【高考突破方案】选择性必修三 专题10 微专题9　PCR和基因编辑技术 -讲义（教师版） 高考生物一轮复习

微专题九　PCR和基因编辑技术
一、PCR技术
(2024·山东期末)拟南芥中RGL1酶作为E3泛素连接酶(AtRZF1)的抑制因子在响应植物干旱胁迫中发挥着重要作用。研究发现，AtRZF1功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性。研究人员采用融合PCR技术(原理如图所示)将RGL1酶基因和AtRZF1基因连接起来构建融合基因以研究两种基因的相互作用。下列说法正确的是(　　)
A.RGL1酶在植物干旱胁迫响应中起到正调控作用
B.图中第一阶段经过1次PCR循环即可获得双链等长的DNA
C.图中第二阶段构建融合基因时能够起到“搭桥融合”作用的引物有4种
D.融合PCR技术操作过程中的每个阶段都需经历两次降温和一次升温
【审题关键】信息①：融合PCR技术是一个新名词，要认真识图，明白原理；
信息②：由于DNA聚合酶都是从5′端到3′端复制子链，因此引物应结合到模板的3′端；
信息③：由第一阶段知，人为增加了引物2和引物3的5′端的一段序列；
信息④：由第二阶段知，人为增加的引物2和引物3的一段序列是可以碱基互补配对的。
【解析】据题意，E3泛素连接酶(AtRZF1)功能丧失突变体比野生型拟南芥具有更高的耐旱性，说明AtRZF1在干旱胁迫响应中起抑制作用，而RGL1酶作为AtRZF1的抑制因子，所以RGL1酶在植物干旱胁迫响应中起到正调控作用，A正确；由图可知，引物2和引物3的一端都添加了一段序列，所以经过1次PCR循环得到的是含有引物2、引物3的产物，其DNA双链不等长，该产物继续进行第二次扩增(循环)，才能获得双链等长的DNA，B错误；由图可知，融合PCR中是通过在引物2和引物3的一端添加能碱基互补配对的序列，从而在第二阶段利用这两段互补序列形成具有重叠链的PCR引物，所以能够起到“搭桥融合”作用的引物有2种，即引物2和引物3，C错误；PCR技术操作过程中，每轮循环是需要一次降温和两次升温，D错误。
【答案】A
1.PCR的原理
(1)DNA半保留复制。
(2)DNA的热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。
2.PCR的条件
(1)模板：DNA母链。
(2)原料：4种脱氧核苷酸。
(3)酶：耐高温的DNA聚合酶。
(4)能量。
(5)2种引物。
(6)含Mg2+的缓冲溶液。
3.PCR的过程
4.PCR产物测定方法：琼脂糖凝胶电泳。
5.PCR的应用
(1)目的基因的扩增。
(2)基因检测。
(3)测定DNA序列，进行亲子鉴定、遗传病的诊断、传染病毒的诊断。
6.常规PCR基础上改进的PCR分类
(1)逆转录PCR(RT－PCR)：提取总RNA，以mRNA为模板，利用寡脱氧胸腺苷酸或随机引物在逆转录酶的作用下合成cDNA，再以cDNA为模板进行常规的PCR扩增。
(2)实时PCR(real－time PCR)，是一种定量测定样品中特定DNA片段的聚合酶链式反应。反应中一般使用带有荧光标记的PCR引物，从而能够通过荧光监测每次PCR循环后扩增所得的产物的量。
(3)重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术，其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。
(4)融合PCR技术采用具有互补末端引物，形成具有重叠链的PCR产物，再通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。与重叠延伸PCR技术也有相似之处。
1.(2024·山东期中)荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA含量。其原理是：在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针，荧光探针两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光猝灭基团，探针完整时，发射基团发射的荧光信号被猝灭基团吸收，荧光监测系统接收不到荧光信号。当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号。即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如图所示)。下列相关叙述正确的是(　　)
A.扩增过程中引物先于探针结合到模板DNA上
B.在PCR系统中需加入解旋酶
C.荧光信号积累越多，说明PCR循环次数越多
D.若扩增n次，则其需要消耗2n-1个探针
