【高考突破方案】专题10 第6讲 基因工程及生物技术的安全性和伦理问题 -（课件） 高考生物一轮复习

(共148张PPT)
专题 10
生物技术与工程
第6讲　基因工程及生物技术
的安全性和伦理问题
课程标准要求 核心素养解读 1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的 2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具 3.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤 4.举例说明基因工程在农牧、食品及医药等行业的广泛应用改善了人类的生活品质 5.概述人们根据基因工程原理，进行蛋白质设计和改造，可以获得性状和功能更符合人类需求的蛋白质 生命观念 从结构与功能观角度理解基因工程和蛋白质工程的原理
科学思维 1.建立基因工程的操作流程模型
2.掌握通过蛋白质工程技术设计或改造某一蛋白质的设计流程
3.掌握目的基因的检测和鉴定的方法
课程标准要求 核心素养解读 6.举例说明依据人类需要对原有蛋白质结构进行基因改造、生产目标蛋白的过程 7.举例说出日常生活中的转基因产品 8.探讨转基因技术在应用过程中带来的影响 9.举例说出生殖性克隆人面临的伦理问题 10.分析说明我国为什么不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验 11.举例说明历史上生物武器对人类造成了严重的威胁与伤害 12.认同我国反对生物武器及其技术和设备的扩散 科学探究 “通过DNA的粗提取与鉴定”与“DNA片段的扩增及电泳鉴定”培养实验与探究能力
社会责任 关注基因工程和蛋白质工程的发展和应用；理性看待转基因技术
续表
基础知识自查
夯实必备知识
一、重组DNA技术的基本工具
1.基因工程的概念及理论基础
(1)基因工程概念理解
转基因
遗传特性
生物类型
DNA分子水平
基因重组
定向改造生物的遗传性状
(2)基因工程的理论基础
四种脱氧核苷酸
规则的双螺旋结构
中心法则
一套遗传密码
2.基本工具
(1)限制性内切核酸酶(简称“限制酶”)
原核生物
核苷酸序列
磷酸二酯键
一种特定的脱氧核苷酸序列
黏性末端
提醒
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)将一个基因从DNA分子上切割下来需要切两处，同时产生四个黏性末端或平末端。
(3)限制酶不切割自身DNA的原因是原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)DNA连接酶
拼接成DNA分子
平末端
黏性末端和平末端
黏性末端
提醒
①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
②DNA聚合酶起作用时需要以一条DNA链为模板，而DNA连接酶不需要模板。
(3)载体
噬菌体
一个或多个
【易错易混自纠】
(1)在构建基因表达载体中需要使用的工具酶有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体。( )
提示：在构建基因表达载体中需要使用的工具有限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体。载体不是工具酶。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，应选昆虫病毒作为载体。( )
(3)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有能自我复制、具有标记基因、有一个至多个限制酶切割位点。( )
√
×
√
(4)限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的氢键断开。( )
提示：限制酶能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。
(5)载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选的标记基因。( )
提示：载体质粒通常采用抗生素抗性基因作为筛选的标记基因。
×
×
二、基因工程的基本操作程序
1.目的基因的筛选与获取
(1)目的基因：在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞________或获得预期____________等的基因。
(2)筛选合适的目的基因
①从相关的已知__________________的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
②利用____________和序列比对工具进行筛选。
性状
表达产物
结构和功能清晰
序列数据库
(3)目的基因的获取
①人工合成_____________。
②构建基因文库。
③常用_______特异性地快速扩增目的基因。
目的基因
PCR
DNA半保留复制
引物
脱氧核苷酸
耐高温
温度
两种引物
耐高温的DNA聚合酶
指数形式
琼脂糖凝胶电泳
提醒
①在PCR过程中实际加入的原料为dNTP(即dATP、dGTP、dTTP、dCTP)，既可作为合成DNA子链的原料，又可为DNA的合成提供能量。
②引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，作为新子链的合成起点，只能结合在母链的3′端，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③复性温度过高，则引物难以与模板链结合，温度过低则易使两条母链配对结合，均无法获得PCR产物。
④真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+。
2.基因表达载体的构建——核心
稳定存在
遗传
表达
提醒
启动子、起始密码子、终止子、终止密码子的区别
3.将目的基因导入受体细胞
生物类型 受体细胞 常用方法 转化过程
植物 ________或者受精卵 花粉管通道法 ①用微量注射器将含目的基因的DNA溶液直接注入______；②借助花粉管通道进入_____
____________法
体细胞
农杆菌转化
子房
胚囊
续表
生物类型 受体细胞 常用方法 转化过程
动物 受精卵 显微注射法
微生物 原核细胞 感受态细胞法
提醒
①农杆菌转化法中的两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的
T－DNA上，第二次拼接(非人工操作)是指插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞的染色体DNA上。
②农杆菌转化法中的两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T－DNA导入受体细胞。
4.目的基因的检测与鉴定
【易错易混自纠】
(1)用PCR方法扩增目的基因时需要设计两种引物。( )
(2)用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列。( )
提示：用PCR方法扩增目的基因时只需知道基因两端的序列。
(3)外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行复制。( )
提示：外源DNA必须位于重组质粒的启动子和终止子之间才能进行表达。
(4)抗虫基因即使成功地插入植物细胞染色体DNA上也未必能正常表达。( )
(5)应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否完全表达。( )
提示：应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其是否转录出mRNA，通过抗原—抗体杂交法才能检测出是否表达出了蛋白质。
×
×
√
√
×
三、基因工程的应用和蛋白质工程
1.基因工程的应用
(1)基因工程的一般应用
乳腺（房）生物反应器
器官移植
