微专题6 PCR技术的原理和应用
例1 5'端 AGATCT BamH Ⅰ 、EcoR Ⅰ
[解析] 为了使目的基因能够被限制酶切割,扩增目的基因时,需要在引物的5'端添加限制酶的识别序列。结合图表分析,在载体的启动子和终止子之间有BamH Ⅰ 、EcoR Ⅰ 和Xba Ⅰ 的识别序列,而S基因内部含有Xba Ⅰ 、Nde Ⅰ 和BamH Ⅰ 的识别序列,为将S基因正确插入载体,要用BamH Ⅰ 、EcoR Ⅰ 、Xba Ⅰ 中的两种切割载体,又不能用Xba Ⅰ 、Nde Ⅰ 或BamH Ⅰ 切割S基因,再根据各种限制酶的识别序列及切割位点可知,需要用BamH Ⅰ 、EcoR Ⅰ 切割载体,同时用BamH Ⅰ 的同尾酶(识别序列不同,但切割后可产生相同的黏性末端)Bgl Ⅱ 和EcoR Ⅰ 切割S基因,故PCR扩增S基因时需在上游引物添加的碱基序列是5'-AGATCT-3'。
例2 C [解析] 甲流病毒为RNA病毒,欲用PCR检测需先经逆转录形成cDNA,再以此为模板进行扩增,不能直接以RNA为模板,A错误;探针是依据甲流病毒的序列合成的短DNA单链,结合图示可知,荧光探针含有荧光分子R,当探针完整时,R不发出荧光,故该探针本身不发光,B错误;由题干“当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处,探针会被水解”可知,耐高温的DNA聚合酶可能还有水解荧光探针的作用,使R发出荧光,C正确;随着PCR产物量的增加,被水解释放的荧光分子也相应增多,荧光强度与扩增出的DNA分子数成正比,D错误。
例3 D [解析] 过程 Ⅰ 是逆转录过程,是以mRNA为模板合成cDNA,该过程的碱基配对方式为A-T、U-A、G-C、C-G,而DNA复制过程的碱基配对方式为A-T、T-A、G-C、C-G,二者碱基配对方式不完全相同,A错误;引物是通过碱基互补配对结合到模板链上的,该过程是在复性阶段完成的,复性的温度一般在50 ℃左右,而不是72 ℃,72 ℃是延伸阶段的温度,B错误;题图中子链的合成是以四种脱氧核糖核苷酸为原料,从引物的一端开始进行的,C错误;过程 Ⅱ 中,若进行6轮循环,最终产生的DNA单链数为26=64(条),新合成的子链数为63条,则进行6轮循环,共需要加入引物的数量为63个,D正确。
例4 (1)154 C变为A G变为T
(2)温度偏低时DNA双链解旋不充分,延伸时模板减少,产物量偏少
(3)A
(4)3 诱变前的抗菌肽基因 引物1和引物2
[解析] (1)mRNA上3个相邻的碱基决定1个氨基酸,每3个这样的碱基为1个密码子,第52位的氨基酸对应的mRNA上的碱基位次为154~156(51×3+1=154),脯氨酸密码子为CCA,苏氨酸密码子为ACA,若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸,可将mRNA上154位的碱基替换,碱基具体变化为C变为A。模板链与mRNA碱基互补配对,则基因模板链对应的碱基改变为G变为T。(2)变性的目的是使双链DNA打开,若变性时温度偏低DNA双链解旋不充分,延伸时模板减少,产物量偏少,导致反应效率降低。(3)由图可知,诱变引物与转录非模板链碱基互补配对,则诱变引物序列与转录模板链相同,且需将模板链上154位碱基G变为T(模板链方向为3'→5'),则诱变引物序列为5'…CCTGTTAT…3',A正确,B、C、D错误。(4)产物1最早出现在PCR1的第3轮循环;DNA的复制方式为半保留复制,因此PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外,还有诱变前的抗菌肽基因。由图可知,通过PCR3扩增时应选的引物是引物1和引物2,这样才能获得目的基因。
例5 A [解析] 巢式PCR使用两对引物进行两轮扩增,其中第二轮扩增的引物是针对第一轮扩增的中间产物设计的,因此具有更高的特异性,这种特异性使得巢式PCR能够更准确地扩增目标DNA片段,降低了扩增多个靶位点的可能性,A正确。根据图示和巢式PCR的原理,第一次PCR扩增应该使用引物①和引物④,它们分别与目标DNA片段的两端互补,从而能够扩增出包含整个目标片段的中间产物;引物②和引物③则是用于第二轮扩增的,它们与中间产物的特定序列互补,B错误。巢式PCR的两个阶段通常不在同一试管中进行,因为第二阶段需要去除第一阶段的引物和未反应的DNA,以免干扰第二阶段的特异性扩增,C错误。PCR扩增DNA分子的过程中,分为变性、复性、延伸三步,变性时温度超过90 ℃,双链DNA解聚为单链; 复性时温度下降到50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合;延伸时温度上升到72 ℃左右,溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA 链,因此PCR扩增DNA分子过程中,变性阶段温度最高,D错误。
例6 D [解析] 制作探针ss-DNA时,不需要知道目的基因的全部碱基排列顺序,只需要知道目的基因两端的碱基序列,以便合成两种引物,A错误;若引物①与ss-DNA结合,则引物①延伸的单链与ss-DNA互补,数量应该较少,故PCR仪中引物①的数量要小于引物②的数量,B错误;在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶,C错误;PCR扩增目的基因时,若复性的温度过高,则引物与母链无法通过氢键形成碱基对,使后面的延伸无法进行,DNA分子无法复制,得不到ss-DNA,D正确。
例7 F2和R1或F1与R2 a链