【解析】C　基因扩增过程中需要特定的引物，该引物的作用是定位基因，与模板链结合并为子链的延伸提供起点，扩增过程中引物和探针应同时结合到模板DNA上，A错误；在PCR反应系统中无需加入解旋酶，可通过高温解旋DNA，B错误；据题干信息“即每扩增一次，就有一个荧光分子生成”可知，荧光信号积累越多，说明PCR循环次数越多，C正确；据题干信息“在PCR反应体系中每加入一对引物的同时加入一个与某模板链互补的荧光探针”，即每个DNA分子需要1个探针，扩增n次，可得到2n个DNA分子，则共需要消耗2n－1个探针，D错误。
2.(2024·山东一模)IKK激酶由IKKα、IKKβ和IKKγ三种亚基组成，该酶参与动物体内免疫细胞的分化。临床上发现某重症联合免疫缺陷(SCID)患儿的IKKβ基因编码区第1 183位碱基T突变为C。为研究该患儿发病机制，研究人员应用大引物PCR定点诱变技术获得突变基因，并培育出SCID模型小鼠。图1为定点诱变获得突变基因的过程。回答下列问题：
(1)在定点诱变获取突变基因时，PCR1中使用的引物有______________，PCR2中使用的引物有____________。PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理，其目的是__________________。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应采取的措施是________________________。
(3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶Sac Ⅰ、Hind Ⅲ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切的优点是____________________。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果如图2。据此结果推测SCID患者免疫缺陷产生的机制是__________________________________________________________________________。
【答案】(1)引物A、引物C　引物B、大引物b
引物之间能结合，会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程　(2)增加大分子模板DNA彻底变性的概率　适当提高复性温度
(3)防止质粒和目的基因的自身环化及反向连接　IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化
【解析】(1)在PCR反应体系中，除需要加入引物和IKKβ基因外，还需要加入Taq酶(耐高温的DNA聚合酶)、4种脱氧核苷酸(原料)、缓冲液(维持pH)、Mg2+(激活DNA聚合酶)等；在图1获取突变基因过程中，分析题图可知，在PCR1中，需要两种引物，将来在切取IKKβ基因时，需要在基因的左侧用限制酶Hind Ⅲ来切割，在基因的右侧用限制酶Sac Ⅰ来切割，因此在该基因的左端应有限制酶Hind Ⅲ识别的序列，在基因的右端应有限制酶Sac Ⅰ识别的序列，因此在PCR1中结合到基因右端的引物序列从5′到3′端的开始部位应含有限制酶Sac Ⅰ识别的序列，所以要用到引物C，从题图中看，另一个引物从5′到3′端的序列中开始部位应含有突变碱基C，所以要用到引物A。从图中看，在PCR2中，有一个引物结合到了基因的左端，在它从5′到3′的序列的开始部位应含有限制酶Hind Ⅲ识别的序列，所以要用到引物B，而另外的一个引物就是大引物中的一条链，它应该结合到基因的右端，且从5′到3′端的序列中开始部位应含有Sac Ⅰ识别的序列，从图中看，它是大引物的b链。由于PCR1和PCR2过程使用的引物之间能结合，因而会干扰引物和模板链的结合，影响PCR过程，因此PCR1和PCR2不能在同一个反应体系中进行，需要分开进行。(2)PCR在第一个循环之前通常将DNA样品加热至95 ℃数分钟进行预变性处理，这样可以增加大分子模板DNA彻底变性的概率，为后续的PCR过程创造条件。由于大引物较长，含C与G的碱基较多，为减少非目标基因的获得，在PCR2复性过程中应适当提高复性温度，便于引物与模板链的结合。(3)培育模型鼠的过程中，需用限制酶Sac Ⅰ、Hind Ⅲ对突变基因和载体进行双酶切，双酶切能保证质粒和目的基因的正确连接，避免自身环化及反向连接。研究人员经鉴定、筛选获得一只转基因杂合鼠HE，让HE与野生鼠杂交得F1，F1雌雄鼠随机交配得F2。对F2中纯合野生鼠WT、纯合突变鼠HO、杂合鼠HE三种小鼠胸腺淋巴细胞中组成IKK激酶的三种亚基进行提纯和电泳，结果显示HO小鼠体内不含IKKβ或含量很少，因而可推测IKKβ基因突变导致IKKβ含量减少，IKK激酶活力降低，不利于免疫细胞的分化，进而导致SCID患者表现为免疫缺陷。
