性较低或混入了其他模板DNA 1和引物4 2和引物3
[解析] (1)PCR反应体系中应包含模板、引物、四种脱氧核苷酸(dNTP)、耐高温的DNA聚合酶、(含Mg2+的)缓冲液。(2)根据题意可知,利用题图所示4种可与Va基因结合的引物扩增,结果无论是哪对引物均扩增出了除Va基因外的其他DNA片段,原因可能是引物特异性较低或混入了其他模板DNA,导致扩增出了非目的DNA片段。在利用现有引物的前提下,为尽可能减少非目的DNA片段的产生,可以先使用引物1和引物4扩增,若扩增出的DNA片段是目的DNA片段,则再次以初次扩增产物为模板,并加入引物2和引物3进行第二次扩增,将成功扩增出目的DNA片段;若初次扩增的DNA片段是非目的DNA片段,则加入引物2和引物3进行第二次扩增时将可能扩增不出目的DNA片段。
二、激活耐高温的DNA聚合酶(或激活TaqDNA聚合酶) ①引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 局部发生碱基互补配对而失效 ②引物 Ⅰ '自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
[解析] 在PCR的过程中,需要在缓冲液中添加 Mg2+, Mg2+能激活耐高温的DNA聚合酶。①分析题图中引物可知,第1组引物中引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 的部分碱基之间存在互补配对关系,这可能会导致引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 发生局部碱基互补配对而失效;②第2组引物中引物 Ⅰ '自身存在互补配对关系,折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
● 典型例题
3.能与DNA母链碱基互补配对;两种引物之间不能构成碱基互补配对;引物的5'端应具有限制酶酶切位点 5'端
[解析] 引物设计的要求:①能与DNA母链碱基互补配对;②两种引物之间不能构成碱基互补配对;③引物的5'端应该有限制酶酶切位点等。
4.引物2和引物3 引物过短,则会导致引物特异性太弱,出现非特异性扩增,非目标产物增多
[解析] 引物需要互补结合在模板链的3'端,因此利用PCR 获得 Ech基因时应选择的两种引物是引物2和引物3;引物过短,则会导致引物特异性太弱,出现非特异性扩增,非目标产物增多,故引物核苷酸序列不宜过短。
三、(1)B、C 3 30 (2)7/8 5 8
[解析] (1)已知DNA扩增时总是从子链的5'端向3'端延伸,由题图可知,5'端对应的引物分别是B和C。至少要3个循环才能分离出双链等长的目的基因片段。PCR体外扩增DNA时,每条链都需要一个引物,所以循环n次,产生2n个DNA,去除原来的模板,即需要的引物数目为(2n-1)×2。循环四次共需要的引物数目为(24-1)×2=30。(2)PCR过程与细胞内的DNA复制过程类似,复制4次后,产生的DNA总数为16,有2个DNA分子中含有原来的母链,其他的DNA都同时含有两种引物,所以同时含有两种引物的DNA占总数的14/16,即7/8。复制过程中部分DNA片段如图所示:
第一次复制得到两个、两种类型的DNA片段:①和②;第二次复制得到四个、四种类型的DNA片段:①复制得①和③、②复制得②和④;第三次复制得到八个、五种类型的DNA片段:①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤;第四次复制得到十六个、五种类型的DNA片段:①复制得①和③、②复制得②和④、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤复制得4个⑤。所以,经过四轮复制后,共有5种不同种类的DNA片段,8个等长目的基因。
● 典型例题
5.D [解析] 根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断,②链从 L 到 R 的方向为 5'→3',题图中①②链均可作为子链合成的模板,A错误;PCR 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链,也并非边解旋边复制,B错误;以 1 个 DNA 分子为模板经 3 次循环产生的DNA分子数目为23=8,则需消耗引物③的数目为(8×2-2)÷2=7,C错误;引物③的 5'端添加了某序列,至少需经 2 次循环才可获得该序列的双链DNA产物,D正确。
