【高考突破方案】专题20 发酵工程 -（高考专题分类汇编）高考生物一轮复习
文档属性
| 名称 | 【高考突破方案】专题20 发酵工程 -（高考专题分类汇编）高考生物一轮复习 |
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| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 3.1MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2025-12-08 17:16:57 | ||
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文档简介
专题20 发酵工程
考点1 微生物的培养与应用
1．（2024·贵州·高考真题）生物学实验中合理选择材料和研究方法是顺利完成实验的前提条件。下列叙述错误的是（ ）
A．稀释涂布平板法既可分离菌株又可用于计数
B．进行胚胎分割时通常是在原肠胚期进行分割
C．获取马铃薯脱毒苗常选取茎尖进行组织培养
D．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端
【答案】B
【分析】胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
【详解】A、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌，A正确；
B、在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，B错误；
C、马铃薯顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，所以可以选取马铃薯茎尖进行组织培养获得脱毒苗，C正确；
D、不同的限制酶识别的DNA序列不同，但使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端，D正确。
故选B。
2．（2024·江西·高考真题）井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种（JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长）发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是（ ）
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
【答案】D
【分析】1、发酵工程生产的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。
2、 产品不同，分离提纯的方法般不同。（1）如果产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；（2） 如果产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取。
3、 发酵过程中要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
4、 发酵过程一般来说都是在常温常压下进行，条件温和、反应安全，原料简单、污染小，反应专一性强， 因而可以得到较为专的产物。
【详解】A、基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，A错误；
B、JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会影响JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，B错误；
C、在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；
D、JGs是一种放线菌，菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。
故选D。
3．（2024·湖南·高考真题）微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是（ ）
A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦ C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
【答案】D
【分析】微生物平板划线和培养的过程中要保证始终没有杂菌的污染，接种环、培养基、试管等都需要进行灭菌，实验操作过程应该在酒精灯火焰旁进行。
【详解】由图可知，②中拨出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。
①③④⑤正确，故选D。
4．（2024·浙江·高考真题）脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是（ ）
A．镍是组成脲酶的重要元素
B．镍能提高尿素水解反应的活化能
C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
【答案】B
【分析】1、在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
【详解】A、根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；
B、脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；
C、产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确；
D、产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。
故选B。
5．（2024·河北·高考真题）下列相关实验操作正确的是（ ）
A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板
D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
【答案】B
【分析】PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸。琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。
【详解】A、PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A错误；
B、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确；
C、将配制的酵母培养基高温灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误；
D、将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死），蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D错误。
故选B。
6．（2024·山东·高考真题）酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z，trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞，而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上，生长情况如图。据图分析，3种酶在该合成途径中的作用顺序为（ ）
A．X→Y→Z B．Z→Y→X C．Y→X→Z D．Z→X→Y
【答案】A
【分析】由图可知，接种时，相当于在培养基表面划了一个三角形的三条边。左边那条边线是用trpY突变型菌液划线接种的，右边那个边是用trpX突变型菌液接种的，最下面那个边是用trpZ突变型菌液划线接种的。最终结果是，trpY那条接种线左下方出现了又黑又粗的明显的菌落，trpX那条接种线两头出现了明显的菌落，而trpZ那条接种线，没有长出明显的菌落，。
【详解】ABCD、添加少量色氨酸，突变体菌株可以生长，色氨酸合成途径的中间产物积累后可排出胞外，进入培养基后，通过扩散，从而给其他突变型提供代谢原料，帮助其长出明显的菌落。trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体，据图可知，trpX不能为trpY和trpZ提供原料，trpY不能为trpZ提供原料，trpZ可以为trpX、trpY的生长提供原料，推测3种酶在该合成途径中的作用顺序为X→Y→Z。
故选A。
7．（2024·吉林·高考真题）某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是（ ）
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
【答案】CD
【分析】1、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技 术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
