微专题10 几种常见PCR技术的原理
1.(1)引物4和引物5 BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ 当外源DNA入侵时,原核生物利用限制酶来切割外源DNA,使之失效,以保证自身安全 (2)逆转录酶 变性
(3)易于进行大规模培养、易于进行蛋白产物的收集
[解析] (1)引物应与模板链的3'端碱基互补配对,故引物1、引物2、引物7和引物8不合适,扩增得到的RBD蛋白基因也应该含有多个限制酶的酶切位点,故引物3和引物6不合适,所以应选择引物4和引物5。质粒上没有Sma Ⅰ 酶的酶切位点,且Sma Ⅰ 酶的酶切位点位于RBD蛋白基因内部,所以不选Sma Ⅰ 进行切割;若使用EcoR Ⅰ 进行切割,易造成目的基因和质粒自身环化;所以选择的限制酶是BamH Ⅰ 和Hind Ⅲ 。原核生物容易受外源DNA的入侵,所以在长期进化过程中形成了一套完善的防御机制,限制酶是原核生物的一种防御性工具,当外源DNA入侵时,原核生物利用限制酶来切割外源DNA,使之失效,以保证自身安全,防止外来病原物的危害。(2)以病毒RNA为模板合成cDNA属于逆转录过程,这一过程需要的酶是逆转录酶。PCR每次循环分为变性、复性、延伸三步,变性温度超过90 ℃,复性温度为50 ℃左右,延伸温度在72 ℃左右。(3)CHO细胞可贴壁培养、经过多次传代筛选后也可悬浮培养,属于成纤维细胞,本身很少分泌内源蛋白,由此推测制备重组疫苗的实验思路中用CHO细胞作为受体细胞的原因是该细胞易培养、易生长、易收获蛋白产物。
2.(1)②③ 2n-n-1 (2)含有定点突变的碱基并能与DNA模板链碱基互补配对 2 ② (3)5' Sma Ⅰ 和BamH Ⅰ
[解析] (1)所选引物应该把编码序列全部扩增在内,则所用的引物是②③。T4溶菌酶基因的两条链分别为a、b,引物②与a链结合,引物③与b链结合。每复制一次,以a链为模板复制出一条含有引物②的新链,且复制出的含此链的DNA不符合要求,则复制n次,形成n个不符合要求的DNA,另外含b链的DNA分子有1个且不符合要求,所以复制n次后,符合要求的DNA分子有(2n-n-1)个。(2)据图乙所示,突变上游引物对应的是DNA的拟突变位点,因此进行第一次PCR时所用的突变上游引物的合理设计是含有定点突变的碱基并能与DNA模板链碱基互补配对。经过第一次PCR扩增可以获得①,下游大引物是与①互补配对的DNA单链,需要再次进行PCR扩增才能获得,所以至少需要2次循环,才能获得相应的大引物。DNA复制的方向是从模板链的3'→5',对应的下游大引物是②。(3)对T4溶菌酶基因进行PCR扩增时,是从引物的5'端到3'端延伸子链,因此限制酶识别序列应在引物的5'端。构建重组DNA分子时,需要目的基因和质粒含有相同的黏性末端,结合图丙分析,若选择EcoR Ⅰ 切割,则会破坏质粒上的氨苄青霉素抗性基因,导致无法进行筛选,因此选择Sma Ⅰ 和BamH Ⅰ 。
3.(1)④②③⑤① 引物是根据该冠状病毒的核酸的一段已知序列设计合成的(或引物能与该冠状病毒核酸对应的cDNA特异性结合) (2)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,从而延伸DNA子链 使2个引物分别与互补的DNA单链结合,形成氢键 (3)耐高温的DNA聚合酶 5'→3' PCR产物
[解析] (2)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,只能从引物的3'端延伸DNA子链,因此在体外扩增目的基因时,需要根据目的基因的核苷酸序列人工合成两种引物。PCR过程中复性的作用是使2个引物分别与互补的DNA单链结合,形成氢键。(3)根据题干信息可知,PCR反应中,耐高温的DNA聚合酶的作用是催化子链延伸,同时还具有外切酶活性,可以沿着5'→3'方向将探针酶切,报告基团分离出来后会发出荧光,随着DNA扩增次数的增加,探针中的报告基团分离增多,荧光的强度增加,荧光信号的变化与PCR产物的形成完全同步。微专题10 几种常见PCR技术的原理
1.RT-PCR技术
(1)概念:以mRNA为模板进行的特殊的PCR。
(2)步骤:逆转录→cDNA→(常规PCR)扩增目的基因(见下图)。
(3)应用:检测目的基因的转录水平(表达)。
1.[2024·湖北武汉期末]研究人员发现,某种RNA病毒包膜表面的S蛋白能识别人体细胞膜表面的ACE2受体并导致病毒入侵人体细胞。现提出制备重组疫苗的思路:提取该种病毒的遗传物质→通过RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)技术扩增筛选RBD蛋白(S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分)基因(图甲)→构建基因表达载体→导入CHO细胞并培养→提取并纯化RBD蛋白→制成疫苗。回答下列问题:
(1)利用PCR扩增含有较多限制酶酶切位点的RBD蛋白基因时,应选择的引物是 。为提高目的基因和载体的正确连接效率,应选择的限制酶是 ;限制酶通常是从原核生物中分离纯化而来,限制酶存在于原核生物中的主要作用是 。
(2)RT-PCR技术的基本原理是先以病毒RNA为模板合成cDNA,这一过程需要的酶是 ;再通过PCR技术扩增相应的DNA片段。PCR过程每次循环分为3步,其中温度最高的一步是 。
(3)CHO细胞又称中国仓鼠卵巢细胞,可贴壁培养、经过多次传代筛选后也可悬浮培养。CHO细胞属于成纤维细胞,本身很少分泌内源蛋白,广泛应用于生物制药中重组蛋白的生产。由此推测制备重组疫苗的实验思路中用CHO细胞作为受体细胞的原因是 (答出1点即可)。
2.PCR定点突变技术
(1)概念:将某基因中的一个或几个特定的碱基对替换、增加或删除,导致基因中的部分碱基序列发生改变,实现基因的定点突变。
(2)两种方法
①重叠延伸PCR技术:该技术要使用四条引物。引物1和引物3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,且这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此,分别利用引物1和引物2,引物3和引物4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物1和引物3互补的碱基杂交在一起,它们再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA。最后,用引物2和引物4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检测定点突变是否成功。
②大引物PCR技术:需要用到三种引物进行两次PCR,这三种引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一次PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增,得到不完整的含有突变位点的DNA片段;第二次PCR利用第一次扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物,它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。该技术的流程如图所示:
(3)应用:实现基因的定点突变。
2.[2025·山东枣庄月考]天然T4溶菌酶由164个氨基酸构成,大多耐热性差,不利于工业化应用。我国学者借助PCR改造T4溶菌酶基因,并将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌,最终获得耐高温的T4溶菌酶。回答下列问题:
(1)研究发现T4溶菌酶的第3位异亮氨酸(密码子为AUU、AUC、AUA)变为半胱氨酸(密码子为UGU、UGC),该半胱氨酸可以与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫键,从而使T4溶菌酶的耐热性得到大幅度提升。科学家利用PCR定点突变技术对T4溶菌酶基因的编码序列进行改造(如图甲),要选择的图中的引物组合最好是 ,其中突变(含已替换碱基)引物为③,经过n轮复制之后,符合要求的DNA数是 。
甲
(2)科学家又发现若将第78位氨基酸由脯氨酸(密码子为CCU)替换为天冬氨酸(密码子为GAU),耐热性提升幅度更大。可运用大引物PCR技术进行定点突变,相关原理如图乙所示。进行第一次PCR时所用的突变上游引物需满足的条件是 ,至少需要 次循环,才能获得相应的大引物。用所获得的大引物、模板和其他引物等进行第二次PCR,要获得带有突变位点的、适于与质粒构建基因表达载体的改良基因,引物应选用大引物两条链中的 (填“①”或“②”)。
(3)为了使扩增后的T4溶菌酶基因能够与丙图中的质粒A正确连接,设计引物时需要在两种引物的 (填“3'”或“5'”)端连接上限制酶 的识别序列。
3.实时荧光定量PCR技术
(1)概念:通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,从而精确定量计算样品的初始模板量的方法。
(2)该技术最关键的是荧光标记方式,两种方法:
①SYBRGreenⅠ法:在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地渗入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
②TaqMan探针法:在PCR体系中每加入一对引物的同时,也加入一个与某条模板链互补的荧光探针,当上游引物与下游引物分别与模板链复性时,荧光基团标记的探针序列也与模板链复性。由于探针序列同时具有荧光淬灭基团(Q),故探针的荧光很弱。但是当子链延伸至探针时,耐高温的DNA聚合酶将探针5'端的荧光报告基团(R基团)酶切降解,荧光报告基团(R基团)脱离了荧光淬灭基团(Q基团)的抑制,发出荧光,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成,实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。(如图所示)
a.热变性
b.复性/探针与模板的杂交
c.延伸反应
(3)应用:实时精确测量每轮PCR产物的浓度。
3.[2024·湖南长沙二模]对某冠状病毒进行核酸检测其实就是对病毒的遗传物质RNA进行检测。目前主流方法为实时荧光RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)法。为检测某人是否感染了该冠状病毒,需要进行以下相关操作:①分析PCR扩增结果;②从组织样本中提取RNA;③RT(逆转录)成cDNA;④采集样本(咽拭子或鼻拭子);⑤利用PCR扩增DNA片段。回答下列问题:
(1)若要得到正确的核酸检测结果,正确的操作顺序应该是 (用数字序号表示)。核酸检测样本多采集于咽、鼻,这些部位存在多种微生物,提取物中核酸种类可能有多种,但通过PCR技术可专一地对该冠状病毒的核酸序列进行扩增,原因是 。
(2)操作⑤中,需设计2种引物,需要提供引物的原因是 ;复性时温度的设定是该步操作成败的关键,复性的作用是
。
(3)PCR扩增时,在加入引物的同时还需加入一个特异性荧光探针,其两端分别标记一个报告基团和一个淬灭基团,如图所示:
探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收; 在催化子链延伸时,还具有外切酶活性,它可以沿着 (填“5'→3'”或“3'→5'”)方向将探针酶切,使报告基团和淬灭基团分离,随着DNA扩增次数的增加,荧光的强度会逐渐增大,从而实现荧光信号的变化与 的形成完全同步。(共27张PPT)
微专题10
几种常见PCR技术的原理
1.技术
2.定点突变技术
3.实时荧光定量技术
1. 技术
（1）概念：以为模板进行的特殊的 。
（2）步骤：逆转录 （常规 ）扩增目的基因（见下图）。
（3）应用：检测目的基因的转录水平（表达）。
1.[2024·湖北武汉期末] 研究人员发现，
某种病毒包膜表面的 蛋白能识别人
体细胞膜表面的 受体并导致病毒入
侵人体细胞。现提出制备重组疫苗的思路：
提取该种病毒的遗传物质 通过
（逆转录聚合酶链式反应）技术
扩增筛选蛋白蛋白中真正与 结
合的关键部分基因（图甲） 构建基因表达载体 导入 细胞并
培养 提取并纯化蛋白 制成疫苗。回答下列问题：
（1）利用 扩增含有较多限制酶酶切
位点的 蛋白基因时，应选择的引物是
______________。为提高目的基因和载体
的正确连接效率，应选择的限制酶是
_________________；限制酶通常是从原
核生物中分离纯化而来，限制酶存在于原
核生物中的主要作用是________________
____________________________________
___________________________。
引物4和引物5
Ⅰ 和Ⅲ
当外源入侵时，原核生物利用限制酶来切割外源，使之失效，以保证自身安全
[解析] 引物应与模板链的 端碱基互补
配对，故引物1、引物2、引物7和引物8
不合适，扩增得到的 蛋白基因也应
该含有多个限制酶的酶切位点，故引物
3和引物6不合适，所以应选择引物4和
引物5。质粒上没有 Ⅰ 酶的酶切位
点，且 Ⅰ 酶的酶切位点位于 蛋
白基因内部，所以不选 Ⅰ 进行切割；若使用 Ⅰ 进行切割，
易造成目的基因和质粒自身环化；所以选择的限制酶是 Ⅰ 和
Ⅲ 。原核生物容易受外源 的
入侵，所以在长期进化过程中形成了一
套完善的防御机制，限制酶是原核生物
的一种防御性工具，当外源 入侵时，
原核生物利用限制酶来切割外源 ，
使之失效，以保证自身安全，防止外来
病原物的危害。
（2） 技术的基本原理是先以病毒
