《直通名校》第一部分 专题八 大题突破（五）　生物工程类（课件）-高考生物大二轮专题复习

(共73张PPT)
大题突破（五）　生物工程类
典｜例｜示｜范
（2024·山东高考25题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆
的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在
载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入
大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并
发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲：载体信息
LB/RB：T-DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr：氨苄青霉
素抗性基因
图乙：目标基因L部分序列
图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越
短，引物特异性越 　　　　（填“高”或“低”）。限制酶在切开
DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用Bsa Ⅰ酶切大豆
基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 　　　种。载体信息
如图甲所示，经Bsa Ⅰ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-
　　　　-3'和5'- 　　　　-3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 　　　　筛选到具
有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上
述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息
及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如
图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 　　　　　，其中纯合的突
变植株是 　　　　（填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗
性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛
选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株
所占比例为 　　　　，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【解题思路】
1. 信息获取与处理——明确向导DNA序列和目标序列的作用
2. 问题分析与解答[第（1）小题]
若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因
组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaⅠ切割产生的黏性末端是
NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序。根据图甲所示的载体信
息，在载体的碱基序列上有两个酶切位点，经BsaⅠ酶切后，载体上保留
的黏性末端序列应为5'-GTTT-3'和5'-CAAT-3'（注意是载体上保留的黏性
末端序列，也就是靠近LB和RB边界的保留，中间切下来的那段换成大
豆基因L的向导DNA序列），酶切情况如图所示：
3. 逻辑推理[第（2）小题]
4. 演绎推理[第（3）小题]
根据图示可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来
筛选该植株进行自交，根据分离定律，其配子中含有抗生素抗性基因的
比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变
位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，因此，
突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选
出的敏感植株可用于后续的品种选育。
答案：（1）低　256　GTTT　CAAT　（2）卡那霉素　SacⅠ　④　
（3）1/4
同｜向｜题｜组
1. （2024·湖北武汉模拟）为研究Atu5117启动子能否独立启动下游基因的表达，研究人员利用重叠延伸PCR技术，获得“Atu5117启动子和绿色荧光蛋白基因（GFP）”的“嵌合序列”，再构建基因表达载体（仅
使用1种限制酶），以获得含有“嵌合序列”的重组DNA分子。相关过程、基础质粒及限制酶的酶切位点如图1所示。回答下列问题：
（1）重叠延伸PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋，以激活
，PCR中预变性时间比循环
过程中变性时间长，其原因是
。