[解析] 据图甲可知,引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因及周围部分的碱基序列,因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链,而根据题图中启动子和终止子的位置可知转录方向是从左向右,对应的模板链方向应该是3'→5',非模板链(也就是a链)是5'→3';DNA复制中子链延伸方向为5'→3',故引物方向为5'→3',所以F1配对的单链是3'→5'的b链,故其序列应该与a链相应部分的序列相同。
例8 D [解析] 利用双脱氧测序法时,PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA,故只需加入一种引物,A正确。电泳时,产物的片段越大,迁移速率越慢,B正确。依据题中双脱氧测序法的原理,可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3'端的碱基,如+ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3'端碱基就是A;另外由于每个片段的起始点相同,但终止点不同,因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基;图示电泳方向为从上→下,即对应的DNA片段为长→短,则对应的DNA测序结果为3'→5',如对照个体的电泳结果最短的条带为+ddCTP泳道组最下面的条带,则说明该DNA片段5'端第一个碱基为C,因此对照个体的测序结果为5'-CTACCCGTGAT-3',患者的测序结果为5'-CTACCTGTGAT-3',C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知,患者该段序列中某位点的碱基C突变为T,D错误。
例9 (1)限制性内切核酸(或限制) 核苷酸序列
(2)磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸
(3)②④
(4)B
[解析] (1)步骤 Ⅰ 用的EcoR Ⅰ 是一种限制性内切核酸酶,它能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(2)步骤 Ⅱ 用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成磷酸二酯键,PCR循环中,升温到95 ℃是为了获得DNA单链,这个过程称为变性,TaqDNA聚合酶的作用是催化以DNA为模板的DNA链的延伸。(3)PCR引物是一小段核苷酸序列,它能与DNA母链的一段进行碱基序列互补配对,并且在PCR过程中,引物只能与DNA母链3'端配对,子链的延伸方向是从3'端到5'端。由题图可知,环状DNA在进行PCR时,两条子链的延伸方向相反,也就是说,两个引物分别结合的是已知序列的3'端,子链向左延伸需要引物④,子链向右延伸需要引物②。(4)对PCR产物进行测序、分析,得到片段F的完整序列,其中片段F的完整序列内部有限制酶EcoR Ⅰ 的识别序列,它识别的序列是GAATTC,只有B选项中包含EcoR Ⅰ 的识别序列,B正确。
例10
[解析] 图中虚线方框中的两条链在延伸过程中,既可作为模板又可以起到引物的作用,使耐高温的DNA聚合酶能够从两条链的3'端开始连接脱氧核苷酸,可继续延伸的复性结果见答案。
例11 (1)a
(2)插入序列后,基因转录产生的mRNA上终止密码子提前出现,导致翻译提前终止
(3)①P2和P3 丙的基因型为AA,无引物P3的结合序列,利用引物P2和P3扩增时,无法得到扩增产物
②
③2∶1
[解析] (1)根据题意可知,研究人员获得了一个紧凑株型的植株,为研究控制该性状的基因,将其与纯合松散株型植株杂交,F1均为松散株型,F2中松散株型∶紧凑株型=3∶1,说明紧凑株型为隐性性状,由a基因控制。(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因,a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短,推测可能是A基因内部插入一段序列后,使基因转录产生的mRNA上终止密码子提前出现,导致翻译提前终止。(3)①子二代的基因型为AA、Aa、aa,根据图1可知,A和a基因上均含有与P1和P2引物互补的序列,而P3引物识别的序列只有a基因中才存在,F2中紧凑株型植株基因型为aa,松散株型植株基因型为Aa或AA,分析图2-A,可知甲、乙扩增出的条带相同,说明扩增出的为a基因,因此图2-A使用的引物组合为引物P2和引物P3。由以上分析可知,甲的基因型为Aa,则丙的基因型为AA,无引物P3的结合序列,故利用引物P2和P3扩增时,无法得到扩增产物。②由①中分析可知甲、乙、丙基因型分别为Aa、aa、AA,结合图2-B中甲的条带分析可知,图2-B是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果。由于a基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物,因此基因型为AA(松散株型)、aa(紧凑株型)的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带,且基因型为aa的个体扩增的产物电泳时形成的条带距离点样孔近,而基因型为Aa(松散株型)的个体扩增的产物电泳时会出现两个条带,图见答案。③使用图2-A中的引物组合(P3和P2)扩增F2全部样本,由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物,且子二代中Aa∶AA=2∶1,所以使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本,有扩增条带松散株型(Aa)∶无扩增条带松散株型(AA)=2∶1。微专题6 PCR技术的原理和应用
一、引物的设计
典型例题
例1[2025·陕青宁晋卷节选]马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
