(共71张PPT)
专题8 生物技术与工程
5 蛋白质工程中的基因改造技术
重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如下图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是 ( )
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因，则需要消耗15个通用引物RP2
鉴典例
突破1 定 点 突 变
技术一 PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
1
D
解析：两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，只有5′端为单链的杂交DNA可以完成延伸过程，因为子链只能从3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30个通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15个，D正确。
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如右图：
深解构
技术二 PCR定点突变——大引物PCR技术
瑞典科学家斯万特帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变，其过程如下图。下列叙述正确的是 ( )
A．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
B．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
鉴典例
2
C．第二轮PCR所用的引物为第一轮PCR所产生的DNA的两条链
D．要完成两处位点的突变，至少需要4种引物
B
解析：进行PCR扩增需要的酶是耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，A错误；蛋白质工程是指通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，B正确；第二轮PCR所用的一个引物是第一轮的产物DNA的一条链(即大引物)，另一个引物为常规上游引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；由图可知，完成一处突变需要两种通用引物(常规上、下游引物)和两种诱变引物(上游突变引物和下游大引物)，如果要完成两种突变，则需要两种通用引物和四种诱变引物，至少要6种引物，D错误。
基因融合技术可以将不同的基因编码区首尾相连，或利用某些连接肽序列将功能基因相互连接，得到的融合基因受同一套调控序列控制，表达出融合蛋白。
深解构
突破2 同源重组(基因融合)
(2022·江苏卷)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引发多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由________________组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是______________ ________________________________。
鉴典例
3
图1
脂质和蛋白质
发出星射线，形成纺锤体(与纺锤体的形成有关)
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度，将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是______________。PCR扩增时，需在__________________________________ ___________催化下，在引物的_______端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
溶解DNA
耐热/耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)
3′
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可指示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图2所示载体质粒Y，构建 Y－M 重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)。请完成表3。
表1
限制酶 识别序列
BamHⅠ G↓GATCC
EcoRⅤ GAT↓ATC
Hind Ⅲ A↓AGCTT
BglⅡ A↓GATCT
图2
表2
序列编号 Y－M连接处测序后部分序列
Q1 5′－AGATCTCCGATATT－3′
Q2 5′－AGATCTCCAAGCTT－3′
Q3 5′－AAGCTTCCGGATCC－3′
Q4 5′－AAGCTTCCGATATC－3′
表3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M ①选择图2引物_________；
②PCR目的产物约为_________ bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序，表2中正确的是______(选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部，说明________________ __________________
a、b
1 100
Q4
蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经__________形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的______倍。
逆转录
32
解析：(1)纤毛膜由细胞膜延伸而来，故两者成分是一样的，主要是脂质和蛋白质。中心体与有丝分裂过程中纺锤体的形成有关，动物细胞有丝分裂前期，中心体发出星射线，形成纺锤体。(2)DNA在0.14 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度最低，而可溶于2.0 mol·L－1的NaCl溶液，故添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶(即Taq DNA聚合酶)的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸(DNA链的合成方向是从5′端到3′端)。
(3)由图中限制酶切割位点和引物箭头方向可知，PCR应选择图2中的引物a和引物b，则PCR目的产物长度约为300＋800＝1 100 bp。在EcoR Ⅴ位点插入片段构建Y－M重组质粒，则Y－M的连接处应含有EcoR Ⅴ的识别序列，根据表1中各限制酶识别序列，表中序列Q4符合。实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部。(4)RNA经逆转录形成cDNA。Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20，说明病人基因Z表达较弱，假设正常人基因Z的cDNA为x，患者基因Z的cDNA为y，则有x·215＝y·220，得x/y＝25，故从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32倍。
1．定义：CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如下图)。CRISPR复合体中sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
深解构
突破3 基因编辑(CRISPR/Cas9技术)
2．作用：从功能上来看，CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制酶，该系统广泛存在于细菌中，作用是切割外源DNA，使之失效，起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵，保护自身或清除入侵的病毒DNA)。
3．优点：若用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
4．弊端：CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，sgRNA的识别序列越短，则特异性越差，容易与其他片段结合造成编辑出错，基因编辑的脱靶率越高。
(2025·如东2.5模)基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象。CRISPR/Cas9基因编辑系统包含Cas9基因和sgRNA编码序列(gRNAs)，科学家借助该系统研发出人工基因驱动系统，并在拟南芥和蚊子等生物中实现了外部引入的基因多代遗传。在作物快速育种、根除疟疾等方面具有广阔的前景。请回答下列问题：
鉴典例
4
(1)为研发拟南芥蓝光受体CRY1基因驱动系统，科学家首先构建了基因驱动元件，将基因驱动元件精确插入一条染色体上的CRY1基因中，过程如图1所示。
①将基因驱动元件导入拟南芥细胞，在细胞中表达Cas9/sgRNA复合物，该复合物通过______________识别和结合DNA特定序列，并引导Cas9酶切断DNA双链的______________，从而将基因驱动元件插入CRY1基因中，该过程属于定点______ ______(填“基因突变”或“染色体变异”)。
图1
sgRNA
磷酸二酯键
基因
突变
②为确定基因驱动元件是否插入CRY1基因，选择引物____________进行PCR—电泳，结果如图2。条带1的大小约为7 800 bp，条带2的大小约为3 200 bp。基因驱动元件成功插入的是条带_____，基因驱动元件的大小约为____________。
P1和P4
图2
1
4 600 bp
(2)当携带基因驱动元件的动物与野生型动物交配时，它们的后代从父母中各获得一份DNA副本：自然版本和基因驱动版本。受精后，来自不同亲本的染色体排列在一起时，基因驱动DNA中的CRISPR被激活。它能识别对侧染色体上自然基因的拷贝，并在胚胎发育开始前引导Cas9酶切除自然拷贝。一旦自然基因受损，细胞的特殊修复机制就会启动，修复丢失的DNA，但它使用未断裂的染色体(携带基因驱动的染色体)作为模板。所以当修复完成后，两条染色体都携带一份基因驱动的拷贝。此过程被称为同源定向修复。
①用CRY1基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达8%的植株为纯合突变体。纯合突变体产生的原因是F1中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父本的______________(部位)上也插入CRY1基因驱动元件。
②用基因驱动技术改造传播疟疾的按蚊X染色体上的A基因获得a基因，已知含a基因的精子不能成活。用改造后的纯合雌蚊突变体与野生型雄蚊交配获得子一代，子一代相互交配，子二代中的性别组成为__________，且子二代中含有a基因的比例________(填“大于”“等于”或“小于”)1/2。若将基因驱动雌蚊释放到疟疾疫区，可通过______________________________________来降低按蚊的种群密度。
同源染色体
(全)雄
大于
破坏按蚊种群的性别比例，降低出生率
解析：(1)①CRISPR/Cas9基因编辑系统中，sgRNA起向导作用，引导Cas9切割DNA。插入基因内部引起基因突变。②子链从引物3′端进行延伸，为确定基因驱动元件是否插入CRY1基因，选择引物P1和P4进行PCR—电泳，其中M加样孔加入的是已知大小的不同长度的DNA混合物，即标准样液。基因驱动元件成功插入CRY1基因，使得PCR扩增出的条带变长，碱基对数量增多，对应条带1，则条带2是未插入基因驱动元件的CRY1基因，所以基因驱动元件的大小约为7 800－3 200＝4 600 bp。
(2)①F1应为杂合子，但有多达8%的植株为纯合突变体，根据题中“同源定向修复”概念可知，应是野生型父本的同源染色体上插入CRY1基因驱动原件。②雌蚊突变体基因型为XaXa，野生型雄蚊基因型为XAY，杂交后代F1中雌性基因型为XAXa，雄性基因型为XaY。子一代相互交配，由于含a基因的精子不能成活，雄性只产生Y一种精子，因此子二代的性别是全雄。由于F1中有多达8%的植株为纯合突变体，即F1中有8%的XAXa变成了XaXa，因此，子二代中含有a基因的比例大于1/2。若将基因驱动雌蚊释放到疟疾疫区，因为破坏了按蚊种群的性别比例，导致出生率下降，种群密度下降，所以疟疾发病率将会下降。
无缝克隆是一种显著区别于传统酶切连接方法的新技术，该技术是依赖于同源序列的基因克隆技术。通过重组酶的作用，能够将任意含有载体末端重叠区域的DNA片段重组至线性化载体上，不受酶切位点限制，载体自连极低。
