长句应答(六) “实验思路法”解答基因工程的原理分析
[考题例证]
(2022·山东卷节选)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。
(1)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是 。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是
。
(2)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;由②④组或③⑤组的差异推测,P△中缺失的特定序列的作用是 。
[解题策略]
1.解法指导
分析基因编辑表达错误出现的原因,构建模型,提出修改思路。
2.实验思路分析
(1)融合基因时,注意事项:
找出模板链→明确转录、翻译的方向→添加引物或者限制酶→不能改变相应基因的读码序列→若有必要可以适当添加或减少碱基进行改造
(2)基因工程中的相关实验分析:
分析实验目的
↓
分析实验的自变量和因变量
↓
根据实验结果,进行实验分析
3.(1)找出模型中表示的DNA编码链→转录、翻译从左向右进行→ATG对应AUG,恰好是起始密码子(对应甲硫氨酸Met)→P基因编码链的第一个碱基“A”与EcoRⅠ识别序列最后两个碱基“TC”构成了TCA,导致后续密码子被错位读取→重新设计引物,在EcoRⅠ识别序列3′端(即识别序列之后)增添1个碱基。
(2)实验目的:探究药物A的作用
↓
分析自变量、因变量:自变量为①～⑤组中加入的物质不同,①组为对照组,②～⑤组为实验组
因变量为是否出现UBC的条带
↓
若样品中含有FLAG,它们就会被介质滞留,用抗UBC的抗体检测介质中的UBC含量,并以图丙作为实验主要结果。若要出现UBC的条带,则结合模型为UBC抗体-UBC-P(或P△)-FLAG-FLAG抗体。②组有弱阳性结果,说明FLAG-P可以实现上述过程,③组添加药物A,结果为显著阳性,最可能是增强了P与UBC的结合。④⑤组中无UBC条带,说明UBC与P△不能结合,P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列
【答案】 (1)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取 在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基 (2)增强FLAG-P与UBC的结合 参与P与UBC的结合
【解析】 (1)融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同,说明P基因翻译时出错。由图可看出,P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取,翻译出的氨基酸序列改变,可通过在引物的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基,这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变,能够正常翻译。
(2)①组仅添加UBC,处理后,用UBC抗体检测,不出现杂交带;②组添加UBC和FLAG-P,出现杂交带;③组添加UBC、药物A和FLAG-P,杂交带更加明显,说明药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P,出现杂交带;④⑤组使用FLAG-P△,不出现杂交带,据此推测P△中缺失的特定序列参与P与UBC的结合。
[技法应用]
1.(2025·山东德州模拟节选)哺乳动物体内一定含量的ω-3多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心血管疾病的作用,但LCPUFA在大多数动物体内不能合成,只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1(1 229 bp),培育转fat-1基因家兔,其部分流程如图一所示。
(1)在构建PEBf质粒时,为确保fat-1基因按正确方向插入,需要双酶切,还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链,与b链结合的引物5′端添加了限制酶识别序列GAATTC,则另一引物5′端需添加的限制酶识别序列为 ,理由是 。
(2)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功,科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA,利用fat-1基因引物进行PCR扩增后电泳,部分结果如图二所示。据图分析, (填“1”或“2”)组是PEBf质粒成功转染细胞组PCR产物。
