第14讲 基因工程及其应用
考点1 基因工程的基本工具与基本操作程序
1.基因工程标记基因的分类和应用
分类:标记基因可分为选择基因和报告基因,二者都可以用来筛选标记目的基因是否成功转化。
(1)选择基因。
①直接选择:载体上的选择基因一般是一些抗生素抗性基因,在受体细胞的培养体系中加入该抗生素,就可以只保留转入载体的受体细胞,原理如图所示:
②间接选择:将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时,如果插入某种抗生素抗性基因内部,则会导致该抗生素抗性基因失活。
③常用方法——“影印法”筛选含有重组质粒的细胞。
ⅰ.将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养,能生长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌,如图1、2、3、4、5菌落。
ⅱ.再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上,如图能生长的菌落为2、3、4,则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落,如图1、5菌落。
(2)报告基因。
①报告基因则是指其编码产物能够被快速测定且不依赖于外界压力的一类基因。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。
②常用方法——“蓝白斑”筛选含重组质粒的细胞。
大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色物质,在经人工插入外源基因后,大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断,无法形成完整的β-半乳糖苷酶,故不能对无色化合物X-gal进行切割,菌落呈白色。
2.限制酶切割位点选择的四点要求
(1)位置要求:限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因结构内部(若载体有多个标记基因,并非都不能破坏,要至少保留一个),所选酶切位点应位于启动子和终止子之间。
(2)对象要求。
①单酶切:为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接,通常使用同一种限制酶将两者切割,用DNA连接酶连接后,会出现外源DNA片段与载体正向连接(A),外源DNA片段与载体反向连接(B),多个外源DNA片段串联后与一个载体互连(C),多个载体与多个外源DNA片段混连(D),载体自身环化(E),外源DNA自身环化(F)等。
②双酶切:双酶切可以确保目的基因的正确插入,要求两个酶切位点位于目的基因的两侧,如图所示可选择PstⅠ和BamHⅠ,但也要注意酶切位点个数和相对位置,如不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。
限制酶选择的两点特殊情况
①不同的限制酶所产生的末端相同,两端也可连接,如MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同,可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因,用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
②虽然双酶切可以避免载体和目的基因的自身环化,但也避免不了目的基因双片段或多片段环化。
(3)数量要求:如果所选限制酶的切割位点不止一个,如图选择SmaⅠ进行酶切,则切割重组后可能会丢失复制原点,那么载体进入受体细胞后不能自主复制,所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。
(4)特殊要求:例如根据Ti质粒的T-DNA片段选择限制酶,设切割目的基因的限制酶为XbaⅠ和SacⅠ,则甲、乙、丁质粒均不宜选取,丙质粒宜选取。
3.基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的筛选与获取。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建。
①启动子和终止子:启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上);终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)上。
②目的基因插入位置:启动子与终止子之间。
③利用乳腺生物反应器生产药物时,应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
(3)将目的基因导入受体细胞。
农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
①两次拼接:第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位;第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
②两次导入:第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌;第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因,还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
1.(2024·河北卷,T22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病,我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN,使其在水稻胚乳特异表达,制备获得r2HN疫苗,并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题:
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子,若使r2HN仅在水稻胚乳表达,GtP应为_____________________________________启动子。Nos为终止子,其作用为_______________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此,可选择限制酶____________和____________对r2HN基因与载体进行酶切,用于表达载体的构建。
(2)利用____________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况,可通过PCR技术检测_____________________,通过___________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后,通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后,r2HN纯合体植株的占比为___________。选择纯合体进行后续研究的原因是_____________________________________。
(4)制备r2HN疫苗后,为研究其免疫效果,对实验组鸡进行接种,对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平,结果如图2所示。据此分析,获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的____________免疫和____________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是_________________________________________________(答出两点即可)。
[关键能力] (1)信息获取与加工。
由题意可知,若使r2HN基因仅在水稻胚乳表达,GtP(启动子)应为水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子,其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点,用KpnⅠ酶切会破坏启动子,Nos下游含有SacⅠ的酶切位点,用SacⅠ酶切会使目的基因无法插入启动子和终止子之间,进而无法表达,故构建基因表达载体时,可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。
(2)建构数学模型。
选择单一位点插入目的基因的植株(用AO表示)进行自交一代,构建分离定律杂合子自交模型:
配子 雌配子
A(1/2) O(1/2)
雄配子 A(1/2) r2HN纯合体植株(AA)(1/4) 杂合体植株(AO)(1/4)
O(1/2) 杂合体植株(AO)(1/4) 无r2HN基因的纯合体植株(OO)(1/4)
r2HN纯合体植株(AA)占1/4,无r2HN基因的纯合体植株(OO)占1/4,杂合体植株(AO)占1/2。由于纯合体植株遗传性状稳定,故选择r2HN纯合体植株进行后续研究。
(3)实验探究能力。
该实验为简单的对照实验,需对实验结果进行分析评价。
实验原理:通过体液免疫,机体可产生较多抗体,通过细胞免疫,机体可产生较多细胞毒性T细胞。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平,检测疫苗效果。
结果及结论:由题图可知,实验组的抗体和CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)的相对值明显高于对照组,因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
2.(2024·新课标卷,T35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题:
(1)限制酶切割的化学键是___________。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是__________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和_____________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是_______________;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是____________________________________。
(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是________________________________(答出两点即可)。
考向一 科学思维与社会责任
1.某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基,短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段与质粒连接成功构建了基因表达载体。下列叙述正确的是( )
A.其中一个引物序列为3'—TGCGCAGT—5'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对质粒进行酶切,至少获得2个片段
D.构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA聚合酶
2.大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体,具有氨苄青霉素抗性基因,该质粒中某限制酶的唯一切点位于LacZ基因中。在特定的选择培养基中,若LacZ基因没有被破坏,则大肠杆菌菌落呈蓝色;若LacZ基因被破坏,则菌落呈白色。下列关于图中操作的叙述,正确的是( )
A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶
B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌,需用Ca2+处理大肠杆菌
C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色
D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
3.(2025·湖北模拟)中国的野生百合资源种类繁多,分布广泛。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L,该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图1。图2是一种Ti质粒的结构示意图,其中基因gus编码GUS酶,GUS酶活性可反映启动子活性。回答下列问题:
(1)启动子pL的基本组成单位是_______________。
(2)扩增基因L时,PCR反应中常使用TaqDNA聚合酶而不使用普通的DNA聚合酶,主要原因为________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割,需在引物上添加相应的限制酶识别序列,该限制酶识别序列应添加在引物的____________(填“3'端”或“5'端”)。
(3)为研究病原微生物对基因L的启动子pL活性的影响,应选用_________酶同时切割基因L和Ti质粒,构建表达载体。不宜选用SacⅠ、SmaⅠ酶酶切的原因是__________________________________。