6.5'-CTGGGCATGG-3' 22
[解析] 由题干信息可知,引物1(5'-ATTCCATATC-3')与3'-TAAGGTATAG……GGTACGGGTC-5'链的3'端相连,则引物2应与3'-TAAGGTATAG……GGTACGGGTC-5'的互补链的3'端相连,根据碱基互补配对原则,则引物2为5'-CTGGGCATGG-3',使用这两种引物对一个M基因进行扩增,经5轮PCR循环后,如⑤所示的DNA分子(脱氧核苷酸链等长的DNA分子)有(25-2×5)个,即22个。微专题9 PCR中的引物和计算
一、选择合适的引物
请回答基因工程方面的有关问题:
(1)若用PCR技术扩增psy基因,需要在PCR扩增仪中加入 种引物,其作用是
。
(2)在利用PCR技术扩增某基因过程中,利用 可寻找该基因的位置。
(3)研制疫苗时,获取S蛋白基因(如图所示)选择的引物是 。
(1)引物的作用:引物需要互补结合在模板链的3'端,为DNA聚合酶提供结合位点,使子链得以从5'端向3'端延伸。
(2)种类:2种;为了保证基因的两条反向平行的链都可以做模板,需要2种引物。
(3)结果:随PCR扩增的次数增加,2种引物中间的序列会被大量重复拷贝,进而方便后续的技术应用。
(4)应用
①合适的引物可仅扩增目的基因序列,能用于基因工程中目的基因的获取、检测和鉴定。
②不同的引物可结合不同的目的基因并进行扩增,能用于待测个体基因型的鉴定。
③引物序列与模板链的个别序列错配,依然可以获得PCR的扩增产物,能用于基因的定点诱变。
1.[2025·广东揭阳月考]利用PCR获得目的基因后,用限制酶EcoRⅠ同时处理目的基因与质粒,拼接后可得到重组基因表达载体,其部分DNA片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是()
A.通过PCR获取目的基因时,所选的引物可为引物2和引物3
B.检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时,应选用引物1和引物4进行PCR
C.若设计的引物与模板不完全配对,为了引物能与模板链结合可适当提高PCR复性的温度
D.DNA聚合酶能与引物结合,并从引物的5'端连接脱氧核苷酸
2.[2024·湖南衡阳三模]真核生物转录起始过程十分复杂,RNA聚合酶往往需要与一类特定的蛋白质结合,并在其引导下与启动子结合起始转录,我们将这类蛋白称作转录因子。某科研团队在对山葡萄的研究过程中发现其Va基因具有编码转录因子的作用,并对此展开研究。
(1)研究人员欲利用PCR技术从山葡萄基因组DNA中提取并扩增Va基因,除基因组DNA和引物外还需向PCR仪中加入 。
(2)研究人员设计并合成如图所示4种可与Va基因结合的引物,结果无论是哪对引物,除扩增出Va基因外,还扩增出了其他DNA片段,原因可能是 。在利用现有引物的前提下,为尽可能减少非目的DNA片段的产生,可先加入引物 进行初次扩增,再以初次扩增产物为模板,并加入引物 进行第二次扩增。
二、PCR引物设计原则
利用PCR技术对除草剂抗性基因G进行复制的过程中,需要在缓冲液中添加Mg2+,其作用是 。设计引物是该技术关键步骤之一,某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如图),请分别说明理由。
①第1组: ;②第2组: 。
设计引物的主要原则
①引物长度通常为20~30个核苷酸,可防止随机结合。
②两个引物之间不能有连续4个碱基的互补配对,否则加入的引物自身形成双链以至于得不到目的基因片段。
③某一引物自身不能有大于4个碱基的反向重复序列或自身互补序列的存在,否则自身折叠出现局部碱基互补配对。
④为构建合适酶切位点,常常需要在2种引物的5'端添加不同的限制酶的识别序列。
⑤设计的引物在合成之前,要在DNA数据库中进行BLAST检测,以确保引物中的序列只在所扩增的基因中出现,而与其他基因不具有互补性。
⑥PCR反应时复性温度和时间均与引物的序列有关,长度相同但G、C含量高,则需设定较高的复性温度。
3.进行PCR前,根据已知的模板DNA序列,可设计合成内外引物对,引物设计的要求有 (答出两点即可);同时,为方便扩增产物后续的操作,可在引物的 (填“5'端”或“3'端”)添加限制性内切核酸酶切割位点。