生长
(2)乳腺生物反应器
乳腺中特异表达的基因的启动子
受精卵
显微注射
所需的药物
提醒
①乳腺生物反应器是利用转基因动物的乳汁生产药用蛋白，而膀胱生物反应器是利用转基因动物的尿液生产药用蛋白，乳腺生物反应器是处于生殖期的雌性动物才可生产药用蛋白，而膀胱生物反应器则是任何生长期的雌雄动物均可生产。
②青霉素是青霉菌产生的，不是通过基因工程产生的。
③动物基因工程主要是为了改善畜产品的品质，而不是为了产生体形巨大的个体。
④原核生物的基因(如抗虫基因)可以作为真核生物(棉花)的目的基因。
2.蛋白质工程
(1)蛋白质工程概念的理解
生物功能
蛋白质
基因合成
(2)基本思路
从预期的__________出发→设计预期的__________→推测应有的________→找到并改变相对应的_____________________________新的基因→获得所需要的蛋白质
蛋白质功能
蛋白质结构
氨基酸序列
脱氧核苷酸序列(基因)或合成
(3)蛋白质工程的应用
酶
工业用酶
参与调控光合作用的酶
【易错易混自纠】
(1)由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后可直接应用。( )
提示：由大肠杆菌工程菌获得人的干扰素后不能直接应用，大肠杆菌没有内质网、高尔基体等，不能对干扰素进行加工，所以不能直接应用。
(2)蛋白质工程的目的是改造或合成人类需要的蛋白质。( )
(3)蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。( )
提示：由于基因决定蛋白质，因此要对蛋白质的结构进行设计改造，最终必须通过改造或合成基因来完成，所以是对分子水平上的DNA分子直接进行操作。
×
√
×
四、DNA的粗提取与鉴定和DNA片段的扩增及电泳鉴定
1.DNA的粗提取与鉴定
不溶于
蛋白质
2mol/L
二苯胺
研磨液
上清液
95%
一个方向
2mol/L
二苯胺
5 min
蓝色
2.DNA片段的扩增及电泳鉴定
(1)实验基础
DNA的热变性
相反
大小和构象
(2)PCR实验操作步骤
微量移液枪
离心管
底部
PCR仪
(3)DNA的电泳鉴定
微量移液器
紫外灯
注意
①为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
②每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
③进行DNA的鉴定时，紫外灯的波长是300 nm。
【易错易混自纠】
(1)在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色。( )
提示：在溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂沸水浴后才呈蓝色。
(2)DNA不溶于酒精，但某些蛋白质溶于酒精。( )
(3)在凝胶中DNA分子的迁移速率只与DNA分子的大小相关。( )
提示：在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象相关。
(4)为了节约资源，移液枪上的枪头在实验过程中不必更换。( )
提示：每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
×
√
×
×
五、生物技术的安全性与伦理问题
1.转基因成果
(1)基因工程中研究最早、最广泛和取得实际应用成果最多的领域是______________________。
(2)转基因动物方面，科学家将______________、________________________等转入动物体内，培育了一批生长迅速、营养品质优良的转基因家禽、家畜；转基因植物方面，目前已经培育出了大批具有_______、_______、_________和耐储藏等新性状的作物。
(3)种植转基因作物面积较大的国家有美国、巴西、阿根廷、加拿大等；种植的转基因作物中__________和__________最多，其次是棉花和油菜。
对微生物的基因改造
生长激素基因
生长激素释放激素基因
抗虫
抗病
抗除草剂
大豆
玉米
2.对转基因产品的安全性的争论及理性看待转基因技术
(1)引发对转基因产品安全性争论的原因
①基因工程对原本是自然造就的生命形式进行了________，使之具有了全新特征。
②人们所生活的国家或社会，政治制度、意识形态、宗教信仰、经济发展水平、历史背景、传统文化和伦理道德观念等的差异，决定了人们具有不同的_________取向。
改造
价值观
(2)理性看待转基因技术
①以____________________为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
②应该看到人们的观点受到许多复杂的_________、经济和________等因素的影响。
③要靠______________和____________进行思考和辩论。
完备的相关科学知识
政治
文化
确凿的证据
严谨的逻辑
3.关注生殖性克隆人
(1)生殖性克隆：指通过______技术产生独立生存的新个体。
(2)治疗性克隆：指利用__________产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官，从而达到__________的目的。
(3)我国________、不允许、________、不接受任何生殖性克隆人实验。
4.警惕用新技术研究生殖性克隆人
(1)利用________________________技术，有可能产生人的iPS细胞，从而产生克隆人。
(2)如果按照“人类基因组编写计划”合成人类的整个________，就有可能造出“无父母”人类或者拥有相同基因组的“克隆人”。
克隆
克隆技术
治疗疾病
不赞成
不支持
化学诱导多能干细胞
基因组
5.禁止生物武器
(1)种类：致病菌类、________、生化毒剂类等。
(2)中国政府的态度：在任何情况下________________、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
病毒类
不发展、不生产
【易错易混自纠】
(1)种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性。( )
(2)克隆人实验可能会存在流产率高、胎儿畸形率高等问题。( )
(3)“设计试管婴儿”与“试管婴儿”技术没有什么不同。( )
提示：“设计试管婴儿”在胚胎移植前要进行遗传学诊断，主要用于白血病等遗传疾病的预测及治疗；“试管婴儿”在胚胎移植前不需要进行遗传学诊断，主要解决不孕夫妇的生育问题。
(4)中国政府禁止生殖性克隆，但不反对治疗性克隆。( )
√
×
√
√
1.(选择性必修3 P80)构建基因表达载体的目的是_______________________________________________________________________________________。一个基因表达载体的组成包括_____________________________________等。
2.(选择性必修3 P94)蛋白质工程通过对基因操作来实现对天然蛋白质的改造的原因是________________________________________________________________________________________________________________________。
基础知识自查
跟教材学长句
目的基因、启动子、终止子及标记基因
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用
①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传
3.(选择性必修3 P74 探究·实践)DNA的粗提取实验中过滤不能用滤纸代替纱布的原因是_______________________________________________________ 。
DNA会被吸附到滤纸上而大量损失，影响最终提取的DNA量