2、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来 统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养 基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活 菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含 有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30 300 的平板进行计数。
【详解】A、题干信息：某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；
B、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；
C、题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；
D、题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。
故选CD。
8．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题：
(1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。
(2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。
(3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。
(4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。
【答案】(1) 选择 水 无机盐 氮源
(2) 基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒）
(3)诱变育种
(4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀
【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子；
2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。
【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。
（2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。
（3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。
（4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。
9．（2024·全国·高考真题）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是 。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为 个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是 ，冷却的目的是 。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 ，判断依据是 。（答出两点即可）
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈 色。
【答案】(1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌
(2)5000
(3) 杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染 防止温度过高杀死菌种
(4) A A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高
(5)黑
【分析】平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
【详解】（1）显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法计数只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故前者的数量多于后者。
（2）从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1mL细菌原液中细菌浓度=（菌落数÷菌液体积）×稀释倍数=（100÷200 μL）×10个=5000个。
（3）菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
（4）A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。
（5）大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。
10．（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。
(3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。
生物质原料 降解率（%） 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物
11．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
【答案】(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
12．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。
【答案】(1)碳源、氮源
(2) PT7、PBAD 和PBAD 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
(4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
（2）题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
（4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
（5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
13．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
【答案】(1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长
(2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
(3) 划线分离 振荡培养
(4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量数量多
【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相近，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。
【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。
（2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。
（3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
（4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。
考点2 传统发酵技术与应用
（2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
柿子具有较高的营养价值和药用价值。采用液体发酵法可酿制出醋香浓郁、酸味纯正的柿子醋，提高了柿子的经济价值。柿子醋的酿造工艺流程如图所示。
1．下列关于酒精发酵和醋酸发酵的叙述，错误的是（ ）
A．酒精发酵是吸能反应 B．酒精发酵在无氧条件下进行
C．醋酸发酵是放能反应 D．醋酸发酵在有氧条件下进行
2．下列关于柿子醋酿造过程的叙述，错误的是（ ）
A．加酶榨汁环节加入果胶酶，有利于提高柿子汁产量
B．酒精发酵前可对柿子汁进行杀菌，以利于酒精发酵
C．若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵
D．用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味相同
【答案】1．A 2．D
【分析】酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，需要的是无氧条件；醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，需要的是有氧条件。
1．A、酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，属于放能反应，A错误；
B、酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，需要的是无氧条件，B正确；