限制酶 识别序列及 切割位点 限制酶 识别序列及 切割位点
BglⅡ ↓5'-AGATCT-3' 3'-TCTAGA-5'↑ EcoRⅠ ↓5'-GAATTC-3' 3'-CTTAAG-5'↑
NdeⅠ ↓5'-CATATG-3' 3'-GTATAC-5'↑ BamHⅠ ↓5'-GGATCC-3' 3'-CCTAGG-5'↑
XhoⅠ ↓5'-CTCGAG-3' 3'-GAGCTC-5'↑ SalⅠ ↓5'-GTCGAC-3' 3'-CAGCTG-5'↑
XbaⅠ ↓5'-TCTAGA-3' 3'-AGATCT-5'↑
图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的 (填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'- -3',切割载体时应选用的两种限制酶是 ,PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
二、常用的PCR技术及其原理
典型例题
(一)荧光定量PCR
例2[2025·广西柳州模拟]检测甲流病毒(遗传物质为RNA)最常见的方法是实时荧光定量PCR,其原理是在PCR反应体系中加入引物的同时,加入与某条模板链互补的荧光探针,当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处,探针会被水解,使荧光监测系统接收到荧光信号,即每扩增一次,就有一个荧光分子生成(如下图)。下列叙述正确的是( )
A.该PCR扩增是直接以甲流病毒的遗传物质作为模板进行的
B.此荧光探针是以甲流病毒遗传物质序列为模板合成的短DNA单链,本身发出荧光
C.耐高温的DNA聚合酶可能还有水解荧光探针的作用,使R发出荧光
D.一定时间内,检测到的荧光强度与反应体系中扩增出的DNA分子数成反比
(二)RT-PCR
例3[2025·福建厦门一模]RT-PCR是将RNA逆转录(RT)成cDNA(与mRNA互补的DNA单链)和聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术,具体过程如图所示,下列叙述正确的是( )
A.过程Ⅰ获得cDNA的过程与DNA复制过程中碱基配对方式相同
B.图中A、B两种引物在72℃时通过碱基互补配对结合到模板链
C.图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D.过程Ⅱ中,若进行6轮循环,则共需要加入引物的数量为63个
(三)PCR定点突变技术——大引物PCR
例4[2025·广东揭阳模拟]抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现,将抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图所示。回答下列问题:
(1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸,需要将mRNA的对应碱基序列中第 位的碱基替换,碱基具体变化为 。基因模板链对应的碱基改变为 。
(2)PCR过程中温度的控制至关重要,若变性时温度偏低则会导致反应效率降低,原因是 。
(3)据图分析,“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择 。
A.5'…CCTGTTAT…3'
B.5'…CCTGGTAT…3'
C.5'…ATACCAGG…3'
D.5'…ATAACAGG…3'
(4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR(PCR1和PCR2),产物1最早出现在PCR1的第 轮循环;PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外,还有 ;通过PCR3快速扩增时应选用的引物是 。
(四)巢式PCR
例5[2025·陕西汉中模拟]巢式PCR是特殊的PCR技术,使用两对PCR引物扩增完整的DNA片段。具体过程分为两个阶段:第一阶段使用一对引物进行第一次PCR扩增,获得中间产物;第二阶段以中间产物为模板,使用另一对引物进行第二次PCR扩增,从而扩增出目标产物。下列相关叙述正确的是( )
A.巢式PCR技术能降低扩增多个靶位点的可能性
B.第一次PCR扩增DNA分子应选用引物①和引物③
C.巢式PCR扩增的两个阶段应在同一试管中进行
D.PCR扩增DNA分子的过程中,复性阶段的温度最高
(五)不对称PCR
例6[2025·湖北黄冈模拟]目的基因的单链DNA片段(ss-DNA)可作为探针,在科研和医学检测等方面有重要应用。利用不对称PCR技术可制作大量的探针ss-DNA,其基本原理是采用数量或浓度不同的一对引物(引物①和引物②),经若干次循环后,低浓度的引物首先被消耗完毕,之后的循环只能产生高浓度引物的延伸产物,结果产生了大量的ss-DNA,下列有关叙述正确的是( )
A.制作探针ss-DNA的前提是需要检测目的基因的全部碱基排列顺序
B.若引物①与ss-DNA结合,则PCR仪中引物①的数量大于引物②的数量
C.在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活引物与母链碱基互补配对
D.PCR扩增目的基因时,若复性的温度过高,可能得不到ss-DNA
三、PCR技术的应用
典型例题
(一)利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式
例7[2023·山东卷节选]科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测,该质粒的部分结构如图甲所示,其中V5编码序列表达标签短肽V5。