【答案】 (1)GGATCC 转录的模板链是a链,说明fat-1基因转录方向为从左向右,则a链引物所在一侧应靠近启动子,所以应选择BamHⅠ限制酶的序列作为a链引物5′端序列,即另一引物5′端需添加的限制酶序列为GGATCC (2)2
【解析】 (1)在构建PEBf质粒时,为确保fat-1基因按正确方向插入,需要双酶切,还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链,结合基因末端的磷酸基团、羟基位置判断,fat-1基因的转录方向为从左向右,则a链引物所在一侧应靠近启动子,已知与b链结合的引物5′端添加了限制酶识别序列GAATTC(EcoRⅠ),则应选择BamHⅠ限制酶的序列作为a链引物5′端序列,即另一引物5′端需添加的限制酶识别序列为GGATCC。
(2)据图分析,M2组和1组没有扩增出DNA片段,故细胞内不存在目的基因,已知M2组是PEB质粒转染细胞组PCR产物,故推测1组是PEBf质粒未成功转染细胞组PCR产物,2组出现一条DNA条带,为目的基因条带,说明2组是PEBf质粒成功转染细胞组PCR产物。
2.(2023·山东卷节选)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(2)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
【答案】 (1)F2和R1或F1与R2 a链
(2)J-V5融合蛋白 不是
【解析】 (1)据图甲可知,引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列和部分连接序列,因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链,而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3′→5′,非模板链(也就是a链)是5′→3′;考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′,引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′,所以引物结合的单链其方向是3′→5′;图中F1是前引物,在左侧,所以其配对的单链是3′→5′的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
(2)据图乙可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测,均出现条带1,说明条带1是JV5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2,抗V5抗体检测不出现条带2,说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
专题综合限时练(六) 生物技术与工程
(时间:60分钟 分值:74分)
选择题第1～15题每题3分;非选择题第16～17题每题10分,第18题9分,除标注外,每空
1分。
一、单选题
1.(2025·河北石家庄一模)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述,正确的是( )
[A]可选用新鲜菠菜或猪的红细胞作为实验材料提取DNA
[B]研磨液离心后的沉淀物中加入预冷的酒精溶液可提取到DNA
[C]向溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂摇匀后会呈现蓝色
[D]设置“NaCl溶液+二苯胺试剂组”可排除NaCl溶液对实验结果的影响
【答案】 D
【解析】 猪是哺乳动物,其成熟的红细胞中无细胞核,不含DNA,因此猪的红细胞不能用于提取DNA;DNA不溶于酒精,研磨液离心后的上清液中加入预冷的酒精溶液可提取到DNA;向溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂沸水浴加热后才会呈现蓝色;设置“NaCl溶液+二苯胺试剂组”可排除NaCl溶液对实验结果的影响。
2.(2025·安徽马鞍山二模)我国研究人员通过体细胞核移植技术完全自主培育出了克隆猫。下列叙述正确的是( )
[A]制备供体细胞的培养基,灭菌后再加入血清等一些天然成分
[B]采集的卵母细胞通过显微操作去核后,再在体外培养到MⅡ期
[C]为了提高核移植的成功率可将重组细胞直接移植到代孕猫体内
[D]对受体猫进行同期发情处理的目的是避免其对外来胚胎发生免疫排斥
【答案】 A
【解析】 制备供体细胞的培养基时,培养基需先高温灭菌,冷却后加入不耐高温的血清等成分,以避免破坏其活性;采集的卵母细胞需先在体外培养至MⅡ期(减数分裂Ⅱ中期),才能进行去核操作;重组细胞需先体外培养形成早期胚胎(如桑葚胚或囊胚),才能移植到代孕母体;受体子宫通常不会对移植的外来胚胎发生免疫排斥,供体和受体要进行同期发情处理,目的是使供体与受体出现相同的生理变化,为胚胎植入提供相同的生理环境。