4.[2024·四川遂宁一模]如图所示的引物1~4中,利用PCR获得Ech基因时应选择的两种引物是 。引物核苷酸序列不宜过短,其原因是 。
三、PCR扩增过程中的相关计算
玉米是重要的粮食作物,其叶片细胞中的P蛋白是一种水通道蛋白,由P基因编码;科研人员成功培育出超量表达P蛋白的转基因玉米,回答下列问题。
(1)利用PCR技术以图中的DNA片段为模板扩增P基因,需要的引物有 (从A、B、C、D中选择)。上述过程中,至少经过 次循环后会产生双链等长的P基因片段,循环4次共需要的引物数为 。
(2)从理论上推测,第四轮循环产物中同时含有两种引物的DNA片段所占的比例为 。经4轮循环后产物中有 种不同种类的DNA分子,其中只含等长目的基因的DNA分子有 个。
1.熟悉PCR的过程图
2.PCR中的数量关系(假设两种引物均在模板DNA的中段)
循环次数 1 2 3 n
DNA 分子数 2 4 8 2n
含引物A (或B)的 DNA分子数 1 3 7 2n-1
同时含引 物A、B的 DNA分子数 0= 21-2 2= 22-2 6= 23-2 2n-2
(续表)
循环次数 1 2 3 n
共消耗的 引物数量 2=21+1 -2 6=22+1 -2 14=23+1 -2 2n+1-2
两条链等 长的DNA 分子数 0 0 2=23- 2×3 2n- 2n
DNA 分子种类 2 4 5=4+1 5
5.[2024·福建厦门模拟]下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,L、R表示方向。下列叙述正确的是()
A.②链从L到R的方向为3'→5',①②链均可作为子链合成的模板
B.PCR过程需要通过解旋酶断开氢键,且为边解旋边复制
C.以1个DNA分子为模板经3次循环需消耗8个引物③
D.引物③的5'端添加了某序列,至少需经2次循环才可获得该序列的双链产物
6.[2024·湖南郴州模拟]利用PCR技术扩增M基因时,相应的引物结合部位及扩增片段(①~⑤)如图所示。已知M基因单链片段为3'-TAAGGTATAG……GGTACGGGTC-5',引物1为5'-ATTCCATATC-3',则引物2为 (写出10个碱基)。使用这两种引物对一个M基因进行扩增,经5轮PCR循环后,如⑤所示的DNA分子有 个。(共30张PPT)
微专题9
PCR中的引物和计算
一、选择合适的引物
二、引物设计原则
三、扩增过程中的相关计算
一、选择合适的引物
请回答基因工程方面的有关问题:
（1）若用技术扩增基因,需要在 扩增仪中加入___种引物,
其作用是____________________________________________________
___________________________________________________。
2
引物与模板链通过碱基互补配对结合，使聚合酶能够从引物的端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸子链
（2）在利用 技术扩增某基因过程中,利用______可寻找该基因的
位置。
引物
（3）研制疫苗时,获取 蛋白基因（如图所示）选择的引物是__________。
Ⅱ 、 Ⅲ
[解析] 由于子链从端向 端延伸,引物需要互补结合在模板链
的端,即 端,则据图分析,选择的引物是 Ⅱ 、 Ⅲ 。
（1）引物的作用:引物需要互补结合在模板链的端,为 聚合酶提
供结合位点,使子链得以从端向 端延伸。
（2）种类:2种;为了保证基因的两条反向平行的链都可以做模板,需要2
种引物。
（3）结果:随 扩增的次数增加,2种引物中间的序列会被大量重复拷
贝,进而方便后续的技术应用。
[归纳总结]
（4）应用
①合适的引物可仅扩增目的基因序列,能用于基因工程中目的基因的获
取、检测和鉴定。
②不同的引物可结合不同的目的基因并进行扩增,能用于待测个体基因
型的鉴定。
③引物序列与模板链的个别序列错配,依然可以获得 的扩增产物,能
用于基因的定点诱变。
1.[2025·广东揭阳月考] 利用 获得目的基
因后，用限制酶 Ⅰ 同时处理目的基因与
质粒，拼接后可得到重组基因表达载体，其
部分 片段如下图所示。下列有关引物的分析正确的是( )
A.通过 获取目的基因时，所选的引物可为引物2和引物3
B.检测目的基因是否插入质粒且方向是否正确时，应选用引物1 和引
物4进行
C.若设计的引物与模板不完全配对，为了引物能与模板链结合可适当
提高 复性的温度
D.聚合酶能与引物结合，并从引物的 端连接脱氧核苷酸
√
[解析] 引物结合在模板链的 端，