3.(2024·四川期末)某科研小组采用PCR 技术构建了红色荧光蛋白基因(dsred2)和α－淀粉酶基因(amy)的dsred2－amy融合基因，其过程如图所示，其中引物②和引物③中部分序列(黑色区域)可互补配对。下列说法错误的是(　　)
A.利用PCR 技术扩增基因时不需要解旋酶来打开 DNA 双链
B.不能在同一反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增
C.dsred2基因和amy基因混合后只能得到一种类型的杂交链
D.杂交链延伸得到dsred2－amy融合基因的过程不需要加引物
【解析】C　利用PCR 技术扩增基因时，高温变性使DNA双链解旋，不需要解旋酶来打开 DNA 双链，A正确；引物之间的结合会干扰引物和模板链的结合，从而影响PCR过程，因此不能在同一个反应体系中进行dsred2基因和amy基因的扩增，B正确；dsred2基因和amy基因混合可以得到两种类型的杂交链，C错误；杂交链延伸得到dsred2－amy融合基因的过程中，不需要加入引物，两条母链的起始位置的碱基序列即为引物，可以作为子链合成的引物，D正确。
二、基因组编辑技术
(2024·浙江模拟预测)CRISPR/Cas9基因编辑系统是由Cas9蛋白和向导RNA构成的复合体，可利用向导RNA识别并结合特定DNA序列，引导Cas9蛋白对目标DNA进行编辑，其过程如下图所示。利用该系统对某种野生食用真菌进行了DNA编辑，培育出转基因真菌。CRISPR/Cas9系统的相关基因能否成功转入受体细胞是遗传转化体系建立的重要前提。回答下列问题：
(1)将真菌细胞置于一定浓度的PEG溶液中，一段时间后再与重组DNA混合可以提高转化效率，其中PEG的作用是______________________。在转基因真菌的培育中，一般以原生质体为主，极少尝试菌丝体和孢子，说明遗传转化体系中_____________的选择是制约转化效率的另一重要因素。
(2)野生型核基因组中含有pyrg、ura3基因，这两类基因表达可产生乳清核苷－5′－磷酸脱羧酶，参与催化尿嘧啶的合成，通过CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA与____________基因中的序列进行____________，将Cas9蛋白带到靶基因附近并对基因进行剪切。当目标基因序列被破坏后，菌体表现为尿嘧啶营养缺陷，只能在含有____________和5－氟乳清酸的培养基上正常生长，利用这种选择作用可以初步区分出野生型真菌及完成了转化的转基因品系。研究发现CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否则极易脱靶即难以精准找到目标DNA序列，脱靶最可能的原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)Cas9蛋白和向导RNA基因在真菌细胞中表达水平低，可通过在基因一端添加合适的__________来构建高表达基因编辑系统，还可以通过基因优化，使其转录产物中含有真菌细胞高频使用________，以此来提高翻译效率。
【审题关键】信息①：据“可利用向导RNA识别并结合特定DNA序列”，知向导RNA应该是通过碱基互补配对结合特定DNA序列；
信息②：据(2)中“CRISPR/Cas9编辑系统中的向导RNA序列长度应当适中否则极易脱靶即难以精准找到目标DNA序列”，可知脱靶应该与RNA序列的长度有关，若长度过短，特异性差，容易与其他基因的某些区域结合；
信息③：据“引导Cas9蛋白对目标DNA进行编辑”，知Cas9蛋白应该相当于是一种限制酶。
【答案】(1)增加细胞膜的通透性　受体细胞　(2)pyrg、ura3　互补配对(或特异性识别并结合)　尿嘧啶　其他基因序列中也有与向导RNA互补配对的序列，造成向导RNA错误结合到有关基因区域　(3)启动子　密码子
1.基因组编辑的含义：对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。
2.应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9。
3.CRISPR/Cas9组分及功能
短链RNA(sgRNA、向导RNA) 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合
细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂
4.CRISPR/Cas9技术的主要应用
(1)基因敲除。
(2)特异突变引入。
(3)定点转基因。
5.CRISPR/Cas9技术的风险
(1)基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。
(2)对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。