构建重组质粒后,为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确,需进行PCR检测,若仅用一对引物,应选择图甲中的引物 。已知J基因转录的模板链位于b链,由此可知引物F1与图甲中J基因的 (填“a链”或“b链”)相应部分的序列相同。
(二)利用“双脱氧法”进行基因测序
例8[2024·湖南卷改编]最早的双脱氧测序法是在PCR反应体系中,分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP),子链延伸时,双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则,以加入ddATP的体系为例:若配对的为ddATP,延伸终止;若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP),继续延伸;PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列,结果如图所示。下列叙述错误的是( )
A.上述PCR反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越大,迁移速率越慢
C.5'-CTACCCGTGAT-3'为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
(三)利用PCR技术测定未知DNA区域
例9[江苏卷]如果已知一小段DNA的序列,可采用PCR的方法,简捷地分析出已知序列两侧的序列,具体流程如下图(以EcoRⅠ酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种 酶,它通过识别特定的 切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3'-羟基与5'-磷酸间形成 ;PCR循环中,升温到95℃是为了获得 ;TaqDNA聚合酶的作用是催化 。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物,步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是 (从引物①②③④中选择,填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5'-AACTATGCGCTCATGA-3' ②5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3' ③5'-AGAGGCTACGCATTGC-3' ④5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'
(4)对PCR产物测序,经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的是 。
A.5'-AACTATGCG…AGCCCTT-3'
B.5'-AATTCCATG…CTGAATT-3'
C.5'-GCAATGCGT…TCGGGAA-3'
D.5'-TTGATACGC…CGAGTAC-3'
(四)利用PCR技术引导基因定点突变
例10[2024·北京东城区一模]请在方框中画出可继续延伸的复性结果,要求标明每条链的5'端和3'端。
(五)利用PCR技术进行产物鉴定
例11[2025·河南卷]某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状,紧凑株型适合高密度种
植,利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株,为研究控制该性状的基因,将其与纯合松散株型植株杂交,F1均为松散株型,F2中松散株型∶紧凑株型=3∶1,控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题:
(1)该紧凑株型性状由 (填“A”或“a”)基因控制。
(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图1),a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是 。
图1
(3)研究人员设计了3条引物(P1~P3),位置如图1(→表示引物5'→3'方向)。以3个F2单株(甲、乙、丙)的DNA为模板,使用不同引物组合进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B(不考虑PCR结果异常)。
图2
①图2-A中使用的引物组合是 ;丙单株无扩增条带的原因是 。
②结合图2-A的扩增结果,在图2-B中,参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带(将正确条带涂黑)。
③使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本,有扩增条带松散株型∶无扩增条带松散株型= 。(共60张PPT)
微专题6
PCR技术的原理和应用
一、引物的设计
典型例题
例1 [2025 陕青宁晋卷节选］马铃薯作为重要农
作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植
区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中 基因
的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽
培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列
问题。
限制酶 识别序列及切割位点 限制酶 识别序列及切割位点
Ⅱ
Ⅰ