C、醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，属于放能反应，C正确；
D、醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，需要的是有氧条件，D正确。
故选A。
2．A、加酶榨汁环节加入果胶酶，破坏其细胞壁，有利于提高柿子汁产量，A正确；
B、酒精发酵前可以可对柿子汁进行杀菌，再接种酵母菌，以利于酒精发酵，B正确；
C、醋酸菌是好氧细菌当阳气糖原充足时可以将糖分解成醋酸，当缺少糖原时可以将乙醇转化为一圈，再有乙醛转化为醋酸，因此若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵，C正确；
D、用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味不相同，D错误。
故选D。
3．（2024·湖北·高考真题）制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是（ ）
A．食用醋的酸味主要来源于乙酸 B．醋酸菌不适宜在无氧条件下生存
C．醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶 D．葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
【答案】D
【分析】参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的果糖分解成醋酸。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【详解】A、食用醋的酸味主要来自醋酸，醋酸学名乙酸，A正确；
B、醋酸菌是好氧型细菌，不适宜在无氧的条件下生存，B正确；
C、在制醋时，缺失原料的情况下，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，因此醋酸菌体内含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确；
D、醋酸菌属于细菌，没有核膜包被的细胞核和众多细胞器，因此没有线粒体，D错误。
故选D。
4．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。
(1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。
(2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。
(3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。
(4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。
【答案】(1) 酒精/C2H5OH 能量
(2)无氧/无氧
(3)不能，该实验只能证明随着H2O2 浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2 浓度会持续上升；该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到培养基上无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件
(4)过氧化氢酶/H2O2 酶
【分析】（1）在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖；
（2）在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳。
【详解】（1）酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精（C2H5OH）和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。
（2）由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。
（3）依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降（酵母菌受损程度加深），但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升；由题意可知，该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到含不同浓度H2O2的培养基上进行无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件，所以不能完全证实上述推测。
（4）过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。
考点3 发酵工程与应用
1．（2024·江西·高考真题）井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种（JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长）发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是（ ）
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
【答案】D
【分析】1、发酵工程生产的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。
2、 产品不同，分离提纯的方法般不同。（1）如果产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；（2） 如果产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取。
3、 发酵过程中要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
4、 发酵过程一般来说都是在常温常压下进行，条件温和、反应安全，原料简单、污染小，反应专一性强， 因而可以得到较为专的产物。
【详解】A、基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，A错误；
B、JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会影响JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，B错误；
C、在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；
D、JGs是一种放线菌，菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。
故选D。
2．（2024·山东·高考真题）在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是（ ）
A．相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B．发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C．发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D．发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
【答案】D
【分析】发酵工程：（1）定义：利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品；主要为微生物细胞本身或者其代谢产物。（2）分离、提纯产物：产品若是微生物细胞，在发酵结束后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥；产品若是微生物代谢物，则根据产物的性质采取 适当的提取、分离和纯化措施。
【详解】A、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧，相同菌体密度下，菌球体越大越不利于菌体与氧气接触，柠檬酸产生速率越慢，A正确；
B、菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制，发酵中期添加一定量的硫酸铵，提高铵离子浓度，菌体内可提高柠檬酸产量，B正确；
C、发酵过程中pH下降导致细菌生命活动所必须的酶失活，可抑制大部分细菌的生长，C正确；
D、发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行分离、纯化、浓缩、干燥等一系列操作后才能获得柠檬酸产品，D错误。
故选D。
3．（2024·河北·高考真题）中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述正确的是（ ）
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在或环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
【答案】ABD
【分析】1、在发酵过程中分泌酶不同，它们所发挥的作用就不同，因此传统酿造不仅仅需要酵母菌，还要有其他菌种。
2、酒曲中微生物（如曲霉）分泌的淀粉酶可将谷物中的淀粉转变成单糖等，会使米酒具有甜味，进一步在酵母菌的作用下产生酒精。