深解构
突破4 无 缝 克 隆
In－Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In－Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端任意16个碱基，使其降解)处理即可实现无缝连接。其操作步骤如右图。请回答下列问题：
鉴典例
5
(1)为获得线性化质粒，除了图示利用PCR方法外，还可利用______________的方法实现。
(2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一：先将除___________________以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比，这样做的目的是可减少反应起始时____________形成的产物。
(3)图中，同源序列1、2中的碱基序列________(填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是________________________，还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。
限制酶处理
Taq DNA聚合酶
引物错配
不同
防止目的基因反向连接
(4)据图分析，引物A或引物B要依据__________________的序列进行设计。过程②经过_____轮循环就可能首次得到符合要求的目的基因片段。
(5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后，In－Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列，形成____________，然后降温使其发生________________，进而在DNA聚合酶及______________酶的作用下完成质粒的环化，形成重组质粒。
(6)与传统构建重组质粒的方法相比，In－Fusion技术的优势是_____________ ___________________________________________________________________________________(答出一条即可)。
目的基因与质粒
3
黏性末端
碱基互补配对
DNA连接
不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等
解析：(2)常规PCR最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低温度下引物可能与部分单链模板非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，导致引物错配形成的产物扩增。热启动PCR先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。这样做可减少反应起始时引物错配形成的产物。(4)据图分析，目的基因经引物A和引物B扩增后需要与线性化质粒连接，故为保证扩增出所需的目的基因，引物A和引物B要依据目的基因和质粒序列进行设计。PCR时至少经过3轮循环才可能首次得到符合要求的目的基因片段。
热练
1．(多选)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是 ( )
突破1 定点突变
A．两轮PCR过程中退火时的温度不一样
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
AD
解析：为了使引物与模板链准确配对，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮高，A正确；单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；第一轮产物的一条链作第二轮PCR扩增的大引物，还需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；蛋白质工程是指通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
2．(2025·盐城中学节选)牛的瘤胃中生活着多种微生物，其中一些微生物能分解尿素。这些微生物细胞中G蛋白参与激活脲酶，且G蛋白激活脲酶依赖于其与E蛋白结合。为探究G蛋白与E蛋白的结合位点，拟采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，相关过程见图1。请回答下列问题：
图1
(1)为获得点突变G蛋白基因，PCR1需要的引物是________________(从图1引物中选择)，PCR4需要的引物是________________(从图1引物中选择)，PCR3反应体系需加入__________(从下列选项中选择)。
A．含Mg2+缓冲液 B．四种脱氧核苷酸
C．TaqDNA聚合酶 D．引物2和5
E．引物1和6 F．产物1和2
(2)据图1可知，G蛋白转录的模板链是________(填“a链”或“b链”)，引物4中该突变位点碱基为________(按5′到3′方向)。
引物1和引物4
引物1和引物6
ABCF
b链
GC
(3)改造后的G蛋白基因约有1 600个碱基。PCR扩增结果如图2所示，则加样孔位于______(填“甲”或“乙”)端。由图2可知泳道1条带中的PCR产物长度为1 600个碱基左右，由此推测PCR产物__________(填“一定”“不一定”或“不”)是改造的G蛋白基因，理由是______________________________________________________________________________________。
图2
甲
不一定
PCR产物电泳结果只能说明DNA分子大小，不能说明产物的碱基对序列与G蛋白基因一致
解析：(1)由图1可知，引物3和引物4处含有突变位点，且引物会与模板链的3′端结合，子链延伸方向是5′→3′，所以为获得点突变G蛋白基因，PCR1需要的引物是引物1和引物4，PCR4需要与G蛋白基因两端互补的引物，即引物1和引物6，PCR3扩增时，反应体系中应加入含Mg2+缓冲液、原料(四种脱氧核苷酸)、模板(PCR1的产物1的一条链和PCR2的产物2的一条链)、TaqDNA聚合酶等。(2)转录时，mRNA延伸的方向是5′→3′，图1中a链的3′端起始碱基是AGT，对应mRNA链中的是GCA，不是起始密码子，而b链的3′端起始碱基是TAC，对应mRNA链中的是AUG，是起始密码子，所以图1中，G蛋白转录的模板链是b链。
采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，而组氨酸的密码子为CAU，丙氨酸的密码子为GCU，按照碱基互补配对原则，对应b链3′→5′为CG，引物4中该突变位点碱基5′→3′为GC。(4)分子质量越小的DNA，在电泳时跑得越快，与加样端的距离越远，则加样孔位于甲端。由于改造的G蛋白基因是通过G蛋白碱基替换得到的，基因的碱基个数没有发生改变，泳道1条带中的PCR产物长度为1 600个碱基左右，但PCR不能测得碱基序列，由此推测PCR产物不一定是改造的G蛋白基因。
3．(2025·扬州中学)Cre－loxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把三种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。
突破2 同源重组(基因融合)
图1
图2
下列说法不正确的是 ( )
A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能随机出现两种颜色叠加
B
解析：DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，敲除基因时需要切断基因前后两端，因此需要破坏4个磷酸二酯键，A正确。据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝色荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，故肌肉细胞不会表达颜色基因，B错误。由题意可知，图2两个loxP1之间或两个1oxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，且仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因，小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，若敲除两个loxP2之间的黄色(或红色)荧光蛋白基因，则与启动子相邻的红色(或黄色)荧光蛋白基因表达，脑组织细胞呈红色(或黄色)；
若敲除两个1oxP1之间的红色荧光蛋白基因，则与启动子相邻的黄色荧光蛋白基因表达，脑组织细胞呈黄色；若敲除两个1oxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，则与启动子相邻的蓝色荧光蛋白基因表达，脑组织细胞呈蓝色，所以不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，C正确。小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而脑组织细胞的颜色可由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，D正确。
4．(2025·海安中学)同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，以研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因(2071 bp)是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题：
(1)过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入________ __________________________，所加dNTP的作用有________________________。
(2)为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需在引物_______端添加限制酶________________________(填种类)的识别序列；过程②需要限制酶和______________酶。
(3)过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为__________细胞。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加__________。
引物
(或P1、P2)和模板(或质粒1)
既作为原料又提供能量
5′
BamHⅠ、EcoRⅠ
DNA连接
感受态
四环素
(4)右图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功，判断的理由是__________________ _______________________，过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5′端分别添加________基因两端的同源序列。
4、5、7的电泳结果接近(或大于)2 071 bp
(5)过程⑦中，在含有四环素和___________的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加__________ __________。
LacZ
X－gal
蔗糖和
X－gal
解析：(1)PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。故在PCR反应体系中，需加入引物(P1、P2)、模板、Taq酶、4种脱氧核苷酸(dNTP)、缓冲液、Mg2+等，DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，dNTP既能为反应提供原料，还能提供能量。(2)HindⅢ会破坏tetr基因，XmaⅠ会破坏复制原点，为保证sacB基因和质粒2定向连接，应用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ切割目的基因和质粒，引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，因此设计引物P1、P2时，需在引物5′端添加限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，过程②为基因表达载体的构建，需要限制酶和DNA连接酶。(3)过程③为将目的基因导入受体细胞，导入目的基因时，首先用Ca2+处理大肠杆菌使其成为感受态细胞。重组质粒的标记基因为tetr(四环素抗性基因)，筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加四环素。