限制酶 识别序列及切割位点 限制酶 识别序列及切割位点
Ⅰ Ⅰ
Ⅰ
续表
图中标识了载体和基因中限制酶的切割位点。为将 基因正确插入载体，扩增基因时需在引物的_____(填“端”或“ 端”)添加限制酶识别序列，结合上表分析，上游引物应添加的碱基序列是
_________ ，切割载体时应选用的两种限制酶是________________________， 扩增产物和载体分别被限制酶切割后，经纯化和连接，获得含 基因的表达载体并导入农杆菌。
端
、
[解析] 为了使目的基因能够被限制酶切割，扩增目的基因时，需要
在引物的 端添加限制酶的识别序列。结合图表分析，在载体的启
动子和终止子之间有 、 和 Ⅰ 的识别序列，而
基因内部含有 Ⅰ 、 Ⅰ 和 的识别序列，为将 基
因正确插入载体，要用 、 、 Ⅰ 中的两种切割
载体，又不能用 Ⅰ 、 Ⅰ 或 切割 基因，再根据各
种限制酶的识别序列及切割位点可知，需要用 、
切割载体，同时用 的同尾酶(识别序列不同，但切割后可产生相同的黏性末端) Ⅱ 和 切割基因，故扩增 基
因时需在上游引物添加的碱基序列是 。
二、常用的 技术及其原理
典型例题
(一)荧光定量
例2 [2025·广西柳州模拟]检测甲流病毒遗传物质为 最常见的方
法是实时荧光定量，其原理是在 反应体系中加入引物的同时，
加入与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的 聚合酶催化子链
延伸至探针处，探针会被水解，使荧光监测系统接收到荧光信号，即
每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如下图)。下列叙述正确的是
( )
A.该 扩增是直接以甲流病毒的遗传物质作为模板进行的
B.此荧光探针是以甲流病毒遗传物质序列为模板合成的短 单链，
本身发出荧光
C.耐高温的聚合酶可能还有水解荧光探针的作用，使 发出荧光
D.一定时间内，检测到的荧光强度与反应体系中扩增出的 分子数
成反比
√
[解析] 甲流病毒为病毒，欲用检测需先经逆转录形成 ，
再以此为模板进行扩增，不能直接以 为模板，A错误；探针是依
据甲流病毒的序列合成的短 单链，结合图示可知，荧光探针含
有荧光分子，当探针完整时， 不发出荧光，故该探针本身不发光，
B错误；由题干“当耐高温的 聚合酶催化子链延伸至探针处，探
针会被水解”可知，耐高温的 聚合酶可能还有水解荧光探针的作
用，使发出荧光，C正确；
随着 产物量的增加，被水解释放的荧光分子也相应增多，荧光强
度与扩增出的 分子数成正比，D错误。
(二)
例3 [2025·福建厦门一模]是将逆转录成
(与互补的单链)和聚合酶链式反应 相结合的技术，具
体过程如图所示，下列叙述正确的是( )
A.过程 Ⅰ 获得的过程与 复制过程中碱基配对方式相同
B.图中A、B两种引物在 时通过碱基互补配对结合到模板链
C.图中子链的合成均是以四种核糖核苷酸为原料从引物的一端开始的
D.过程 Ⅱ 中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个
√
[解析] 过程 Ⅰ 是逆转录过程，
是以为模板合成 ，
该过程的碱基配对方式为、
、、，而
复制过程的碱基配对方式为
、、、 ，
二者碱基配对方式不完全相同，A错误；引物是通过碱基互补配对结
合到模板链上的，该过程是在复性阶段完成的，复性的温度一般在
左右，而不是， 是延伸阶段的温度，B错误；
题图中子链的合成是以四种脱氧核糖核苷酸为原料，从引物的一端开
始进行的，C错误；过程 Ⅱ 中，若进行6轮循环，最终产生的单
链数为 (条)，新合成的子链数为63条，则进行6轮循环，共需
要加入引物的数量为63个，D正确。
(三)定点突变技术——大引物
例4 [2025·广东揭阳模拟] 抗生素的长期
使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌
肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免
疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最
有前景的抗菌药物。研究发现，将抗菌肽
第52位的脯氨酸密码子为 替换成苏
氨酸密码子为 可增强抗菌肽的杀菌
活性。科研人员利用大引物 定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造
的过程如图所示。回答下列问题：
(1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，
需要将 的对应碱基序列中第_____
位的碱基替换，碱基具体变化为_______
__。基因模板链对应的碱基改变为_____
____。
154
C变为A
变
为
[解析] 上3个相邻的碱基决定1个
氨基酸，每3个这样的碱基为1个密码子，
第52位的氨基酸对应的 上的碱基
位次为 ，
脯氨酸密码子为 ，苏氨酸密码子为
，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换
成苏氨酸，可将 上154位的碱基替
换，碱基具体变化为C变为A。模板链与 碱基互补配对，则基
因模板链对应的碱基改变为变为 。
(2) 过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低则会导致反应效率降低，原因是___________________________________________________________。
温度偏低时双链解旋不充分，延伸时模板减少，产物量偏少
[解析] 变性的目的是使双链 打开，若变性时温度偏低 双链解旋不充分，延伸时模板减少，产物量偏少,导致反应效率降低。
(3)据图分析，“大引物 定点诱变”技术
中设计的“诱变引物”应选择___。
A.