解析： 重叠延伸PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋，以
激活耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶），PCR中预变性时
间比循环过程中变性时间长，其原因是预变性时间较长可增大模
板DNA彻底变性的概率，使模板DNA充分解旋。
耐高温
的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）
预变性时间较长可增大模板DNA
彻底变性的概率，使模板DNA充分解旋
（2）由阶段2“变性后杂交”的原理可知，引物2和引物3在碱基序列上
的要求是 。
解析： PCR扩增时需要引物，由阶段2“变性后杂交”的原
理可知，引物2和引物3在碱基序列上的要求是引物2和引物3必须
具有碱基互补配对的片段。
（3）阶段3构建基因表达载体需要的酶有
，它们作用的化学键是 。
解析： 阶段3构建基因表达载体需要的酶有限制性内切核酸
酶（限制酶）和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键。
引物2和引物3必须具有碱基互补配对的片段
限制性内切核酸酶（限制
酶）和DNA连接酶
磷酸二酯键
（4）本实验中，在阶段3需破坏基础质粒上T7启动子的结构，从而使得
GFP的表达仅受Atu5117启动子的调控，因此，在设计阶段1和2的
引物时，需确保 （填引物名称）上含
有 （填限制酶的名称）的识别序列。
解析： 由图可知，T7启动子上含有BamHⅠ的酶切位点，因
此在阶段3需破坏基础质粒上T7启动子的结构，构建基因表达载体
仅使用1种限制酶，在设计阶段1和2的引物时，需确保引物1和引
物4上含有BamHⅠ的识别序列。
引物1和引物4
BamHⅠ
（5）提取受体细胞的相应DNA，利用与阶段3相同的限制酶酶切，进行
DNA电泳检测，结果如图2。已知Atu5117启动子、GFP基因、基
础质粒的序列大小分别约为490 bp、750 bp、2 750 bp（bp代表碱
基对），据图判断受体细胞 中成功导入了重组DNA分子。
B
解析： 利用与阶段3相同的限制酶酶切，如果受体细胞中成
功导入了重组DNA分子，酶切后会得到两个DNA片段，已知
Atu5117启动子、GFP基因、基础质粒的序列大小分别约为490
bp、750 bp、2 750 bp，所以酶切后得到两个DNA片段的大小分别
是1 240 bp和2 750 bp，符合细胞B的电泳图。
2. （2024·广东湛江三模）酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程
中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分
离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）
而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了
相关研究。回答下列问题。
（1）乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市
售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培
养基，利用 法对该培养基进行灭
菌，并采用 法将酸菜液接种
到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。
解析： 常用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）对培养基进行灭菌。
分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，即
可采用稀释涂布平板法和平板划线法将酸菜液接种到培养基中，
选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。
高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）
平板划线（稀释涂布平板）
（2）通过上述方法筛选得到6种乳酸菌，测得它们对霉菌的抑菌率如下
表，应选择乳酸菌编号为 的菌株进行后续操作。
乳酸菌编号 L1 L2 L3 L4 L5 L6
抑菌率/％ 28.57 19.48 58.44 14.28 6.49 36.36
解析： 表格中，乳酸菌编号为L3的菌株对霉菌的抑菌率最
高，因此应选择乳酸菌编号为L3的菌株进行后续操作。
L3
（3）研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再
对受体菌做进一步的检测与鉴定。下面是细菌素基因及构建的基
因表达载体的示意图。
①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是
。引物的作用是
。
PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是 。
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，
应在与甲链结合的引物的5'端加入 （填“BamHⅠ”或
“NdeⅠ”）的识别序列。
引物2
和引物3