(4)将上述重组质粒导入烟草,随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图3。由此可知,三种病原微生物都能诱导启动子pL的活性增强,其中___________的诱导作用最强。现发现栽培种百合B中也有基因L,但其上游的启动子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中基因L的表达量,培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为________________________。
考向二 科学探究与语言表达
4.(2025·湖北模拟)基因驱动效应是一种利用遗传学手段提高特定基因在种群中传播速度的技术。我国科学家构建了一个人工基因驱动系统CAIN,该系统由三部分组成(如图甲所示):gRNA/Cas9复合体靶向编辑NPG1基因(该基因编码花粉管发育的必需蛋白),作为“毒药”阻断花粉粒萌发;重编码的、不受编辑作用的NPG1基因,作为“解药”使携带该系统的花粉粒恢复萌发;货物基因可根据实际研究需求进行选择。
注:表示启动子;RFP为红色荧光蛋白。
回答下列问题:
(1)通过农杆菌转化法将CAIN系统整合到拟南芥染色体,经过筛选获得单一位点插入的转基因植株T1,并在其细胞内表达gRNA和Cas9基因。gRNA可识别靶基因,引导Cas9切割____________(填化学键名称)使其断裂。据图乙分析,编辑后NPG1功能失活的原因是________________________。
注:图为编辑前后一对同源染色体上NPG1基因非模板链的部分序列。
(2)为实现基因驱动并追踪携带CAIN系统的后代,图甲中的启动子①②及③控制的基因应依次在____________(填下列选项字母)中表达,并简述启动子②选择该选项的理由:__________________________________。
A.体细胞
B.造孢细胞(可发育成花粉母细胞)
C.种子
D.花粉粒(由花粉母细胞经减数分裂产生)
(3)以T1植株为父本与野生型杂交,F1与野生型母本回交,获得F2。若F2红色荧光种子的比例为____________,表明CAIN系统可发挥预期作用。
(4)某农田使用除草剂后效果下降,在农业生产上用CAIN系统提高除草效果,请简述如何利用或改造CAIN系统以达到上述目的:__________________________________。
考点2 基因工程的应用与蛋白质工程
1.基因工程的应用
不仅可以利用基因工程菌生产药物,还可以将目的基因与乳腺组织中特异性表达的基因启动子结合导入哺乳动物受精卵中,利用转基因动物生产所需的蛋白质,这称为乳腺生物反应器。
2.蛋白质工程与基因工程的比较
蛋白质工程的2项应用
①蛋白质工程可以改造现有的蛋白质,或者生产自然界中没有的蛋白质。
②蛋白质工程通过改造基因的遗传信息实现对蛋白质结构和功能的改造,而不是对蛋白质直接操作。
1.(2024·天津卷,T5)胰岛素的研发走过了动物提取—化学合成—重组胰岛素生产—胰岛素类似物生产等历程。下列有关叙述错误的是( )
A.动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞
B.氨基酸是化学合成胰岛素的原料
C.用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子
D.利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物
2.(2022·湖南卷,T22)水蛭是我国的传统中药材,主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一,具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构,提高其抗凝血活性。回答下列问题:
(1)蛋白质工程流程如图所示,物质a是____________,物质b是____________。在生产过程中,物质b可能不同,合成的蛋白质空间构象却相同,原因是__________________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸,基因工程中获取目的基因的常用方法有_________________、____________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是____________________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后,分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性,结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的____________(填“种类”或“含量”)有关,导致其活性不同的原因是__________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异,简要写出实验设计思路:_________________________________________________________________。
考向 科学思维与社会责任
1.(2025·邢台模拟)人白细胞介素-2(IL-2)是一种细胞因子,含有3个半胱氨酸,分别位于第58、105、125位,其中第58位与第105位半胱氨酸之间形成的二硫键对保持IL-2活性起重要作用。用大肠杆菌生产IL-2,为保证产物活性,将IL-2基因中编码第125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列。下列叙述错误的是( )
A.突变的IL-2基因的序列发生了碱基对的增添
B.天然的和基因工程生产的IL-2均在核糖体上合成
C.突变的IL-2基因的表达降低了二硫键错配的可能
D.大肠杆菌中IL-2基因的复制和表达遵循中心法则
2.(2025·武汉模拟)水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼,可用于监测水体E物质,如图中ERE和UAS是两种诱导型启动子,分别被E物质—受体复合物和Gal4蛋白特异性激活,启动下游基因表达。下列叙述错误的是( )
A.根据题意可知,斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B.用ERE直接驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度
C.用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D.基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
第14讲 基因工程及其应用
考点1 基因工程的基本工具与基本操作程序
考源·核心整合
3.(1)基因文库 PCR 逆转录 (2)RNA聚合酶 (3)农杆菌转化法 显微注射法 (4)抗原—抗体杂交 抗性接种实验
考题·经典再研
1.答案 (1)水稻胚乳细胞特异表达基因的 终止转录 HindⅢ EcoRⅠ (2)农杆菌转化 r2HN 是否转录出mRNA 抗原—抗体杂交 (3)1/4 纯合体自交后代不发生性状分离
(4)体液 细胞 (5)不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
2.答案 (1)磷酸二酯键 保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性,确保N基因能够顺利表达 (2)C—G、U—A、A—T (3)菌株B2的基因组 无PCR产物 (4)无空气污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,高效利用秸秆资源等
解析 (1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知,该过程是将重组质粒特定位点接入M1、M2,再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1+启动子+N基因+终止子+M2),再接入B1基因组中,得到B2,因此在M1和M2之间,需要保证N基因完整性,同时需要保证N基因能够正常表达,因此需要把M1接入启动子之前,M2接入终止子之后。(2)根据所给信息,向导RNA需要与对应DNA进行结合,结合期间,RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对,根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要验证是否插入重组后的片段甲,因此所用模板为菌株B2的基因组,如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因,如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。因为片段甲被替换,因此在重组片段甲(M1+启动子+N基因+终止子+M2)中,没有引物P4的结合位置,因此使用引物P3、P4进行PCR时,无法获得PCR产物。(4)秸秆焚烧严重污染环境,且有很大的火灾隐患,与此同时,焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费,可以从上述角度进行论述。例如:无空气污染;更安全,无火灾隐患;分解效率更高,高效利用秸秆资源等。
考向·命题趋势
1.C 解析 由于引物只能引导子链从5'到3',根据碱基互补配对原则,其中一个引物序列为5'—TGCGCAGT—3',A项错误;根据三种酶的酶切位点,左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的,右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的,B项错误;用步骤①的酶对载体进行酶切,使用了NheⅠ和CfoⅠ进行切割,根据其识别位点以及原本DNA的序列,切割之后至少获得了2个片段,C项正确;构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA连接酶,D项错误。
2.B 解析 分析题图可知,在加入试管1之前,质粒和目的基因已经被切割,故试管1中应加入DNA连接酶,A项错误;试管2中用Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,B项正确;能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白色,C项错误;若大肠杆菌的菌落为蓝色,则LacZ基因没有被破坏,即导入大肠杆菌的是普通质粒,试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养,D项错误。
3.答案 (1)脱氧核糖核苷酸(或脱氧核苷酸) (2)PCR反应时需要加热,Taq DNA聚合酶耐高温(而普通的DNA聚合酶在高温下会失活) 5'端 (3)HindⅢ、BamHⅠ SacⅠ、SmaⅠ酶酶切后基因L的启动子pL被切掉(破坏),没有连接到Ti质粒上,同时会将Ti质粒上的基因gus切掉,无法通过GUS酶活性研究启动子的活性 (4)交链格孢 (野生百合中基因L的启动子)pL
解析 (1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,启动子是一段DNA片段,其基本组成单位是脱氧核糖核苷酸(或脱氧核苷酸)。(2)在PCR反应中,需要高温使DNA双链解聚为单链,Taq DNA聚合酶耐高温,普通的DNA聚合酶在高温下会失活。以单链DNA为模板,在DNA聚合酶作用下进行延伸,将脱氧核苷酸加到引物的3'端,引物的3'端也是决定PCR引物结合特异性的关键部分,因此引物的5'端可以用于添加额外的序列,如限制酶识别序列,而不会影响引物的特异性结合。(3)为研究病原微生物对基因L的启动子pL活性的影响,必须将基因L的启动子pL连接到质粒上,根据目的基因片段以及质粒上限制酶的识别位点,可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切,以替换Ti质粒中的启动子,从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。据题图可知,如果使用SacⅠ和SmaⅠ酶处理基因L和Ti质粒,基因L的启动子pL和Ti质粒上的基因gus会被切掉(破坏),启动子pL没有连接到Ti质粒上,也没有基因gus表达GUS酶,因此无法通过GUS酶活性研究启动子的活性。(4)根据题图3的结果可知,交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高,可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种,可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。
4.答案 (1)磷酸二酯键 基因增添1个碱基(对),表达产物结构异常 (2)B、C、D 红色荧光蛋白基因需要在种子中表达,以追踪携带CAIN系统的后代 (3)100% (4)将RFP替换成提高植物对除草剂敏感性的基因(或将CAIN系统插入除草剂抗性基因,使其失活)