1.(选择性必修3 P72旁栏思考)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
_____________________________________________________________________________。
2.(选择性必修3 P77相关信息)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要_______激活。因此，PCR反应缓冲溶液中一般要添加_______。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的________________。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
基础知识自查
教材拾遗
不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个脱氧核苷酸
Mg2+
Mg2+
短单链核酸
3.(选择性必修3 P79旁栏思考改编)PCR可以扩增mRNA吗？利用PCR扩增目的基因时，为什么要用2种不同的引物？
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ 。
不可以，因为PCR是用DNA双链作模板的，不能直接用单链RNA进行PCR，必须把mRNA逆转录成单链cDNA之后再进行PCR。DNA是两条反向平行的双链，而复制时只能从固定的方向(模板链的3′端)开始，所以引物的碱基序列是不同的
考点1 基因工程
1
2
3
考点2 基因工程的基本操作程序
考点3 基因工程和蛋白质工程
4
考点4 DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
5
考点5 生物技术的安全性和伦理问题
考点1　基因工程
素养全面提升
1.与DNA有关的几种酶的比较
2.图解限制酶的选择原则
(1)不破坏目的基因原则：如图甲中可选择PstⅠ，而不选择SmaⅠ。
(2)保留标记基因、启动子、终止子、复制原点原则：所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中不选择SmaⅠ。
(3)确保出现相同黏性末端原则：通常选择与切割目的基因相同的限制酶(如果没有相同的限制酶，可选择同尾酶)，如图甲中PstⅠ；为避免目的基因和质粒自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶。
1.(2024·河南二模)为了提高玉米的抗虫能力，研究员将H与S两种抗虫基因构建成融合基因，共同导入植物体内。图1为构建表达载体所用质粒，图2是H－S融合基因两侧序列，图3为部分限制酶的识别序列。下列叙述正确的是(　　)
热点考向点拨
考向
结合基因工程工具酶的应用，考查科学思维
A.卡那霉素抗性基因可以用来筛选导入目的基因的植物细胞
B.目的基因和质粒应该同时用酶B与酶C来切割，确保不会发生反向连接和
自身环化
C.该玉米同时转入两种抗性基因可延缓害虫抗性基因频率增加
D.重组质粒中仍有酶A的切割位点
答案：C
【解析】C　卡那霉素抗性基因位于T－DNA之外的区域，只能与重组质粒一起导入农杆菌细胞，用于筛选导入目的基因的农杆菌细胞，只有T－DNA上的潮霉素抗性基因才能用于筛选导入目的基因的植物细胞，A错误；质粒应用酶A和酶B切割，避免破坏T－DNA，B错误；相比于导入一种抗性基因，同时导入两种抗性基因可以减缓害虫对抗性基因的选择，从而延缓抗性基因频率增加，C正确；酶A与酶C的识别序列相比，酶C的识别序列特异性更低，酶A与酶C切割后产生的黏性末端互补后形成的连接位点只能被酶C识别，而不能被酶A识别，D错误。
2.(2024·吉林模拟预测)(不定项)我国科学家发现玉米中ZmNBS42基因是玉米抗病性的关键基因。如图为ZmNBS42基因编码区序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)，表中为相关限制酶识别序列及备选引物(注：起始密码子为AUG)。现需要在ZmNBS42基因编码区添加BamHⅠ的识别序列以用于转基因技术中。下列相关叙述正确的是(　　)
限制酶 识别序列 引物 序列(5′－3′)
Sac Ⅰ GAGCTC C1 ATGGATCCATGGCGATGTCATTTTCA
Kpn Ⅰ GGTACC C2 AGGTACCCTTGGTGGCATCCTTAGC
BamH Ⅰ GGATCC C3 ATGGTACCATGGCGATGTCATTTTCA
Hmd Ⅲ AAGCTT C4 AGGATCCCTTGGTGGCATCCTTAGC
A.ZmNBS42基因还应包括非编码区
B.ZmNBS42基因编码区左侧有启动子序列
C.PCR 中需添加dNTP作为扩增原料，添加Mg2+激活Taq DNA聚合酶
D.PCR 中应选用引物C1或C4与ZmNBS42基因编码区左侧结合
答案：ABC
【解析】ABC　完整的基因结构包括编码区和非编码区，所以ZmNBS42基因还应包括非编码区，A正确；ZmNBS42基因编码区左侧的3′端作为转录的模板，mRNA左侧起始碱基序列为5′－AUG……3′，对应的是起始密码子，启动子是RNA聚合酶结合和识别部位，起始转录，所以ZmNBS42基因编码区左侧有启动子序列，B正确；PCR 扩增时需要模板、引物、原料、酶、能量、缓冲液等，所以可以添加dNTP作为扩增原料，添加Mg2+可以激活Taq DNA聚合酶，C正确；由题干信息可知，需要在ZmNBS42基因编码区添加BamHⅠ的识别序列以用于转基因技术中，而BamH Ⅰ的识别序列是GGATCC，而引物C1和C4的序列中含有BamH Ⅰ的识别位点，引物应该与模板的3′端结合，所以PCR 中应选用引物C1与ZmNBS42基因编码区左侧结合，C4与ZmNBS42基因编码区右侧结合，D错误。
3.(2024·湖北模拟预测)为研究Atu5117启动子能否独立启动下游基因的表达，研究人员利用重叠延伸PCR技术，获得“Atu5117启动子和绿色荧光蛋白基因(GFP)”的“嵌合序列”，再构建基因表达载体(仅使用1种限制酶)，以获得含有“嵌合序列”的重组DNA分子。相关过程、基础质粒及限制酶的酶切位点如图1所示。回答下列问题：
(1)重叠延伸PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2+，以激活____________________________，PCR中预变性时间比循环过程中变性时间长，其原因是________________________________________________________________。
(2)由阶段2“变性后杂交”的原理可知，引物2和引物3在碱基序列上的要求是________________________________________。
(3)阶段3构建基因表达载体需要的酶有_______________________________________，它们作用的化学键是____________。
耐高温的DNA聚合酶(Taq酶)
预变性时间较长可增大模板DNA彻底变性的概率，使模板DNA充分解旋
引物2和引物3必须具有碱基互补配对的片段
限制性内切核酸酶(限制酶)和DNA连接酶
磷酸二酯键
(4)本实验中，在阶段3需破坏基础质粒上T7启动子的结构，从而使得GFP的表达仅受Atu5117启动子的调控，因此，在设计阶段1和2的引物时，需确保________________(填引物名称)上含有_________(填限制酶的名称)的识别序列。
引物1和引物4
BamH Ⅰ
(5)提取受体细胞的相应DNA，利用与阶段3相同的限制酶酶切，进行DNA电泳检测，结果如图2。已知Atu5117启动子、GFP基因、基础质粒的序列大小分别约为490 bp、750 bp、2 750 bp(bp代表碱基对)，据图判断受体细胞________中成功导入了重组DNA分子。
注：M指标准参照物。
B
【解析】(5)利用与阶段3相同的限制酶酶切，如果受体细胞中成功导入了重组DNA分子，酶切后会得到两个DNA片段，已知Atu5117启动子、GFP基因、基础质粒的序列大小分别约为490 bp、750 bp、2 750 bp，所以酶切后得到两个DNA片段的大小分别是1 240 bp和2 750 bp，符合细胞B的电泳图。