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始
连接脱氧核苷酸
30
BamHⅠ
电泳结果表明 。
目的基因已成功导入受体细胞
③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩
增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图。设置4号的目的
是 （答出一点即可），
判断PCR反应体系是否受到污染
解析： ①PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链
的3'端通过碱基互补配对结合，因此利用PCR技术扩增细菌素基因
时，应选择的一对引物是引物2和引物3。引物作用是使DNA聚合
酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程中，经过4轮
循环，消耗引物的个数是2×24－2＝30。②若以细菌素基因甲链
为转录的模板链，图中细菌素基因转录方向为从右往左，即启动
子位于右端，终止子位于左端，与甲链结合的引物为引物2，即在
引物2的5'端加入BamHⅠ的识别序列。③4号为无菌水组，设置4号
的目的是判断PCR反应体系是否受到污染。3号为转化操作后受体菌的DNA，提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，3号中出现500 bp的DNA片段，已知细菌素基因为500 bp，
由此可知目的基因已成功导入受体细胞。
大题突破强化练
1. （2024·安徽三模）锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位
于细胞膜，具有吸收和转运环境中Zn2＋的功能。为研究该植物某种锌转
运蛋白与吸收Zn2＋相关的生物学功能，通过基因工程对锌吸收缺陷型酵
母进行转化。回答下列问题：
（1）扩增锌转运蛋白基因时，以该植物 为材料提取并纯
化mRNA，通过 合成cDNA。设计引物进行PCR扩增，
PCR完成以后产物通常采用 来鉴定。
解析： 锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于
细胞膜，所以以该植物的根为材料提取并纯化mRNA，逆转录合
成cDNA。PCR完成以后产物通常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
根部细胞
逆转录
琼脂糖凝胶电泳
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（2）为便于锌转运蛋白基因与质粒连接，需在PCR引物的 端加上
限制酶识别序列，且两种引物含不同的限制酶识别序列，主要目
的是为了防止构建基因表达载体时出现
（答出一点即可）。
为保证锌转运蛋白基因的表达，常利用酵母质粒作为载体，并借
助质粒上原有基因的 ，并将目的基因插入在
它们之间。
5'
目的基因自身环化；质
粒的自身环化；目的基因的反向连接
启动子与终止子
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解析： PCR过程中，由于DNA子链是从引物的3'端延伸，因
此在设计引物时，只能在两条引物的5'端加上限制酶酶切位点。两
种引物含不同的限制酶识别序列，主要目的是为了防止构建基因
表达载体时出现目的基因自身环化、质粒的自身环化或目的基因
的反向连接。要将锌转运蛋白基因插入到质粒的启动子和终止子
之间，才能保证锌转运蛋白基因的表达。
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（3）酵母菌转化，取冻存的锌吸收缺陷型酵母菌株，活化、培养后用
重组表达载体转化酵母菌。转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细
胞，使细胞处于感受态，目的是 ，
通过 检测目的基因在受体细胞中表达锌转
运蛋白水平的高低。
解析： 转化前一般用醋酸锂处理酵母菌细胞，使细胞处于感
受态，目的是改变细胞膜的通透性，使细胞易于吸收外源DNA。
可采用抗原—抗体杂交法检测目的基因在受体细胞中的表达。
使细胞易于吸收外源DNA
抗原—抗体杂交法
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（4）已知锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，通过设置一个固体培养基来鉴
定转化酵母是否赋予了锌吸收特性。配制含适量Zn2＋的（酵母
菌）固体培养基、灭菌，分成a、b两半区域，a区接种涂布少量的
缺陷型酵母，b区接种涂布少量的转化酵母，在适宜的条件下培养
一段时间后，如何判断有转化成功的酵母？
。
b区有些菌落明显大于a区的菌落
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解析： 配制含适量Zn2＋的（酵母菌）固体培养基、灭菌，分
成a、b两半区域，a区接种涂布少量的缺陷型酵母，b区接种涂布
少量的转化酵母，由于锌吸收缺陷型酵母增殖较慢，转化成功的
酵母赋予了锌吸收特性后增殖较快，在适宜的条件下培养一段时
间后，b区有些菌落明显大于a区的菌落。