(4)sacB基因是目的基因，sacB基因大小为2 071 bp，4、5、7的电泳结果接近(或大于)2 071 bp，说明4、5、7对应的菌株中含有目的基因，说明泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功。引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，目的基因(tetr－sacB)需要与LacZ基因连接，因此需在引物5′端分别添加LacZ基因两端的同源序列。(5)LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物，过程⑦为筛选LacZ基因敲除菌株，因此，若LacZ基因被敲除，则在含有四环素和X－gal的培养基中出现白色菌落。sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物，则添加X－gal起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X－gal可筛选LacZ基因回补菌株。
5．下图是采用CRISPR技术对某生物基因进行编辑的过程，该过程中用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的位点进行切割。下列叙述正确的是 ( )
A
突破3 基因编辑(CRISPR/Cas9技术)
A．根据破坏b基因后生物体的功能变化，可推测b基因的功能
B．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的sgRNA
C．图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2碱基序列相同或互补
D．可利用此技术编辑生殖细胞相关基因以期生育出免疫艾滋病的婴儿
解析：由图可知，sgRNA引导Cas9与靶基因特定位点结合时，只需要与靶基因的部分序列配对；图中sgRNA1与sgRNA2分别与靶基因的不同位点配对，二者的碱基序列没有关联；基因编辑技术还不完全成熟，存在脱靶现象等问题，目前不适合通过基因编辑技术生育免疫艾滋病婴儿。
6．(2025·盐城考前模拟)科研人员开发了一种可将C—G碱基对转变为T—A碱基对的单碱基编辑工具(简称CBE系统)。该系统由三个元件构成，其中“dCas9蛋白＋胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，对结合区域第4～8位点的碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的不可逆编辑，不需要DNA链断裂，如图1所示。请回答下列问题：
图1 CBE系统的编辑过程
(1)图中CBE系统与靶DNA结合区域可能存在的碱基互补配对方式有________ __________________。
(2)CBE系统与靶DNA的识别和结合过程发生了______键的断裂和形成，过程①__________(填“发生”或“未发生”)磷酸二酯键的断裂和形成，经脱氨作用形成的一个如图1所示的DNA分子，经过n轮(n＞2)复制，可形成__________个碱基编辑的DNA。该系统中单碱基编辑________(填“属于”或“不属于”)基因突变。
(3)根据所学知识分析，CBE系统不可以______。
A．提供更多生物进化的原材料 B．改变基因库
C．改变生物进化的方向 D．改变基因频率
A—T、
A—U、C—G
氢
未发生
2n－1－1
属于
C
(4)某研究发现，在二倍体野生草莓和八倍体栽培草莓中，花青素合成过程的关键转录因子之一MYB10基因自然变异导致草莓果实成白色，严重影响营养价值。科学家利用单碱基编辑系统对二倍体野生草莓果实中MYB10基因定点突变，为培育优良草莓品种提供了有价值的候选基因。已知二倍体野生草莓中MYB10基因编码链第469～488位碱基序列为5′－ACAGGACATGGGACGGATAA－3′，为实现该区域编码多肽链中的组氨酸定点突变为酪氨酸，应设计的sgRNA序列是______。(组氨酸：CAU、CAC，酪氨酸：UAU、UAC)
A．3′－UGUCCUGUACCCUGCCUAUU－5′
B．5′－UGUCCUGUACCCUGCCUAUU－3′
C．3′－ACAGGACAUGGGACGGAUAA－5′
D．5′－ACAGGACAUGGGACGGAUAA－3′
D
(5)下表为相关限制酶及其识别序列及切割位点。利用图2质粒和目的基因构建CBE系统，为高效连接和筛选，结合pHSE401质粒上限制酶识别位点，推测目的基因上游和下游含有的限制酶识别位点组合可以为__________(填序号)。
表 限制酶及其识别序列和切割位点
②⑤⑥
限制酶 识别序列和切割位点
XbaⅠ T↓TCGAG
SmaⅠ CCC↓GGG
EcoRⅠ G↓AATTC
SacⅠ C↓TCGAG
HindⅠ A↓AGCTT
图2 质粒(左)和目的基因(右)
①XbaⅠ和SacⅠ ②XbaⅠ和HindⅢ ③EcoRⅠ和SacⅠ
④SmaⅠ和SacⅠ ⑤HindⅢ和EcoRⅠ ⑥XbaⅠ和EcoRⅠ
(6)上述单碱基编辑技术的优点有________________________________________ ______________________________________________________________________。
不涉及双链DNA的切割，有更高的安全性；可以精确地靶向基因组DNA的特定位置，具有高度的特异性；可实现胞内编辑
解析：(1)CBE系统中的sgRNA与靶DNA的一条链配对，所以可能存在的碱基互补配对有A—T、A—U、C—G。(2)CBE系统与靶DNA的识别和结合过程中，基因组DNA双链先解开，其中的一条链与sgRNA结合，发生了氢键的断裂和形成。据图可知，过程①碱基C在脱氨作用下发生了碱基种类的改变：C→U，并未发生磷酸二酯键的断裂和形成。经脱氨作用形成的一个G//U经一次复制得到A//U，经过第2次复制后形成A//T(碱基编辑的DNA)和A//U。如图所示的DNA分子经过n轮复制，即A//U经过(n－1)次复制，共形成2n－1个DNA，其中一个DNA含有的是A//U，所以含有A//T(碱基编辑的DNA)的为(2n－1－1)个。该系统中单碱基编辑发生了碱基种类的改变，属于基因突变。
(3)生物进化的方向是由自然选择决定的，而非变异决定，C错误。(4)sgRNA与转录的模板链配对，而模板链碱基序列未发生改变，所以设计的sgRNA序列与原来的编码链相同(将T改为U)，所以设计的sgRNA序列是5′－ACAGGACAUGGGACG GAUAA－3′，D正确。(5)XbaⅠ和SacⅠ会造成目的基因与质粒的不定向连接；EcoRⅠ和SacⅠ造成目的基因反向插入质粒；SmaⅠ和SacⅠ会破坏复制原点，只有用②⑤⑥既能保证正向插入，又能破坏四环素抗性基因，便于筛选。(6)根据图示CBE系统的原理图，单碱基编辑技术不涉及双链DNA的切割，有更高的安全性；可以精确地靶向基因组DNA的特定位置，具有高度的特异性；可实现胞内编辑等。
7．(2025·启东调研)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题：
突破4 无缝克隆
注：bar为草胺膦抗性基因；Kamr为卡那霉素抗性基因。
(1)无缝克隆时，T5核酸外切酶沿__________的方向水解DNA，其目的是形成____________。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，______________________。
(2)过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是__________________________ ________，过程③所需的酶有____________________________。
(3)与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有________。
A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基
C．操作时间短，成功率高 D．有利于多个小片段(小于50 bp)连接
5′→3′
黏性末端
防止过度水解DNA
过程①形成的黏性末端长度不同
DNA聚合酶和DNA连接酶
ABC
(4)PCR扩增PABD基因时需依据_________________________________________ ___________设计引物R1。据图分析，扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的________。
PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列
1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′
2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′
3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′
4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′
1、4
(5)利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有__________的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为______________________________，说明T1为单位点插入的转基因株系。
(6)通过观测转基因拟南芥根尖细胞中____________________，了解PA的动态变化。
草胺膦
抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1
绿色荧光点的分布
解析：(1)由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。(2)过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到子链3′—OH末端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。
(3)传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒不受限制酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段(小于50 bp)连接，A、B、C正确。
(4)用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因(目的基因)需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的4。
(5)由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2代幼苗的基因型及比例为A_∶aa＝3∶1，因此抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1。(6)由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，可了解PA的动态变化。
8．(2025·泰州中学)虾青素可由β－胡萝卜素在β－胡萝卜素酮化酶(Bkt)和β－胡萝卜素羟化酶(CrtR－B)的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β－胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”(如图1)构建含bkt基因和crtR－B基因的表达载体(如图2、3所示)，导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，请回答下列问题：
图1
图2
图3
(1)获取目的基因：红球藻是天然虾青素的重要来源，提取红球藻的总DNA为________，设计特异性引物扩增bkt基因和crtR－B基因，此过程需要_____________ ____________________________(至少写两种)。
(2)构建转化载体：
①PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序列。若将来需要将抗除草剂基因从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增抗除草剂基因时，设计的引物序列(5′→3′)为______。
A．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列
B．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列