3.(2025·广东茂名二模)解钾菌能将土壤中难溶性含钾化合物分解,转变为可溶性化合物。下表是研究人员筛选解钾菌的培养基配方,下列分析错误的是( )
成分 含量(g/L)
葡萄糖 10.0
硫酸铵 0.5
NaH2PO4 0.5
MgSO4·7H2O 0.2
NaCl 0.1
CaCO3 0.1
钾长石粉 5.0
琼脂 15.0
蒸馏水 定容至1 L
[A]解钾菌属于自养微生物
[B]CaCO3调节培养基的pH
[C]该培养基是固体培养基
[D]解钾菌有增加肥力作用
【答案】 A
【解析】 从培养基配方看,该培养基含有葡萄糖这种有机碳源,说明解钾菌属于异养微生物。
4.(2025·河北承德一模)甜酒酿(醪糟)是江南地区的传统小吃,是用蒸熟的糯米拌上酿酒酵母发酵而成的一种甜米酒,其制作流程为浸米→蒸米→凉饭→拌酿酒酵母→发酵→检查→甜酒酿。下列有关叙述正确的是( )
[A]“蒸米”的主要目的是通过杀灭杂菌,延长甜酒酿的保质期
[B]“凉饭”后再拌入酿酒酵母,可避免高温杀死发酵所需菌种
[C]“发酵”时应将拌有酿酒酵母的凉饭装满密闭的容器
[D]在发酵过程中酒精的浓度会持续增加,pH会持续降低
【答案】 B
【解析】 “蒸米”的主要目的是使淀粉更易分解,便于微生物发酵,同时杀灭杂菌,保证发酵顺利进行;“凉饭”后再拌入酿酒酵母,可避免高温杀死发酵所需菌种;“发酵”时应将拌有酿酒酵母的凉饭装在密闭的容器中,但是不能装满容器,应该适当留出约1/3的空间;发酵过程中pH降低以及酒精含量增多,对发酵起抑制作用,从而导致一段时间后酵母菌发酵停止,因此酒精浓度不会持续增加,pH不会持续降低。
5.(2025·山东菏泽二模)稻瘟菌引起的水稻稻瘟病是危害最为严重的真菌病害之一。土壤中某些微生物能合成并分泌几丁质酶,能抑制稻瘟菌的生长,可用于稻瘟病的防治。科研人员试图从土壤中筛选出能高效降解几丁质的菌株,通过微生物培养获得几丁质酶。下列说法错误的是( )
[A]纯化培养时,可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种
[B]筛选土壤中目的微生物时需用以几丁质为唯一碳源的培养基
[C]在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落均能分泌几丁质酶
[D]可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株
【答案】 C
【解析】 在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落不一定都能分泌几丁质酶,可能部分是以几丁质的分解产物为碳源的微生物。
6.(2025·甘肃白银二模)果酒、啤酒、白酒等都是主要利用酵母菌发酵生产的。白酒需经过蒸馏,其主要成分是水和酒精,而果酒和啤酒则是非蒸馏酒;啤酒、白酒制作过程中一般需要进行糖化处理。下列说法正确的是( )
[A]家庭酿制果酒时,需每隔一定时间打开瓶盖放气
[B]糖化主要是将淀粉水解为葡萄糖,为发酵提供底物
[C]啤酒、黄酒、家庭酿制果酒发酵结束后都需进行消毒以延长保存期
[D]生产啤酒时大部分糖的分解在主发酵阶段完成,代谢物的生成在后发酵阶段完成
【答案】 B
【解析】 家庭酿制果酒时,为了排出产生的气体,需要将瓶盖拧松放气,但不能打开,否则会引起杂菌污染;啤酒、白酒制作过程中所用的原料中含有较多的淀粉,糖化主要是将淀粉水解为葡萄糖,为发酵提供底物;家庭酿制果酒时不需要进行消毒;啤酒发酵时酵母菌的繁殖、大部分糖的分解和代谢物的生成在主发酵阶段完成。
7.(2025·贵州贵阳二模)科研人员分离了天山雪莲(2n=32)和莴苣(2n=18)的原生质体并将其融合,为天山雪莲新种选育奠定了基础,培育过程如图所示。下列叙述正确的是( )
[A]过程②可以用PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法等
[B]过程④诱导形成愈伤组织期间一般不需要光照
[C]经过程②得到的c细胞只有1种类型,因此不需要筛选
[D]最后得到的试管苗体细胞中含有25条染色体
【答案】 B
【解析】 灭活病毒诱导法是诱导动物细胞融合的常用方法;诱导形成愈伤组织期间一般不需要光照,在后续的培养过程中,需要给予适当时间与强度的光照;细胞融合的过程中,可能会发生自体融合(即同一种细胞之间的融合)和异体融合(即不同种细胞之间的融合),所以我们需要对融合后的细胞进行筛选;天山雪莲的染色体数为32,而莴苣的染色体数为18,所以融合后的细胞应该含有32+18=50条染色体。
8.(2025·四川成都二模)利用红豆杉愈伤组织进行细胞产物的工厂化生产可获取紫杉醇。科研人员在不同pH的培养基上培养南方红豆杉愈伤组织,30天后收获,测鲜重和紫杉醇含量,结果如图所示。下列有关说法错误的是( )
[A]南方红豆杉愈伤组织的生长受pH影响明显
[B]细胞产物的工厂化生产的优点包括不占用耕地、几乎不受季节、天气等的限制
[C]紫杉醇是红豆杉生长和生存所必需的次生代谢物
[D]紫杉醇的工厂化生产不能体现出植物细胞的全能性