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2. （2024·湖南模拟）“中中”和“华华”克隆猴的成功培育标志着我国
非人灵长类疾病动物模型研究处于国际领先水平。“中中”和“华华”
的克隆流程如图1所示，回答下列问题：
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（1）图1中的细胞a是 ，从卵巢中采集的细胞a
需在体外培养至 期才能用于体细胞
核移植等。
解析： 图1中的细胞a是母猴的卵母细胞，从卵巢中采集
的细胞a需在体外培养至MⅡ（减数分裂Ⅱ中）期才能用于体细
胞核移植等。
母猴的卵母细胞
MⅡ（减数分裂Ⅱ中）
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（2）图中取胎猴期而非成年期的体细胞的原因是
。
当贴壁细胞在体外培养过程中发生 现象时，需要对
细胞分瓶进行 培养。
解析： 体细胞分化的程度高，恢复其全能性较难，因此动物
体细胞核移植技术难度明显高于胚胎细胞核移植，所以取胎猴期
而非成年期的体细胞。当贴壁细胞在体外培养过程中发生接触抑
制现象时，需要对细胞分瓶进行传代培养。
动物胚胎细胞比体
细胞的分化程度低，表达全能性相对容易
接触抑制
传代
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（3）科研人员发现：对灵长类动物供体细胞核进行表观遗传修饰，激
活重构胚分化潜能调控基因A的表达，是克隆成功的关键。研究
表明染色体组蛋白H2动态可逆地被修饰酶所改变，从而调控基因
A的表达，如图2所示。为了激活基因A的表达，研究人员将组蛋
白H3去甲基化酶Kdm4d的mRNA注入重构胚，同时用组蛋白脱乙
酰酶抑制剂TSA处理重构胚。
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据图2分析，给重构胚注入Kdm4d的mRNA来促进基因A表达的机
理是
，进而促进基因A的表达；TSA可以抑制
的活性， （填“提高”或“降低”）组蛋白的乙
酰化水平，进而促进基因A的表达。
Kdm4d可以表达组蛋白去甲基化酶，降低H3组蛋白的甲
基化水平
组蛋白脱乙
酰酶
提高
解析： Kdm4d是组蛋白去甲基化酶，则Kdm4d可以表达组蛋
白去甲基化酶，降低H3组蛋白的甲基化水平，进而促进基因A的
表达。TSA是组蛋白脱乙酰酶抑制剂，可以抑制组蛋白脱乙酰酶
的作用，提高组蛋白的乙酰化水平最终调节相关基因的表达。
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3. （2024·陕西铜川模拟）RANKL是一种跨膜蛋白，RANKL过量表
达会激活破骨细胞，导致实体瘤骨转移的发生。地舒单抗是一种可
与人细胞中RANKL结合的IgG2单克隆抗体，能够靶向作用于过度
表达RANKL的细胞，阻断肿瘤的生长。地舒单抗制备流程如图1所
示。回答下列问题：
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（1）步骤①中，用RANKL多次免疫小鼠，其目的是获得
。
解析： 步骤①中，用RANKL多次免疫小鼠，其目的是获得
能产生抗RANKL抗体的B淋巴细胞。
能产生抗
RANKL抗体的B淋巴细胞
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（2）步骤②诱导动物细胞融合的常用方法有
（写出两种）。经过步骤②后获得的细胞需
要在选择培养基上进行筛选，在该培养基上，
细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞
才能生长，然后对获得的杂交瘤细胞进行
，经多次筛选，就可获得足够数量分泌抗RANKL单克隆抗体
的细胞。
PEG融合法、电融合法
和灭活病毒诱导法
未融合的亲本细
胞和融合有同种细胞的
克隆化培养和抗体检
测
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解析： 步骤②为诱导动物细胞融合的过程，常用的诱导动物
细胞融合的方法有PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法，经
过步骤②后获得的细胞需要在选择培养基上方可筛选出杂交瘤细
胞，因为该培养基上未融合的亲本细胞和融合有同种细胞的细胞
都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长，然后对获得的杂交
瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够
数量分泌抗RANKL单克隆抗体的细胞。
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（3）单克隆抗体的优点有 。
解析： 单克隆抗体的优点有能准确地识别抗原，与特定抗原
发生特异性结合，并且可以大量制备，即表现为纯度高、灵敏度
高和可以大量制备的优势。
纯度高、灵敏度高和可以大量制备
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（4）为进一步明确地舒单抗对于骨肿瘤
肺转移是否具有临床疗效，科研人
员观察了5例骨肿瘤肺转移患者联合
使用地舒单抗与抗血管靶向药物治