通过 获取目的基因时，所选
的引物可为引物2和引物3，A正
确；引物结合在模板链的 端，检测目的基因是否插入质粒且方向
是否正确时，应选用引物2 和引物4进行 ，B错误；若设计的引
物与模板不完全配对，可适当降低 复性的温度，以便引物与模
板链结合，C错误；聚合酶能与引物结合，并从引物的 端连接
脱氧核苷酸，D错误。
2.[2024·湖南衡阳三模] 真核生物转录起始过程十分复杂， 聚合酶
往往需要与一类特定的蛋白质结合，并在其引导下与启动子结合起始
转录，我们将这类蛋白称作转录因子。某科研团队在对山葡萄的研究
过程中发现其 基因具有编码转录因子的作用，并对此展开研究。
（1）研究人员欲利用技术从山葡萄基因组中提取并扩增 基
因，除基因组和引物外还需向 仪中加入___________________
_______________________________________________。
四种脱氧核苷酸、耐高温的聚合酶、（含的）缓冲液
[解析] 反应体系中应包含模板、引物、四种脱氧核苷酸 、
耐高温的聚合酶、（含 的）缓冲液。
（2）研究人员设计并合成如图所示4种可与 基因结合的引物，结果
无论是哪对引物，除扩增出基因外，还扩增出了其他 片段，原
因可能是____________________________________。在利用现有引物
的前提下，为尽可能减少非目的 片段的产生，可先加入引物____
______进行初次扩增，再以初次扩增产物为模板，并加入引物______
____进行第二次扩增。
引物特异性较低或混入了其他模板
1和引物4
2和引物3
[解析] 根据题意可知，利用题图所示4
种可与 基因结合的引物扩增，结果
无论是哪对引物均扩增出了除基因外的其他 片段，原因可能是引物特异性较低或混入了其他模板，导致扩增出了非目的 片段。在利用现有引物的前提下，为尽可能减少非目的 片段的产生，可以先使用引物1和引物4扩增，若扩增出的片段是目的 片段，则再次以初次扩增产物为模板，并加入引物2和引物3进行第二次扩增，将成功扩增出目的片段；若初次扩增的片段是非目的 片段，则加入引物2和引物3进行第二次扩增时将可能扩增不出目的 片段。
二、 引物设计原则
利用技术对除草剂抗性基因 进行复制的过程中，需要在缓冲液中
添加 ，其作用是__________________________________________
______。设计引物是该技术关键步骤之一，某同学设计的两组引物
（只标注了部分碱基序列）都不合理（如图），请分别说明理由。
激活耐高温的聚合酶（或激活聚合酶）
①第1组：____________________________________________；②第2
组：______________________________________________。
引物 Ⅰ 和引物 Ⅱ 局部发生碱基互补配对而失效
引物 Ⅰ自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
[解析] 在的过程中，需要在缓冲液中添加， 能激活
耐高温的 聚合酶。①分析题图中引物可知，第1组引物中引物 Ⅰ
和引物 Ⅱ 的部分碱基之间存在互补配对关系，这可能会导致引物 Ⅰ
和引物 Ⅱ 发生局部碱基互补配对而失效；②第2组引物中引物 Ⅰ 自
身存在互补配对关系，折叠后会因出现局部碱基互补配对而失效。
设计引物的主要原则
①引物长度通常为个核苷酸,可防止随机结合。
②两个引物之间不能有连续4个碱基的互补配对,否则加入的引物自身
形成双链以至于得不到目的基因片段。
③某一引物自身不能有大于4个碱基的反向重复序列或自身互补序列
的存在,否则自身折叠出现局部碱基互补配对。
[方法总结]
④为构建合适酶切位点,常常需要在2种引物的 端添加不同的限制酶
的识别序列。
⑤设计的引物在合成之前,要在数据库中进行 检测,以确保引
物中的序列只在所扩增的基因中出现,而与其他基因不具有互补性。
反应时复性温度和时间均与引物的序列有关,长度相同但 、C含
量高,则需设定较高的复性温度。
3.进行前，根据已知的模板 序列，可设计合成内外引物对，
引物设计的要求有____________________________________________
_________________________________________________（答出两点
即可）；同时，为方便扩增产物后续的操作，可在引物的_____