C．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列
模板
dNTP、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液等
C
②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将bkt基因和crtR－B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增crtR－B基因所用的引物为__________。
③最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是________________________。
(3)准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行第一次培养，一段时间后，挑取生长良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。期间可取藻液滴入血细胞计数板，在显微镜下进行计数，第二次培养的目的是________ _______________。
Ⅵ和Ⅷ
确保目的基因正常表达
扩大
培养杜氏盐藻
(4)目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含__________的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用______ ______________技术检测是否成功转录出β－胡萝卜素酮化酶和β－胡萝卜素羟化酶的mRNA。
(5)叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高__________________；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免__________。
除草剂
PCR
(分子杂交)
目的基因的表达量
基因污染
解析：(1)因红球藻是天然虾青素的重要来源，是目的基因的来源，故可提取红球藻的总DNA为模板，设计特异性引物对其DNA中的bkt基因和crtR－B基因进行PCR扩增，此过程需要TaqDNA聚合酶的催化，同时还需要dNTP、缓冲液等。(2)①根据PCR扩增的原理，在PCR过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在5′端添加对应的同源序列；根据题意，若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，则所需引物(5′→3′)的序列应为“同源序列＋限制酶识别序列＋特异性扩增引物序列(抗除草剂基因部分序列)”，C正确。
②根据图2所示，要通过“无缝克隆法”同时将bkt基因和crtR－B基因插入质粒，则要保证bkt基因一侧有一致同源序列，另一侧有crtR－B基因部分序列，因此扩增bkt基因所用的引物为Ⅰ、Ⅲ；同理，扩增crtR－B基因所用的引物为Ⅵ和Ⅷ。③启动子是转录的起始信号，选用内源性启动子的目的是防止基因沉默，确保目的基因能表达。(3)选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养的目的是纯化杜氏盐藻，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养的目的是扩大培养杜氏盐藻。突破1 定 点 突 变
技术一 PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
鉴典例
重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如下图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是( )
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因，则需要消耗15个通用引物RP2
技术二 PCR定点突变——大引物PCR技术
深解构
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如下图：
鉴典例
瑞典科学家斯万特帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变，其过程如下图。下列叙述正确的是( )
A．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
B．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
C．第二轮PCR所用的引物为第一轮PCR所产生的DNA的两条链
D．要完成两处位点的突变，至少需要4种引物
突破2 同源重组(基因融合)
深解构
基因融合技术可以将不同的基因编码区首尾相连，或利用某些连接肽序列将功能基因相互连接，得到的融合基因受同一套调控序列控制，表达出融合蛋白。
鉴典例
(2022·江苏卷)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引发多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
图1
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由__ 组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__ 。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度，将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是__ __。PCR扩增时，需在__ 催化下，在引物的__ __端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可指示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图2所示载体质粒Y，构建 Y－M 重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)。请完成表3。
表1
限制酶 识别序列
BamHⅠ G↓GATCC
EcoRⅤ GAT↓ATC
Hind Ⅲ A↓AGCTT
BglⅡ A↓GATCT
图2
表2
序列编号 Y－M连接处测序后部分序列
Q1 5′－AGATCTCCGATATT－3′
Q2 5′－AGATCTCCAAGCTT－3′
Q3 5′－AAGCTTCCGGATCC－3′
Q4 5′－AAGCTTCCGATATC－3′
表3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M ①选择图2引物__ __； ②PCR目的产物约为__ __ bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序，表2中正确的是__ __(选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部，说明__ __
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经__ __形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__ __倍。
突破3 基因编辑(CRISPR/Cas9技术)
深解构
1．定义：CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如下图)。CRISPR复合体中sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
2．作用：从功能上来看，CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制酶，该系统广泛存在于细菌中，作用是切割外源DNA，使之失效，起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵，保护自身或清除入侵的病毒DNA)。
3．优点：若用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
4．弊端：CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，sgRNA的识别序列越短，则特异性越差，容易与其他片段结合造成编辑出错，基因编辑的脱靶率越高。
鉴典例
(2025·如东2.5模)基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象。CRISPR/Cas9基因编辑系统包含Cas9基因和sgRNA编码序列(gRNAs)，科学家借助该系统研发出人工基因驱动系统，并在拟南芥和蚊子等生物中实现了外部引入的基因多代遗传。在作物快速育种、根除疟疾等方面具有广阔的前景。请回答下列问题：
(1)为研发拟南芥蓝光受体CRY1基因驱动系统，科学家首先构建了基因驱动元件，将基因驱动元件精确插入一条染色体上的CRY1基因中，过程如图1所示。
图1
图2
①将基因驱动元件导入拟南芥细胞，在细胞中表达Cas9/sgRNA复合物，该复合物通过__ __识别和结合DNA特定序列，并引导Cas9酶切断DNA双链的__ __，从而将基因驱动元件插入CRY1基因中，该过程属于定点__ __(填“基因突变”或“染色体变异”)。
②为确定基因驱动元件是否插入CRY1基因，选择引物__ __进行PCR—电泳，结果如图2。条带1的大小约为7 800 bp，条带2的大小约为3 200 bp。基因驱动元件成功插入的是条带__ __，基因驱动元件的大小约为__ __ 。
(2)当携带基因驱动元件的动物与野生型动物交配时，它们的后代从父母中各获得一份DNA副本：自然版本和基因驱动版本。受精后，来自不同亲本的染色体排列在一起时，基因驱动DNA中的CRISPR被激活。它能识别对侧染色体上自然基因的拷贝，并在胚胎发育开始前引导Cas9酶切除自然拷贝。一旦自然基因受损，细胞的特殊修复机制就会启动，修复丢失的DNA，但它使用未断裂的染色体(携带基因驱动的染色体)作为模板。所以当修复完成后，两条染色体都携带一份基因驱动的拷贝。此过程被称为同源定向修复。
①用CRY1基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达8%的植株为纯合突变体。纯合突变体产生的原因是F1中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父本的__ __(部位)上也插入CRY1基因驱动元件。
②用基因驱动技术改造传播疟疾的按蚊X染色体上的A基因获得a基因，已知含a基因的精子不能成活。用改造后的纯合雌蚊突变体与野生型雄蚊交配获得子一代，子一代相互交配，子二代中的性别组成为__ __，且子二代中含有a基因的比例__ __(填“大于”“等于”或“小于”)1/2。若将基因驱动雌蚊释放到疟疾疫区，可通过__ __ 来降低按蚊的种群密度。
突破4 无 缝 克 隆
深解构
无缝克隆是一种显著区别于传统酶切连接方法的新技术，该技术是依赖于同源序列的基因克隆技术。通过重组酶的作用，能够将任意含有载体末端重叠区域的DNA片段重组至线性化载体上，不受酶切位点限制，载体自连极低。
鉴典例
In－Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In－Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端任意16个碱基，使其降解)处理即可实现无缝连接。其操作步骤如下图。请回答下列问题：
(1)为获得线性化质粒，除了图示利用PCR方法外，还可利用__ __ 的方法实现。
(2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一：先将除__ __ 以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比，这样做的目的是可减少反应起始时__ __形成的产物。
(3)图中，同源序列1、2中的碱基序列__ __(填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是__ __，还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。
(4)据图分析，引物A或引物B要依据__ __的序列进行设计。过程②经过__ __轮循环就可能首次得到符合要求的目的基因片段。
(5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后，In－Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列，形成__ __，然后降温使其发生__ __，进而在DNA聚合酶及__ __酶的作用下完成质粒的环化，形成重组质粒。