3、酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。
【详解】A、白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；
B、窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；
C、酵母菌是是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，C错误；
D、谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。
故选ABD。
4．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。
(1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。
(2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。
(3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。
(4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。
【答案】(1) 酒精/C2H5OH 能量
(2)无氧/无氧
(3)不能，该实验只能证明随着H2O2 浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2 浓度会持续上升；该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到培养基上无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件
(4)过氧化氢酶/H2O2 酶
【分析】（1）在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖；
（2）在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳。
【详解】（1）酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精（C2H5OH）和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。
（2）由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。
（3）依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降（酵母菌受损程度加深），但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升；由题意可知，该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到含不同浓度H2O2的培养基上进行无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件，所以不能完全证实上述推测。
（4）过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。
5．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
【答案】(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
考点1 微生物的培养与应用
1．（2024·贵州·高考真题）生物学实验中合理选择材料和研究方法是顺利完成实验的前提条件。下列叙述错误的是（ ）
A．稀释涂布平板法既可分离菌株又可用于计数
B．进行胚胎分割时通常是在原肠胚期进行分割
C．获取马铃薯脱毒苗常选取茎尖进行组织培养
D．使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端
【答案】B
【分析】胚胎分割是指采用机械方法将早期胚胎切割成2等份、4等份或8等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。
【详解】A、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌，A正确；
B、在进行胚胎分割时，应选择发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚，B错误；
C、马铃薯顶端分生区附近（如茎尖）的病毒极少，甚至无病毒，所以可以选取马铃薯茎尖进行组织培养获得脱毒苗，C正确；
D、不同的限制酶识别的DNA序列不同，但使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端，D正确。
故选B。
2．（2024·江西·高考真题）井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种（JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长）发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是（ ）
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
【答案】D
【分析】1、发酵工程生产的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。
2、 产品不同，分离提纯的方法般不同。（1）如果产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；（2） 如果产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取。
3、 发酵过程中要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
4、 发酵过程一般来说都是在常温常压下进行，条件温和、反应安全，原料简单、污染小，反应专一性强， 因而可以得到较为专的产物。
【详解】A、基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，A错误；
B、JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会影响JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，B错误；
C、在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；
D、JGs是一种放线菌，菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。
故选D。
3．（2024·湖南·高考真题）微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是（ ）
A．①②⑤⑥ B．③④⑥⑦ C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
【答案】D
【分析】微生物平板划线和培养的过程中要保证始终没有杂菌的污染，接种环、培养基、试管等都需要进行灭菌，实验操作过程应该在酒精灯火焰旁进行。
【详解】由图可知，②中拨出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。
①③④⑤正确，故选D。
4．（2024·浙江·高考真题）脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。脲酶被去除镍后失去活性。下列叙述错误的是（ ）
A．镍是组成脲酶的重要元素
B．镍能提高尿素水解反应的活化能
C．产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖
D．以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌
【答案】B
【分析】1、在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为选择培养基。
2、只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用以尿素作为唯一氮源的选择培养基，可以从土壤中分离出分解尿素的细菌。
【详解】A、根据题意，脲酶被去除镍后失去活性，说明镍是组成脲酶的重要元素，A正确；
B、脲酶催化尿素水解的机理为降低化学反应所需的活化能，镍作为脲酶的重要组成元素，应该与降低尿素水解反应的活化能有关，B错误；
C、产脲酶细菌可利用NH4Cl里的氮源进行代谢活动，因此产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖，C正确；
D、产脲酶细菌能利用脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源，不能产脲酶的细菌则无法分解尿素获得氮源，因此以尿素为唯一氮源的培养基可用于筛选产脲酶细菌，D正确。
故选B。
5．（2024·河北·高考真题）下列相关实验操作正确的是（ ）
A．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料