解析 (1)gRNA/Cas9复合体靶向编辑NPG1基因,gRNA可识别靶基因,引导Cas9切割磷酸二酯键,使基因断裂;结合题图乙可知,编辑后的NPG1增添一个碱基(对),表达产物结构异常,导致编辑后NPG1功能失活。(2)基因驱动效应是一种利用遗传学手段提高特定基因在种群中传播速度的技术。①是Cas9的启动子,需要在造孢细胞(可发育成花粉母细胞)中表达,②是红色荧光蛋白基因的启动子,红色荧光基因作为报告基因,需要在种子中表达,以追踪携带CAIN系统的后代;③为NPG1基因的启动子,在花粉粒细胞中表达,重新编码后花粉粒恢复萌发。故启动子①②及③控制的基因应依次在B、C、D中表达。(3)T1植株CAIN系统导入到一条染色体上,这样的植株为父本,产生的花粉萌发数∶不萌发数=1∶1,萌发的花粉会发红色荧光,因此与野生型杂交后代,若CAIN系统发挥了预期作用,则F2红色荧光种子的比例为100%。(4)植物基因驱动工具在抗除草剂杂草防治中的原理是破坏抗除草剂基因,并能够迅速扩散在整个种群中。将RFP替换成提高植物对除草剂敏感性的基因,或将CAIN插入除草剂抗性基因中破坏该基因功能,通过CAIN的高效遗传,经过多代杂交后,农田杂草群体能够恢复对除草剂的敏感性。
考点2 基因工程的应用与蛋白质工程
考源·核心整合
1.微生物 Ca2+处理法
考题·经典再研
1.C 解析 胰岛素在动物体内由胰岛B细胞合成后,经过胞吐作用释放出细胞,A项正确;胰岛素的化学本质是蛋白质,所以化学合成胰岛素的原料是氨基酸,B项正确;用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素不需要使用相同的启动子,因为两者属于不同的表达系统,大肠杆菌是原核生物表达系统,而乳腺生物反应器属于真核生物表达系统,启动子要求不同,C项错误;利用蛋白质工程技术可以对胰岛素进行改造,生成具有不同作用特性的胰岛素类似物,包括速效胰岛素,D项正确。
2.答案 (1)多肽链 mRNA mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性 (2)从基因文库中获取 人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同 (4)在相同条件下,将等量生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较四组血液凝固所需时间长短,所需时间越长,说明其抗凝血活性越大
解析 (1)蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性,因此mRNA不同,翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的,再盘曲、折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的原理是DNA半保留复制。(3)由题图可知,水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后,酶解产物的肽含量差别不大,但是抗凝血活性有所差异,所以推测该差异主要与肽的种类有关,两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同,从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。(4)在相同条件下,将等量生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验,比较四组血液凝固所需时间长短,所需时间越长,说明其抗凝血活性越大。
考向·命题趋势
1.A 解析 由题意可知,将IL-2基因中编码第125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列,只是一个氨基酸发生了改变,应该是发生了碱基替换,而不是碱基对的增添,A项错误;天然的和基因工程生产的IL-2的化学本质都是蛋白质,都是在核糖体上合成的,B项正确;第58位与第105位半胱氨酸之间形成的二硫键对保持IL-2活性起重要作用,突变的IL-2基因的表达降低了二硫键错配的可能,C项正确;大肠杆菌是原核生物(细胞生物),其遗传物质是DNA,基因的复制和表达都遵循中心法则,D项正确。
2.B 解析 将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼,可用于监测水体E物质,推测斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体,A项正确;结合题图可知,ERE诱导Gal4基因转录,其翻译产物Gal4蛋白激活UAS,使其驱动GFP基因表达,提高监测的灵敏度,这是一个间接驱动而非直接驱动的过程,B项错误;用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的,避免因有性生殖带来的基因污染,C项正确;基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵,受精卵全能性高,基因成功表达的概率大,D项正确。(共68张PPT)
第14讲 基因工程及其应用
考点1 基因工程的基本工具与
基本操作程序
1.基因工程标记基因的分类和应用
分类：标记基因可分为选择基因和报告基因，二者都可以用来筛选标记目的基因是否成功转化。
(1)选择基因。
①直接选择：载体上的选择基因一般是一些抗生素抗性基因，在受体细胞的培养体系中加入该抗生素，就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如图所示：
②间接选择：将目的基因插入含有两种抗生素抗性基因的载体时，如果插入某种抗生素抗性基因内部，则会导致该抗生素抗性基因失活。
③常用方法——“影印法”筛选含有重组质粒的细胞。
ⅰ.将混合处理后的细菌先放在含氨苄青霉素的培养基上培养，能生
长的是含重组质粒的细菌和含自身环化质粒的细菌，如图1、2、 3、4、5菌落。
ⅱ.再利用无菌的绒布影印到含有四环素的培养基上，如图能生长的菌落为2、3、4，则在含四环素培养基上不生长的即为含有目的基因的菌落，如图1、5菌落。
(2)报告基因。
①报告基因则是指其编码产物能够被快速测定且不依赖于外界压力的一类基因。常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-半乳糖苷酶基因(LacZ)等。
②常用方法——“蓝白斑”筛选含重组质粒的细胞。
大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和蓝色物质，在经人工插入外源基因后，大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因被插入的外源基因切断，无法形成完整的β-半乳糖苷酶，故不能对无色化合物X-gal进行切割，菌落呈白色。
2.限制酶切割位点选择的四点要求
(1)位置要求：限制酶的酶切位点不能位于启动子、终止子、复制原点、标记基因结构内部(若载体有多个标记基因，并非都不能破坏，要至少保留一个)，所选酶切位点应位于启动子和终止子之间。
(2)对象要求。
①单酶切：为使目的基因与载体形成的DNA片段末端能够连接，通常使用同一种限制酶将两者切割，用DNA连接酶连接后，会出现外
源DNA片段与载体正向连接(A)，外源DNA片段与载体反向连接
(B)，多个外源DNA片段串联后与一个载体互连(C)，多个载体与多个外源DNA片段混连(D)，载体自身环化(E)，外源DNA自身环化(F)等。
②双酶切：双酶切可以确保目的基因的正确插入，要求两个酶切位点位于目的基因的两侧，如图所示可选择PstⅠ和BamHⅠ，但也要注意酶切位点个数和相对位置，如不能选择XhoⅠ和BamHⅠ进行双酶切。
限制酶选择的两点特殊情况
①不同的限制酶所产生的末端相同，两端也可连接，如MunⅠ和EcoRⅠ酶切后产生的末端相同，可选择XhoⅠ和MunⅠ酶切目的基因，用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切质粒。
②虽然双酶切可以避免载体和目的基因的自身环化，但也避免不了目的基因双片段或多片段环化。
(3)数量要求：如果所选限制酶的切割位点不止一个，如图选择SmaⅠ进行酶切,则切割重组后可能会丢失复制原点，那么载体进入受体细胞后不能自主复制，所选限制酶在载体上最好只有一个酶切位点。
(4)特殊要求：例如根据Ti质粒
的T-DNA片段选择限制酶，设
切割目的基因的限制酶为XbaⅠ
和SacⅠ，则甲、乙、丁质粒均
不宜选取，丙质粒宜选取。
3.基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的筛选与获取。
基因文库
PCR
逆转录
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建。
RNA聚合酶
①启动子和终止子：启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA
上)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)上。
②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。
(3)将目的基因导入受体细胞。
农杆菌转化法
显微注射法
农杆菌转化法中的两次拼接和两次导入
①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上。
②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆 菌；第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
(4)目的基因的检测与鉴定。
抗原—抗
体杂交
抗性接
种实验
PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
1.(2024·河北卷，T22)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________________________启动子。Nos为终止子，其作用为__________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶____________和____________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
水稻胚乳细胞特异表达基因的
终止转录
HindⅢ
EcoRⅠ
(2)利用____________方法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测________________________，通过_________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合体植株的占比为_____。选择纯合体进行后续研究的原因是_______________________________。
农杆菌转化
r2HN 是否转录出mRNA
抗原—抗体杂交
1/4
纯合体自交后代不发生性状分离
(4)制备r2HN疫苗后，为研究其免疫效 果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的_______免疫和_______免疫。
体液
细胞
(5)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是______________ __________________________________(答出两点即可)。
不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
[关键能力] (1)信息获取与加工。
由题意可知，若使r2HN基因仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳细胞中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有KpnⅠ的酶切位点，用KpnⅠ酶切会破坏启动子，Nos下游含有SacⅠ的酶切位点，用SacⅠ酶切会使目的基因无法插入启动子和终止子之间，进而无法表达，故构建基因表达载体时，可选择限制酶HindⅢ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切。
(2)建构数学模型。
选择单一位点插入目的基因的植株(用AO表示)进行自交一代，构建分离定律杂合子自交模型：
配子 雌配子 A(1/2) O(1/2)
雄配子 A(1/2) r2HN纯合体植株(AA) (1/4) 杂合体植株(AO)(1/4)
O(1/2) 杂合体植株(AO)(1/4) 无r2HN基因的纯合体植株(OO)(1/4)
r2HN纯合体植株(AA)占1/4，无r2HN基因的纯合体植株(OO)占1/4，杂合体植株(AO)占1/2。由于纯合体植株遗传性状稳定，故选择r2HN纯合体植株进行后续研究。
(3)实验探究能力。
该实验为简单的对照实验，需对实验结果进行分析评价。
实验原理：通过体液免疫，机体可产生较多抗体，通过细胞免疫，机体可产生较多细胞毒性T细胞。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)水平，检测疫苗效果。
结果及结论：由题图可知，实验组的抗体和CD8+T细胞(细胞毒性T细胞)的相对值明显高于对照组，因此获得的r2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。
2.(2024·新课标卷，T35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题：