为模板合成 ，这一过程需要的酶是
__________；再通过 技术扩增相应的
片段。 过程每次循环分为3步，其中
温度最高的一步是______。
逆转录酶
变性
[解析] 以病毒为模板合成 属于逆转录过程，这一过程需要的酶是逆转录酶。 每次循环分为变性、复性、延伸三步，变性温度超过，复性温度为 左右，延伸温度在 左右。
（3） 细胞又称中国仓鼠卵巢细胞，
可贴壁培养、经过多次传代筛选后也可悬
浮培养。 细胞属于成纤维细胞，本身
很少分泌内源蛋白，广泛应用于生物制药
中重组蛋白的生产。由此推测制备重组疫
苗的实验思路中用 细胞作为受体细胞
的原因是____________________________
_________________（答出1点即可）。
易于进行大规模培养、易于进行蛋白产物的收集
[解析] 细胞可贴壁培养、经过多次
传代筛选后也可悬浮培养，属于成纤维
细胞，本身很少分泌内源蛋白，由此推
测制备重组疫苗的实验思路中用 细
胞作为受体细胞的原因是该细胞易培养、
易生长、易收获蛋白产物。
2. 定点突变技术
（1）概念：将某基因中的一个或几个特定的碱基对替换、增加或删
除，导致基因中的部分碱基序列发生改变，实现基因的定点突变。
（2）两种方法
①重叠延伸 技术：该技术要使用四条
引物。引物1和引物3的突起处代表与模板
链不能互补的突变位点，且这两条引物有
部分碱基（包括突变位点）是可以互补的。
因此，分别利用引物1和引物2，引物3和
引物4进行后，得到的 片段可以通
过引物1和引物3互补的碱基杂交在一起，
它们再在 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完整的。最后，用引物2和引物4进行扩增得到含有突变位点的 片段。通过测序可以检测定点突变是否成功。
②大引物技术：需要用到三种引物进行两
次 ，这三种引物分别是突变上游引物、
常规上游引物和常规下游引物。第一次
利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，
得到不完整的含有突变位点的片段；第
二次 利用第一次扩增产物中的一条 链
作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增
得到完整的含有突变位点的 片段。该技术的流程如图所示：
（3）应用：实现基因的定点突变。
2.[2025·山东枣庄月考] 天然 溶菌酶由164个氨基酸构成，大多耐热
性差，不利于工业化应用。我国学者借助改造 溶菌酶基因，并
将改造的基因与质粒重组后导入大肠杆菌，最终获得耐高温的 溶菌
酶。回答下列问题：
（1）研究发现 溶菌酶的第3位异
亮氨酸（密码子为、 、
）变为半胱氨酸（密码子为
②③
、 ），该半胱氨酸可以与第97位半胱氨酸之间形成一个二硫
键，从而使溶菌酶的耐热性得到大幅度提升。科学家利用 定点
突变技术对 溶菌酶基因的编码序列进行改造（如图甲），要选择的
图中的引物组合最好是______，其中突变（含已替换碱基）引物为③，
经过轮复制之后，符合要求的 数是___________。
[解析] 所选引物应该把编码序列全部扩增在内，则所用的引物是②
③。溶菌酶基因的两条链分别为、，引物②与 链结合，引物③
与链结合。每复制一次，以 链为模板复制出一条含有引物②的新
链，且复制出的含此链的不符合要求，则复制次，形成 个不
符合要求的,另外含链的 分子有1个且不符合要求，所以复
制次后，符合要求的分子有 个。
（2）科学家又发现若将第78位氨基酸由脯氨酸（密码
子为）替换为天冬氨酸（密码子为 ），耐热性
提升幅度更大。可运用大引物 技术进行定点突变，
相关原理如图乙所示。进行第一次 时所用的突变上
游引物需满足的条件是____________________________
____________________，至少需要___次循环，才能获得
相应的大引物。用所获得的大引物、模板和其他引物等
进行第二次 ，要获得带有突变位点的、适于与质粒构建基因表达载体的改良基因，引物应选用大引物两条链中的____（填“①”或“②”）。
含有定点突变的碱基并能与模板链碱基互补配对
2
②
[解析] 据图乙所示，突变上游引物对应的是
的拟突变位点，因此进行第一次 时所
用的突变上游引物的合理设计是含有定点突变
的碱基并能与 模板链碱基互补配对。经过
第一次 扩增可以获得①，下游大引物是与
①互补配对的单链，需要再次进行 扩
增才能获得，所以至少需要2次循环，才能获
得相应的大引物。 复制的方向是从模板链
的 ，对应的下游大引物是②。
（3）为了使扩增后的 溶菌酶基因能够与
丙图中的质粒A正确连接，设计引物时需要