(6)与传统构建重组质粒的方法相比，In－Fusion技术的优势是__ (答出一条即可)。
突破1 定点突变
1．(多选)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是( )
A．两轮PCR过程中退火时的温度不一样
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
2．(2025·盐城中学节选)牛的瘤胃中生活着多种微生物，其中一些微生物能分解尿素。这些微生物细胞中G蛋白参与激活脲酶，且G蛋白激活脲酶依赖于其与E蛋白结合。为探究G蛋白与E蛋白的结合位点，拟采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，相关过程见图1。请回答下列问题：
注：引物中表示碱基突变位点。可能用到的密码子：起始密码子(AUG)、组氨酸(CAU)、丙氨酸(GCU)。
图1
图2
(1) 为获得点突变G蛋白基因，PCR1需要的引物是__ __(从图1引物中选择)，PCR4需要的引物是__ __(从图1引物中选择)，PCR3反应体系需加入__ __(从下列选项中选择)。
A．含Mg2+缓冲液 B．四种脱氧核苷酸 C．TaqDNA聚合酶 D．引物2和5 E．引物1和6 F．产物1和2
(2) 据图1可知，G蛋白转录的模板链是__ __(填“a链”或“b链”)，引物4中该突变位点碱基为__ __(按5′到3′方向)。
(3) 改造后的G蛋白基因约有1 600个碱基。PCR扩增结果如图2所示，则加样孔位于__ __(填“甲”或“乙”)端。由图2可知泳道1条带中的PCR产物长度为1 600个碱基左右，由此推测PCR产物__ __(填“一定”“不一定”或“不”)是改造的G蛋白基因，理由是__ __ 。
突破2 同源重组(基因融合)
3．(2025·扬州中学)Cre－loxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把三种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法不正确的是( )
图1
图2
A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能随机出现两种颜色叠加
4．(2025·海安中学)同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，以研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因(2071 bp)是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题：
(1) 过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入__ __ ，所加dNTP的作用有__ __。
(2) 为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需在引物__ __ 端添加限制酶__ __(填种类)的识别序列；过程②需要限制酶和__ __酶。
(3) 过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为__ __细胞。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加__ __。
(4) 下图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功，判断的理由是__ __ ，过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5′端分别添加__ __基因两端的同源序列。
(5) 过程⑦中，在含有四环素和__ __的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加__ __。
突破3 基因编辑(CRISPR/Cas9技术)
5．下图是采用CRISPR技术对某生物基因进行编辑的过程，该过程中用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的位点进行切割。下列叙述正确的是( )
A．根据破坏b基因后生物体的功能变化，可推测b基因的功能
B．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的sgRNA
C．图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2碱基序列相同或互补
D．可利用此技术编辑生殖细胞相关基因以期生育出免疫艾滋病的婴儿
6．(2025·盐城考前模拟)科研人员开发了一种可将C—G碱基对转变为T—A碱基对的单碱基编辑工具(简称CBE系统)。该系统由三个元件构成，其中“dCas9蛋白＋胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，对结合区域第4～8位点的碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的不可逆编辑，不需要DNA链断裂，如图1所示。请回答下列问题：
图1 CBE系统的编辑过程
(1) 图中CBE系统与靶DNA结合区域可能存在的碱基互补配对方式有__ __ 。
(2) CBE系统与靶DNA的识别和结合过程发生了__ __键的断裂和形成，过程①__ __(填“发生”或“未发生”)磷酸二酯键的断裂和形成，经脱氨作用形成的一个如图1所示的DNA分子，经过n轮(n>2)复制，可形成__ _ _个碱基编辑的DNA。该系统中单碱基编辑__ __(填“属于”或“不属于”)基因突变。
(3) 根据所学知识分析，CBE系统不可以__ __。
A．提供更多生物进化的原材料 B．改变基因库
C．改变生物进化的方向 D．改变基因频率
(4) 某研究发现，在二倍体野生草莓和八倍体栽培草莓中，花青素合成过程的关键转录因子之一MYB10基因自然变异导致草莓果实成白色，严重影响营养价值。科学家利用单碱基编辑系统对二倍体野生草莓果实中MYB10基因定点突变，为培育优良草莓品种提供了有价值的候选基因。已知二倍体野生草莓中MYB10基因编码链第469～488位碱基序列为5′－ACAGGACATGGGACGGATAA－3′，为实现该区域编码多肽链中的组氨酸定点突变为酪氨酸，应设计的sgRNA序列是__ __。(组氨酸：CAU、CAC，酪氨酸：UAU、UAC)
A．3′－UGUCCUGUACCCUGCCUAUU－5′
B．5′－UGUCCUGUACCCUGCCUAUU－3′
C．3′－ACAGGACAUGGGACGGAUAA－5′
D．5′－ACAGGACAUGGGACGGAUAA－3′
(5) 下表为相关限制酶及其识别序列及切割位点。利用图2质粒和目的基因构建CBE系统，为高效连接和筛选，结合pHSE401质粒上限制酶识别位点，推测目的基因上游和下游含有的限制酶识别位点组合可以为__ __(填序号)。
表 限制酶及其识别序列和切割位点
限制酶 识别序列和切割位点
XbaⅠ T↓TCGAG
SmaⅠ CCC↓GGG
EcoRⅠ G↓AATTC
SacⅠ C↓TCGAG
HindⅠ A↓AGCTT
图2 质粒(左)和目的基因(右)
①XbaⅠ和SacⅠ ②XbaⅠ和HindⅢ ③EcoRⅠ和SacⅠ
④SmaⅠ和SacⅠ ⑤HindⅢ和EcoRⅠ ⑥XbaⅠ和EcoRⅠ
(6) 上述单碱基编辑技术的优点有__ __ 。
突破4 无缝克隆
7．(2025·启东调研)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题：
注：bar为草胺膦抗性基因；Kamr为卡那霉素抗性基因。
(1) 无缝克隆时，T5核酸外切酶沿__ __的方向水解DNA，其目的是形成__ __。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，__ __。
(2) 过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是__ _ _，过程③所需的酶有__ __。
(3) 与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有__ __ 。
A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基
C．操作时间短，成功率高 D．有利于多个小片段(小于50 bp)连接
(4) PCR扩增PABD基因时需依据__ __ 设计引物R1。据图分析，扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的__ __。
1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′
2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′
3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′
4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′
(5) 利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有__ __的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为__ __，说明T1为单位点插入的转基因株系。
(6) 通过观测转基因拟南芥根尖细胞中__ __，了解PA的动态变化。
8．(2025·泰州中学)虾青素可由β－胡萝卜素在β－胡萝卜素酮化酶(Bkt)和β－胡萝卜素羟化酶(CrtR－B)的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β－胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”(如图1)构建含bkt基因和crtR－B基因的表达载体(如图2、3所示)，导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，请回答下列问题：
图1
图2
图3
(1) 获取目的基因：红球藻是天然虾青素的重要来源，提取红球藻的总DNA为__ __，设计特异性引物扩增bkt基因和crtR－B基因，此过程需要__ __(至少写两种)。
(2) 构建转化载体：
①PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序列。若将来需要将抗除草剂基因从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增抗除草剂基因时，设计的引物序列(5′→3′)为__ __。
A．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列
B．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列
C．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列
②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将bkt基因和crtR－B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增crtR－B基因所用的引物为__ __。
③最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是__ __ 。
(3) 准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行第一次培养，一段时间后，挑取生长良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。期间可取藻液滴入血细胞计数板，在显微镜下进行计数，第二次培养的目的是__ __。
(4) 目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含__ __的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用__ __技术检测是否成功转录出β－胡萝卜素酮化酶和β－胡萝卜素羟化酶的mRNA。
(5) 叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高__ __；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免__ __。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)突破1 定 点 突 变
技术一 PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
鉴典例