疗后的疾病无进展生存率（PFS，
指癌症患者从开始接受临床治疗到
癌症恶变或其他原因导致其死亡的时间），其中4例为
RANKL高表达，1例为RANKL低表达，结果如图2所示。由图可
知，使用地舒单抗后能使RANKL高表达骨肿瘤肺转移患者PFS时
间 （填“大于”或“小于”）RANKL低表达患者。通过
分析患者4的PFS时长可对骨肿瘤肺转移患者给出的治疗建议
是
。
大于
在癌症患者体内RANKL高表达的情况下，联合用药效果最
好
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解析： 由图可知，使用地舒单抗后能使RANKL高表达骨肿
瘤肺转移患者PFS时间大于RANKL低表达患者。题意显示，
RANKL是一种跨膜蛋白，RANKL过量表达会激活破骨细胞，导
致实体瘤骨转移的发生。地舒单抗是一种可与人细胞中RANKL结
合的IgG2单克隆抗体，能够靶向作用于过度表达RANKL的细胞，
阻断肿瘤的生长，而患者4表现为效果最佳，且用药方式为联合用
药，且癌症患者表现为RANKL高表达，因此对于癌症患者来讲，
在癌症患者体内RANKL高表达的情况下，联合用药效果最好。
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4. （2024·山东聊城三模）研究人员利用一种从某生物体内分离出的抗
盐碱基因，通过基因工程、植物细胞工程等现代生物技术，培育出
了抗盐碱大豆，使大豆能在盐碱地中正常生长，提高了大豆的产
量。下图为培育流程，其中①～⑥为不同过程，其中AmpR为氨苄青
霉素抗性基因，AluⅠ、SmaⅠ、HindⅢ和PstⅠ为限制酶。根据所学知
识，回答下列问题：
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（1）利用PCR技术可获取大量目的基因，PCR反应体系中有两种引
物，在复性时引物会结合到互补DNA链上，设计两种引物的碱基
序列时，要避免 ；扩增时，需
先加热至90 ℃以上，再冷却至50 ℃左右，再加热至72 ℃左右，
进行系列温度调整的目的分别是

。
两种引物的碱基序列互补配对
加热使 DNA变性后解旋为单
链；冷却复性使引物结合到模板DNA 链上；再加热促进热稳定
DNA聚合酶发挥作用，开始子链的延伸
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解析： DNA分子是由两条反向平行的链构成，且都作模板，
其上碱基序列互补，因此要避免两种引物的碱基序列互补配对；
扩增时，需先加热至90 ℃以上，再冷却至50 ℃左右，再加热至72
℃左右，进行系列温度调整的目的分别是：加热使 DNA变性后解
旋为单链；冷却复性使引物结合到模板DNA 链上；再加热促进热
稳定DNA聚合酶发挥作用，开始子链的延伸。
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（2）不用限制酶AluⅠ切割抗盐碱基因的原因是
。用限制酶切割抗盐碱基因和质粒时，选择SmaⅠ和PstⅠ
比只选择PstⅠ的优点是 、
（答出两点）。
AluⅠ切割会破坏抗盐
碱基因
防止目的基因和质粒反向连接
防
止目的基因、质粒自身环化
解析： 据图可知，抗盐碱基因中包含了AluⅠ限制酶识别序
列，若用限制酶AluⅠ切割则会破坏抗盐碱基因；选择SmaⅠ和PstⅠ
两种限制酶分别切割抗盐碱基因和质粒，抗盐碱基因与质粒各自
能形成不能互补配对的两个黏性末端，同时抗盐碱基因与质粒之
间的黏性末端又能互补配对，相比只选择PstⅠ一种酶进行切割的
优点是可防止目的基因、质粒反向连接，防止目的基因和质粒自
身环化。
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（3）图中②表示 。诱导组织细胞
脱分化的是 号培养基。若要利用AmpR筛选出含重组质粒的
农杆菌，需要的操作是
。
利用Ti质粒，通过农杆菌转化法可将抗盐碱基因导入大豆愈伤组
织细胞的理论依据是
。
将目的基因导入农杆菌细胞
3
在培养农杆菌的培养基内添加氨苄青霉
素
农杆菌中 Ti质粒上的T-DNA 能转移并整合
至植物细胞染色体DNA上
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解析： 图中②表示将目的基因导入农杆菌细胞；据图分析，
3号培养基可诱导组织细胞脱分化形成愈伤组织；质粒中含有氨苄
青霉素抗性基因，故含重组质粒的农杆菌具有抗氨苄青霉素的特
性，所以为了筛检成功导入重组质粒的农杆菌，1号培养基需要加
入氨苄青霉素；Ti质粒上的T-DNA具有可转移的特性，当农杆菌
侵染大豆愈伤组织细胞时，农杆菌中Ti质粒上的T-DNA包括插入
其中的目的基因，可转移并整合至受体细胞染色体DNA上。
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5. （2024·山东菏泽二模）由P基因编码的P蛋白是一种水通道蛋白，该蛋
白在植物调节水分吸收方面发挥着重要作用。科研人员成功培育出超量
表达P蛋白的转基因玉米。培育过程中所用DNA片段和Ti质粒的酶切位
点如图1所示。
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（1）构建基因表达载体时，切割Ti质粒应选用
酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体完成共
需 种酶。
解析： 构建基因表达载体时，切割目的基因需要用到的限制
酶为MunⅠ和XbaⅠ，结合各种限制酶的识别序列可知，EcoRⅠ和
SpeⅠ分别和MunⅠ和XbaⅠ为同尾酶，因此，切割Ti质粒应选用
EcoRⅠ和SpeⅠ酶。从切割DNA片段和Ti质粒到构建基因表达载体
完成共需四种限制酶和一种DNA连接酶，即需要5种酶。
EcoRⅠ和SpeⅠ
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（2）将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，培养基中需
加入 （填“潮霉素”“卡那霉素”或“潮霉素或卡
那霉素”）进行筛选，理由是
。
筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。
解析： 将农杆菌浸泡过的玉米愈伤组织进行植物组织培养，
培养基中需加入潮霉素进行筛选，因为潮霉素基因位于T-DNA
中，会与目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上，因
此凡是成功导入目的基因的愈伤组织细胞应该都具有对潮霉素的
抗性。进而用筛选出的愈伤组织最终培养成转基因玉米。
潮霉素
潮霉素基因位于T-DNA中，会与
目的基因一同转移到玉米愈伤组织细胞的染色体上
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（3）农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通过T-DNA插
入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突变体，某科
研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉默。由于T-
DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M基因中，该
小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引物（LP、
RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引物，BP为插
入T-DNA的特异引物，如图所示。
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（说明：T-DNA插入基因后，会阻止被插入基因两端引物的扩增产物的形
成）根据下表中三种样品的电泳结果判断样品 是纯合突变体，
理由是
。
3
样品1表现为能合成大片段，其基因型为MM，样品3中插入了
T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型可表示为mm
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引物种类样品序号 LP＋RP BP＋RP
样品1 有大片段 无
样品2 有大片段 有小片段
样品3 无 有小片段
解析： 农杆菌转化法除了用于获取转基因植物外，还可以通
过T-DNA插入基因内部使基因沉默，获得突变体。为了获得mm突
变体，某科研小组利用野生型MM，通过农杆菌转化法使基因M沉
默。由于T-DNA插入的位置是随机的，为确定T-DNA是否插入M
基因中，该小组采用“三引物法”进行PCR扩增，即采用三种引
物（LP、RP、BP），LP、RP为与目的基因片段互补的特异引
物，BP为插入T-DNA的特异引物，如图所示。结合题图以及题目
信息可知，样品1没有插入相应的T-DNA片段，其基因型为MM，
样品3中插入了T-DNA片段，表现为无扩增大片段出现，其基因型
可表示为mm，而样品2的基因型可表示为Mm。即根据表中三种
样品的电泳结果可判断样品3是纯合突变体。
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6. （2024·河北邢台二模）研究发现，GsERF6基因可以提高水稻的耐盐
性。图1是某研究小组利用PCR技术扩增GsERF6基因的过程，图2是该
研究小组通过基因工程的方法获得GsERF6基因超表达水稻新品种的过
程。请据图分析回答下列有关问题：
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（1）图1中步骤1和步骤2分别是PCR循环程序中的 ，这
两个步骤的温度都相对较高，可能与
中碱基C和G的含量较高有关；循环n次能获得等长目的
基因 个。
变性、复性
模板DNA和两种引
物
2n－2n
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解析： PCR（聚合酶链式反应）是利用DNA在体外95 ℃高
温时变性会变成单链，低温（经常是50 ℃左右）时引物与单链按
碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度
（72 ℃左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'→3'）的方向