(1)限制酶切割的化学键是______________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是___________________________ ___________________________________________。
磷酸二酯键
保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和__________________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是_____________________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是_____________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是__________________________________________________________________(答出两点即可)。
C—G、U—A、A—T
菌株B2的基因组
无PCR产物
无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等
(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知，该过程是将重组质粒特定位点接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1+启动子+N基因+终止子+M2)，再接入B1基因组中，得到B2，因此在M1和M2之间，需要保证N基因完整性，同时需要保证N基因能够正常表达，因此需要把M1接入启动子之前，M2接入终止子之后。(2)根据所给信息，向导RNA需要与对应DNA进行结 合，结合期间，RNA的碱基会和DNA的碱基进行互补配对，根据碱基互补配对原则配对方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。
解析
(3)需要验证是否插入重组后的片段甲，因此所用模板为菌株B2的基因组，如果有PCR产物说明菌株B2中含有N基因，如果没有PCR产物说明菌株B2中不含N基因。因为片段甲被替换，因此在重组片段甲(M1+启动子+N基因+终止子+M2)中，没有引物P4的结合位置，因此使用引物P3、P4进行PCR时，无法获得PCR产物。(4)秸秆焚烧严重污染环境，且有很大的火灾隐患，与此同时，焚烧对于有机物中的能量是极大的浪费，可以从上述角度进行论述。例如：无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等。
解析
考向一 科学思维与社会责任
1.某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如图)，再用所得片段与质粒连接成功构建了基因表达载体。下列叙述正确的是( )
A.其中一个引物序列为3'—TGCGCAGT—5'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对质粒进行酶切，至少获得2个片段
D.构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA聚合酶
由于引物只能引导子链从5'到3'，根据碱基互补配对原则，其中一个引物序列为5'—TGCGCAGT—3'，A项错误；根据三种酶的酶切位点，左侧的黏性末端是使用NheⅠ切割形成的，右边的黏性末端是用CfoⅠ切割形成的，B项错误；用步骤①的酶对载体进行酶切，使用了NheⅠ和CfoⅠ进行切割，根据其识别位点以及原本DNA的序列，切割之后至少获得了2个片段，C项正确；构建基因表达载体时需要使用限制酶和DNA连接酶，D项错误。
解析
2.大肠杆菌pUC118质粒是基因工程中常用的一种载体，具有氨苄青霉素抗性基因，该质粒中某限制酶的唯一切点位于LacZ基因中。在特定的选择培养基中，若LacZ基因没有被破坏，则大肠杆菌菌落呈蓝色；若LacZ基因被破坏，则菌落呈白色。下列关于图中操作的叙述，正确的是( )
A.试管1中应加入限制酶和DNA连接酶
B.试管2中将重组质粒导入大肠杆菌，需用Ca2+处理大肠杆菌
C.能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落均呈现白色
D.试管3应选择蓝色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养
分析题图可知，在加入试管1之前，质粒和目的基因已经被切割，故试管1中应加入DNA连接酶，A项错误；试管2中用Ca2+处理大肠杆菌使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B项正确；能在氨苄青霉素培养基中存在的菌落呈现蓝色或白 色，C项错误；若大肠杆菌的菌落为蓝色，则LacZ基因没有被破坏，即导入大肠杆菌的是普通质粒，试管3应选择白色菌落内的大肠杆菌进行扩大培养，D项错误。
解析
3.(2025·湖北模拟)中国的野生百合资源种类繁多，分布广泛。研究人员从野生百合中获得一个抵抗尖孢镰刀菌侵染的基因L，该基因及其上游的启动子pL和下游的终止子结构如图1。图2是一种Ti质粒的结构示意图，其中基因gus编码GUS酶，GUS酶活性可反映启动子活性。回答下列问题：
(1)启动子pL的基本组成单位是_______________________________。
(2)扩增基因L时，PCR反应中常使用TaqDNA聚合酶而不使用普通的DNA聚合酶，主要原因为_____________________________________ _________________________________________。为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的______(填“3'端”或“5'端”)。
脱氧核糖核苷酸(或脱氧核苷酸)
PCR反应时需要加热，Taq DNA聚合酶耐高温(而普通的DNA聚合酶在高温下会失活)
5'端
(3)为研究病原微生物对基因L的启动子pL活性的影响，应选用__________________酶同时切割基因L和Ti质粒，构建表达载体。不宜选用SacⅠ、SmaⅠ酶酶切的原因是__________________________ _________________________________________________________________________________________________________________。
HindⅢ、BamHⅠ
SacⅠ、SmaⅠ酶酶切后基因
L的启动子pL被切掉(破坏)，没有连接到Ti质粒上，同时会将Ti质粒上的基因gus切掉，无法通过GUS酶活性研究启动子的活性
(4)将上述重组质粒导入烟草，随机选取3组转基因成功的烟草(P1、P2和P3)进行病原微生物胁迫,结果如图3。由此可知,三种病原微生物都能诱导启动子pL的活性增强,其中__________的诱导作用最强。现发现栽培种百合B中也有基因L,但其上游的启动
子与野生百合不同,且抗病性弱。若要提高该百合中基因L的表达量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为_______________________________。
交链格孢
(野生百合中基因L的启动子)pL
(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，启动子是一段DNA片段，其基本组成单位是脱氧核糖核苷酸(或脱氧核苷酸)。(2)在PCR反应中，需要高温使DNA双链解聚为单链，Taq DNA聚合 酶耐高温，普通的DNA聚合酶在高温下会失活。以单链DNA为模板，在DNA聚合酶作用下进行延伸，将脱氧核苷酸加到引物的3'端，引物的3'端也是决定PCR引物结合特异性的关键部分，因此引物的5'端可以用于添加额外的序列，如限制酶识别序列，而不会
解析
影响引物的特异性结合。(3)为研究病原微生物对基因L的启动子pL活性的影响，必须将基因L的启动子pL连接到质粒上，根据 目的基因片段以及质粒上限制酶的识别位点，可选用限制酶HindⅢ、BamHⅠ进行酶切，以替换Ti质粒中的启动子，从而达到根据GUS酶活性反映启动子活性的目的。据题图可知，如果使用SacⅠ和SmaⅠ酶处理基因L和Ti质粒，基因L的启动子pL和Ti质粒上的基因gus会被切掉(破坏)，启动子pL没有连接到Ti质粒上，也没
解析
有基因gus表达GUS酶，因此无法通过GUS酶活性研究启动子的活性。(4)根据题图3的结果可知，交链格孢处理的每一组转基因烟草中的GUS酶活性都最高，可确定其诱导作用最强。欲培育具有高抗病原微生物能力的百合新品种，可利用转基因技术将百合B中基因L的启动子替换为野生百合中基因L的启动子pL。
解析
考向二 科学探究与语言表达
4.(2025·湖北模拟)基因驱动效应是一种利用遗传学手段提高特定基因在种群中传播速度的技术。我国科学家构建了一个人工基因驱动系统CAIN，该系统由三部分组成(如图甲所示)：gRNA/Cas9复合体靶向编辑NPG1基因(该基因编码花粉管发育的必需蛋白)，作为“毒药”阻断花粉粒萌发；重编码的、不受编辑作用的NPG1基因，作为“解药”使携带该系统的花粉粒恢复萌发；货物基因可根据实际研究需求进行选择。
注： 表示启动子；RFP为红色荧光蛋白。
回答下列问题：
(1)通过农杆菌转化法将CAIN系统整合到拟南芥染色体，经过筛选获得单一位点插入的转基因植株T1，并在其细胞内表达gRNA和Cas9基因。gRNA可识别靶基因，引导Cas9切割____________(填化学键名称)使其断裂。据图乙分析，编辑后NPG1功能失活的原因是___________________ ____________________________。
注：图为编辑前后一对同源染色体上NPG1基因非模板链的部分序列。
磷酸二酯键
基因增添1个碱基
(对)，表达产物结构异常
(2)为实现基因驱动并追踪携带CAIN系统的后代，图甲中的启动子①②及③控制的基因应依次在____________(填下列选项字母)中表达，并简述启动子②选择该选项的理由：___________________________ ______________________________________。
A.体细胞
B.造孢细胞(可发育成花粉母细胞)
C.种子
D.花粉粒(由花粉母细胞经减数分裂产生)
B、C、D
红色荧光蛋白基因需要在种子中表达，以追踪携带CAIN系统的后代
(3)以T1植株为父本与野生型杂交，F1与野生型母本回交，获得F2。若F2红色荧光种子的比例为____________，表明CAIN系统可发挥预期作用。
(4)某农田使用除草剂后效果下降，在农业生产上用CAIN系统提高除草效果，请简述如何利用或改造CAIN系统以达到上述目的：______________________________________________________________________________________。
100%
将RFP替换成提高植物对除草剂敏感性的基因(或将CAIN系统插入除草剂抗性基因，使其失活)
(1)gRNA/Cas9复合体靶向编辑NPG1基因，gRNA可识别靶基因，引导Cas9切割磷酸二酯键，使基因断裂；结合题图乙可知，编辑后的NPG1增添一个碱基(对)，表达产物结构异常，导致编辑后NPG1功能失活。(2)基因驱动效应是一种利用遗传学手段提高特定基因在种群中传播速度的技术。①是Cas9的启动子，需要在造孢细胞(可发育成花粉母细胞)中表达，②是红色荧光蛋白基因的启动子，红色荧光基因作为报告基因，需要在种子中表达，以追
解析
踪携带CAIN系统的后代；③为NPG1基因的启动子，在花粉粒细胞中表达，重新编码后花粉粒恢复萌发。故启动子①②及③控制的基因应依次在B、C、D中表达。(3)T1植株CAIN系统导入到一条染色体上，这样的植株为父本，产生的花粉萌发数∶不萌发数=1∶1，萌发的花粉会发红色荧光，因此与野生型杂交后代，若CAIN系统发挥了预期作用，则F2红色荧光种子的比例为100%。
解析
(4)植物基因驱动工具在抗除草剂杂草防治中的原理是破坏抗除草剂基因，并能够迅速扩散在整个种群中。将RFP替换成提高植物对除草剂敏感性的基因，或将CAIN插入除草剂抗性基因中破坏该基因功能，通过CAIN的高效遗传，经过多代杂交后，农田杂草群体能够恢复对除草剂的敏感性。
解析
第14讲 基因工程及其应用
考点2 基因工程的应用与蛋白质工程
1.基因工程的应用
微生物
Ca2+处理法
不仅可以利用基因工程菌生产药物，还可以将目的基因与乳腺组织中特异性表达的基因启动子结合导入哺乳动物受精卵中，利用转基因动物生产所需的蛋白质，这称为乳腺生物反应器。
2.蛋白质工程与基因工程的比较
蛋白质工程的2项应用
①蛋白质工程可以改造现有的蛋白质，或者生产自然界中没有的蛋白质。
②蛋白质工程通过改造基因的遗传信息实现对蛋白质结构和功能的改造，而不是对蛋白质直接操作。
1.(2024·天津卷，T5)胰岛素的研发走过了动物提取—化学合成—重组胰岛素生产—胰岛素类似物生产等历程。下列有关叙述错误的是
( )
A.动物体内胰岛素由胰岛B细胞合成并胞吐出细胞
B.氨基酸是化学合成胰岛素的原料
C.用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素需相同的启动子
D.利用蛋白质工程可生产速效胰岛素等胰岛素类似物
胰岛素在动物体内由胰岛B细胞合成后，经过胞吐作用释放出细胞，A项正确；胰岛素的化学本质是蛋白质，所以化学合成胰岛素的原料是氨基酸，B项正确；用大肠杆菌和乳腺生物反应器生产胰岛素不需要使用相同的启动子，因为两者属于不同的表达系统，大肠杆菌是原核生物表达系统，而乳腺生物反应器属于真核生物表达系统，启动子要求不同，C项错误；利用蛋白质工程技术可以对胰岛素进行改造，生成具有不同作用特性的胰岛素类似物，包括速效胰岛素，D项正确。
解析