在两种引物的___（填“”或“ ”）端连接上
限制酶________________的识别序列。
Ⅰ 和Ⅰ
[解析] 对溶菌酶基因进行 扩增时，
是从引物的端到端延伸子链，因此限制酶识别序列应在引物的
端。构建重组 分子时，需要目的基因和质粒含有相同的黏性末
端，结合图丙分析，若选择 Ⅰ 切割，则会破坏质粒上的氨苄青
霉素抗性基因，导致无法进行筛选，因此选择 Ⅰ 和 Ⅰ 。
3.实时荧光定量 技术
（1）概念：通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针对 产物进行
标记跟踪，实时在线监控反应过程，从而精确定量计算样品的初始模
板量的方法。
（2）该技术最关键的是荧光标记方式，两种方法：
Ⅰ 法：在反应体系中，加入过量 荧光染料，
荧光染料特异性地渗入 双链后，发射荧光信号，而不掺入链
中的 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加
与 产物的增加完全同步。
探针法：在 体系中每加入一对引物的同时，也加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当上游引物与下游引物分别与模板链复性时，荧光基团标记的探针序列也与模板链复性。由于探针序列同时具有荧光淬灭基团 ，故探针的荧光很弱。但是当子链延伸至探针时，耐高温的 聚合酶将探针端的荧光报告基团基团酶切降解，荧光报告基团基团 脱离了荧光淬灭基团基团 的抑制，发出荧光，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，实现了荧光信号的累积与 产物的形成完全同步。（如图所示）
.热变性
.复性/探针与模板的杂交
.延伸反应
（3）应用：实时精确测量每轮 产物的浓度。
3.[2024·湖南长沙二模] 对某冠状病毒进行核酸检测其实就是对病毒的
遗传物质进行检测。目前主流方法为实时荧光
（逆转录聚合酶链式反应）法。为检测某人是否感染了该冠状病毒，
需要进行以下相关操作：①分析 扩增结果；②从组织样本中提取
；（逆转录）成 ；④采集样本（咽拭子或鼻拭子）；
⑤利用扩增 片段。回答下列问题：
（1）若要得到正确的核酸检测结果，正确的操作顺序应该是_______
_____（用数字序号表示）。核酸检测样本多采集于咽、鼻，这些部
位存在多种微生物，提取物中核酸种类可能有多种，但通过 技术
可专一地对该冠状病毒的核酸序列进行扩增，原因是______________
____________________________________________________________
_____________________________。
④②③⑤①
引物是根据该冠状病毒的核酸的一段已知序列设计合成的（或引物能与该冠状病毒核酸对应的特异性结合）
（2）操作⑤中，需设计2种引物，需要提供引物的原因是__________
____________________________________________________________
__________________；复性时温度的设定是该步操作成败的关键，复
性的作用是_____________________________________________。
聚合酶不能从头开始合成，只能从引物的端开始连接脱氧核苷酸，从而延伸子链
使2个引物分别与互补的单链结合，形成氢键
[解析] 聚合酶不能从头开始合成，只能从引物的 端延伸
子链，因此在体外扩增目的基因时，需要根据目的基因的核苷
酸序列人工合成两种引物。 过程中复性的作用是使2个引物分别
与互补的 单链结合，形成氢键。
（3） 扩增时，在加入引物的同时还需加
入一个特异性荧光探针，其两端分别标记一
个报告基团和一个淬灭基团，如图所示：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬
灭基团吸收；____________________在催化
子链延伸时，还具有外切酶活性，它可以沿
耐高温的聚合酶
产物
着________（填“”或“ ”）方向将探针酶切，使报告基团
和淬灭基团分离，随着 扩增次数的增加，荧光的强度会逐渐增大，
从而实现荧光信号的变化与_________的形成完全同步。
[解析] 根据题干信息可知， 反应中，
耐高温的 聚合酶的作用是催化子链延
伸，同时还具有外切酶活性，可以沿着
方向将探针酶切，报告基团分离出
来后会发出荧光，随着 扩增次数的增
加，探针中的报告基团分离增多，荧光的
强度增加，荧光信号的变化与 产物的形成完全同步。