B．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果
C．将配制的酵母培养基煮沸并冷却后，在酒精灯火焰旁倒平板
D．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落
【答案】B
【分析】PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸。琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。
【详解】A、PCR的原理是DNA复制，DNA的单体是脱氧核糖核苷酸，配制PCR反应体系时，加入4种脱氧核糖核苷酸的等量混合液作为扩增原料，A错误；
B、琼脂糖凝胶制备中加入的核酸染料能与DNA分子结合，凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来，B正确；
C、将配制的酵母培养基高温灭菌并冷却到不烫手（50℃左右）后，在酒精灯火焰旁倒平板，C错误；
D、将接种环烧红，待冷却后（避免菌种被烫死），蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落，D错误。
故选B。
6．（2024·山东·高考真题）酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z，trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞，而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上，生长情况如图。据图分析，3种酶在该合成途径中的作用顺序为（ ）
A．X→Y→Z B．Z→Y→X C．Y→X→Z D．Z→X→Y
【答案】A
【分析】由图可知，接种时，相当于在培养基表面划了一个三角形的三条边。左边那条边线是用trpY突变型菌液划线接种的，右边那个边是用trpX突变型菌液接种的，最下面那个边是用trpZ突变型菌液划线接种的。最终结果是，trpY那条接种线左下方出现了又黑又粗的明显的菌落，trpX那条接种线两头出现了明显的菌落，而trpZ那条接种线，没有长出明显的菌落，。
【详解】ABCD、添加少量色氨酸，突变体菌株可以生长，色氨酸合成途径的中间产物积累后可排出胞外，进入培养基后，通过扩散，从而给其他突变型提供代谢原料，帮助其长出明显的菌落。trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体，据图可知，trpX不能为trpY和trpZ提供原料，trpY不能为trpZ提供原料，trpZ可以为trpX、trpY的生长提供原料，推测3种酶在该合成途径中的作用顺序为X→Y→Z。
故选A。
7．（2024·吉林·高考真题）某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作正确的是（ ）
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从感病植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
【答案】CD
【分析】1、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染。无菌技 术应围绕着如何避免杂菌的污染展开，主要包括消毒和灭菌。
2、稀释涂布平板法除可以用于分离微生物外，也常用来 统计样品中活菌的数目。当样品的稀释度足够高时，培养 基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活 菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含 有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数为30 300 的平板进行计数。
【详解】A、题干信息：某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，故在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从未感病植株上采集样品，A错误；
B、获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染；将采集的样品充分消毒后，用无菌水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测，B错误；
C、题图可知，样品研磨后进行了稀释涂布，可见将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落，C正确；
D、题图抗性检测可知，判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组，对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑，实验组接种内生菌得到病原菌菌斑，然后比较对照组和实验组的菌斑大小，实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好，D正确。
故选CD。
8．（2024·江西·高考真题）聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）是一种聚酯塑料，会造成环境污染。磷脂酶可催化PET降解。为获得高产磷脂酶的微生物，研究人员试验了2种方法。回答下列问题：
(1)方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯（一种磷脂类物质）为唯一碳源制备 培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有 、 、 等营养物质。
(2)方法2采用 技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要 、 、 等“分子工具”。
(3)除了上述2种方法之外，还可以通过 技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物。
(4)将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是 。
【答案】(1) 选择 水 无机盐 氮源
(2) 基因工程（或转基因） 限制酶 DNA连接酶 载体（或质粒）
(3)诱变育种
(4)不同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀
【分析】1、培养基的基本成分：水、无机盐、碳源、氮源及特殊生长因子；
2、微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，常用来统计样品活菌数目的方法是稀释涂布平板法。
【详解】（1）方法1从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯为唯一碳源制备选择培养基，在该培养基中只有能利用磷脂酰乙醇酯的微生物能生长，其他微生物的生长被抑制，进而获得筛选出所需要的微生物，为了提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有水分、无机盐和氮源等营养物质，同时还需要提供微生物生长所需要的外界环境条件。
（2）方法2采用基因工程技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因，即目的基因外，该技术还需要限制酶、DNA连接酶和载体（或质粒）等“分子工具”，进而可以实现目的基因表达载体的构建。
（3）除了上述2种方法之外，还可以通过诱变育种技术非定向改造现有微生物，筛选获得能够高产磷脂酶的微生物，该该技术的原理是基因突变，由于基因突变具有不定向性，因而该技术具有盲目性。
（4）将以上获得的微生物接种到鉴别培养基（在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂）平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，即倒平板过程中没有经过定量检测，且平板倒置的实际可能也会影响平板中培养基厚度的不同，因此不同平板中培养基量的差异以及平板内培养基厚度不均匀以及平板间厚度不均匀都会影响实验结果的判断，因此可采用降解圈的直径和菌落直径的比值作为判断依据。
9．（2024·全国·高考真题）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题。
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是 。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为 个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是 ，冷却的目的是 。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是 ，判断依据是 。（答出两点即可）
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈 色。
【答案】(1)前者微生物分散的活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌
(2)5000
(3) 杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染 防止温度过高杀死菌种
(4) A A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高
(5)黑
【分析】平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作。将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。分为系列稀释操作和涂布平板操作两步。
【详解】（1）显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法计数只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故前者的数量多于后者。
（2）从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1mL细菌原液中细菌浓度=（菌落数÷菌液体积）×稀释倍数=（100÷200 μL）×10个=5000个。
（3）菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止涂布器上可能存在的微生物污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
（4）A消毒液活菌数减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。
（5）大肠杆菌在伊红美蓝培养基上生长的菌落呈黑色。
10．（2024·甘肃·高考真题）源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶（如下图），研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是 。高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了 。
(2)过程④扩增不同目的基因片段需要的关键酶是 。
(3)过程⑤在基因工程中称为 ，该过程需要的主要酶有 。
(4)过程⑥大肠杆菌作为受体细胞的优点有 。该过程用Ca2+处理细胞，使其处于一种 的生理状态。
(5)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是 （答出两点）。
生物质原料 降解率（%） 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物
11．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
【答案】(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
12．（2024·广东·高考真题）驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶（可催化酪氨酸形成黑色素）的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路（图一）。
回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的 （答两点）等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜（菌体和 BC膜的复合物）。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶（T7RNAP）及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体（光控原理见图二a，载体的部分结构见图二b）。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD（被工程菌 RNA 聚合酶识别）和特异型启动子PT7（仅被T7RNAP识别）。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为 ，理由是 。
(3)光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 （答两点）。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是 。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路 。
【答案】(1)碳源、氮源
(2) PT7、PBAD 和PBAD 基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株
(4)该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
(5)将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
【分析】基因工程技术的基本步骤：（1）目的基因的获取。（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。（4）目的基因的检测与鉴定。
【详解】（1）培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。
（2）题图二a分析可知，蓝光照射下，T7RNAP N端-nMag与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图一，蓝光处理后，RNA聚合酶（T7RNAP）识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。
（3）光控表达载体携带大观霉素（抗生素）抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌；去除丢失质粒的菌株的作用。
（4）由小问2分析可知，细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。
（5）由小问2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，则需要将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)。
13．（2024·浙江·高考真题）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。回答下列问题：
(1)锌转运蛋白基因M、N克隆。以该植物 为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。根据序列信息设计引物进行PCR扩增，PCR每个循环第一步是进行热变性处理，该处理的效果类似于生物体内 的作用效果。PCR产物琼脂糖凝胶电泳时，DNA分子因为含 而带负电荷，凝胶点样孔端应靠近电泳槽负极接口；当2个PCR产物分子量接近时，若延长电泳时间，凝胶中这2个条带之间的距离会 。回收DNA片段，连接至克隆载体，转化大肠杆菌，测序验证。
(2)重组表达载体构建。分别将含M、N基因的重组质粒和酵母表达载体同时进行双酶切处理，然后利用 连接，将得到的重组表达载体转化大肠杆菌。用PCR快速验证重组转化是否成功。此反应可以用大肠杆菌悬液当模板的原因是 。
(3)酵母菌转化。取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，直接在固体培养基进行 培养，活化后接种至液体培养基，采用 以扩大菌体数量，用重组表达载体转化酵母菌。检测M、N基因在受体细胞中的表达水平，无显著差异。
(4)转基因酵母功能鉴定。分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用 法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.0006，然后各取10μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为 。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是 ，依据是 。
注：OD600为波长600nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
【答案】(1) 根 解旋酶 磷酸基团 变长
(2) DNA连接酶 热变性使大肠杆菌内的DNA外溢
(3) 划线分离 振荡培养
(4) 梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母+空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量数量多
【分析】由图中光谱吸收值可知，锌吸收缺陷型酵母+N基因表达载体组吸收值与野生型酵母+空载体组相近，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。
【详解】（1）由题意可知，锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，反转录合成cDNA。热变性处理的目的是使DNA解螺旋，相当于生物体内解旋酶的效果。DNA分子因为含有磷酸基团而带负电荷，所以其点样孔端应靠近电泳槽负极接口。随着时间的推移，不同分子量的DNA分子速度不同，时间越长，距离差越大。