2.(2022·湖南卷，T22)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是_______，物质b是________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是__________________________________________。
多肽链
mRNA
mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有__________________、__________和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的基本原理是__________________。
从基因文库中获取
人工合成
DNA半保留复制
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是_____________________________________ __________________。
种类
酶处理后形成的肽中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路：
____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
在相同条件下，将等量生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验，比较四组血液凝固所需时间长短，所需时间越长，说明其抗凝血活性越大
(1)蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由于mRNA上决定氨基酸的密码子具有简并性，因此mRNA不同，翻译形成的多肽链中氨基酸序列有可能是相同的，再盘曲、折叠形成相同结构的蛋白质。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有从基因文库中获取、人工合成和利用PCR技术扩增。PCR技术遵循的原理是DNA半保留复制。
解析
(3)由题图可知，水蛭蛋白经两种蛋白酶处理后，酶解产物的肽含量差别不大，但是抗凝血活性有所差异，所以推测该差异主要与肽的种类有关，两种处理后酶解产物中氨基酸的种类、数目和排列顺序不同，从而导致两种处理后抗凝血活性有差异。(4)在相同条件下，将等量生理盐水、蛋白质工程改造后的水蛭素、水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素分别进行抗凝血实验，比较四组血液凝固所需时间长短，所需时间越长，说明其抗凝血活性越大。
解析
考向 科学思维与社会责任
1.(2025·邢台模拟)人白细胞介素-2(IL-2)是一种细胞因子，含有3个半胱氨酸，分别位于第58、105、125位，其中第58位与第105位半胱氨酸之间形成的二硫键对保持IL-2活性起重要作用。用大肠杆菌生产IL-2，为保证产物活性，将IL-2基因中编码第125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列。下列叙述错误的是( )
A.突变的IL-2基因的序列发生了碱基对的增添
B.天然的和基因工程生产的IL-2均在核糖体上合成
C.突变的IL-2基因的表达降低了二硫键错配的可能
D.大肠杆菌中IL-2基因的复制和表达遵循中心法则
由题意可知，将IL-2基因中编码第125位半胱氨酸的序列突变为丝氨酸序列，只是一个氨基酸发生了改变，应该是发生了碱基替 换，而不是碱基对的增添，A项错误；天然的和基因工程生产的IL-2的化学本质都是蛋白质，都是在核糖体上合成的，B项正确；第58位与第105位半胱氨酸之间形成的二硫键对保持IL-2活性起重要作用，突变的IL-2基因的表达降低了二硫键错配的可能，C项正确；大肠杆菌是原核生物(细胞生物)，其遗传物质是DNA，基因的复制和表达都遵循中心法则，D项正确。
解析
2.(2025·武汉模拟)水中E物质污染会导致鱼类雌性化异常。将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，如图中ERE和UAS是两种诱导型启动子，分别被E物质—受体复合物和Gal4蛋白特异性激活，启动下游基因表达。下列叙述错误的是( )
A.根据题意可知，斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体
B.用ERE直接驱动GFP基因表达可提高监测的灵敏度
C.用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的
D.基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵
将绿色荧光蛋白(GFP)基因、Gal4蛋白基因等转入斑马鱼，可用于监测水体E物质，推测斑马鱼的某些细胞存在E物质的受体，A项正确；结合题图可知，ERE诱导Gal4基因转录，其翻译产物Gal4蛋白激活UAS，使其驱动GFP基因表达，提高监测的灵敏度，这是一个间接驱动而非直接驱动的过程，B项错误；用于监测E物质污染的转基因斑马鱼最好是不育的，避免因有性生殖带来的基因污染，C项正确；基因表达载体最好以显微注射法导入斑马鱼受精卵，受精卵全能性高，基因成功表达的概率大，D项正确。
解析专题微练(十四) 基因工程及其应用
一、选择题
1.(2025·顺义模拟)转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累,可能与内源蛋白相互作用,产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素,科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因(如图)导入棉花细胞。下列相关叙述正确的是( )
A.使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接
B.选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接
C.可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞
D.融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累
2.化疗会造成癌症病人血小板减少。血小板生成素(TPO)可促进血小板产生。研究人员将含人TPO基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中,获得有生物活性的TPO并应用于临床。下列叙述错误的是( )
A.用PCR技术可获取和扩增人TPO基因
B.构建表达载体需要解旋酶和DNA聚合酶
C.表达载体包括TPO基因、标记基因、启动子和终止子等
D.用抗原—抗体杂交技术可检测TPO基因的表达情况
3.(2025·安康模拟)哺乳动物胃液中有凝乳酶,该酶能使牛奶中的蛋白质凝聚成乳酪,被广泛应用于奶酪和酸奶的制作。研究人员将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌或酵母菌的基因组中,通过工业发酵批量生产凝乳酶。下列有关叙述错误的是( )
A.用PCR扩增牛凝乳酶基因时,缓冲液中一般要添加能激活DNA聚合酶的Mg2+
B.构建的含牛凝乳酶基因的表达载体应包含启动子、标记基因、终止子等
C.将牛凝乳酶基因导入大肠杆菌时,常先用Ca2+处理大肠杆菌
D.用转基因酵母菌生产凝乳酶时,发酵结束后采用过滤或沉淀的方法即可获得产品
4.科研人员培育含细菌G6基因的转基因矮牵牛,主要过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A.Ti质粒上的T-DNA可将G6基因整合到矮牵牛细胞的线粒体DNA上
B.③过程可通过植物组织培养技术得到转基因矮牵牛植株
C.细菌G6基因能在矮牵牛细胞中表达,说明它们共用一套遗传密码
D.①过程为构建基因表达载体,是培育转基因矮牵牛的核心步骤
5.把某种植物中的一种易感病基因进行改造,然后通过农杆菌转化法重新导入植物,并抑制其表达。如图所示为T-DNA的酶切位点,L、R分别为T-DNA的左边界、右边界。已知限制酶A切割后为平末端,P和Q切割后露出的黏性末端碱基序列不同,据图分析,提取的易感病基因两端需添加的限制酶的识别序列分别为( )
选项 A端添加的序列 B端添加的序列
A 限制酶A的识别序列 限制酶P的识别序列
B 限制酶P的识别序列 限制酶A的识别序列
C 限制酶P的识别序列 限制酶Q的识别序列
D 限制酶A的识别序列 限制酶A的识别序列
6.(2025·安徽模拟)下列关于“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述,正确的是( )
A.丝状物的粗细表示一个DNA分子直径的大小
B.用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取,原因是DNA不溶于NaCl溶液
C.搅拌时用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌,以保证DNA分子完整
D.用二苯胺试剂进行鉴定,原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色
7.(2024·湖南卷,T5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
8.(2025·汕头模拟)听毛细胞能够接受声音信号并将其转变为电信号,其损伤后可能会导致耳聋。为探究听毛细胞内TRPC6基因过表达是否能治疗小鼠耳聋,研究人员利用TRPC6基因过表达的慢病毒载体进行了相关实验。他们分别对正常小鼠进行噪声处理得到耳聋模型小鼠,并在耳聋前后测量ABR数值(与听力能力呈负相关),部分结果如表所示,下列说法错误的是( )
组别 噪声 处理前 噪声处 理后3 d 噪声处 理后10 d 噪声处理 后20 d
TRPC6基 因过表达 载体组 32.86 66.43 55.71 45.71
32.14 68.57 65.71 62.57
A.听毛细胞作为感受器,产生的电信号单向传至大脑皮层并产生听觉
B.推测慢病毒为一种动物病毒,表中“ ”组别可能为TRPC6基因正常表达载体组
C.慢病毒表达载体上除了含TRPC6基因外,可能还含有启动子、终止子和标记基因等
D.TRPC6基因过表达后,实验组ABR数值较对照组低,说明TRPC6基因过表达不能治疗小鼠耳聋
9.(2025·黄冈模拟)目的基因的单链DNA片段(ss-DNA)可作为探针,在科研和医学检测等方面有重要应用。利用不对称PCR技术可制作大量的探针ss-DNA,其基本原理是采用数量或浓度不同的一对引物(引物①和引物②),经若干次循环后,低浓度的引物首先被消耗完毕,之后的循环只能产生高浓度引物的延伸产物,结果产生了大量的ss-DNA,下列有关叙述正确的是( )
A.制作探针ss-DNA的前提是需要检测目的基因的全部碱基排列顺序
B.若引物①与ss-DNA结合,则PCR仪中引物①的数量大于引物②的数量
C.在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活引物与母链碱基互补配对
D.PCR扩增目的基因时,若复性的温度过高,可能得不到ss-DNA
10.人干扰素(IFN)是机体免疫细胞产生的一类细胞因子。用白细胞生产干扰素时,每个细胞最多只能产生100~1 000个干扰素分子,而用基因工程技术改造的大肠杆菌发酵生产(原理如图),在1~2天内每个菌体能产生20万个干扰素分子。天然的干扰素在体外保存相当困难,如果将干扰素分子上的一个半胱氨酸变为丝氨酸,在一定条件下可以延长保存时间。下列说法正确的是( )
A.基因工程核心步骤需要的工具酶有DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶,其作用部位都是磷酸二酯键
B.将重组质粒导入大肠杆菌常用显微注射技术
C.酵母菌或大肠杆菌都可作受体菌,二者生产的干扰素在结构上没有区别
D.为延长保存时间,对干扰素进行改造,需通过改造干扰素基因来实现
二、非选择题
11.(2025·南阳模拟)水蛭素(Hirudin)可预防和治疗血栓。研究发现,用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。如图表示改造Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。回答下列问题:
(1)图中利用PCR引物在Hirudin基因内部引入碱基对的_______________(填“增添”“缺失”或“替换”),需要在___________________(填引物)中设计特定的碱基,从而对Hirudin基因进行改造以获得改良的Hirudin蛋白,这种技术操作属于_______________工程。
(2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别序列和切割位点,为使质粒pCLY11与Hirudin改良基因高效连接,应选用_____________对pCLY11进行酶切。质粒pCLY11中neor的作用是_____________________________________________。
(3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内,一般先用___________________处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。培养基中应加入新霉素,经过培养、筛选获得工程菌株,所选的工程菌菌落应呈_______________。