重叠延伸PCR可实现定点基因诱变，其操作过程如下图所示(凸起处代表突变位点)。下列说法正确的是( D )
A．过程①需要把两对引物同时加入一个扩增体系以提高扩增效率
B．过程①需要3轮PCR才能得到图中所示PCR产物
C．过程②的产物都可以完成延伸过程
D．若过程④得到16个突变基因，则需要消耗15个通用引物RP2
解析：两种突变引物能互补配对，因此过程①必须分两个反应系统进行，A错误；过程①至少需要2轮PCR才能得到图中所示PCR产物，B错误；过程②获得的杂交DNA有2种，一种3′端为单链，一种5′端为单链，只有5′端为单链的杂交DNA可以完成延伸过程，因为子链只能从3′端开始延伸，C错误；若过程④得到16个突变基因，由于模板中不含有通用引物，则产生16个突变基因共需要消耗16×2－2＝30个通用引物，而需要通用引物RP2的数量为30÷2＝15个，D正确。
技术二 PCR定点突变——大引物PCR技术
深解构
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如下图：
鉴典例
瑞典科学家斯万特帕博凭借对已灭绝古人类基因组和人类进化的发现荣获2022年诺贝尔生理学或医学奖。他在研究过程中使用了大引物PCR构建定点突变，其过程如下图。下列叙述正确的是( B )
A．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和耐高温的DNA聚合酶
B．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
C．第二轮PCR所用的引物为第一轮PCR所产生的DNA的两条链
D．要完成两处位点的突变，至少需要4种引物
解析：进行PCR扩增需要的酶是耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶，A错误；蛋白质工程是指通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，B正确；第二轮PCR所用的一个引物是第一轮的产物DNA的一条链(即大引物)，另一个引物为常规上游引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；由图可知，完成一处突变需要两种通用引物(常规上、下游引物)和两种诱变引物(上游突变引物和下游大引物)，如果要完成两种突变，则需要两种通用引物和四种诱变引物，至少要6种引物，D错误。
突破2 同源重组(基因融合)
深解构
基因融合技术可以将不同的基因编码区首尾相连，或利用某些连接肽序列将功能基因相互连接，得到的融合基因受同一套调控序列控制，表达出融合蛋白。
鉴典例
(2022·江苏卷)纤毛是广泛存在的细胞表面结构，功能异常可引发多种疾病。因此，研究纤毛形成的作用机制具有重要意义。请回答下列问题：
图1
(1)纤毛结构如图1所示，由细胞膜延伸形成的纤毛膜主要由__脂质和蛋白质__组成。基体由中心体转变而来，中心体在有丝分裂中的功能是__发出星射线，形成纺锤体(与纺锤体的形成有关)__。
(2)某病人肾小管上皮细胞纤毛异常，为了分析纤毛相关基因X是否发生了变异，对基因X进行了PCR扩增与产物测序。从细胞样品中分离DNA时，可通过交替调节盐浓度，将与核蛋白结合的DNA分离出来，溶液中添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是__溶解DNA__。PCR扩增时，需在__耐热/耐高温的DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)__催化下，在引物的__3′__端进行DNA链的延伸，获得扩增产物用于测序。
(3)为研究蛋白质X在细胞中的定位，构建绿色荧光蛋白GFP与X的融合蛋白，融合蛋白具有绿色荧光，可指示其在细胞内位置。将X－GFP基因融合片段M导入如图2所示载体质粒Y，构建 Y－M 重组质粒(在EcoR Ⅴ位点插入片段)。请完成表3。
表1
限制酶 识别序列
BamHⅠ G↓GATCC
EcoRⅤ GAT↓ATC
Hind Ⅲ A↓AGCTT
BglⅡ A↓GATCT
图2
表2
序列编号 Y－M连接处测序后部分序列
Q1 5′－AGATCTCCGATATT－3′
Q2 5′－AGATCTCCAAGCTT－3′
Q3 5′－AAGCTTCCGGATCC－3′
Q4 5′－AAGCTTCCGATATC－3′
表3
分步实验目标 简易操作、结果、分析
PCR鉴定正向重组质粒Y－M ①选择图2引物__a、b__； ②PCR目的产物约为__1_100__ bp
确保M及连接处序列正确 ③质粒测序，表2中正确的是__Q4__(选填序列编号)
检测融合蛋白定位 ④对照质粒Y－GFP(仅表达GFP)与实验质粒Y－M分别导入细胞，发现对照组整个细胞均有绿色荧光而实验组荧光集中在纤毛基部，说明__蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部__
(4)为研究另一纤毛病相关基因Z表达的变化，采用荧光定量PCR法检测健康人与病人基因Z的转录水平。采集样本、提取总RNA，经__逆转录__形成cDNA作为模板，PCR扩增结果显示，在总cDNA模板量相等的条件下，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20(Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数)。从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的__32__倍。
解析：(1)纤毛膜由细胞膜延伸而来，故两者成分是一样的，主要是脂质和蛋白质。中心体与有丝分裂过程中纺锤体的形成有关，动物细胞有丝分裂前期，中心体发出星射线，形成纺锤体。(2)DNA在0.14 mol·L－1的NaCl溶液中溶解度最低，而可溶于2.0 mol·L－1的NaCl溶液，故添加NaCl至2.0 mol·L－1的目的是溶解DNA。PCR扩增时，需在耐高温的DNA聚合酶(即Taq DNA聚合酶)的催化下，在引物的3′端进行DNA链的延伸(DNA链的合成方向是从5′端到3′端)。(3)由图中限制酶切割位点和引物箭头方向可知，PCR应选择图2中的引物a和引物b，则PCR目的产物长度约为300＋800＝1 100 bp。在EcoR Ⅴ位点插入片段构建Y－M重组质粒，则Y－M的连接处应含有EcoR Ⅴ的识别序列，根据表1中各限制酶识别序列，表中序列Q4符合。实验组荧光集中在纤毛基部，说明蛋白质X在细胞中定位于纤毛基部。(4)RNA经逆转录形成cDNA。Ct值是产物荧光强度达到设定阈值时的PCR循环数，健康人Ct值为15，而病人Ct值为20，说明病人基因Z表达较弱，假设正常人基因Z的cDNA为x，患者基因Z的cDNA为y，则有x·215＝y·220，得x/y＝25，故从理论上估算，在PCR扩增20个循环的产物中，健康人样品的目的产物大约是病人的25＝32倍。
突破3 基因编辑(CRISPR/Cas9技术)
深解构
1．定义：CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如下图)。CRISPR复合体中sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
2．作用：从功能上来看，CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制酶，该系统广泛存在于细菌中，作用是切割外源DNA，使之失效，起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵，保护自身或清除入侵的病毒DNA)。
3．优点：若用CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
4．弊端：CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而造成“脱靶”，sgRNA的识别序列越短，则特异性越差，容易与其他片段结合造成编辑出错，基因编辑的脱靶率越高。
鉴典例
(2025·如东2.5模)基因驱动是指特定基因有偏向性地遗传给下一代的自然现象。CRISPR/Cas9基因编辑系统包含Cas9基因和sgRNA编码序列(gRNAs)，科学家借助该系统研发出人工基因驱动系统，并在拟南芥和蚊子等生物中实现了外部引入的基因多代遗传。在作物快速育种、根除疟疾等方面具有广阔的前景。请回答下列问题：
(1)为研发拟南芥蓝光受体CRY1基因驱动系统，科学家首先构建了基因驱动元件，将基因驱动元件精确插入一条染色体上的CRY1基因中，过程如图1所示。
图1
图2
①将基因驱动元件导入拟南芥细胞，在细胞中表达Cas9/sgRNA复合物，该复合物通过__sgRNA__识别和结合DNA特定序列，并引导Cas9酶切断DNA双链的__磷酸二酯键__，从而将基因驱动元件插入CRY1基因中，该过程属于定点__基因突变__(填“基因突变”或“染色体变异”)。
②为确定基因驱动元件是否插入CRY1基因，选择引物__P1和P4__进行PCR—电泳，结果如图2。条带1的大小约为7 800 bp，条带2的大小约为3 200 bp。基因驱动元件成功插入的是条带__1__，基因驱动元件的大小约为__4_600_bp__。
(2)当携带基因驱动元件的动物与野生型动物交配时，它们的后代从父母中各获得一份DNA副本：自然版本和基因驱动版本。受精后，来自不同亲本的染色体排列在一起时，基因驱动DNA中的CRISPR被激活。它能识别对侧染色体上自然基因的拷贝，并在胚胎发育开始前引导Cas9酶切除自然拷贝。一旦自然基因受损，细胞的特殊修复机制就会启动，修复丢失的DNA，但它使用未断裂的染色体(携带基因驱动的染色体)作为模板。所以当修复完成后，两条染色体都携带一份基因驱动的拷贝。此过程被称为同源定向修复。
①用CRY1基因纯合突变体作为母本与野生型父本杂交，F1中有多达8%的植株为纯合突变体。纯合突变体产生的原因是F1中来自母本的基因驱动序列通过同源定向修复，使来自父本的__同源染色体__(部位)上也插入CRY1基因驱动元件。
②用基因驱动技术改造传播疟疾的按蚊X染色体上的A基因获得a基因，已知含a基因的精子不能成活。用改造后的纯合雌蚊突变体与野生型雄蚊交配获得子一代，子一代相互交配，子二代中的性别组成为__(全)雄__，且子二代中含有a基因的比例__大于__(填“大于”“等于”或“小于”)1/2。若将基因驱动雌蚊释放到疟疾疫区，可通过__破坏按蚊种群的性别比例，降低出生率__来降低按蚊的种群密度。
解析：(1)①CRISPR/Cas9基因编辑系统中，sgRNA起向导作用，引导Cas9切割DNA。插入基因内部引起基因突变。②子链从引物3′端进行延伸，为确定基因驱动元件是否插入CRY1基因，选择引物P1和P4进行PCR—电泳，其中M加样孔加入的是已知大小的不同长度的DNA混合物，即标准样液。基因驱动元件成功插入CRY1基因，使得PCR扩增出的条带变长，碱基对数量增多，对应条带1，则条带2是未插入基因驱动元件的CRY1基因，所以基因驱动元件的大小约为7 800－3 200＝4 600 bp。(2) ①F1应为杂合子，但有多达8%的植株为纯合突变体，根据题中“同源定向修复”概念可知，应是野生型父本的同源染色体上插入CRY1基因驱动原件。②雌蚊突变体基因型为XaXa，野生型雄蚊基因型为XAY，杂交后代F1中雌性基因型为XAXa，雄性基因型为XaY。子一代相互交配，由于含a基因的精子不能成活，雄性只产生Y一种精子，因此子二代的性别是全雄。由于F1中有多达8%的植株为纯合突变体，即F1中有8%的XAXa变成了XaXa，因此，子二代中含有a基因的比例大于1/2。若将基因驱动雌蚊释放到疟疾疫区，因为破坏了按蚊种群的性别比例，导致出生率下降，种群密度下降，所以疟疾发病率将会下降。
突破4 无 缝 克 隆
深解构
无缝克隆是一种显著区别于传统酶切连接方法的新技术，该技术是依赖于同源序列的基因克隆技术。通过重组酶的作用，能够将任意含有载体末端重叠区域的DNA片段重组至线性化载体上，不受酶切位点限制，载体自连极低。
鉴典例
In－Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。该技术关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列，通常为15～20 bp)，然后用In－Fusion酶(能识别双链线性化DNA片段5′→3′末端任意16个碱基，使其降解)处理即可实现无缝连接。其操作步骤如下图。请回答下列问题：
(1)为获得线性化质粒，除了图示利用PCR方法外，还可利用__限制酶处理__的方法实现。
(2)热启动PCR可提高扩增效率，方法之一：先将除__Taq_DNA聚合酶__以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。与常规PCR相比，这样做的目的是可减少反应起始时__引物错配__形成的产物。
(3)图中，同源序列1、2中的碱基序列__不同__(填“相同”或“不同”)。这样设计的目的是__防止目的基因反向连接__，还能防止线性化质粒或目的基因自身环化。
(4)据图分析，引物A或引物B要依据__目的基因与质粒__的序列进行设计。过程②经过__3__轮循环就可能首次得到符合要求的目的基因片段。