4.(2024·河南月考)我国科研人员通过基因治疗，成功治愈了全球首例β－地中海贫血症患者。研究人员运用高精准变形式碱基编辑器(tBE)，对患者自体造血干细胞中的单个碱基进行编辑，以重新激活γ－珠蛋白的表达，最终使患者血红蛋白水平恢复正常，过程如图1所示。相较于图2中基于 CRISPR 技术的β－地贫基因编辑疗法，该方法见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变或片段缺失。请回答下列问题：
(1)基因治疗中通常用到AAV(腺病毒)等，AAV的作用为________________________。
(2)据图2分析CRISPR 技术中gRNA 起________(填“导向”或“切割”)的作用。相比 CRISPR 技术(切断双链)，tBE 不需要破坏DNA 双链就能对致病的碱基突变进行校正，由此可知tBE 具有___________________________________________________________________________(写出1点即可)的优点。
(3)为了检测目的基因是否翻译成γ－珠蛋白，可采用的技术为__________________。采用自体造血干细胞编辑移植的优点为________________________(写出1点即可)。
(4)欲验证图1中基因治疗方法对β－地中海贫血症患者的疗效，请写出大致实验思路。(注：使用的测量工具无需说明，β－地中海贫血症志愿者、健康志愿者多人)_________________________________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】(1)作为载体将目的基因导入(受体)细胞　(2)导向　高安全性、高特异性；针对单碱基进行编辑，正常不发生错编或误编的情况；见效更快、疗效更好，且不引发患者基因组突变和片段缺失　(3)抗原—抗体杂交　不发生免疫排斥反应　(4)将生理状态、性别、年龄等相同的β－地中海贫血症志愿者随机均分为甲、乙两组，分别测量二者的血红蛋白水平后，对甲组采用碱基编码疗法进行治疗，乙组不采用，在相同且适宜条件下生活一段时间后，分别再次测量二者的血红蛋白水平，并与健康志愿者的血红蛋白水平进行比较
5.(2024·福建期末)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，原理如图1所示：由一条单链向导SgRNA引导Cas9蛋白识别并切割目标DNA双链的特定序列，以敲除目标基因或插入新的基因。我国科学家领衔的团队利用CRISPR/Cas9等技术，将的人突变亨廷顿舞蹈症致病基因(HTT基因)部分片段，插入猪基因组内，获得了人—猪“镶嵌”HTT基因，利用胚胎工程技术成功地构建了亨廷顿舞蹈症的动物模型。回答下列问题：
图1
图2
(1)PCR技术是获得HTT基因常用的方法，制备PCR反应体系时，向缓冲液中分别加入HTT基因模板、4种脱氧核糖核苷酸、________、________________等进行扩增。
(2)SgRNA可识别并特异性结合目标DNA序列，二者结合所遵循的原则是____________________。Cas9蛋白相当于______酶，可催化______________键断裂，可在受体细胞中特定的基因位点进行切割，改变基因结构。
(3)CRISPR/Cas9基因编辑技术可通过改变______________的碱基序列，从而任意编辑基因组上的各种靶序列。若要将目标基因从目标DNA上切除下来，一般需要设计____种不同的SgRNA。
(4)含有插入序列的猪胚胎成纤维细胞在体外培养时通过细胞分裂，数量不断增加，当细胞贴壁生长到表面相互接触时，细胞停止分裂增殖，这种现象称为__________。将含有插入序列的猪胚胎成纤维细胞的细胞核导入去核的卵母细胞的过程，称为________________。此后进行体外胚胎培养并移植到代孕母猪体内，最终获得亨廷顿舞蹈症动物模型。
(5)CRISPR/Cas9基因编辑技术存在一定的脱靶效应：正常情况下，SgRNA通过20个核苷酸长度的引导序列与目标DNA序列发生碱基互补配对准确识别需要编辑的位点，然而有时会发生第18～20个碱基不匹配的情况，此时，Cas9可通过一个手指状的结构紧紧抓住错配区稳定住RNA—DNA双链，从而为Cas9切割DNA铺平道路，但这可能会导致Cas9在错误的基因位点切割双链DNA，从而引发潜在风险。请就如何降低脱靶效应，提出可能的思路：________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
【答案】(1)引物　耐高温的DNA聚合酶　(2)碱基互补配对原则　限制　磷酸二酯　(3)SgRNA的引导序列　2　(4)接触抑制　动物体细胞核移植　(5)设计SgRNA的长度为17个碱基，避免第18～20个碱基不匹配时，导致错误位点的切割