(4)若利用乳腺生物反应器生产改良的Hirudin蛋白,请写出简要操作步骤:_____________________________________________。
12.(科学探究)(2025·安徽卷,T20)稻瘟病是一种真菌病害,水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌,并开展了相关研究。回答下列问题:
(1)采集有病斑的水稻叶片,经表面消毒、研磨处理,制备研磨液。此后,采用_____________________________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基,分别置于不同温度下培养,目的是_____________________________________________。
(2)经筛选获得一株内生放线菌,该菌株高效合成铁载体小分子,能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株,探究铁载体的功能。主要步骤如下:首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D;然后构建重组质粒;最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理,对目标基因进行敲除。如图1所示。
注:用图1中的引物1和2进行PCR扩增。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步,反复循环,可实现基因片段的_______________。R基因敲除过程中,可发生多种形式的同源区段交换,PCR检测结果如图2所示,其中R基因敲除株为菌落_______________(填序号),出现菌落④的可能原因是___________________________。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用,从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测,简要写出实验思路。
专题微练(十四) 基因工程及其应用
1.C 解析 DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸(如PCR中),而连接两个基因需要的是DNA连接酶(如T4 DNA连接酶),因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接,A项错误;PCR检测融合基因时,需选择位于两个基因外侧的引物(如C基因上游和Bt基因下游),确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段,因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接,B项错误;花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管,利用受精过程将基因整合到胚胎细胞中,因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞,C项正确;C蛋白能结合纤维素(主要存在于细胞壁),融合基因表达后,Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近,减少细胞质中的积累,从而避免非期望效应,D项错误。
方法微点拨
设计两种引 物的原因 基因的两条链作为模板,其碱基序列不同,且DNA聚合酶只能从3'端延伸子链,用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增
引物长度 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。若引物过短,则引物与模板链结合的特异性较差
其他要求 (1)每种引物内部不能发生过多的局部碱基互补配对,否则会导致自身折叠; (2)两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对,否则会导致引物二聚体产生
引物中设计 限制酶的酶 切位点 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接,可在引物的5'端加上限制酶的酶切位点,且常在两种引物上设计不同的酶切位点,主要目的是保证目的基因与载体的正向连接
2.B 解析 PCR技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术,所以可以利用PCR技术获取和扩增人TPO基因,A项正确;构建表达载体需要限制酶来切割目的基因和载体,以及DNA连接酶来连接切割后的片段,而解旋酶在DNA复制等过程中起作用,DNA聚合酶主要用于DNA复制过程中合成DNA子链,构建表达载体不需要解旋酶和DNA聚合酶,B项错误;基因表达载体通常包含目的基因(这里是TPO基因)、标记基因、启动子和终止子等,C项正确;抗原—抗体杂交技术的原理是抗原和抗体的特异性结合,若TPO基因表达产生了相应的蛋白质(TPO),则可以用相应的抗体进行抗原—抗体杂交来检测其表达情况,D项正确。
3.D 解析 PCR扩增时需要TaqDNA聚合酶的催化,缓冲液中一般要添加能激活DNA聚合酶的Mg2+,有利于扩增牛凝乳酶基因,A项正确;基因表达载体应该包含启动子和终止子,这是目的基因能成功表达的要素,标记基因有利于受体细胞的筛选,B项正确;将目的基因导入大肠杆菌时,为了使大肠杆菌更好地接纳重组质粒,通常用Ca2+处理大肠杆菌,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,C项正确;用转基因酵母菌生产凝乳酶时,凝乳酶是酵母菌代谢产物,可根据产物的性质采取适当提取、分离、纯化措施来获得产品,若发酵产物是菌体本身,则一般采用过滤或沉淀的方法,D项错误。
4.A 解析 Ti质粒上的T-DNA可将G6基因整合到矮牵牛细胞的染色体DNA上,A项错误;③过程表示由分化的矮牵牛细胞发育成转基因矮牵牛的过程,可通过植物组织培养技术实现,B项正确;细菌G6基因能在矮牵牛细胞中表达,说明细菌和矮牵牛共用一套遗传密码,C项正确;①过程为构建基因表达载体,是培育转基因矮牵牛的核心步骤,D项正确。
5.B 解析 由于质粒的启动子内有限制酶Q的切割位点,所以目的基因两端不能添加限制酶Q的识别序列,C项错误;若要抑制易感病基因的表达,该目的基因应反向插入T-DNA中,再结合目的基因的转录方向,可确定目的基因A端添加限制酶P的识别序列,B端添加限制酶A的识别序列,A项错误、B项正确;目的基因A端添加限制酶A的识别序列,B端添加限制酶A的识别序列,不能确保目的基因反向插入T-DNA中,D项错误。
方法微点拨 图解限制酶的选择依据
甲 乙
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶,如图甲中可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶,如图甲中不能选择SmaⅠ。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①通常选择与切割目的基因相同的限制酶,以确保出现相同的黏性末端,如图乙中的PstⅠ。
②在只有一种标记基因时,选择的限制酶不能破坏标记基因,如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因。
6.C 解析 丝状物是由多个DNA分子形成的,不能代表DNA分子直径的大小,A项错误;用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取,原因是DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,B项错误;搅拌时用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌,以避免DNA断裂,保证DNA分子完整,C项正确;二苯胺试剂与DNA在沸水浴条件下呈蓝色,D项错误。
7.B 解析 限制酶失活会使DNA完全不被酶切,此时应更换新的限制酶,A项正确;在酶切条件不合适时,可能会出现DNA完全没有被酶切的情况,需要调整反应条件,如温度、pH等,但调整酶的用量没有作用,B项错误;质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失,进而造成限制酶无法进行切割,此时应更换为正常质粒DNA,C项正确;质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰,会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切,此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶,D项正确。
8.D 解析 据题干“听毛细胞能够接受声音信号并将其转变为电信号”推测,听毛细胞应该为感受器,其产生的电信号单向传导至大脑皮层后产生听觉,A项正确;用慢病毒作为基因工程的载体,说明慢病毒可以侵染受体细胞(小鼠的听毛细胞),推测其为一种动物病毒。本实验的目的是探究听毛细胞内TRPC6基因过表达是否能治疗小鼠耳聋,自变量是慢病毒载体上TRPC6基因的表达情况,故题表中的“ ”组别可能为TRPC6基因正常表达载体组,B项正确;重组载体上除了含有目的基因外,还含有启动子、终止子和标记基因等,C项正确;从题表数据发现,噪声处理后,TRPC6基因过表达载体组ABR数值比对照组低,而ABR数值与听力能力呈负相关,说明TRPC6基因过表达能治疗小鼠耳聋,D项错误。
9.D 解析 制作探针ss-DNA时,不需要知道目的基因的全部碱基排列顺序,只需要知道目的基因两端的碱基序列,以便合成两种引物,A项错误;若引物①与ss-DNA结合,则引物①延伸的单链与ss-DNA互补,数量应该较少,故PCR仪中引物①的数量要小于引物②,B项错误;在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶的活性,C项错误;PCR扩增目的基因时,若复性的温度过高,则引物与模板母链无法通过氢键形成碱基对,使后面的延伸无法进行,DNA分子无法复制,得不到任何ss-DNA,D项正确。
10.D 解析 基因工程核心步骤是基因表达载体的构建,需要的工具酶是限制酶、DNA连接酶,不需要DNA聚合酶,A项错误;将重组质粒导入大肠杆菌时,要用Ca2+处理,使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,B项错误;酵母菌是真核生物,大肠杆菌是原核生物,干扰素是糖蛋白,蛋白质的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的,所以二者生产的干扰素在结构上会存在一定的区别,C项错误;为延长保存时间,对干扰素进行改造,可以利用基因工程生产干扰素,所以需通过改造干扰素基因来实现,D项正确。
11.答案 (1)替换 引物2和引物3 蛋白质 (2)Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ 作为标记基因,便于筛选含目的基因的受体细胞 (3)Ca2+(或CaCl2) 白色 (4)将Hirudin改良基因与乳腺中特异表达基因的启动子等调控元件重组,通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中,培育出转基因动物,通过转基因动物分泌乳汁来生产Hirudin蛋白
解析 (1)从题图中可以看出,利用PCR引物在Hirudin基因内部引入碱基对,改变了基因的碱基序列,属于碱基对的替换,因为引物与模板链互补配对进行扩增,要在基因内部引入特定碱基对实现替换,需要在引物2和引物3中设计特定的碱基,这种通过对基因进行改造从而获得改良蛋白质的技术操作属于蛋白质工程。(2)Hirudin改良基因两端的黏性末端图中已经给出,观察各限制酶的识别序列可知,限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割产生的黏性末端能与Hirudin改良基因的黏性末端碱基互补,要想把Hirudin改良基因与质粒pCLY11(运载体)拼接起来需要得到相同的黏性末端,因此质粒pCLY11(运载体)也需要限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割,质粒pCLY11中neor是新霉素抗性基因,其作用是作为标记基因,便于筛选含目的基因的受体细胞,在含有新霉素的培养基中,只有含有重组质粒(含有neor)的细胞才能存活。(3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内,一般先用Ca2+(或CaCl2)处理大肠杆菌细胞,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。由于重组质粒构建时破坏了mlacZ基因(表达产物会使细胞呈蓝色,否则细胞呈白色),所以所选的工程菌菌落应呈白色。(4)利用乳腺生物反应器生产改良的Hirudin蛋白的简要操作步骤见答案。
12.答案 (1)稀释涂布平板法 筛选出不同条件下的内生放线菌
(2)扩增 ② 重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起,形成了7 000 bp的DNA片段 (3)实验分三组进行,甲组是稻瘟病致病菌+含Fe培养基;乙组是内生放线菌+稻瘟病致病菌+含Fe培养基;丙组是R基因敲除放线菌+稻瘟病致病菌+含Fe培养基,在相同且适宜条件下培养一段时间,观察致病菌的生长情况或检测致病菌体内的铁含量。