【答案】 C
【解析】 紫杉醇是一种次生代谢物,次生代谢物不是植物生长和生存所必需的。
9.(2025·河南开封二模)马丁达比犬肾脏细胞(简称MDCK细胞)是流感病毒感染研究使用最多的细胞系,也是分离、扩增和纯化流感病毒较理想的细胞系。有关MDCK细胞培养的叙述正确的是( )
[A]在培养MDCK细胞过程中可能会出现细胞贴壁和接触抑制的现象
[B]流感病毒侵染MDCK细胞后利用自身遗传物质和原料合成子代
[C]培养MDCK细胞,需要为其创造95%O2和5%CO2的气体环境
[D]培养MDCK细胞时需要定期更换培养液,目的是减少杂菌污染
【答案】 A
【解析】 在动物细胞培养过程中,动物细胞可能会出现贴壁生长的现象,即细胞会附着在培养瓶的壁上生长,当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时,细胞通常会停止分裂增殖,这种现象称为接触抑制;当流感病毒侵染MDCK细胞后,会利用MDCK细胞的物质和能量,以自身遗传物质为模板合成子代病毒,而不是利用自身原料合成子代;动物细胞培养时,需要为其创造含95%空气和5%CO2的气体环境;培养MDCK细胞时需要定期更换培养液,目的是为细胞提供充足的营养物质,同时去除细胞代谢产生的废物。
10.(2025·辽宁丹东一模)某研究小组以小鼠甲为实验材料,研制抗病毒A的单克隆抗体,过程如下图。下列叙述正确的是( )
[A]实验前给小鼠甲注射病毒A是为了促进产生特定抗体的B淋巴细胞的有丝分裂
[B]将小鼠体内取出的脾脏用剪刀剪碎后加入胃蛋白酶处理,使其分散成单个细胞
[C]筛选1需用特定的选择培养基进行筛选才能获得融合的杂交瘤细胞
[D]筛选2利用96孔板经1次筛选可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
【答案】 C
【解析】 实验前给小鼠甲注射病毒A,目的是刺激机体进行体液免疫,得到能产生特定抗体的B淋巴细胞;将小鼠体内取出的脾脏用剪刀剪碎后应加入胰蛋白酶处理,使其分散成单个细胞,胃蛋白酶的最适pH约为1.5～2.2,在动物细胞培养液的pH条件下,胃蛋白酶会变性失活,不能用于分散细胞;筛选1需用特定的选择培养基进行筛选,在该培养基上,未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡,只有融合的杂交瘤细胞才能生长,从而获得融合的杂交瘤细胞;筛选2利用96孔板经多次筛选可获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。
11.(2025·辽宁沈阳模拟)下图表示通过相关技术获得某种克隆哺乳动物(二倍体)的流程,下列叙述正确的是( )
[A]A表示细胞核,其供体应选用XX性染色体的个体
[B]从牛卵巢中采集的卵母细胞可直接用于①过程
[C]进行②过程前必须对受体动物注射适量免疫抑制剂
[D]胚胎发育卵裂阶段细胞数目增加,胚胎总体积并不增加
【答案】 D
【解析】 A为供体体细胞的细胞核,性染色体的组成可为XX或XY;从牛卵巢中采集的卵母细胞需要在体外经人工培养至减数第二次分裂中期,不可直接用于①过程;②过程是胚胎移植,胚胎移植时,受体对植入的胚胎通常不会产生排斥反应,因此不需要注射免疫抑制剂;卵裂阶段胚胎中细胞进行有丝分裂,数目不断增加,但胚胎的总体积并不增加。
12.(2025·江西南昌三模)mTOR是一种对细胞生长和增殖有调节作用的胞内蛋白激酶。抑制mTOR活性可使小鼠囊胚的内细胞团增殖减慢,进而导致胚胎发育停滞;当mTOR被重新激活时,囊胚发育恢复正常。下列叙述错误的是( )
[A]通过体外受精和胚胎培养技术可获得小鼠囊胚
[B]受体母鼠接受移植的囊胚前需进行同期发情处理
[C]移植前用mTOR抑制剂处理囊胚可提高移植成功率
[D]该研究可为体外培养胚胎的非冷冻保存提供依据
【答案】 C
【解析】 因为抑制mTOR活性会使小鼠囊胚的内细胞团增殖减慢,进而导致胚胎发育停滞,所以移植前用mTOR抑制剂处理囊胚会不利于胚胎的正常发育,不能提高移植成功率。
13.(2025·安徽芜湖二模)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
[A]反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增
[B]设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降
[C]PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子
[D]整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
【答案】 C