(5)含同源序列的线性化质粒与目的基因混合后，In－Fusion酶的作用可能是处理线性化质粒与目的基因的同源序列，形成__黏性末端__，然后降温使其发生__碱基互补配对__，进而在DNA聚合酶及__DNA连接__酶的作用下完成质粒的环化，形成重组质粒。
(6)与传统构建重组质粒的方法相比，In－Fusion技术的优势是__不受限制酶酶切位点的限制；可以把目的基因插入任何位点；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等__(答出一条即可)。
解析：(2)常规PCR最初加热过程中，样品温度上升到70 ℃之前，在较低温度下引物可能与部分单链模板非特异性结合，并在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，导致引物错配形成的产物扩增。热启动PCR先将除Taq DNA聚合酶以外的各成分混合后，加热到80 ℃以上再混入酶，然后直接从94 ℃开始PCR扩增。这样做可减少反应起始时引物错配形成的产物。(4)据图分析，目的基因经引物A和引物B扩增后需要与线性化质粒连接，故为保证扩增出所需的目的基因，引物A和引物B要依据目的基因和质粒序列进行设计。PCR时至少经过3轮循环才可能首次得到符合要求的目的基因片段。
突破1 定点突变
1．(多选)大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR反应即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，过程如图所示。下列有关叙述正确的是( AD )
A．两轮PCR过程中退火时的温度不一样
B．单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因重组
C．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
D．利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程
解析：为了使引物与模板链准确配对，引物设计时应考虑不同的退火温度，第二轮PCR的退火温度应该比第一轮高，A正确；单核苷酸的定点诱变所属变异类型为基因突变，B错误；第一轮产物的一条链作第二轮PCR扩增的大引物，还需加入另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；蛋白质工程是指通过基因改造或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，利用该技术将某功能蛋白的结构改变属于蛋白质工程，D正确。
2．(2025·盐城中学节选)牛的瘤胃中生活着多种微生物，其中一些微生物能分解尿素。这些微生物细胞中G蛋白参与激活脲酶，且G蛋白激活脲酶依赖于其与E蛋白结合。为探究G蛋白与E蛋白的结合位点，拟采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，相关过程见图1。请回答下列问题：
注：引物中表示碱基突变位点。可能用到的密码子：起始密码子(AUG)、组氨酸(CAU)、丙氨酸(GCU)。
图1
图2
(1) 为获得点突变G蛋白基因，PCR1需要的引物是__引物1和引物4__(从图1引物中选择)，PCR4需要的引物是__引物1和引物6__(从图1引物中选择)，PCR3反应体系需加入__ABCF__(从下列选项中选择)。
A．含Mg2+缓冲液 B．四种脱氧核苷酸 C．TaqDNA聚合酶 D．引物2和5 E．引物1和6 F．产物1和2
(2) 据图1可知，G蛋白转录的模板链是__b链__(填“a链”或“b链”)，引物4中该突变位点碱基为__GC__(按5′到3′方向)。
(3) 改造后的G蛋白基因约有1 600个碱基。PCR扩增结果如图2所示，则加样孔位于__甲__(填“甲”或“乙”)端。由图2可知泳道1条带中的PCR产物长度为1 600个碱基左右，由此推测PCR产物__不一定__(填“一定”“不一定”或“不”)是改造的G蛋白基因，理由是__PCR产物电泳结果只能说明DNA分子大小，不能说明产物的碱基对序列与G蛋白基因一致__。
解析：(1) 由图1可知，引物3和引物4处含有突变位点，且引物会与模板链的3′端结合，子链延伸方向是5′→3′，所以为获得点突变G蛋白基因，PCR1需要的引物是引物1和引物4，PCR4需要与G蛋白基因两端互补的引物，即引物1和引物6，PCR3扩增时，反应体系中应加入含Mg2+缓冲液、原料(四种脱氧核苷酸)、模板(PCR1的产物1的一条链和PCR2的产物2的一条链)、TaqDNA聚合酶等。(2) 转录时，mRNA延伸的方向是5′→3′，图1中a链的3′端起始碱基是AGT，对应mRNA链中的是GCA，不是起始密码子，而b链的3′端起始碱基是TAC，对应mRNA链中的是AUG，是起始密码子，所以图1中，G蛋白转录的模板链是b链。采用PCR定点突变的方法，获得第72位组氨酸被替换为丙氨酸的G蛋白，而组氨酸的密码子为CAU，丙氨酸的密码子为GCU，按照碱基互补配对原则，对应b链3′→5′为CG，引物4中该突变位点碱基5′→3′为GC。(4) 分子质量越小的DNA，在电泳时跑得越快，与加样端的距离越远，则加样孔位于甲端。由于改造的G蛋白基因是通过G蛋白碱基替换得到的，基因的碱基个数没有发生改变，泳道1条带中的PCR产物长度为1 600个碱基左右，但PCR不能测得碱基序列，由此推测PCR产物不一定是改造的G蛋白基因。
突破2 同源重组(基因融合)
3．(2025·扬州中学)Cre－loxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把三种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法不正确的是( B )
图1
图2
A．Cre酶切下一个待敲除基因的过程，需要破坏四个磷酸二酯键
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈红色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能呈红色或黄色或蓝色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能随机出现两种颜色叠加
解析：DNA单链上相邻的两个脱氧核苷酸之间通过磷酸二酯键相连，DNA由两条单链螺旋缠绕形成，敲除基因时需要切断基因前后两端，因此需要破坏4个磷酸二酯键，A正确。据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝色荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，故肌肉细胞不会表达颜色基因，B错误。由题意可知，图2两个loxP1之间或两个1oxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，且仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因，小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，若敲除两个loxP2之间的黄色(或红色)荧光蛋白基因，则与启动子相邻的红色(或黄色)荧光蛋白基因表达，脑组织细胞呈红色(或黄色)；若敲除两个1oxP1之间的红色荧光蛋白基因，则与启动子相邻的黄色荧光蛋白基因表达，脑组织细胞呈黄色；若敲除两个1oxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，则与启动子相邻的蓝色荧光蛋白基因表达，脑组织细胞呈蓝色，所以不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，C正确。小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，因而脑组织细胞的颜色可由细胞内两种荧光蛋白的颜色叠加而成，D正确。
4．(2025·海安中学)同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对基因进行敲除与回补，以研究基因的功能。下图是科研人员利用该方法对大肠杆菌LacZ基因进行敲除与回补的相关过程，其中tetr是四环素抗性基因，sacB基因(2071 bp)是蔗糖致死基因，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物。请回答下列问题：
(1) 过程①PCR除需要加入Taq酶、dNTP、缓冲液、Mg2+外，还需加入__引物(或P1、P2)和模板(或质粒1)__，所加dNTP的作用有__既作为原料又提供能量__。
(2) 为保证sacB基因和质粒2定向连接，设计引物P1、P2时，需在引物__5′__端添加限制酶__BamHⅠ、EcoRⅠ__(填种类)的识别序列；过程②需要限制酶和__DNA连接__酶。
(3) 过程③中，需先用Ca2+处理大肠杆菌，使其成为__感受态__细胞。筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加__四环素__。
(4) 下图是对质粒3转化菌落进行PCR验证时的产物电泳结果，泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功，判断的理由是__4、5、7的电泳结果接近(或大于)2_071_bp__，过程⑤PCR中设计引物P3、P4时，需在引物5′端分别添加__LacZ__基因两端的同源序列。
(5) 过程⑦中，在含有四环素和__X－gal__的培养基中出现了白色菌落，即为筛选出的敲除LacZ基因菌株。过程⑧通过同源重组技术结合tetr－sacB双重选择系统可对LacZ基因进行回补，筛选LacZ基因回补菌株时应在培养基中添加__蔗糖和X－gal__。
解析：(1)PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解开。故在PCR反应体系中，需加入引物(P1、P2)、模板、Taq酶、4种脱氧核苷酸(dNTP)、缓冲液、Mg2+等，DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，dNTP既能为反应提供原料，还能提供能量。(2) HindⅢ会破坏tetr基因，XmaⅠ会破坏复制原点，为保证sacB基因和质粒2定向连接，应用限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ切割目的基因和质粒，引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，因此设计引物P1、P2时，需在引物5′端添加限制酶BamHⅠ、EcoRⅠ的识别序列，过程②为基因表达载体的构建，需要限制酶和DNA连接酶。(3)过程③为将目的基因导入受体细胞，导入目的基因时，首先用Ca2+处理大肠杆菌使其成为感受态细胞。重组质粒的标记基因为tetr(四环素抗性基因)，筛选导入质粒3的大肠杆菌时需在培养基中添加四环素。(4)sacB基因是目的基因，sacB基因大小为2 071 bp，4、5、7的电泳结果接近(或大于)2 071 bp，说明4、5、7对应的菌株中含有目的基因，说明泳道4、5、7对应的菌株可能转化成功。引物是根据目的基因两端的DNA序列设计的，目的基因(tetr－sacB)需要与LacZ基因连接，因此需在引物5′端分别添加LacZ基因两端的同源序列。(5)LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物，过程⑦为筛选LacZ基因敲除菌株，因此，若LacZ基因被敲除，则在含有四环素和X－gal的培养基中出现白色菌落。sacB基因是蔗糖致死基因，则添加蔗糖起到选择作用，LacZ基因表达产物能将无色化合物X－gal水解成蓝色化合物，则添加X－gal起到筛选作用，所以在培养基中添加蔗糖和X－gal可筛选LacZ基因回补菌株。
突破3 基因编辑(CRISPR/Cas9技术)
5．下图是采用CRISPR技术对某生物基因进行编辑的过程，该过程中用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的位点进行切割。下列叙述正确的是( A )
A．根据破坏b基因后生物体的功能变化，可推测b基因的功能
B．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的sgRNA
C．图中sgRNA1的碱基序列和sgRNA2碱基序列相同或互补
D．可利用此技术编辑生殖细胞相关基因以期生育出免疫艾滋病的婴儿
解析：由图可知，sgRNA引导Cas9与靶基因特定位点结合时，只需要与靶基因的部分序列配对；图中sgRNA1与sgRNA2分别与靶基因的不同位点配对，二者的碱基序列没有关联；基因编辑技术还不完全成熟，存在脱靶现象等问题，目前不适合通过基因编辑技术生育免疫艾滋病婴儿。