考点2　基因工程的基本操作程序
素养全面提升
1.PCR技术和DNA复制的比较
2.基因表达载体构建过程中的注意点
如果用同一种限制酶切割，若考虑两两相连，则DNA连接酶连接DNA片段会出现三种情况：目的基因与目的基因的连接、目的基因与质粒的连接、质粒与质粒的连接，需筛选出重组质粒。
3.含目的基因的受体细胞的筛选
(1)原理：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，若插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。如图，目的基因插入四环素抗性基因内部，则四环素抗性基因失活。
(2)被转化的细菌有三种：含环状目的基因的细菌、含重组质粒的细菌、含自身环化质粒的细菌。
(3)筛选方法：将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、3、4、5菌落，再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。最后，可在含氨苄青霉素的培养基上挑取1、5菌落进行培养。
热点考向点拨
考向1
围绕PCR技术，考查科学思维和科学探究
1.(2024·山东二模)(不定项)丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种传染病。为研制针对HCV的多肽疫苗，某研究小组构建LTB－R9－Bp融合基因的过程如图，进而构建出融合基因表达载体，其中LTB是一种免疫增强剂基因，R9－Bp是HCV两个相连的包膜蛋白基因。下列说法正确的是(　　)
A.PCR反应体系中需加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚
合酶
B.若要大量扩增LTB－R9－Bp融合基因，可选择引物P2和引物P3继续进行
PCR
C.融合基因表达载体的组成元件有融合基因、标记基因、启动子和终止密
码子等
D.若利用转基因植物生产该疫苗，需用到基因工程、植物组织培养和抗
原—抗体杂交技术
答案：AD
【解析】AD　PCR扩增时，需要在反应体系中加入待扩增的模板、引物、原料以及耐高温的DNA聚合酶，A正确；通过PCR技术扩增LTB－R9－Bp融合基因，需要与融合基因两端序列互补配对的引物，结合图示分析，可选择引物P1和引物P4继续进行PCR，B错误；终止密码子存在于mRNA上，不会存在于融合基因中，C错误；若利用转基因植物生产该疫苗，则需要通过基因工程获得含有目的基因的受体细胞，再通过植物组织培养获得能产生疫苗的植物，最终需要通过抗原—抗体杂交技术进行鉴定，D正确。
2.(2024·山东一模)fat1基因和fat2基因控制的酶分别调控两种多不饱和脂肪酸的合成，两种酶的共同表达对于细胞内多不饱和脂肪酸的合成具有协同效应。2A肽是一种来源于病毒的短肽，受2A基因序列控制。2A基因的转录产物可以通过“核糖体跳跃”断开位于2A肽尾端甘氨酸和脯氨酸之间的肽键，将2A基因编码的蛋白分割成2个独立蛋白。图甲表示科研人员利用重叠延伸PCR技术成功构建融合基因fat1—2A—fat2的过程。图乙表示构建成功的包含融合基因的重组质粒的部分片段，F1～F4、R1～R4表示引物。通过基因工程成功实现了fat1基因和fat2基因在小鼠体内的共同表达，大大提高了细胞内多不饱和脂肪酸的含量。回答下列问题：
(1)利用PCR技术可以实现在体外快速大量进行DNA扩增，其与细胞内DNA复制的共同点是__________________________________________________(答出2点)。若图乙中融合基因的b链为模板链，则图甲PCR1中的引物甲与图乙中的引物______的绝大部分序列相同。
(2)PCR1和PCR2需要分开单独进行，原因是_________________________________________________。PCR3不需要引物，高温加热后fat1—2A和2A—fat2的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是________(填序号)形成的杂交链。
都需要模板、引物、DNA聚合酶、原料都是脱氧核苷酸
R4
引物甲和引物丁部分碱基互补配对，影响子链的合成
①④
(3)为了确定fat1基因连接到质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物__________。融合基因经下图中的过程表达产生fat1和fat2两种蛋白，经检测发现通过该技术表达的fat1蛋白的分子量较正常fat1蛋白的分子量大，依据该融合基因的结构和表达原理推测，原因是___________________________________________________________ 。
F1、R3
fat1基因后面连接了2A序列，使fat1蛋白后面连接了2A肽的部分片段
【解析】(1)PCR技术与细胞内DNA复制的共同点是都需要模板、引物、DNA聚合酶、原料都是脱氧核苷酸；若图乙中融合基因的b链为模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3′→5′，非模板链(也就是a链)是5′→3′；考虑到DNA复制的方向是子链的5′→3′，所以引物结合的单链其方向 是3′→5′；图中fat1片段中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3′→5′的b链，故图甲PCR1中的引物甲与图乙中的R4链相应部分的序列相同。
(2)利用重叠延伸PCR连接fat1和fat2基因过程中引物2和引物3的侧翼序列是互补配对的，若置于同一反应体系，会发生结合而失去作用，不能扩增目的基因，因此PCR1体系与PCR2体系应分别独立进行；高温加热后fat1—2A和2A—fat2的双链解开，其中能正常延伸形成融合基因的是①④形成的杂交链。(3)为了确定fat1基因连接到质粒中且插入2A序列的上游，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图乙中的引物F1、R3；由图可知，fat1基因后面连接了2A序列，使fat1蛋白后面连接了2A肽的部分片段，因此该技术表达的fat1蛋白的分子量较正常fat1蛋白的分子量大。
考向2
结合基因工程的基本操作程序，考查科学探究
3.(2024·北京一模)如图为构建苘麻抗除草剂基因A重组质粒的技术流程，其中Npt Ⅱ是卡那霉素抗性基因，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色。下列说法错误的是(　　)
A.PCR扩增A时可在引物中加入Pst Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点
B.在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌
C.用农杆菌转化植物愈伤组织，选择呈现蓝色的组织进行培养
D.启动子若为除草剂诱导启动子将减少细胞物质和能量浪费
答案：C
【解析】C　PCR扩增A后，为使A能与质粒结合形成重组质粒，需要在A的两侧加入相应的限制酶的酶切位点，即在引物中加入Pst Ⅰ和Xho Ⅰ的酶切位点，A正确；由图可知，卡那霉素抗性基因是标记基因，因此在培养基中添加卡那霉素初步筛选导入重组质粒的农杆菌，B正确；由题意可知，GUS基因仅在真核细胞中表达，表达产物可催化底物呈蓝色，不能在农杆菌中表达，C错误；启动子若为除草剂诱导启动子，表达后具有除草剂的功能，将减少细胞物质和能量浪费，D正确。
4.(2024·湖南教学教研联盟第一次)土壤盐渍化影响水稻生长发育，将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，其操作流程及可能用到的限制酶如图，其中bar为抗除草剂基因，Tetr为四环素抗性基因，Ampr为氨苄青霉素抗性基因，①～⑦表示操作过程。回答下列问题：