【解析】 DNA子链合成的方向为5′端到3′端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增;设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降;PCR产物是包含未知序列的链状DNA分子;整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶。
14.(2025·北京一模)转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累,可能与内源蛋白相互作用,产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素,科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因(如图)导入棉花细胞。相关叙述正确的是( )
[A]使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接
[B]选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接
[C]可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞
[D]融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累
【答案】 C
【解析】 使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接;无论Bt基因是否正确连接,利用引物2和引物4均可扩增出产物,因此选择引物2和引物4无法确定基因是否正确连接,可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞;C蛋白能结合纤维素(主要存在于细胞壁),融合基因表达后,Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向转运至细胞壁附近,减少在细胞质中积累。
15.(2025·河北石家庄模拟)某公司拟开发一种新型碱性蛋白酶,用于高效去除衣物上的蛋白质污渍。已知天然蛋白酶X在pH=10时活性较低,且易被洗涤剂中的氧化剂破坏。研究人员计划通过蛋白质工程改造酶X,使其在碱性环境中活性提升并增强抗氧化能力。为实现上述目标,下列哪项技术手段不属于蛋白质工程的关键步骤( )
[A]利用冷冻电镜解析酶X的三维结构,确定影响pH敏感性和抗氧化性的关键氨基酸位点
[B]通过体外定向进化技术,在模拟洗涤环境的培养基中筛选高活性突变体
[C]将人工设计的突变基因导入毕赤酵母表达系统,验证改造后酶的催化性能
[D]对产酶X的枯草芽孢杆菌进行紫外线诱变,随机筛选耐碱性菌株
【答案】 D
【解析】 利用冷冻电镜解析酶X的三维结构,确定影响pH敏感性和抗氧化性的关键氨基酸位点,属于蛋白质工程;定向进化需要人工定向改造或合成目的基因,属于蛋白质工程;将人工设计的突变基因导入毕赤酵母表达系统,验证改造后酶的催化性能,这是基因表达验证阶段,该阶段是蛋白质工程改造的必要环节;紫外线诱变属于传统随机诱变技术,未针对目标蛋白进行定向设计,不属于蛋白质工程。
二、非选择题
16.(10分)(2025·黑龙江哈尔滨二模)番茄灰霉菌严重影响番茄生产,枯草芽孢杆菌可以产生对多种病原菌具有抑制作用的蛋白质。为了探究枯草芽孢杆菌能否用于番茄灰霉病的防治,研究者进行了相关实验。回答下列问题。
(1)在实验室培养微生物时,需要对所用的培养基和玻璃器皿进行灭菌,可采用的方法分别是
(2分)。
(2)用液体培养基培养枯草芽孢杆菌需要摇床振荡,目的是 (2分)。培养过程中为检测枯草芽孢杆菌活菌数量,需采用 计数。
(3)在检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉菌的 (化学或生物)防治作用时,首先取适量的番茄灰霉菌菌液涂布于 培养基表面,再将无菌滤纸片(直径5 mm)在培养过 的菌液中浸泡,然后覆盖于番茄灰霉菌培养基中心,数秒后取出滤纸片,培养皿倒置培养一段时间,测量 的大小以判定枯草芽孢杆菌防治(抑菌)作用效果。
(4)为了筛选出更高效抑制番茄灰霉菌的枯草芽孢杆菌,研究者进一步设计了如下实验:应从培养皿B中选择 号菌落继续进行纯化培养。
【答案】 (1)高压蒸汽灭菌、干热灭菌
(2)增大培养液的溶氧量,使菌体与营养物质充分接触 稀释涂布平板法
(3)生物 固体 枯草芽孢杆菌 抑菌圈
(4)②
【解析】 (1)防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键,对制备的培养基采用高压蒸汽灭菌,对所用的玻璃器皿进行干热灭菌。
(2)枯草芽孢杆菌为好氧微生物,采用摇床振荡培养可增大培养液的溶氧量,使菌体与营养物质充分接触,有利于枯草芽孢杆菌的生长繁殖。培养过程中要抽样检测活菌数量,应该采用稀释涂布平板法。
(3)利用枯草芽孢杆菌抑制多种病原菌,属于生物防治,要检测枯草芽孢杆菌对番茄灰霉菌的抑制作用,先把适量的番茄灰霉菌菌液涂布于固体培养基表面,将无菌滤纸片在培养过枯草芽孢杆菌的菌液中浸泡后覆盖于固体培养基中心,数秒后取出滤纸片,培养皿倒置培养后会出现抑菌圈,测量抑菌圈大小以判定抑菌效果。