合成互补链。图1中步骤1和步骤2分别是PCR循环程序中的变性、
复性，这两个步骤的温度都相对较高，可能与模板DNA和两种引
物中碱基C和G的含量较高有关，因为碱基C和G之间可以形成三
个氢键。观察图中信息可知，三次循环可以得到目的基因，因此
循环n次能获得等长目的基因2n－2n个。
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（2）图2中A为构建的GsERF6基因超表达载体的部分序列（图中 和 分
别为T-DNA的左、右边界，NeoR为新霉素抗性基因， 为终止
子），35s的作用是
。
解析： 根据题干信息“所有转入该重组DNA分子的植物细胞
都会表达GsERF6基因，且表达量较高”，可知该35s为启动子，
能驱动基因高效表达，且在所有植物细胞中均能驱动基因表达，
故35s的作用是RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出mRNA。
RNA聚合酶结合位点，驱动基因转录出
mRNA
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（3）超表达载体中T-DNA的作用是
，将重组GsERF6基因超
表达载体导入农杆菌，①过程利用含 的培养基筛选
出重组的农杆菌。
解析： T-DNA又叫可转移的DNA，因此T-DNA的作用是将
目的基因转移到受体细胞，并将其整合到受体细胞的染色体DNA
上；T-DNA可以将目的基因转移到受体细胞，并将其整合到受体
细胞的染色体DNA上，NeoR为新霉素抗性基因，因此将重组
GsERF6基因超表达载体导入农杆菌，①过程利用含新霉素的培养
基筛选出重组的农杆菌。
将目的基因转移到受体细胞，并
将其整合到受体细胞的染色体DNA上
新霉素
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（4）愈伤组织到幼苗的过程需要加入的激素有
，另外该过程还需要光照，光照的作用是
（写出两个）。
解析： 愈伤组织到幼苗的过程需要加入的激素有生长素和细
胞分裂素，另外该过程还需要光照，光照的作用是诱导叶绿素的
形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要。
生长素和细胞分裂
素
诱导叶绿素的
形成、满足叶绿体利用光能制造有机物的需要
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（5）请你设计实验检验此转基因水稻新品种是否培育成功：

（写出实验设计思路）。
解析： 个体水平上的鉴定包括抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴
定等，因此检验此转基因水稻新品种是否培育成功可以将此转基
因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中，观察和对比这两种水稻
的长势。
将此转
基因水稻和普通水稻分别种在高盐稻田中，观察和对比这两种水
稻的长势
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7. （2024·河北保定二模）在DNA体外重组实验中，目的基因与载体连接形成基因表达载体时，基因表达载体是否构建成功需要进行筛选与鉴定。抗药性筛选法是一种常见的筛选方法，该方法实施的前提条件是载体DNA上携带特定的抗性基因。利用某外源DNA和pBR322质粒构建基因表达载体，然后
导入大肠杆菌中，并进行筛选和鉴定，部分过程如图1、2所示，其中，AmpR表示氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。回答下列问题：
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（1）限制酶PstⅠ和BamHⅠ切割DNA分子产生的末端不能互补，是因
为
。
解析： 由于限制酶PstⅠ和BamHⅠ所识别的双链DNA分子的核
苷酸序列不同，切割位点不同，所以产生的黏性末端也不同，故
限制酶PstⅠ和BamHⅠ切割DNA分子产生的末端不能互补。
限制酶PstⅠ和BamHⅠ所识别的双链DNA分子的核苷酸序列不
同，切割位点不同，产生的黏性末端也不同
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（2）RT-PCR是一种结合了逆转录和PCR的技术。在利用RT-PCR技术获
取外源DNA的过程中用到的原料是 。在PCR扩
增外源DNA的过程中，需要用到大量引物，以1个外源DNA分子
为亲代，第n次扩增外源DNA时需要消耗的引物数量是 。
解析： 利用RT-PCR技术获取外源DNA的过程中用到的原料
是4种脱氧核苷酸。DNA复制过程中每一个子链的合成都需要引
物，第n次扩增外源DNA时即DNA分子数由2n－1变为2n，增加的
DNA分子数为2n－2n－1＝2n－1，需要消耗的引物数量是2（n－1）
×2＝2n个。
4种脱氧核苷酸
2n
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（3）在某次实际操作中，实验人员将外源DNA片段插入pBR322的
BamH Ⅰ切割位点处，构建了重组质粒，然后导入大肠杆菌中。为
检测重组质粒是否构建成功，实验人员进行了图2所示的实验。