B.
C.
D.
√
[解析] 由图可知，诱变引物与转录非模
板链碱基互补配对，则诱变引物序列与
转录模板链相同，且需将模板链上154
位碱基变为模板链方向为 ，
则诱变引物序列为 ，
A正确，B、C、D错误。
(4)进行大引物 定点诱变获得改良的抗
菌肽基因需要进行两次 和
，产物1最早出现在 的第___轮
循环; 的产物除改良的抗菌肽基因外，
还有____________________;通过 快
速扩增时应选用的引物是______________。
3
诱变前的抗菌肽基因
引物1和引物2
[解析] 产物1最早出现在 的第3轮
循环; 的复制方式为半保留复制，因
此 的产物除改良的抗菌肽基因外，
还有诱变前的抗菌肽基因。由图可知，
通过 扩增时应选的引物是引物1和
引物2，这样才能获得目的基因。
(四)巢式
例5 [2025·陕西汉中模拟]巢式是特殊的技术，使用两对 引
物扩增完整的 片段。具体过程分为两个阶段：第一阶段使用一对
引物进行第一次 扩增，获得中间产物；第二阶段以中间产物为模
板，使用另一对引物进行第二次 扩增，从而扩增出目标产物。下
列相关叙述正确的是( )
A.巢式 技术能降低扩增多个靶位点的可能性
B.第一次扩增 分子应选用引物①和引物③
C.巢式 扩增的两个阶段应在同一试管中进行
D.扩增 分子的过程中，复性阶段的温度最高
√
[解析] 巢式 使用两对引物进行两轮扩增，其中第二轮扩增的引
物是针对第一轮扩增的中间产物设计的，因此具有更高的特异性，
这种特异性使得巢式能够更准确地扩增目标 片段，降低了扩
增多个靶位点的可能性，A正确。根据图示和巢式 的原理，第一
次扩增应该使用引物①和引物④，它们分别与目标 片段的两
端互补，从而能够扩增出包含整个目标片段的中间产物；引物②和
引物③则是用于第二轮扩增的，它们与中间产物的特定序列互补，B
错误。巢式 的两个阶段通常不在同一试管中进行，因为第二阶
段需要去除第一阶段的引物和未反应的 ，以免干扰第二阶段的
特异性扩增，C错误。扩增 分子的过程中，分为变性、复性、
延伸三步，变性时温度超过，双链 解聚为单链； 复性时温
度下降到左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链 结
合；延伸时温度上升到 左右，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高
温的聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的 链，
因此扩增 分子过程中，变性阶段温度最高，D错误。
(五)不对称
例6 [2025·湖北黄冈模拟]目的基因的单链片段 可作为
探针，在科研和医学检测等方面有重要应用。利用不对称 技术可
制作大量的探针 ，其基本原理是采用数量或浓度不同的一对
引物引物①和引物 ，经若干次循环后，低浓度的引物首先被消耗
完毕，之后的循环只能产生高浓度引物的延伸产物，结果产生了大量
的 ，下列有关叙述正确的是( )
A.制作探针 的前提是需要检测目的基因的全部碱基排列顺序
B.若引物①与结合，则 仪中引物①的数量大于引物②的
数量
C.在反应缓冲液中加入 的作用是激活引物与母链碱基互补配对
D.扩增目的基因时，若复性的温度过高，可能得不到
√
[解析] 制作探针 时，不需要知道目的基因的全部碱基排列
顺序，只需要知道目的基因两端的碱基序列，以便合成两种引物，A
错误；若引物①与结合，则引物①延伸的单链与
互补，数量应该较少，故 仪中引物①的数量要小于引物②的数
量，B错误；在反应缓冲液中加入的作用是激活耐高温的
聚合酶，C错误； 扩增目的基因时，若复性的温度过高，则引物
与母链无法通过氢键形成碱基对，使后面的延伸无法进行， 分
子无法复制，得不到 ，D正确。
三、 技术的应用
典型例题
(一)利用 技术鉴定目的基因的连接方式
例7 [2023·山东卷节选] 科研人员构建了可表达 融合蛋白的重组
质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中 编码序列
表达标签短肽 。
构建重组质粒后，为了确定 基因连接到
质粒中且插入方向正确，需进行 检
测，若仅用一对引物，应选择图甲中的
引物__________________。 已知 基因