限制酶 BamH Ⅰ Bcl Ⅰ Sma Ⅰ Sau3A Ⅰ
识别位点及切割位点 －G↓GATCC－ －T↓GATCA－ －CCC ↓GGG－ －↓GATC－
(1)过程①利用PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶催化__________键的形成，还需要添加引物，应选用下列引物组合________。
①5′－CTTGGATGAT－3′
②5′－TAAGTTGTCT－3′
③5′－TAGTAGGTTC－3′
④5′－ATTCAACAGA－3′
⑤5′－TCTGTTGAAT－3′
⑥5′－ATCATCCAAG－3′
磷酸二酯
①⑤
(2)根据基因表达载体的结构组成分析，Ti质粒中的CaMV35S功能是________________________________________。基因表达载体中，OsMYB56基因和bar基因编码链的方向______(填“相同”或“相反”)。
(3)过程③应选用限制酶______________切割质粒，利用所选限制酶进行操作的优势是____________________________________________________________________________(答2点)，切割后需要用______________(写具体名称)进行连接效率更高，以便获得重组质粒。
RNA聚合酶识别和结合的部位(启动转录过程)
相反
Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ
防止酶切后的质粒、目的基因自身环化；保证OsMYB56基因和酶切后的质粒定向连接
T4DNA连接酶
(4)若要鉴定OsMYB56基因是否表达，从分子水平上检测的方法有______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出1种即可)。
提取细胞的mRNA，逆转录得到cDNA后进行PCR扩增；根据OsMYB56基因设计探针进行核酸分子杂交检测OsMYB56基因或者其转录出的mRNA；通过抗原—抗体杂交技术检测OsMYB56基因表达的蛋白质
【解析】(1)DNA分子由2条链构成，每一条链都有3′端与5′端，—OH端为3′端，磷酸基团的末端为5′端，因此OsMYB56基因游离的磷酸基团侧为5′端，羟基端为3′端。过程①PCR扩增OsMYB56基因时加入的酶是Taq酶，该酶能催化磷酸二酯键的形成。在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端根据碱基互补配对原则结合，根据图中两端序列，通常选择5′－CTTGGATGAT－3′(上面链的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′(下面链的引物)作为引物对，①⑤正确。
(2)基因表达载体的结构应该包括启动子、终止子、复制原点、限制酶切割位点、标记基因等，由图可知CaMV35S是启动子，功能是RNA聚合酶识别和结合的位点。RNA聚合酶的移动方向是从启动子移向终止子，故两个基因编码链方向相反。(3)据图可知，质粒中的两个标记基因Tetr和Ampr中都含有限制酶BamH Ⅰ识别序列，如果用限制酶BamH Ⅰ，会破坏质粒中的两个标记基因，为防止质粒自身环化，保证OsMYB56和酶切后的质粒定向连接，需要用双酶切，因此过程③可以选择限制酶Bcl Ⅰ和Sma Ⅰ。酶切后的质粒和目的基因片段，通过T4DNA连接酶作用后获得重组质粒。
考点3　基因工程和蛋白质工程
素养全面提升
蛋白质工程与基因工程的异同
名称 蛋白质工程 基因工程
过程 从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质 筛选与获取目的基因→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质 定向改造或生产人类所需要的蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果 可生产自然界中不存在的蛋白质 只能生产自然界中已存在的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程 热点考向点拨
考向
围绕蛋白质工程，考查科学思维与生命观念
1.(2024·辽宁模拟预测)蛋白质工程被用于改进酶的性能或开发新的工业用酶时，常用两种策略：合理设计，需了解蛋白质的结构及控制性状的基因序列，过程如下图；定向进化，在试管中模拟自然进化，利用人工诱变技术诱发大量突变，按照特定的需要给予选择压力，选择具有所需特征的蛋白质。下列叙述错误的是(　　)
A.对某种蛋白质进行合理设计可能得到多种基因序列
B.⑤过程的完成依赖于基因的改造或基因的合成
C.定向进化也需要事先了解蛋白质的空间结构情况
D.定向进化策略与自然选择实质基本相同，但速度不同
答案：C
【解析】C　由于密码子的简并性，某种蛋白质所对应的基因序列也可能并不是唯一的，即对应的基因序列不一定已知，所以对某种蛋白质进行合理设计可能得到多种基因序列，A正确。根据图示分析可知，图中①为转录过程，②为翻译过程，③表示蛋白质的折叠，④为分子设计，⑤表示DNA合成。⑤过程的完成依赖于基因的改造或基因的合成，B正确。根据题干信息可知，定向进化，在试管中模拟自然进化，利用人工诱变技术诱发大量突变，按照特定的需要给予选择压力，选择具有所需特征的蛋白质，所以不需要事先了解蛋白质的空间结构情况，C错误。由以上分析可知，定向进化策略仍为遗传变异和选择的综合作用，与自然选择实质基本相同，但是定向进化策略建立在对原始蛋白质的结构及功能的了解基础上，需对其对应的基因再进行修饰或合成，是个缓慢的过程，因此定向进化策略与自然选择的速度不同，D正确。
2.(2024·全国模拟预测)目前用于治疗人类疾病的单克隆抗体大多数是鼠源单抗，人体对鼠源单抗有一定的排斥反应。研究人员根据抗体的结构特点欲将鼠源单抗进行改造，思路如图1，改造过程如图2。回答下列问题：
(1)图1所示的思路属于________工程的范畴，图2中①表示的细胞是______________，②是________过程。
(2)脂质体是人工合成的磷脂双分子层形成的囊泡，可以运输药物，推测脂质体可以将DNA运进受体细胞的方式是____________________，该脂质体与细胞膜相比，不具备的功能是________________________。
蛋白质
鼠杂交瘤细胞
逆转录
与细胞膜结合或胞吞
进行细胞间的信息交流
(3)利用PCR对cDNA进行扩增时，需要选择合适的引物，如图3表示cDNA的序列，选择的引物是________，如果选择另外两种引物，还可以用于扩增________(填“已知”或“未知”)序列。
B和C
未知
【解析】(1)题图1所示的思路是改造抗体，将鼠源抗体改造成鼠源—人源嵌合抗体，这属于蛋白质工程的范畴。题图2中①是能分泌抗体的鼠杂交瘤细胞，②过程是利用RNA生成DNA的过程，表示逆转录过程。(2)脂质体的成分是磷脂分子，故其运送药物的方式是与细胞膜结合将药物运进细胞或者整个脂质体连同药物通过胞吞方式进入细胞。与细胞膜相比，脂质体缺少蛋白质，细胞间的信息交流大多与细胞膜上的糖蛋白有关，故其缺少的功能是进行细胞间的信息交流。(3)DNA链延伸的方向是5′→3′，则引物的方向也是5′→3′，故引物应该选择B和C。如果选择A、D两种引物，则属于反向PCR技术，通常用于扩增目的基因旁侧的未知DNA序列。
考点4　DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
素养全面提升
DNA的粗提取与鉴定实验的注意事项
(1)本实验不能用哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料，原因是哺乳动物成熟的红细胞无细胞核(无DNA)。可选用鸡血细胞作为材料。
(2)加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
(4)加入食盐(主要成分是NaCl)的目的是溶解DNA。
(5)在DNA进一步提纯时，选用冷却的95%的酒精的作用是溶解杂质和析出DNA。
热点考向点拨
考向1