(4)培养皿B中②号菌落对应的抑菌圈直径与菌落直径的比值最大,说明该菌对番茄灰霉菌的抑制作用最强,即应从培养皿B中选择②号菌落继续进行纯化培养。
17.(10分)(2025·四川成都一模)不对称体细胞杂交是指利用射线破坏供体细胞的染色质,与未经射线照射的受体细胞融合,所得融合细胞含受体全部遗传物质及供体部分遗传物质。研究人员尝试运用不对称体细胞杂交将红豆杉(2n=24)与柴胡(2n=12)进行了融合,培育能产生紫杉醇的柴胡,过程如图所示。请回答下列问题。
注:X射线处理能随机破坏染色体结构,使其发生断裂、易位或染色体消除,使细胞不再持续分裂;碘乙酰胺处理能使细胞质中的某些酶失活,抑制细胞分裂。
(1)过程①中需将植物组织经 后接种于MS培养基上诱导 过程,产生愈伤组织。对原生质体进行的A处理为 。
(2)采用二乙酸荧光素(FDA)法可测定原生质体活力。已知FDA本身无荧光,当其进入细胞后可被酯酶分解为无毒、具有荧光的物质,该荧光物质不能透过活细胞质膜,会留在细胞内发出荧光。据此分析应选择 的原生质体用于融合。融合前对原生质体在显微镜下用血细胞计数板计数,以确定原生质体密度。
(3)获得的原生质体常使用化学试剂 诱导融合,经诱导融合后,只有异源融合的原生质体可持续分裂形成再生细胞团,原因是
(2分)。
(4)科研人员对获得的部分植株细胞进行染色体观察、计数和DNA分子标记鉴定,结果如表所示。后代植株中 类型植株一定不是所需植株。科研人员推测杂种植株的染色体主要来源于亲本柴胡的染色体,另一方亲本的遗传物质可能不是以染色体的形式存在于杂种植株细胞中,而是以DNA片段的方式整合进柴胡的基因组,作出以上推测的依据有
(2分)。
后代植 株类型 染色体数目、形态 DNA分子标记鉴定
甲 12,形态与柴胡染色体相似 含双亲DNA片段
乙 12,形态与柴胡染色体相似 无红豆杉DNA片段
丙 12,形态与柴胡染色体相似 含双亲DNA片段和新的DNA片段
【答案】 (1)消毒 脱分化 X射线处理
(2)有荧光
(3)聚乙二醇(PEG) 杂种细胞由于融合后在细胞核和细胞质的功能上实现互补,使细胞恢复正常分裂
(4)乙 甲、丙类型植株细胞的染色体与柴胡细胞中的染色体数目相同、形态相似,且含有双亲的DNA片段
【解析】 (1)过程①中需将植物组织消毒处理;由外植体形成愈伤组织的过程是脱分化;A处理为X射线处理,破坏供体细胞的染色质。
(2)分析题意,FDA本身无荧光,当其进入细胞后可被酯酶分解为无毒、具有荧光的物质,且该荧光物质不能透过活细胞质膜,故应选择有荧光的原生质体用于融合。
(3)获得的原生质体常使用化学试剂聚乙二醇(PEG)诱导融合;由于杂种细胞融合后在细胞核和细胞质的功能上实现互补,使细胞恢复正常分裂,故只有异源融合的原生质体可持续分裂形成再生细胞团。
(4)据表格信息可知,乙类型植株无红豆杉DNA片段,说明其不是所需植株;甲、丙类型植株细胞中的染色体与柴胡细胞中的染色体数目相同、形态相似,且含有双亲的DNA片段,说明甲、丙植株属于杂种植株,它们的染色体主要来源于亲本柴胡的染色体,红豆杉亲本的遗传物质可能不是以染色体的形式存在于杂种植株细胞中,而是以DNA片段的方式整合进柴胡的基
因组。
18.(9分)(2025·湖南常德二模)金黄色葡萄球菌(Sa)可引起败血症、细菌性肺炎等疾病。不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa,推测Sa产生头孢霉素抗性与其质粒上的R基因有关。为验证该推测,以下图中R基因的上、下游片段和质粒1构建质粒2,然后通过同源重组(质粒2中的上、下游片段分别与Sa基因组中R基因上、下游片段配对,并发生交换)敲除Sa的R基因。回答下列问题。
注:1 kb=1 000碱基对;Y是可被脱水四环素(不作为抗生素起作用)诱导表达的Sa致死基因。
(1)利用PCR技术扩增出较多的R基因及其上下游序列,应在引物的 (填“3′端”或
“5′端”)添加相应的限制酶识别序列。若要扩增出较
多DNA单链序列,在添加引物时需做怎样的处理 (2分)。
(2)质粒2的构建过程中需选择 (2分)(填限制酶)对PCR扩增产物进行酶切。
(3)用质粒2转化临床分离获得的具有头孢霉素抗性、且对氯霉素敏感的Sa,涂布在含有氯霉素的平板上,经培养获得含质粒2的Sa单菌落,再经多次传代增加同源重组敲除R基因的概率,随后稀释涂布在含 的平板上,筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落中分别挑取少许菌体,依次接种到含 的平板上,若无法增殖,则对应菌落中细菌的R基因可能被敲除。
(4)以上述获得的菌株基因组为模板,采用不同引物组合进行PCR扩增,电泳检测结果如图,表明R基因已被敲除的是 (2分)。
【答案】 (1)5′端 一种引物的量显著多于另一种引物
(2)SacⅡ和EcoRⅠ
(3)脱水四环素 头孢霉素
(4)D