转录的模板链位于链，由此可知引物
与图甲中基因的_____(填“链”或“ 链”)
相应部分的序列相同。
和或与
链
[解析] 据图甲可知，引物与或 与
结合部位包含 基因及周围部分的碱基
序列，因此推测为了确定 基因连接到质粒
中且插入方向正确，进行 检测时，若仅用一对引物，应选择图
甲中的引物和或与。 是模板链，而根据题图中启动子和
终止子的位置可知转录方向是从左向右，对应的模板链方向应该是
，非模板链(也就是链)是； 复制中子链延伸方向
为，故引物方向为，所以配对的单链是的 链，
故其序列应该与 链相应部分的序列相同。
(二)利用“双脱氧法”进行基因测序
例8 [2024·湖南卷改编]最早的双脱氧测序法是在 反应体系中，分
别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸、、 或
，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，
以加入的体系为例：若配对的为 ，延伸终止；若配对的
为脱氧腺苷三磷酸，继续延伸； 产物变性后电泳检测。通
过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下
列叙述错误的是( )
A.上述 反应体系中只加入一种引物
B.电泳时产物的片段越大，迁移速率越慢
C. 为对照个体的一段序列
D.患者该段序列中某位点的碱基C突变为
√
[解析] 利用双脱氧测序法时， 反应体系中加入的模板是待测的
单链 ，故只需加入一种引物，A正确。电泳时，产物的片段越大，
迁移速率越慢,B正确。依据题中双脱氧测序法的原理，可以确定每
个泳道中的条带片段的端的碱基，如 的泳道中出现
的条带片段的 端碱基就是A;另外由于每个片段的起始点相同，
但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定 序列中每
个位置上的碱基；图示电泳方向为从上 下，即对应的 片段为
长 短，则对应的测序结果为 ，如对照个体的电泳结果
最短的条带为泳道组最下面的条带，则说明该片段 端
第一个碱基为C，因此对照个体的测序结果为
，患者的测序结果为
，C正确。对比患者和对照个体的测序结果
可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为 ，D错误。
(三)利用技术测定未知 区域
例9 [江苏卷] 如果已知一小段 的
序列,可采用 的方法，简捷地分析
出已知序列两侧的序列，具体流程如
下图(以 酶切为例):
请据图回答问题:
(1)步骤 Ⅰ 用的 是一种______
__________________酶，它通过识别
特定的____________切割特定位点。
限制
性内切核酸(或限制)
核苷酸序列
[解析] 步骤 Ⅰ 用的 是一种
限制性内切核酸酶，它能够识别双链
分子的某种特定核苷酸序列，并
且使每一条链中特定部位的两个核苷
酸之间的磷酸二酯键断开。
(2)步骤 Ⅱ 用的 连接酶催化相邻核苷酸
之间的羟基与 磷酸间形成_________
_____;循环中,升温到 是为了获得
__________; 聚合酶的作用是催化
_____________________________。
磷酸二
酯键
单链
以为模板的链的延伸
[解析] 步骤 Ⅱ 用的 连接酶催化相邻核
苷酸之间的羟基与磷酸间形成磷酸
二酯键， 循环中，升温到是为了
获得单链，这个过程称为变性，
聚合酶的作用是催化以为模板
的 链的延伸。
(3)若下表所列为已知的序列和设计的一些 引物,步骤 Ⅲ 选用
的 引物必须是______(从引物①②③④中选择，填编号)。
②④
序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知序列
引物
[解析] 引物是一小段核苷酸序列，
它能与 母链的一段进行碱基序列
互补配对，并且在 过程中，引物
只能与母链 端配对，子链的延
伸方向是从端到 端。由题图可知，
环状在进行 时，两条子链的
延伸方向相反，也就是说，两个引物
分别结合的是已知序列的 端，子链向左延伸需要引物④，子链向右延伸需要引物②。
(4)对产物测序，经分析得到了片段 的
完整序列。下列 单链序列中
(虚线处省略了部分核苷酸序列),结果正确的
是___。
A.