（填“端”或“ 端”）添加限制性内切核酸酶切割位点。
能与母链碱基互补配对；两种引物之间不能构成碱基互补配对；引物的端应具有限制酶酶切位点
端
[解析] 引物设计的要求：①能与 母链碱基互补配对；②两种引
物之间不能构成碱基互补配对；③引物的 端应该有限制酶酶切位
点等。
4.[2024·四川遂宁一模] 如图所示的引物中，利用获得
基因时应选择的两种引物是______________。引物核苷酸序列不宜过
短，其原因是________________________________________________
_____________________。
引物2和引物3
引物过短，则会导致引物特异性太弱，出现非特异性扩增，非目标产物增多
[解析] 引物需要互补结合在模板链的端，因此利用获得
基因时应选择的两种引物是引物2和引物3；引物过短，则会导致引
物特异性太弱，出现非特异性扩增，非目标产物增多，故引物核苷
酸序列不宜过短。
三、 扩增过程中的相关计算
玉米是重要的粮食作物,其叶片细胞中的蛋白是一种水通道蛋白,由 基
因编码;科研人员成功培育出超量表达 蛋白的转基因玉米,回答下列问题。
（1）利用技术以图中的 片
段为模板扩增 基因,需要的引物有
______（从A、B、C、D中选择）。
B、
3
30
[解析] 已知扩增时总是从子链的端向端延伸,由题图可知,
端对应的引物分别是B和C。至少要3个循环才能分离出双链等长的
目的基因片段。体外扩增 时,每条链都需要一个引物,所以循
环次,产生个 ,去除原来的模板,即需要的引物数目为
。循环四次共需要的引物数目为 。
上述过程中,至少经过___次循环后会产生双链等长的 基因片段,循环4
次共需要的引物数为____。
（2）从理论上推测,第四轮循环产物中同时含有两种引物的 片段
所占的比例为_____。经4轮循环后产物中有___种不同种类的 分
子,其中只含等长目的基因的 分子有___个。
5
8
[解析] 过程与细胞内的 复制过程类似,复制4次后,产生的
总数为16,有2个分子中含有原来的母链,其他的 都同时
含有两种引物,所以同时含有两种引物的占总数的,即 。
复制过程中部分 片段如图所示：
第一次复制得到两个、两种类型的 片段:①和②;第二次复制得到四个、四种类型的 片段:①复制得①和③、②复制得②和④;第三次复制得到八个、五种类型的 片段:①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤;第四次复制得到十六个、五种类型的 片段:①复制得①和③、②复制得②和④、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤复制得4个⑤。所以,经过四轮复制后,共有5种不同种类的 片段,8个等长目的基因。
1.熟悉 的过程图
[方法总结]
2.中的数量关系（假设两种引物均在模板 的中段）
循环次数 1 2 3
2 4 8
1 3 7
循环次数 1 2 3
共消耗的引物数量
0 0
2 4 5
（续表）
5.[2024·福建厦门模拟] 下图表示 过程中某个阶段反应体系的情况,
、 表示方向。下列叙述正确的是( )
A.②链从到的方向为, 链均可作为子链合成的模板
B. 过程需要通过解旋酶断开氢键,且为边解旋边复制
C.以1个 分子为模板经3次循环需消耗 8 个引物③
D.引物③的 端添加了某序列,至少需经2次循环才可获得该序列的双
链产物
√
[解析] 根据 分子中两条
链的反向平行关系可判断,②
链从到的方向为 , 题图中①②链均可作为子链合成的模板,A
错误; 过程需要通过高温处理使双链中氢键断裂成为单链,也并非
边解旋边复制，B错误;以 1 个 分子为模板经 3 次循环产生的
分子数目为,则需消耗引物③的数目为 ,
C错误;引物③的 端添加了某序列,至少需经 2 次循环才可获得该序
列的双链 产物, D正确。
6.[2024·湖南郴州模拟] 利用技术扩增 基因时，相应的引物结合
部位及扩增片段~如图所示。已知 基因单链片段为
，引物1为
，则引物2为______________________
（写出10个碱基）。使用这两种引物对一个 基因进行扩增，经5轮
循环后，如⑤所示的 分子有____个。
[解析] 由题干信息可知，引物 与
链的 端相连，则引物2应
与的互补链的 端相连，
根据碱基互补配对原则，则引物2为 ，使用这
两种引物对一个基因进行扩增，经5轮 循环后，如⑤所示的
分子（脱氧核苷酸链等长的分子）有 个，即22个。