结合DNA的粗提取与鉴定，考查科学探究
1.(2024·山东质检)血浆中含有大量蛋白质和少量脂质等，血浆cfDNA与蛋白质紧密黏附结合，提取血浆cfDNA的步骤主要有：配制洗涤液→样本裂解→DNA析出→DNA吸附→杂质洗涤→DNA洗脱与收集。下列说法错误的是
(　　)
A.样本裂解的目的是裂解血细胞，使其含有的DNA释放
B.可以通过加入体积分数95%的预冷乙醇，轻轻颠倒混匀的方式析出DNA
C.洗涤液的作用是高效去除血浆中的蛋白质和脂质等
D.洗脱DNA的洗脱液中含有一定浓度的NaCl
A
【解析】A　血浆不含有血细胞，裂解是使样品中的核酸游离在裂解体系中的过程，A错误。DNA不溶于乙醇，细胞中某些蛋白质溶于乙醇，可以通过加入体积分数95%的预冷乙醇，轻轻颠倒混匀的方式析出DNA，B正确。血浆中含有大量蛋白质和少量脂质等，洗涤液的作用是高效去除血浆中的蛋白质和脂质等，C正确。DNA洗脱液的原理：在高盐状态下，硅胶膜专一性地吸附DNA；在低盐或水溶液状态下，DNA被洗脱下来，洗脱DNA的洗脱液中含有一定浓度的NaCl，D正确。
考向2
结合DNA片段的扩增及电泳鉴定，考查科学思维
2.(2024·山东一模)猪圆环病毒2型(PCV2)是单链环状DNA病毒，该病毒的核衣壳蛋白Cap蛋白是PCV2基因工程疫苗研制的关键蛋白。科研人员通过基因工程构建了PCV2Cap蛋白表达菌株，构建过程中先设计引物，通过PCR获取Cap基因片段，经酶切处理后与质粒重组，并将其导入细菌。如图为通过琼脂糖凝胶电泳试验对PCR结果(图1)及PCV2Cap重组质粒构建是否成功(图2为检测结果)进行的检测，图中Marker为DNA标准品。下列相关叙述正确的是(　　)
A.图示结果说明，PCV2Cap重组质粒构建成功
B.应依据Cap基因两端碱基序列来设计获取Cap基因的两种引物
C.细菌获得的产生Cap蛋白的变异可以遗传
D.构建基因表达载体时用BamHⅠ一种酶处理Cap基因和质粒
答案：ABC
【解析】ABC　如果质粒中插入了目的基因，那么单酶切会产生一个特定大小的片段。使用两种不同的限制酶对重组质粒进行切割，如果插入片段和载体质粒都按预期被切割，那么应该会产生两个或多个片段。图中单酶切和双酶切都出现了目的条带，这意味着插入片段已经被成功克隆到载体中。说明PCV2Cap重组质粒构建成功，A正确。根据PCR技术的原理可知，选择基因序列两端的区域设计引物可以提高引物的特异性。因为这些区域在基因中是唯一的，所以设计的引物更容易针对性地扩增目的基因，减少非特异性扩增。应依据Cap基因两端碱基序列来设计获取Cap基因的两种引物，B正确。细菌获得的产生Cap蛋白的变异属于基因重组，可以遗传，C正确。构建基因表达载体时，为了防止目的基因和质粒的反向连接，一般用两种酶处理Cap基因和质粒，D错误。
考点5　生物技术的安全性和伦理
问题
素养全面提升
1.治疗性克隆与生殖性克隆的比较
类型 治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 利用克隆技术产生特定的细胞、组织和器官，用它们来修复或替代受损的细胞、组织和器官 用于生育，获得人的复制品
水平 细胞水平 个体水平
联系 都属于无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息相同 2.试管婴儿与设计试管婴儿的比较
名称 试管婴儿 设计试管婴儿
技术手段 胚胎移植前，不需要进行遗传学诊断 胚胎移植前需要进行遗传学诊断
应用 主要解决不孕夫妇的生育问题 用于白血病等血液病的治疗
相同点 体外受精，进行体外早期胚胎培养；胚胎移植；属于有性生殖 热点考向点拨
考向1
结合生物技术的安全性，考查科学思维
1.(2024·北京一模)下列生物技术操作不会达成预期目标的是(　　)
A.将胰岛素基因表达质粒转入酵母菌，筛选获得产胰岛素工程菌
B.将肠乳糖酶基因导入奶牛乳腺细胞，培育产低乳糖牛乳的奶牛
C.将体外改造后能识别特定癌细胞的T细胞回输患者，进行癌症治疗
D.将花青素代谢相关基因导入植物体细胞，获得具有特定花色的植株
B
【解析】B　将肠乳糖酶基因导入奶牛受精卵，可以培育出产低乳糖牛乳的奶牛，若导入奶牛乳腺细胞则不能达成预期目标，B错误。
考向2
围绕生物技术的伦理问题，考查社会责任
2.(2024·湖北模拟预测)上海长征医院联合中国科学院分子细胞研究中心，利用患者血液PBMC(如淋巴细胞、单核细胞等)重编程为自体iPS细胞，并使用国际首创技术使之转变为内胚层干细胞，国际上首次利用干细胞来源的自体再生胰岛移植，成功治愈胰岛功能严重受损的糖尿病的病例。下列说法错误的是(　　)
A.创造iPS细胞不需要人类胚胎，可避免伦理问题
B.餐后患者再生胰岛B细胞的胰岛素分泌会增加
C.胰岛素与骨骼肌上受体结合后促进肌糖原合成
D.下丘脑分泌的激素经体液运输作用于胰岛细胞
D
【解析】D　下丘脑通过自主神经支配胰岛细胞，D错误。
3.(2024·北京一模)生物安全是指与生物有关的各种因素对社会、经济、人类健康以及生态环境所产生的危害或潜在风险。下列叙述与我国政府相关法规或主张不符的是(　　)
A.禁止人的生殖性克隆和治疗性克隆
B.禁止非医学需要的胎儿性别鉴定
C.销售转基因农产品应有明确标注
D.全面禁止和彻底销毁生物武器
A
【解析】A　我国禁止人的生殖性克隆，但不反对治疗性克隆，A错误。
1.(2024·安徽卷)下列关于“DNA 粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应，可检测溶液中是否含有蛋白质
杂质
真题引领知新
高考真题体验
D
【解析】D　DNA在蒸馏水中的溶解度较低，无法有效提取出来，A正确；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精，B正确；DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，C正确；在沸水浴的条件下，DNA遇二苯胺呈蓝色，但不能检测有没有蛋白质，D错误。
2.(2024·湖南卷)(不定项)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C.5′－CTACCCGTGAT－3′为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
答案：AC
【解析】AC　利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据题干中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A。另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；图示电泳方向为上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5′－CTACCCGTGAT－3′，患者的测序结果为5′－CTACCTGTGAT－3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。
3.(2024·江西卷)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　)
A.上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸
D.可以用其他酶替代Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ构建重组质粒
答案：D
【解析】D　不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误。题意显示，用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一，E.coliB中能表达L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因此可用E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸，该过程中L－谷氨酸钠的作用不是供能，B错误；E.coliA中没有L－谷氨酸脱羧酶(GadB)，因而不能降解L－谷氨酸，而E.coliB中含有该酶的基因，因而能高效降解L－谷氨酸，高效生产γ－氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外还有其他的限制酶可选，此外，PCR产物也未必非要用这两种酶，也可以用同尾酶替代，D正确。