解析 (1)研磨液里含有内生放线菌,可用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选择培养基上进行筛选。经过一段时间培养后,在适宜的温度下,可以形成内生放线菌的菌落,从而分离纯化出内生放线菌。(2)PCR的原理是体外DNA半保留复制,可实现基因片段的大量扩增。结合题图1和题图2可知,菌落①③PCR产物长度都是3 000 bp,正好是R基因的长度,说明R基因没有敲除成功。菌落②PCR产物长度是1 000 bp,说明敲除了R基因中间序列,保留了两端序列,R基因敲除成功。菌落④PCR产物长度是7 000 bp,正好是重组质粒(4 000 bp)和R基因(3 000 bp)的总和,说明重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起,形成了7 000 bp的DNA片段。(3)科研小组推测该内生放线菌通过竞争性利用铁离子,从而抑制稻瘟病致病菌生长,欲设计实验进行验证,可以设置3组实验,一组是稻瘟病致病菌+含Fe培养基,再分别将野生型内生放线菌和R基因敲除株与稻瘟病致病菌混合接种于含铁培养基上,野生型内生放线菌能吸收利用铁离子,R基因敲除株不能吸收利用铁离子,观察稻瘟病致病菌生长情况。预期结果是接种野生型内生放线菌的稻瘟病致病菌生长被抑制,仅含稻瘟病致病菌、接种R基因敲除株的稻瘟病致病菌生长没有被抑制。(共43张PPT)
专题微练(十四) 基因工程及其应用
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一、选择题
1.(2025·顺义模拟)转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因(如图)导入棉花细胞。下列相关叙述正确的是( )
A.使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接
B.选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接
C.可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞
D.融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累
DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸(如PCR中)，而连接两个基因需要的是DNA连接酶(如T4 DNA连接酶)，因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接，A项错误；PCR检测融合基因时，需选择位于两个基因外侧的引物(如C基因上游和Bt基因下游)，确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接，B项错误；花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受精过程将基因整合到胚胎细胞
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中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞，C项正确；C蛋白能结合纤维素(主要存在于细胞壁)，融合基因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向至细胞壁附近，减少细胞质中的积累，从而避免非期望效应，D项错误。
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设计两种引 物的原因 基因的两条链作为模板，其碱基序列不同，且DNA聚合酶只能从3'端延伸子链，用两种引物才能确保DNA的两条链同时被扩增
引物长度 用于PCR的引物长度通常为20~30个核苷酸。若引物过短，则引物与模板链结合的特异性较差
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其他要求 (1)每种引物内部不能发生过多的局部碱基互补配对，否则会导致自身折叠；
(2)两种引物之间不能在局部发生碱基互补配对，否则会导致引物二聚体产生
引物中设计 限制酶的酶 切位点 为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，可在引物的5'端加上限制酶的酶切位点，且常在两种引物上设计不同的酶切位点，主要目的是保证目的基因与载体的正向连接
2.化疗会造成癌症病人血小板减少。血小板生成素(TPO)可促进血小板产生。研究人员将含人TPO基因的表达载体导入中国仓鼠卵巢细胞中，获得有生物活性的TPO并应用于临床。下列叙述错误的是( )
A.用PCR技术可获取和扩增人TPO基因
B.构建表达载体需要解旋酶和DNA聚合酶
C.表达载体包括TPO基因、标记基因、启动子和终止子等
D.用抗原—抗体杂交技术可检测TPO基因的表达情况
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PCR技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的技术，所以可以利用PCR技术获取和扩增人TPO基因，A项正确；构建表达载体需要限制酶来切割目的基因和载体，以及DNA连接酶来连接切割后的片段，而解旋酶在DNA复制等过程中起作用，DNA聚合酶主要用于DNA复制过程中合成DNA子链，构建表达载体不需要解旋酶和DNA聚合酶，B项错误；基因表达载体通常包含目的基因(这里是TPO基因)、标记基因、启动子和终止子等，C项正确；抗原—抗体杂交技术的原理是抗原和抗体的特异性结合，若TPO基因表达产生了相应的蛋白质(TPO)，则可以用相应的抗体进行抗原—抗体杂交来检测其表达情况，D项正确。
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3.(2025·安康模拟)哺乳动物胃液中有凝乳酶，该酶能使牛奶中的蛋白质凝聚成乳酪，被广泛应用于奶酪和酸奶的制作。研究人员将编码牛凝乳酶的基因导入大肠杆菌或酵母菌的基因组中，通过工业发酵批量生产凝乳酶。下列有关叙述错误的是( )
A.用PCR扩增牛凝乳酶基因时，缓冲液中一般要添加能激活DNA聚合酶的Mg2+
B.构建的含牛凝乳酶基因的表达载体应包含启动子、标记基因、终止子等
C.将牛凝乳酶基因导入大肠杆菌时，常先用Ca2+处理大肠杆菌
D.用转基因酵母菌生产凝乳酶时，发酵结束后采用过滤或沉淀的方法即可获得产品
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PCR扩增时需要TaqDNA聚合酶的催化，缓冲液中一般要添加能激活DNA聚合酶的Mg2+，有利于扩增牛凝乳酶基因，A项正确；基因表达载体应该包含启动子和终止子，这是目的基因能成功表达的要素，标记基因有利于受体细胞的筛选，B项正确；将目的基因导入大肠杆菌时，为了使大肠杆菌更好地接纳重组质粒，通常用Ca2+处理大肠杆菌，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，C项正确；用转基因酵母菌生产凝乳酶时，凝乳酶是酵母菌代谢产物，可根据产物的性质采取适当提取、分离、纯化措施来获得产品，若发酵产物是菌体本身，则一般采用过滤或沉淀的方法，D项错误。
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4.科研人员培育含细菌G6基因的转基因矮牵牛，主要过程如图所 示。下列叙述错误的是( )
A.Ti质粒上的T-DNA可将G6基因整合到矮牵牛细胞的线粒体DNA上
B.③过程可通过植物组织培养技术得到转基因矮牵牛植株
C.细菌G6基因能在矮牵牛细胞中表达，说明它们共用一套遗传密码
D.①过程为构建基因表达载体，是培育转基因矮牵牛的核心步骤
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Ti质粒上的T-DNA可将G6基因整合到矮牵牛细胞的染色体DNA上，A项错误；③过程表示由分化的矮牵牛细胞发育成转基因矮牵牛的过程，可通过植物组织培养技术实现，B项正确；细菌G6基因能在矮牵牛细胞中表达，说明细菌和矮牵牛共用一套遗传密码，C项正确；①过程为构建基因表达载体，是培育转基因矮牵牛的核心步骤，D项正确。
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5.把某种植物中的一种易感病基因进行改造，然后通过农杆菌转化法重新导入植物，并抑制其表达。如图所示为T-DNA的酶切位点，L、R分别为T-DNA的左边界、右边界。已知限制酶A切割后为平末端，P和Q切割后露出的黏性末端碱基序列不同，据图分析，提取的易感病基因两端需添加的限制酶的识别序列分别为( )
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选项 A端添加的序列 B端添加的序列
A 限制酶A的识别序列 限制酶P的识别序列
B 限制酶P的识别序列 限制酶A的识别序列
C 限制酶P的识别序列 限制酶Q的识别序列
D 限制酶A的识别序列 限制酶A的识别序列
由于质粒的启动子内有限制酶Q的切割位点，所以目的基因两端不能添加限制酶Q的识别序列，C项错误；若要抑制易感病基因的表达，该目的基因应反向插入T-DNA中，再结合目的基因的转录方向，可确定目的基因A端添加限制酶P的识别序列，B端添加限制酶A的识别序列，A项错误、B项正确；目的基因A端添加限制酶A的识别序列，B端添加限制酶A的识别序列，不能确保目的基因反向插入T-DNA中，D项错误。
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图解限制酶的选择依据
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(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类。
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，如图甲中可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的
限制酶，如图甲中不能选择SmaⅠ。
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(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类。
①通常选择与切割目的基因相同的限制酶，以确保出现相同的黏性末端，如图乙中的PstⅠ。
②在只有一种标记基因时，选择的限制酶
不能破坏标记基因，如图乙中限制酶Sma Ⅰ
会破坏标记基因。
6.(2025·安徽模拟)下列关于“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是( )
A.丝状物的粗细表示一个DNA分子直径的大小
B.用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA不溶于NaCl溶液
C.搅拌时用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以保证DNA分子完整
D.用二苯胺试剂进行鉴定，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色
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丝状物是由多个DNA分子形成的，不能代表DNA分子直径的大 小，A项错误；用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，B项错误；搅拌时用玻璃棒沿一个方向轻缓搅拌，以避免DNA断裂，保证DNA分子完整，C项正确；二苯胺试剂与DNA在沸水浴条件下呈蓝色，D项错误。
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7.(2024·湖南卷，T5)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活，更换新的限制酶
B.酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
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限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A项正确；在酶切条件不合适时，可能会出现DNA完全没有被酶切的情况，需要调整反应条件，如温度、pH等，但调整酶的用量没有作用，B项错误；质粒DNA突变可能会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒DNA，C项正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D项正确。
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8.(2025·汕头模拟)听毛细胞能够接受声音信号并将其转变为电信号，其损伤后可能会导致耳聋。为探究听毛细胞内TRPC6基因过表达是否能治疗小鼠耳聋，研究人员利用TRPC6基因过表达的慢病毒载体进行了相关实验。他们分别对正常小鼠进行噪声处理得到耳聋模型小鼠，并在耳聋前后测量ABR数值(与听力能力呈负相关)，部分结果如表所示，下列说法错误的是( )
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组别 噪声处理前 噪声处理后3 d 噪声处理后10 d 噪声处理后20 d