6．(2025·盐城考前模拟)科研人员开发了一种可将C—G碱基对转变为T—A碱基对的单碱基编辑工具(简称CBE系统)。该系统由三个元件构成，其中“dCas9蛋白＋胞苷脱氨酶”在sgRNA的引导下，对结合区域第4～8位点的碱基C脱氨反应变成U，最终实现C→T的不可逆编辑，不需要DNA链断裂，如图1所示。请回答下列问题：
图1 CBE系统的编辑过程
(1) 图中CBE系统与靶DNA结合区域可能存在的碱基互补配对方式有__A—T、A—U、C—G__。
(2) CBE系统与靶DNA的识别和结合过程发生了__氢__键的断裂和形成，过程①__未发生__(填“发生”或“未发生”)磷酸二酯键的断裂和形成，经脱氨作用形成的一个如图1所示的DNA分子，经过n轮(n>2)复制，可形成__2n－1－1__个碱基编辑的DNA。该系统中单碱基编辑__属于__(填“属于”或“不属于”)基因突变。
(3) 根据所学知识分析，CBE系统不可以__C__。
A．提供更多生物进化的原材料 B．改变基因库
C．改变生物进化的方向 D．改变基因频率
(4) 某研究发现，在二倍体野生草莓和八倍体栽培草莓中，花青素合成过程的关键转录因子之一MYB10基因自然变异导致草莓果实成白色，严重影响营养价值。科学家利用单碱基编辑系统对二倍体野生草莓果实中MYB10基因定点突变，为培育优良草莓品种提供了有价值的候选基因。已知二倍体野生草莓中MYB10基因编码链第469～488位碱基序列为5′－ACAGGACATGGGACGGATAA－3′，为实现该区域编码多肽链中的组氨酸定点突变为酪氨酸，应设计的sgRNA序列是__D__。(组氨酸：CAU、CAC，酪氨酸：UAU、UAC)
A．3′－UGUCCUGUACCCUGCCUAUU－5′
B．5′－UGUCCUGUACCCUGCCUAUU－3′
C．3′－ACAGGACAUGGGACGGAUAA－5′
D．5′－ACAGGACAUGGGACGGAUAA－3′
(5) 下表为相关限制酶及其识别序列及切割位点。利用图2质粒和目的基因构建CBE系统，为高效连接和筛选，结合pHSE401质粒上限制酶识别位点，推测目的基因上游和下游含有的限制酶识别位点组合可以为__②⑤⑥__(填序号)。
表 限制酶及其识别序列和切割位点
限制酶 识别序列和切割位点
XbaⅠ T↓TCGAG
SmaⅠ CCC↓GGG
EcoRⅠ G↓AATTC
SacⅠ C↓TCGAG
HindⅠ A↓AGCTT
图2 质粒(左)和目的基因(右)
①XbaⅠ和SacⅠ ②XbaⅠ和HindⅢ ③EcoRⅠ和SacⅠ
④SmaⅠ和SacⅠ ⑤HindⅢ和EcoRⅠ ⑥XbaⅠ和EcoRⅠ
(6) 上述单碱基编辑技术的优点有__不涉及双链DNA的切割，有更高的安全性；可以精确地靶向基因组DNA的特定位置，具有高度的特异性；可实现胞内编辑__。
解析：(1) CBE系统中的sgRNA与靶DNA的一条链配对，所以可能存在的碱基互补配对有A—T、A—U、C—G。(2) CBE系统与靶DNA的识别和结合过程中，基因组DNA双链先解开，其中的一条链与sgRNA结合，发生了氢键的断裂和形成。据图可知，过程①碱基C在脱氨作用下发生了碱基种类的改变：C→U，并未发生磷酸二酯键的断裂和形成。经脱氨作用形成的一个G//U经一次复制得到A//U，经过第2次复制后形成A//T(碱基编辑的DNA)和A//U。如图所示的DNA分子经过n轮复制，即A//U经过(n－1)次复制，共形成2n－1个DNA，其中一个DNA含有的是A//U，所以含有A//T(碱基编辑的DNA)的为(2n－1－1)个。该系统中单碱基编辑发生了碱基种类的改变，属于基因突变。(3) 生物进化的方向是由自然选择决定的，而非变异决定，C错误。(4) sgRNA与转录的模板链配对，而模板链碱基序列未发生改变，所以设计的sgRNA序列与原来的编码链相同(将T改为U)，所以设计的sgRNA序列是5′－ACAGGACAUGGGACGGAUAA－3′，D正确。(5) XbaⅠ和SacⅠ会造成目的基因与质粒的不定向连接；EcoRⅠ和SacⅠ造成目的基因反向插入质粒；SmaⅠ和SacⅠ会破坏复制原点，只有用②⑤⑥既能保证正向插入，又能破坏四环素抗性基因，便于筛选。(6) 根据图示CBE系统的原理图，单碱基编辑技术不涉及双链DNA的切割，有更高的安全性；可以精确地靶向基因组DNA的特定位置，具有高度的特异性；可实现胞内编辑等。
突破4 无缝克隆
7．(2025·启东调研)磷脂酸(PA)是调节植物生长发育和逆境响应的重要信使物质。为了解植物细胞中PA的动态变化，研究人员用无缝克隆技术将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量。无缝克隆技术连接DNA片段的机理和构建荧光探针表达载体的过程如图所示，请回答下列问题：
注：bar为草胺膦抗性基因；Kamr为卡那霉素抗性基因。
(1) 无缝克隆时，T5核酸外切酶沿__5′→3′__的方向水解DNA，其目的是形成__黏性末端__。T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，__防止过度水解DNA__。
(2) 过程②两个片段退火后存在“缺口”的原因是__过程①形成的黏性末端长度不同__，过程③所需的酶有__DNA聚合酶和DNA连接酶__。
(3) 与传统的酶切再连法相比，无缝克隆技术构建重组质粒的优点有__ABC__。
A．不受限制酶切位点的限制 B．不会引入多余碱基
C．操作时间短，成功率高 D．有利于多个小片段(小于50 bp)连接
(4) PCR扩增PABD基因时需依据__PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列__设计引物R1。据图分析，扩增目的片段的引物F1和R2对应于下表中的__1、4__。
1 5′－TCCGGACTCAGATCTCGAGC－3′
2 5′－AGCTATAGTTCTAGATCTAGATTAACTAGTCTTAGTGGCGTC－3′
3 5′－TATCGATGGCGCCAGCTGAGGATGGTGAGCAAGGGCGA－3′
4 5′－GCTCGAGATCTGAGTCCGGACTTGTACAGCTCGTCCA－3′
(5) 利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有__草胺膦__的MS培养基上进行筛选和鉴定。T1代自交获得的T2代幼苗的抗性表现和比例为__抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1__，说明T1为单位点插入的转基因株系。
(6) 通过观测转基因拟南芥根尖细胞中__绿色荧光点的分布__，了解PA的动态变化。
解析：(1) 由图可知，无缝克隆时，过程①中T5核酸外切酶沿5′→3′的方向水解DNA，以形成黏性末端。温度能影响酶活性，T5核酸外切酶催化的最适温度为37 ℃，而过程①选择的温度为50 ℃，目的是降低酶活性，防止过度水解DNA。(2) 过程②在退火的过程中，两个片段的黏性末端可根据互补序列进行配对结合，但由于过程①形成的黏性末端长度不同，因此在过程②退火后存在“缺口”。过程③缺口处DNA链的补齐可以看作DNA分子的复制过程，所需的酶有DNA聚合酶(DNA聚合酶将脱氧核苷酸加到子链3′—OH末端)和DNA连接酶(将两个DNA片段进行连接)。(3) 传统的酶切再连法需要用特定的限制酶将目的基因和质粒先进行切割，再用DNA连接酶对目的基因和质粒进行连接，在该过程会形成多个小片段，操作复杂，而无缝克隆技术构建重组质粒不受限制酶切位点的限制；不会引入多余碱基；操作时间短，成功率高，但不利于多个小片段(小于50 bp)连接，A、B、C正确。(4) 用于PCR扩增的引物是根据一段已知目的基因(PABD基因)的核苷酸序列来设计的，由图可知，PABD基因(目的基因)需要用载体进行连接，因此PCR扩增PABD基因时需依据PABD基因一端的核苷酸序列和载体一端的核苷酸序列设计引物R1。由重组DNA图可知，GFP基因和PABD基因进行连接，PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，而设计引物F1仅需根据PABD基因一端的核苷酸序列，因此引物F1的碱基序列比引物R2的碱基序列短，因此扩增目的片段的引物F1对应于表中的1。PCR扩增GFP基因时需根据GFP基因一端的核苷酸序列和PABD基因一端的核苷酸序列设计引物R2，即引物R2的一部分能与引物F1进行碱基互补配对，综上所述，R2对应于表中的4。(5) 由图可知，bar(草胺膦抗性基因)为标记基因，位于T－DNA上，农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上，因此利用农杆菌花序侵染法转化拟南芥，将获得的种子(T1)进行表面消毒，均匀铺在含有草胺膦的MS培养基上进行筛选和鉴定。若T1为单位点插入的转基因株系，假设抗性基因用A表示，非抗性为a，则T1的基因型为Aa，T1代自交获得的T2代幼苗的基因型及比例为A_∶aa＝3∶1，因此抗草胺膦∶不抗草胺膦＝3∶1。(6) 由题意“将高度专一的PA结合蛋白(PABD)基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合，构建有效监测细胞PA变化的荧光探针，并测定拟南芥细胞内PA含量”可知，通过观测转基因拟南芥根尖细胞中绿色荧光点的分布，可了解PA的动态变化。
8．(2025·泰州中学)虾青素可由β－胡萝卜素在β－胡萝卜素酮化酶(Bkt)和β－胡萝卜素羟化酶(CrtR－B)的作用下转化而来，具有抗衰老、增强免疫等功能。杜氏盐藻是单细胞浮游植物，生长快，易培养，能大量合成β－胡萝卜素。科研人员利用“无缝克隆技术”(如图1)构建含bkt基因和crtR－B基因的表达载体(如图2、3所示)，导入杜氏盐藻，以实现虾青素的工厂化生产，请回答下列问题：
图1
图2
图3
(1) 获取目的基因：红球藻是天然虾青素的重要来源，提取红球藻的总DNA为__模板__，设计特异性引物扩增bkt基因和crtR－B基因，此过程需要__dNTP、耐高温的DNA聚合酶、缓冲液等__(至少写两种)。
(2) 构建转化载体：
①PCR获取抗除草剂基因过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在引物的一端添加对应的同源序列。若将来需要将抗除草剂基因从重组质粒中切除，还需要在基因两侧加入限制酶识别序列，则扩增抗除草剂基因时，设计的引物序列(5′→3′)为__C__。
A．抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列＋同源序列
B．同源序列＋抗除草剂基因部分序列＋限制酶识别序列
C．同源序列＋限制酶识别序列＋抗除草剂基因部分序列
②科研人员利用“无缝克隆技术”同时将bkt基因和crtR－B基因插入质粒，形成的重组质粒对应部位如图2所示，推测此过程扩增crtR－B基因所用的引物为__Ⅵ和Ⅷ__。
③最终形成的重组质粒如图3所示，其中atpA启动子和psbA启动子均为杜氏盐藻叶绿体启动子，选用内源性启动子的目的是__确保目的基因正常表达__。
(3) 准备受体细胞：选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行第一次培养，一段时间后，挑取生长良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养。期间可取藻液滴入血细胞计数板，在显微镜下进行计数，第二次培养的目的是__扩大培养杜氏盐藻__。
(4) 目的基因导入及相关检测：采用基因枪法将重组质粒导入杜氏盐藻叶绿体，一段时间后，先用含__除草剂__的培养基初筛已转化的杜氏盐藻，然后采用__PCR(分子杂交)__技术检测是否成功转录出β－胡萝卜素酮化酶和β－胡萝卜素羟化酶的mRNA。
(5) 叶绿体转化是植物基因工程的新热点，叶绿体的诸多特点为叶绿体转化提供优势，如叶绿体基因组小，功能清晰，使基因操作方便；叶绿体具有自我复制功能，一个植物细胞可含有多个叶绿体，每个叶绿体中含有多个基因组，可大大提高__目的基因的表达量__；另外，叶绿体基因位于细胞质中，可有效避免__基因污染__。
解析：(1) 因红球藻是天然虾青素的重要来源，是目的基因的来源，故可提取红球藻的总DNA为模板，设计特异性引物对其DNA中的bkt基因和crtR－B基因进行PCR扩增，此过程需要TaqDNA聚合酶的催化，同时还需要dNTP、缓冲液等。(2) ①根据PCR扩增的原理，在PCR过程中，为确保基因两端具有所需同源序列，需在5′端添加对应的同源序列；根据题意，若要确保抗除草剂基因能够从重组质粒中切除，则所需引物(5′→3′)的序列应为“同源序列＋限制酶识别序列＋特异性扩增引物序列(抗除草剂基因部分序列)”，C正确。②根据图2所示，要通过“无缝克隆法”同时将bkt基因和crtR－B基因插入质粒，则要保证bkt基因一侧有一致同源序列，另一侧有crtR－B基因部分序列，因此扩增bkt基因所用的引物为Ⅰ、Ⅲ；同理，扩增crtR－B基因所用的引物为Ⅵ和Ⅷ。③启动子是转录的起始信号，选用内源性启动子的目的是防止基因沉默，确保目的基因能表达。(3) 选取初始杜氏盐藻涂布到杜氏盐藻固体培养基进行培养的目的是纯化杜氏盐藻，挑取生长状态良好的单藻落到杜氏盐藻液体培养基中继续培养的目的是扩大培养杜氏盐藻。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)