4.(2024·湖南卷)百合具有观赏、食用和药用等多种价值，科研人员对其进行了多种育种技术研究。回答下列问题：
(1)体细胞杂交育种。进行不同种百合体细胞杂交前，先用_______________去除细胞壁获得原生质体，使原生质体融合，得到杂种细胞后，继续培养，常用______________________(填植物激素名称)诱导愈伤组织形成和分化，获得完整的杂种植株。
(2)单倍体育种。常用______________的方法来获得单倍体植株，鉴定百合单倍体植株的方法是_______________________________________________。
纤维素酶和果胶酶
生长素和细胞分裂素
花药离体培养
利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目
(3)基因工程育种。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图1。图2是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。
①研究病原微生物对L的启动子pL活性的影响。从图1所示结构中获取pL，首先选用__________________酶切，将其与相同限制酶酶切的Ti质粒连接，再导入烟草。随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫，结果如图3。由此可知：3种病原微生物都能诱导pL的活性增强，其中______________的诱导作用最强。
HindⅢ、BamHⅠ
交链格孢
②现发现栽培种百合B中也有L，但其上游的启动子与野生百合不同，且抗病性弱。若要提高该百合中L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，简要写出实验思路：_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
PCR扩增基因L及其pL；插入质粒中；利用农杆菌导入百合B体细胞，经培养获得转基因植株；筛选L表达量提高的转基因百合；用病原微生物侵染转基因百合，检测百合抗病能力
【解析】(1)因植物细胞细胞壁的成分主要是纤维素和果胶，因此获得原生质体的方法是用纤维素酶和果胶酶对植物细胞进行处理。得到原生质体后使原生质体融合，形成杂种细胞，再用生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织形成和分化，从而获得完整的杂种植株。(2)获得单倍体植株的常用方法是花药(花粉)离体培养；鉴定百合单倍体植株的方法是利用显微镜观察根尖有丝分裂中期细胞中染色体的数目，若染色体数目减少一半，则获得的植株为单倍体植株。(3)根据目的片段以及质粒上限制酶的识别位点，若要获得pL并连接到质粒上，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。根据图3的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。
5.(2024·吉林卷)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T－DNA转移)和不含有Vir基因、含有T－DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题：
注：F1～F3，R1～R3表示引物；T－DNA－LB表示左边界；T－DNA－RB表示右边界；Ori表示复制原点；KanR表示卡那霉素抗性基因；HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是_______________________________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是__________________________________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是________________和__________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是____________________________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是__________________。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用__________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
水解DNA酶，防止DNA被分解
溶解蛋白质等物质，析出不溶于酒精的DNA
PCR技术扩增
人工合成
RNA聚合酶识别并结合的部位
增强目的基因的表达
HygBR
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作为模板，进行PCR，应选用的引物是______和______。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是______。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1－1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1－1 362合成基因序列和1 363－1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
F3
R2
D
6.(2024·河北卷)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为__________________________启动子。Nos为终止子，其作用为__________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
注：KpnⅠ、Hind Ⅲ、SacⅠ和EcoR Ⅰ标注的位点为各限制酶的识别位点。
在胚乳中特异性表达的
终止转录
Hind Ⅲ
EcoR Ⅰ
(2)利用_____________的方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测____________，通过________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为_____。选择纯合体进行后续研究的原因是_______________________________。
农杆菌转化
r2HN mRNA
抗原—抗体杂交
1/4
纯合体自交后代不发现性状分离
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是_______________________________________________(答出2点即可)。
体液
细胞
不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
7.(2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶Bsa Ⅰ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。回答下列问题：
图甲：载体信息
图乙：目标基因L部分序列
图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