B.
C.
D.
√
[解析] 对 产物进行测序、分析，
得到片段的完整序列，其中片段
的完整序列内部有限制酶 的
识别序列，它识别的序列是 ，
只有B选项中包含 的识别序
列，B正确。
(四)利用 技术引导基因定点突变
例10 [2024·北京东城区一模] 请在方框中画出
可继续延伸的复性结果，要求标明每条链的
端和 端。
[答案]
[解析] 图中虚线方框中的两条链在延伸过程
中，既可作为模板又可以起到引物的作用，
使耐高温的聚合酶能够从两条链的 端
开始连接脱氧核苷酸，可继续延伸的复性结
果见答案。
(五)利用 技术进行产物鉴定
图1
例11 [2025·河南卷] 某二倍体植物松
散株型与紧凑株型是一对相对性状，
紧凑株型适合高密度种
植，利于增产。研究人员获得了一个
紧凑株型的植株，为研究控制该性状
的基因，将其与纯合松散株型植株杂
交，均为松散株型， 中松散株型∶
紧凑株型 ，控制该相对性状的
基因为 。回答下列问题：
图1
(1)该紧凑株型性状由__(填“A”或“ ”)
基因控制。
[解析] 根据题意可知，研究人员获
得了一个紧凑株型的植株，为研究
控制该性状的基因，将其与纯合松
散株型植株杂交， 均为松散株型，
中松散株型∶紧凑株型 ，说明
紧凑株型为隐性性状，由 基因控制。
图1
(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序
列得到基因(图1)， 基因表达的肽链比A基
因表达的肽链短。造成此现象的原因是____
______________________________________
_______________________________。
插
入序列后，基因转录产生的上终止密
码子提前出现，导致翻译提前终止
[解析] 在A基因编码蛋白质的区域
中插入一段序列得到基因， 基因
表达的肽链比A基因表达的肽链短，
推测可能是A基因内部插入一段序
列后，使基因转录产生的 上
终止密码子提前出现，导致翻译提
前终止。
图1
(3)研究人员设计了3条引物，位置如图1(→表示引物
方向)。以3个单株(甲、乙、丙)的 为模板，使用不同引物组合
进行扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和(不考虑
结果异常)。
图2
①图2-A中使用的引物组合是________；丙单株无扩增条带的原因是_
____________________________________________________________
________________。
P2和P3
丙的基因型为，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物
图2
[解析] 子二代的基因型为、、，根据图1可知，A和 基因上
均含有与P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有 基因中
才存在，中紧凑株型植株基因型为，松散株型植株基因型为
或 ，分析图2-A，可知甲、乙扩增出的条带相同，说明扩增出的
为 基因，因此图2-A使用的引物组合为引物P2和引物P3。由以上分
析可知，甲的基因型为，则丙的基因型为 ，无引物P3的结合序
列，故利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物。
②结合图2-A的扩增结果，在图2-B中，参照甲的条带补充乙与丙的电
泳条带(将正确条带涂黑)。
图2
[答案]
[解析] 由①中分析可知甲、乙、丙基因型分别为、、 ，结合
图2-B中甲的条带分析可知，图2-B是利用引物P1和P2扩增的产物电
泳的结果。由于 基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物，
因此基因型为(松散株型)、 (紧凑株型)的个体扩增的产物电泳时
均只有一个条带，且基因型为 的个体扩增的产物电泳时形成的条
带距离点样孔近，而基因型为 (松散株型)的个体扩增的产物电泳
时会出现两个条带，图见答案。
③使用图2-A中的引物组合扩增 全部样本，有扩增条带松散株型∶无
扩增条带松散株型 _____。
图2
[解析] 使用图2-A中的引物组合和P2扩增 全部样本，由于只
有含基因的个体才能扩增出相应产物，且子二代中 ，
所以使用图2-A中的引物组合扩增 全部样本，有扩增条带松散株型
无扩增条带松散株型 。
图2