TRPC6基因过表达载体组 32.86 66.43 55.71 45.71
32.14 68.57 65.71 62.57
A.听毛细胞作为感受器，产生的电信号单向传至大脑皮层并产生听觉
B.推测慢病毒为一种动物病毒，表中“ ”组别可能为TRPC6基因正常表达载体组
C.慢病毒表达载体上除了含TRPC6基因外，可能还含有启动子、终止子和标记基因等
D.TRPC6基因过表达后，实验组ABR数值较对照组低，说明TRPC6基因过表达不能治疗小鼠耳聋
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据题干“听毛细胞能够接受声音信号并将其转变为电信号”推测，听毛细胞应该为感受器，其产生的电信号单向传导至大脑皮层后产生听觉，A项正确；用慢病毒作为基因工程的载体，说明慢病毒可以侵染受体细胞(小鼠的听毛细胞)，推测其为一种动物病毒。本实验的目的是探究听毛细胞内TRPC6基因过表达是否能治疗小鼠耳聋，自变量是慢病毒载体上TRPC6基因的表达情况，故题表中的“ ”组别可能为TRPC6基因正常表达载体组，B项正确；重组
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载体上除了含有目的基因外，还含有启动子、终止子和标记基因等，C项正确；从题表数据发现，噪声处理后，TRPC6基因过表达载体组ABR数值比对照组低，而ABR数值与听力能力呈负相关，说明TRPC6基因过表达能治疗小鼠耳聋，D项错误。
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9.(2025·黄冈模拟)目的基因的单链DNA片段(ss-DNA)可作为探针，在科研和医学检测等方面有重要应用。利用不对称PCR技术可制作大量的探针ss-DNA，其基本原理是采用数量或浓度不同的一对引物(引物①和引物②)，经若干次循环后，低浓度的引物首先被消耗完毕，之后的循环只能产生高浓度引物的延伸产物，结果产生了大量的 ss-DNA，下列有关叙述正确的是( )
A.制作探针ss-DNA的前提是需要检测目的基因的全部碱基排列顺序
B.若引物①与ss-DNA结合，则PCR仪中引物①的数量大于引物②的数量
C.在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活引物与母链碱基互补配对
D.PCR扩增目的基因时，若复性的温度过高，可能得不到ss-DNA
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制作探针ss-DNA时，不需要知道目的基因的全部碱基排列顺序，只需要知道目的基因两端的碱基序列，以便合成两种引物，A项错误；若引物①与ss-DNA结合，则引物①延伸的单链与ss-DNA互补，数量应该较少，故PCR仪中引物①的数量要小于引物②，B项错误；在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶的活性，C项错误；PCR扩增目的基因时，若复性的温度过高，则引物与模板母链无法通过氢键形成碱基对，使后面的延伸无法进行，DNA分子无法复制，得不到任何ss-DNA，D项正确。
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10.人干扰素(IFN)是机体免疫细胞产生的一类细胞因子。用白细胞生产干扰素时，每个细胞最多只能产生100~1 000个干扰素分子，而用基因工程技术改造的大肠杆菌发酵生产(原理如图)，在1~2天内每个菌体能产生20万个干扰素分子。
天然的干扰素在体外保存相当困
难，如果将干扰素分子上的一个
半胱氨酸变为丝氨酸，在一定条
件下可以延长保存时间。下列说
法正确的是( )
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A.基因工程核心步骤需要的工具酶有DNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶，其作用部位都是磷酸二酯键
B.将重组质粒导入大肠杆菌常用显微注射技术
C.酵母菌或大肠杆菌都可作受体菌，二者生产的干扰素在结构上没有区别
D.为延长保存时间，对干扰素进行改造，需通过改造干扰素基因来实现
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基因工程核心步骤是基因表达载体的构建，需要的工具酶是限制 酶、DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，A项错误；将重组质粒导入大肠杆菌时，要用Ca2+处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，B项错误；酵母菌是真核生物，大肠杆菌是原核生物，干扰素是糖蛋白，蛋白质的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，所以二者生产的干扰素在结构上会存在一定的区别， C项错误；为延长保存时间，对干扰素进行改造，可以利用基因工程生产干扰素，所以需通过改造干扰素基因来实现，D项正确。
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二、非选择题
11.(2025·南阳模拟)水蛭素(Hirudin)可预防和治疗血栓。研究发现，用赖氨酸替换水蛭素第47位的天冬酰胺可提高其抗凝血活性。如图表示改造Hirudin基因及构建基因表达载体的过程。回答下列问题：
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(1)图中利用PCR引物在Hirudin基因内部引入碱基对的_______(填“增添”“缺失”或“替换”)，需要在_____________(填引物)中设计特定的碱基，从而对Hirudin基因进行改造以获得改良的Hirudin蛋白，这种技术操作属于_______工程。
(2)根据图中质粒pCLY11的限制酶识别序列和切割位点，为使质粒pCLY11与Hirudin改良基因高效连接，应选用__________________
对pCLY11进行酶切。质粒pCLY11中neor的作用是_________________
____________________________。
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替换
引物2和引物3
蛋白质
Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ
作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞
(3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用________________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。培养基中应加入新霉素，经过培养、筛选获得工程菌株，所选的工程菌菌落应呈_______。
(4)若利用乳腺生物反应器生产改良的Hirudin蛋白，请写出简要操作步骤：_____________________________________________________
_______________________________________________________________________________________________________________。
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Ca2+(或CaCl2)
白色
将Hirudin改良基因与乳腺中特异表达基因的启动子等调控元件重组，通过显微注射的方法导入哺乳动物的受精卵中，培育出转基因动物，通过转基因动物分泌乳汁来生产Hirudin蛋白
(1)从题图中可以看出，利用PCR引物在Hirudin基因内部引入碱基对，改变了基因的碱基序列，属于碱基对的替换，因为引物与模板链互补配对进行扩增，要在基因内部引入特定碱基对实现替换，需要在引物2和引物3中设计特定的碱基，这种通过对基因进行改造从而获得改良蛋白质的技术操作属于蛋白质工程。(2)Hirudin改良基因两端的黏性末端图中已经给出，观察各限制酶的识别序列可知，限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割产生的黏性末端能与Hirudin改
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良基因的黏性末端碱基互补，要想把Hirudin改良基因与质粒pCLY11(运载体)拼接起来需要得到相同的黏性末端，因此质粒pCLY11(运载体)也需要限制酶Xma Ⅰ和Bgl Ⅱ切割，质粒pCLY11中neor是新霉素抗性基因，其作用是作为标记基因，便于筛选含目的基因的受体细胞，在含有新霉素的培养基中，只有含有重组质粒(含有neor)的细胞才能存活。(3)若将重组质粒导入大肠杆菌细胞内，一般先用Ca2+(或CaCl2)处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一
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种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。由于重组质粒构建时破坏了mlacZ基因(表达产物会使细胞呈蓝色，否则细胞呈白色)，所以所选的工程菌菌落应呈白色。(4)利用乳腺生物反应器生产改良的Hirudin蛋白的简要操作步骤见答案。
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12.(科学探究)(2025·安徽卷，T20)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用________________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是_______________________
______________。
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稀释涂布平板法
筛选出不同条件下的内生放线菌
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。
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注：用图1中的引物1和2进行PCR扩增。
科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。
主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除。如图1所示。
采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的_________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落_____ (填序号)，出现菌落④的可能原因是______
_________________________________________________________ 。
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扩增
②
重组
质粒和内生放线菌R基因组合在一起，形成了7 000 bp的DNA片段
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路。
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答案 实验分三组进行，甲组是稻瘟病致病菌+含Fe培养基；乙组是内生放线菌+稻瘟病致病菌+含Fe培养基；丙组是R基因敲除放线菌+稻瘟病致病菌+含Fe培养基，在相同且适宜条件下培养一段时间，观察致病菌的生长情况或检测致病菌体内的铁含量。
(1)研磨液里含有内生放线菌，可用稀释涂布平板法将研磨液接种于不同的选择培养基上进行筛选。经过一段时间培养后，在适宜的温度下，可以形成内生放线菌的菌落，从而分离纯化出内生放线菌。(2)PCR的原理是体外DNA半保留复制，可实现基因片段的大量扩增。结合题图1和题图2可知，菌落①③PCR产物长度都是 3 000 bp，正好是R基因的长度，说明R基因没有敲除成功。菌落②PCR产物长度是1 000 bp，说明敲除了R基因中间序列，保留了
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两端序列，R基因敲除成功。菌落④PCR产物长度是7 000 bp，正好是重组质粒(4 000 bp)和R基因(3 000 bp)的总和，说明重组质粒和内生放线菌R基因组合在一起，形成了7 000 bp的DNA片段。 (3)科研小组推测该内生放线菌通过竞争性利用铁离子，从而抑制稻瘟病致病菌生长，欲设计实验进行验证，可以设置3组实验，一组是稻瘟病致病菌+含Fe培养基，再分别将野生型内生放线菌和R基因敲除株与稻瘟病致病菌混合接种于含铁培养基上，野生型内
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生放线菌能吸收利用铁离子，R基因敲除株不能吸收利用铁离子，观察稻瘟病致病菌生长情况。预期结果是接种野生型内生放线菌的稻瘟病致病菌生长被抑制，仅含稻瘟病致病菌、接种R基因敲除株的稻瘟病致病菌生长没有被抑制。
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