注：N代表任一碱基。
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越______(填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用Bsa Ⅰ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有______种。载体信息如图甲所示，经Bsa Ⅰ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5′－________－3′和5′－________－3′。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素_________筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是________，其中纯合的突变植株是____(填序号)。
低
256
GTTT
CAAT
卡那霉素
Sac Ⅰ
④
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T－DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为______，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1/4
【解析】(2)根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在Sac Ⅰ酶切位点上存在，Bam H Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及所展示的电泳结果可知，要以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶Sac Ⅰ，限制酶Sac Ⅰ在突变序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯合突变的植株。
(3)根据题意可知，在实验当中获得了一株基因L成功突变的纯合植株，已知该植株具有抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T－DNA插入。根据图示可知，抗生素抗性基因在T－DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T－DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
真题引领知新
新情境新命题
(2024·北京一模)学习以下材料，回答(1)～(4)题。
构建“动态调控”的工程酵母菌
酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂，经遗传改造后被广泛地应用于生物燃料、化工产品、医药保健品等的合成，但代谢途径改变常造成细胞生长受损即存在“生长”与“生产”之间的矛盾。为解决这一矛盾，我国研究者在酿酒酵母中构建了群体密度调控的蛋白降解系统。
在酿酒酵母中表达拟南芥的细胞分裂素合成酶和细胞分裂素受体.并使细胞分裂素响应途径与酵母菌内源的Ypd1－Skn7信号转导途径结合，构建出群体密度感应系统，如图。当菌体密度增至足够高时，扩散到胞外的细胞分裂素浓度达到一定阈值，会进入细胞与受体结合，引起Skn7与特定启动子中一段重复序列(SD)结合，导致下游基因从低表达状态显著上调表达水平，通过选择适当的下游基因，实现了细胞分裂素信号的正反馈激活。研究者利用绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因进行检测，发现当酵母菌菌体数量达到一定值时，荧光强度开始随菌体数量增加而显著增强。
生长素受体与生长素(IAA)结合后，可进一步结合特定蛋白并导致特定蛋白的降解。这些特定蛋白中共同的氨基酸序列称为IAA蛋白降解决定子。研究者在酵母菌中表达生长素受体，并将IAA蛋白降解决定子与目标蛋白融合表达，构建了IAA诱导的蛋白降解系统。
法尼烯是喷气燃料的替代品。酿酒酵母可利用F酶将法尼基焦磷酸(FPP)合成为法尼烯，E酶会与F酶竞争FPP催化合成麦角固醇，麦角固醇过少时严重影响菌体数量增加。研究者将群体密度感应系统和IAA诱导的蛋白降解系统整合，使工程酵母菌生长到一定密度后，才启动E酶的降解，实现对其代谢的动态调控，提高了生产效率。
(1)研究者从拟南芥中____________目的基因，构建_______________后再导入酿酒酵母，经检测鉴定后获得工程菌。
(2)如何通过提高细胞分裂素浓度实现其信号的正反馈激活，请选择适宜的基因和启动子填在图中。①______；②______；③______基因A：______基因B：______。
a.持续表达下游基因的启动子
b.能结合细胞分裂素的启动子
c.含有SD的启动子
d.细胞分裂素合成酶基因
e.细胞分裂素受体基因
筛选和获取
基因表达载体
a
c
c
e
d
(3)为将群体密度感应系统和IAA诱导的蛋白降解系统整合入酿酒酵母，从而解决法尼烯生产中的问题，一方面需要将群体密度感应系统中的________基因替换为IAA合成酶基因，一方面还需导入______________________________________________________基因替换酵母菌内源的E酶基因。
荧光蛋白
IAA蛋白降解决定子对应的DNA序列与E酶基因的融合
(4)综合所学知识和文中信息，以下说法正确的是______。
A.利用酿酒酵母工业生产法尼烯涉及发酵工程和基因工程技术
B.文中的两个系统均属于转录水平的代谢调控手段
C.工程菌大量增殖后，细胞分裂素合成多，IAA合成少，利于F酶催化FPP合
成法尼烯
D.通过引入两个系统，实现了工程菌生长和生产的平衡，有利于提高法尼烯
生产效率
E. 该策略也可推广至酿酒酵母多种代谢途径的调控，应用前景广阔
ADE
【解析】(1)题干信息：在酿酒酵母中表达拟南芥的细胞分裂素合成酶和细胞分裂素受体.并使细胞分裂素响应途径与酵母菌内源的Ypd1－Skn7信号转导途径结合，构建出群体密度感应系统；可见目的基因从拟南芥中筛选与获取，然后构建基因表达载体，接着导入酿酒酵母，经检测鉴定后获得工程菌。(2)题干信息：当菌体密度增至足够高时，扩散到胞外的细胞分裂素浓度达到一定阈值，会进入细胞与受体结合，可知基因A应该为细胞分裂素受体基因，①应该为持续表达下游基因的启动子，启动细胞分裂素受体基因转录；Skn7与特定启动子中一段重复序列(SD)结合，导致下游基因从低表达状态显著上调表达水平，通过选择适当的下游基因，实现了细胞分裂素信号的正反馈激活，可知基因B为细胞分裂素合成酶基因，②和③是含有SD的启动子。
(3)分析题图酵母菌群体密度感应系统可知，只有荧光蛋白基因可以被替换，故为将群体密度感应系统和IAA诱导的蛋白降解系统整合入酿酒酵母，需要将群体密度感应系统中的荧光蛋白基因替换为IAA合成酶基因；题干信息IAA诱导的蛋白降解系统，需要IAA蛋白降解决定子与目标蛋白融合基因，故还需导入IAA蛋白降解决定子对应的DNA序列与E酶基因的融合基因替换酵母菌内源的E酶基因。
(4)利用酿酒酵母工业生产法尼烯涉及酵母菌培养和群体密度感应系统和IAA诱导的蛋白降解系统，而前者属于发酵工程，后者属于基因工程技术，A正确；转录是由DNA到RNA的过程，由mRNA到蛋白质的过程是翻译；文中的两个系统均属于翻译水平的代谢调控手段，B错误；依据题意可知，工程菌大量增殖后，细胞分裂素合成多，IAA合成多，利于F酶催化FPP合成法尼烯，C错误；题干信息可知，酿酒酵母可利用F酶将法尼基焦磷酸(FPP)合成为法尼烯，E酶会与F酶竞争FPP催化合成麦角固醇，麦角固醇过少时严重影响菌体数量增加；通过引入两个系统促进E酶降解有利于法尼烯的合成，由此可知，通过引入两个系统，实现了工程菌生长和生产的平衡，有利于提高法尼烯生产效率，D正确；题干信息：酿酒酵母作为极具潜力的细胞工厂，经遗传改造后被广泛地应用于生物燃料、化工产品、医药保健品等的合成；综合上述研究者的工作，可推测该策略也可推广至酿酒酵母多种代谢途径的调控，应用前景广阔，E正确。