（2）内切酶处理后的质粒和目的基因，用DNA连接酶进行连接。由于RCR过程中热变性使大肠杆菌内的DNA外溢，所以可用大肠杆菌悬液当模板，利用PCR快速验证重组转化是否成功。
（3）冻存的酵母菌浓度较高，必须稀释后涂布，也可直接在固体培养基上划线接种后进行培养，进行活化，然后转至液体培养基增殖，培养过程中进行震荡，有利于增加培养液的溶氧量和使酵母菌和培养液充分接触，从而快速增殖。
（4）由题意可知，菌液稀释后OD600为0.06、0.006和0.0006，说明其进行10指数的梯度稀释。由图可知，锌吸收缺陷型酵母+空载体组不会吸收锌，为阴性对照。由图中光谱吸收值可知，转入N基因的这组酵母菌数量数量多，说明N转运Zn2+能力更强。
考点2 传统发酵技术与应用
（2024·浙江·高考真题）阅读下列材料，完成下面小题。
柿子具有较高的营养价值和药用价值。采用液体发酵法可酿制出醋香浓郁、酸味纯正的柿子醋，提高了柿子的经济价值。柿子醋的酿造工艺流程如图所示。
1．下列关于酒精发酵和醋酸发酵的叙述，错误的是（ ）
A．酒精发酵是吸能反应 B．酒精发酵在无氧条件下进行
C．醋酸发酵是放能反应 D．醋酸发酵在有氧条件下进行
2．下列关于柿子醋酿造过程的叙述，错误的是（ ）
A．加酶榨汁环节加入果胶酶，有利于提高柿子汁产量
B．酒精发酵前可对柿子汁进行杀菌，以利于酒精发酵
C．若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵
D．用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味相同
【答案】1．A 2．D
【分析】酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，需要的是无氧条件；醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，需要的是有氧条件。
1．A、酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，属于放能反应，A错误；
B、酒精发酵是利用的酵母菌的无氧呼吸，需要的是无氧条件，B正确；
C、醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，属于放能反应，C正确；
D、醋酸发酵利用的是醋酸菌的有氧呼吸，需要的是有氧条件，D正确。
故选A。
2．A、加酶榨汁环节加入果胶酶，破坏其细胞壁，有利于提高柿子汁产量，A正确；
B、酒精发酵前可以可对柿子汁进行杀菌，再接种酵母菌，以利于酒精发酵，B正确；
C、醋酸菌是好氧细菌当阳气糖原充足时可以将糖分解成醋酸，当缺少糖原时可以将乙醇转化为一圈，再有乙醛转化为醋酸，因此若柿子酒的酒精度过高，应稀释后再用于醋酸发酵，C正确；
D、用不同品种和成熟度的柿子酿造的柿子醋风味不相同，D错误。
故选D。
3．（2024·湖北·高考真题）制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是（ ）
A．食用醋的酸味主要来源于乙酸 B．醋酸菌不适宜在无氧条件下生存
C．醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶 D．葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
【答案】D
【分析】参与果醋制作的微生物是醋酸菌，其新陈代谢类型是异养需氧型。果醋制作的原理：当氧气、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的果糖分解成醋酸。当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。
【详解】A、食用醋的酸味主要来自醋酸，醋酸学名乙酸，A正确；
B、醋酸菌是好氧型细菌，不适宜在无氧的条件下生存，B正确；
C、在制醋时，缺失原料的情况下，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸，因此醋酸菌体内含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确；
D、醋酸菌属于细菌，没有核膜包被的细胞核和众多细胞器，因此没有线粒体，D错误。
故选D。
4．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。
(1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。
(2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。
(3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。
(4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。
【答案】(1) 酒精/C2H5OH 能量
(2)无氧/无氧
(3)不能，该实验只能证明随着H2O2 浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2 浓度会持续上升；该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到培养基上无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件
(4)过氧化氢酶/H2O2 酶
【分析】（1）在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖；
（2）在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳。
【详解】（1）酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精（C2H5OH）和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。
（2）由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。
（3）依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降（酵母菌受损程度加深），但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升；由题意可知，该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到含不同浓度H2O2的培养基上进行无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件，所以不能完全证实上述推测。
（4）过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。
考点3 发酵工程与应用
1．（2024·江西·高考真题）井冈霉素是我国科学家发现的一种氨基寡糖类抗生素，它由吸水链霉菌井冈变种（JGs，一种放线菌，菌体呈丝状生长）发酵而来，在水稻病害防治等领域中得到广泛应用。下列关于JGs发酵生产井冈霉素的叙述，正确的是（ ）
A．JGs可发酵生产井冈霉素，因为它含有能够编码井冈霉素的基因
B．JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程不影响井冈霉素的产量
C．提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量
D．稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化
【答案】D
【分析】1、发酵工程生产的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身。
2、 产品不同，分离提纯的方法般不同。（1）如果产品是菌体，可采用过滤，沉淀等方法将菌体从培养液中分离出来；（2） 如果产品是代谢产物，可用萃取、蒸馏、离子交换等方法进行提取。
3、 发酵过程中要严格控制温度、pH、溶氧、通气量与转速等发酵条件。
4、 发酵过程一般来说都是在常温常压下进行，条件温和、反应安全，原料简单、污染小，反应专一性强， 因而可以得到较为专的产物。
【详解】A、基因表达的产物是蛋白质，而井冈霉素是JGs发酵生产的一种氨基寡糖类抗生素，A错误；
B、JGs接入发酵罐前需要扩大培养，该过程会影响JGs的数量，进而影响井冈霉素的产量，B错误；
C、在一定范围内提高JGs发酵培养基中营养物质的浓度，会提高井冈霉素的产量，但若浓度过大，反而会降低井冈霉素的产量，C错误；
D、JGs是一种放线菌，菌体呈丝状生长，形成的菌落难以区分，因此稀释涂布平板法不宜用于监控JGs发酵过程中活细胞数量的变化，D正确。
故选D。
2．（2024·山东·高考真题）在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是（ ）
A．相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B．发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C．发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D．发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
【答案】D