【解析】 (1)在PCR技术中,DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链,所以应在引物的5′端添加相应的限制酶识别序列;若要扩增出较多DNA单链序列,可在添加引物时,让一种引物的量显著多于另一种引物。
(2)由题图可知,质粒2上依次接有SacⅡ、EcoRⅠ、SacⅡ三个酶切位点,而质粒1上只有SacⅡ酶切位点,R基因的上下游依次含有SacⅡ、EcoRⅠ、EcoRⅠ、SacⅡ酶切位点,若要构建质粒2,应用SacⅡ和EcoRⅠ对PCR产物进行酶切。
(3)因为Y是可被脱水四环素诱导表达的Sa致死基因,用质粒2转化临床分离获得的Sa后,要筛选并获得不再含有质粒2的菌落,就需要将菌液稀释涂布在含有脱水四环素的平板上;由于推测Sa产生头孢霉素抗性与其质粒上的R基因有关,所以从这些菌落中分别挑取少许菌体,依次接种到含头孢霉素的平板上,若无法增殖,说明其可能失去了R基因,从而失去了头孢霉素抗性。
(4)从电泳检测结果来看,D组引物组合扩增出的条带大小(约1.9 kb)与预期的含上、下游片段的R基因(0.7+2.2+1.2=4.1 kb)大小明显不一致,说明R基因已被敲除。(共19张PPT)
长句应答(六) “实验思路法”解答基因工程的原理分析
[考题例证]
(2022·山东卷节选)某种类型的白血病由蛋白P引发,蛋白UBC可使P被蛋白酶识别并降解,药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机理,需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P,FLAG是一种短肽,连接在P或P△的氨基端,使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合,但不影响P或P△的功能。
(1)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后,与编码FLAG的序列形成一个融合基因,如图甲所示,其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后,融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析,出现该问题的原因是
。
修改扩增P基因时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题,具体修改方案是
。
P基因编码链的第一个碱基
与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取
在引物中的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基
【解析】 (1)融合基因转录出的mRNA序列正确,翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确,但P基因对应的氨基酸序列与P不同,说明P基因翻译时出错。由图可看出,P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸,导致mRNA上的密码子被错位读取,翻译出的氨基酸序列改变,可通过在引物的EcoRⅠ识别序列3′端添加1个碱基,这样能保证P基因转录出的mRNA上的读码框不改变,能够正常翻译。
(2)融合蛋白表达成功后,将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质,分离出与介质结合的物质并用UBC抗体检测,检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC,由①②③组结果的差异推测,药物A的作用是 ;由②④组或③⑤组的差异推测,P△中缺失的特定序列的作用是 。
增强FLAG-P与UBC的结合
参与P与UBC的结合
【解析】 (2)①组仅添加UBC,处理后,用UBC抗体检测,不出现杂交带;②组添加UBC和FLAG-P,出现杂交带;③组添加UBC、药物A和FLAG-P,杂交带更加明显,说明药物A的作用是增强FLAG-P与UBC的结合。②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P,出现杂交带;④⑤组使用FLAG-P△,不出现杂交带,据此推测P△中缺失的特定序列参与P与UBC的结合。
[解题策略]
1.解法指导
分析基因编辑表达错误出现的原因,构建模型,提出修改思路。
2.实验思路分析
(1)融合基因时,注意事项:
找出模板链→明确转录、翻译的方向→添加引物或者限制酶→不能改变相应基因的读码序列→若有必要可以适当添加或减少碱基进行改造
(2)基因工程中的相关实验分析:
分析实验目的
↓
分析实验的自变量和因变量
↓
根据实验结果,进行实验分析