【分析】发酵工程：（1）定义：利用微生物的特定功能，通过现代工程技术，规模化生产对人类有用的产品；主要为微生物细胞本身或者其代谢产物。（2）分离、提纯产物：产品若是微生物细胞，在发酵结束后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥；产品若是微生物代谢物，则根据产物的性质采取 适当的提取、分离和纯化措施。
【详解】A、黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧，相同菌体密度下，菌球体越大越不利于菌体与氧气接触，柠檬酸产生速率越慢，A正确；
B、菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制，发酵中期添加一定量的硫酸铵，提高铵离子浓度，菌体内可提高柠檬酸产量，B正确；
C、发酵过程中pH下降导致细菌生命活动所必须的酶失活，可抑制大部分细菌的生长，C正确；
D、发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行分离、纯化、浓缩、干燥等一系列操作后才能获得柠檬酸产品，D错误。
故选D。
3．（2024·河北·高考真题）中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述正确的是（ ）
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在或环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
【答案】ABD
【分析】1、在发酵过程中分泌酶不同，它们所发挥的作用就不同，因此传统酿造不仅仅需要酵母菌，还要有其他菌种。
2、酒曲中微生物（如曲霉）分泌的淀粉酶可将谷物中的淀粉转变成单糖等，会使米酒具有甜味，进一步在酵母菌的作用下产生酒精。
3、酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸，大量繁殖，把糖分解成二氧化碳和水；在无氧条件下，酵母菌能进行酒精发酵。
【详解】A、白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；
B、窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；
C、酵母菌是是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的条件下进行，C错误；
D、谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。
故选ABD。
4．（2024·北京·高考真题）啤酒经酵母菌发酵酿制而成。生产中，需从密闭的发酵罐中采集酵母菌用于再发酵，而直接开罐采集的传统方式会损失一些占比很低的独特菌种。研究者探究了不同氧气含量下酵母菌的生长繁殖及相关调控，以优化采集条件。
(1)酵母菌是兼性厌氧微生物，在密闭发酵罐中会产生 和CO2。有氧培养时，酵母菌增殖速度明显快于无氧培养，原因是酵母菌进行有氧呼吸，产生大量 。
(2)本实验中，采集是指取样并培养4天。在不同的气体条件下从发酵罐中采集酵母菌，统计菌落数（图甲）。由结果可知，有利于保留占比很低菌种的采集条件是 。
(3)根据上述实验结果可知，采集酵母菌时O2浓度的陡然变化会导致部分菌体死亡。研究者推测，酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的过氧化氢（H2O2）浓度会持续上升，使酵母菌受损。已知H2O2能扩散进出细胞。研究者在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，分别接种至含不同浓度H2O2的培养基上，无氧培养后得到如图乙所示结果。请判断该实验能否完全证实上述推测，并说明理由 。
(4)上述推测经证实后，研究者在有氧条件下从发酵罐中取样并分为两组，A组菌液直接滴加到H2O2溶液中，无气泡产生；B组菌液有氧培养4天后，取与A组活菌数相同的菌液，滴加到H2O2溶液中，出现明显气泡。结果说明，酵母菌可通过产生 以抵抗H2O2的伤害。
【答案】(1) 酒精/C2H5OH 能量
(2)无氧/无氧
(3)不能，该实验只能证明随着H2O2 浓度的持续上升，酵母菌存活率下降(酵母菌受损程度加深)，但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2 浓度会持续上升；该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到培养基上无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件
(4)过氧化氢酶/H2O2 酶
【分析】（1）在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖；
（2）在无氧条件下，酵母菌进行无氧呼吸产生酒精和二氧化碳。
【详解】（1）酵母菌在密闭发酵罐中进行无氧呼吸，会产生酒精（C2H5OH）和CO2。有氧培养时，酵母菌进行有氧呼吸，有机物被彻底氧化分解，产生大量能量，而无氧呼吸中有机物不能彻底分解，只产生少量能量，故有氧培养时酵母菌增殖速度明显快于无氧培养。
（2）由图甲结果可知，无氧/无氧条件下，菌落数最多，因此有利于保留占比很低菌种的采集条件是无氧/无氧。
（3）依据图乙结果可知，随着H2O2浓度的持续上升，酵母菌存活率下降（酵母菌受损程度加深），但不能证明酵母菌接触O2的最初阶段，细胞产生的H2O2浓度会持续上升；由题意可知，该实验在无氧条件下从发酵罐中取出酵母菌，接种到含不同浓度H2O2的培养基上进行无氧培养，并没有创造O2浓度陡然变化的条件，所以不能完全证实上述推测。
（4）过氧化氢酶能催化H2O2分解出现明显气泡，因此实验结果说明，酵母菌可通过产生过氧化氢酶以抵抗H2O2的伤害。
5．（2024·安徽·高考真题）丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题。
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是 。
(2)使用BamH I和 SalI限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上（如图）。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是 。
、
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的 ，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100g.L-1和15 g.L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉（90 g.L-1、100 g.L-1、110 g.L-1）和酵母粉（12 g.L-1、15g.L-1、18 g.L-1）筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置 （填数字）组实验（重复组不计算在内）。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是 。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经 ，最终获得发酵产品。
【答案】(1)在 PCR 反应中，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温,在高温条件下依然具有活性
(2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3) 乳酸或有机酸 9
(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
(5)提取、分离、纯化
【分析】PCR反应过程:变性→复性→延伸。变性:当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，复性:温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，延伸:72℃左右时，Taq酶有最大活性，可使DNA新链由5'端向3'端延伸。
【详解】（1）在 PCR 反应中，变性的温度需要90℃以上，需要利用高温使 DNA 双链解旋，普通的 DNA聚合酶在高温下会变性失活，而 Tag DNA 聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。
（2）据图可知，使用BamH I和 Sal I限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。
（3）碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3=9组实验。
（4）大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。
（5）发酵工程一般包括菌种的选育，扩大培养，培养基的配制、灭菌，接种，发酵，产品分离、提纯等方面，因此发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离、纯化，最终获得发酵产品。
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