3.(1)找出模型中表示的DNA编码链→转录、翻译从左向右进行→ATG对应AUG,恰好是起始密码子(对应甲硫氨酸Met)→P基因编码链的第一个碱基“A”与EcoRⅠ识别序列最后两个碱基“TC”构成了TCA,导致后续密码子被错位读取→重新设计引物,在EcoRⅠ识别序列3′端(即识别序列之后)增添1个碱基。
(2)实验目的:探究药物A的作用
↓
分析自变量、因变量:自变量为①～⑤组中加入的物质不同,①组为对照组,②～⑤组为实验组
因变量为是否出现UBC的条带
↓
若样品中含有FLAG,它们就会被介质滞留,用抗UBC的抗体检测介质中的UBC含量,并以图丙作为实验主要结果。若要出现UBC的条带,则结合模型为UBC抗体-UBC-P(或P△)-FLAG-FLAG抗体。②组有弱阳性结果,说明FLAG-P可以实现上述过程,③组添加药物A,结果为显著阳性,最可能是增强了P与UBC的结合。④⑤组中无UBC条带,说明UBC与P△不能结合,P△中缺失的特定序列是与UBC结合的关键序列
[技法应用]
1.(2025·山东德州模拟节选)哺乳动物体内一定含量的ω-3多不饱和脂肪酸(LCPUFA)可以起到预防心血管疾病的作用,但LCPUFA在大多数动物体内不能合成,只能从食物中摄取。科研人员从秀丽隐杆线虫中获得LCPUFA合成酶基因fat-1(1 229 bp),培育转fat-1基因家兔,其部分流程如图一所示。
(1)在构建PEBf质粒时,为确保fat-1基因按正确方向插入,需要双酶切,还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链,与b链结合的引物5′端添加了限制酶识别序列GAATTC,则另一引物5′端需添加的限制酶识别序列为 ,理由是
。
GGATCC
转录的模板链是a链,说明fat-1基因
转录方向为从左向右,则a链引物所在一侧应靠近启动子,所以应选择BamHⅠ限制酶的序列作为a链引物5′端序列,即另一引物5′端需添加的限制酶序列为GGATCC
【解析】 (1)在构建PEBf质粒时,为确保fat-1基因按正确方向插入,需要双酶切,还需对fat-1基因的引物进行相应设计。已知fat-1基因转录的模板链为a链,结合基因末端的磷酸基团、羟基位置判断,fat-1基因的转录方向为从左向右,则a链引物所在一侧应靠近启动子,已知与b链结合的引物5′端添加了限制酶识别序列GAATTC(EcoRⅠ),则应选择BamHⅠ限制酶的序列作为a链引物5′端序列,即另一引物5′端需添加的限制酶识别序列为GGATCC。
(2)转染是将外源分子如DNA、RNA等导入真核细胞的技术。为了检验图一家兔成纤维细胞是否转染成功,科研人员分别提取培养液中各细胞的DNA,利用fat-1基因引物进行PCR扩增后电泳,部分结果如图二所示。据图分析,
(填“1”或“2”)组是PEBf质粒成功转染细胞组PCR产物。
2
【解析】 (2)据图分析,M2组和1组没有扩增出DNA片段,故细胞内不存在目的基因,已知M2组是PEB质粒转染细胞组PCR产物,故推测1组是PEBf质粒未成功转染细胞组PCR产物,2组出现一条DNA条带,为目的基因条带,说明2组是PEBf质粒成功转染细胞组PCR产物。
2.(2023·山东卷节选)科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
(1)构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
F2和R1或F1与R2
a链
【解析】 (1)据图甲可知,引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列和部分连接序列,因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链,而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3′→5′,非模板链(也就是a链)是5′→3′;考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′,引物基础上延伸的方向肯定是5′→3′,所以引物结合的单链其方向是3′→5′;图中F1是前引物,在左侧,所以其配对的单链是3′→5′的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
(2)重组质粒在受体细胞内正确表达后,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否表达以及表达水平,结果如图乙所示。其中,出现条带1证明细胞内表达了 ,条带2所检出的蛋白 (填“是”或“不是”)由重组质粒上的J基因表达的。
J-V5融合蛋白
不是
【解析】 (2)据图乙可知,用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测,均出现条带1,说明条带1是J-V5融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2,抗V5抗体检测不出现条带2,说明条带2所检出的蛋白不是由重组质粒上的J基因表达的。