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①结合图2阶段一实验分析，将大肠杆菌接种到固体培养基上的方
法是 。该培养基中添加了氨苄青霉素
（Amp），但是能在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入
了含外源DNA的重组质粒，这是由于

。
稀释涂布平板法
pBR322（空载质粒）和
含外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322 （空载质粒）或含外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗性
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②实验人员利用影印培养技术，将一块无菌丝绒布接触含有大肠
杆菌菌落的平板表面，使之定位沾上菌落印迹，然后平移并压在
含四环素（Tet）的培养基上，经过培养至菌落显现，如图2阶段
二实验所示。导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌菌落应该从
含 （填“Amp”或“Tet”）的培养基上获取，理由
是

。
Amp
限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四环素抗性基因），因
此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环素的培养基中生
长
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解析： ①图示中培养基上菌落分布均匀，因此将大肠杆菌接
种到固体培养基上的方法是稀释涂布平板法。由于pBR322（空载
质粒）和含外源DNA的重组质粒上均含有AmpR，导入了pBR322
（空载质粒）或含外源DNA的重组质粒的大肠杆菌对Amp均有抗
性，因此在该培养基中生长的大肠杆菌并不是一定导入了含外源
DNA的重组质粒。②由于限制酶BamHⅠ破坏了质粒上的TetR（四
环素抗性基因），因此含外源DNA的重组质粒不能在添加了四环
素的培养基中生长，所以导入了成功构建的重组质粒的大肠杆菌
菌落应该从含Amp的培养基上获取。
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8. （2024·湖南模拟）In-Fusion技术是一项新型的无缝克隆技术。技术关
键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列（即同源
序列，通常为15～20 bp），然后用In-Fusion酶（能识别双链线性化
DNA片段5'→3'末端16个碱基，并使其降解）处理即可实现无缝连接。
如下图所示，它的操作步骤大致为：①利用PCR技术将质粒线性化；②
PCR扩增出两端含线性化质粒同源序列的目的基因；③目的基因与线性
化质粒的同源区域在In-Fusion酶作用下形成重组质粒；④将重组质粒导
入受体细胞。回答下列问题：
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（1）①、②环节都需要引物，引物指的是
。
PCR技术需要一种特殊的DNA聚合酶，该酶与人体细胞中的DNA
聚合酶不同之处是
。
解析： 引物指的是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补
配对的短单链核酸。由于PCR技术中需要较高的温度条件，所以
使用的DNA聚合酶必须耐高温，而人体细胞中的DNA聚合酶不耐
高温。
一小段能与DNA母链的一
段碱基序列互补配对的短单链核酸
PCR技术中的DNA聚合酶耐高温，而人体细
胞中的DNA聚合酶不耐高温
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（2）图中的同源序列1、2中的碱基序列一般不同，如果它们的碱基序
列相同，则会导致 和
。基因工程中除了质粒外，
（答两种）也可以作为目的基因的运载体。
解析： 图中的同源序列1、2中的碱基序列不同，可以防止目
的基因或线性化质粒自身环化，还可以防止目的基因反向连接。
目的基因的运载体除了质粒外，噬菌体和动植物病毒也可以作为
目的基因的运载体。
目的基因或线性化质粒自身环化
目的
基因反向连接
噬菌体、动植物病
毒
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（3）如果受体细胞是大肠杆菌，则目的基因导入受体细胞需要用Ca2＋
处理，其目的是
。
目的基因转化后的抗性效果可以用大肠杆菌的致死率来表示，致
死率越低则抗性效果越好，简述测定大肠杆菌致死率的检测方
法：

。
使细胞处于一种能够吸收周围环境中DNA分子
的生理状态
用含有氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，然后分别用显
微镜计数法和稀释涂布平板法进行计数，若计数结果是A和B，则
致死率＝（A－B）/A×100％
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解析： 将目的基因导入微生物细胞（如大肠杆菌）时，需要
用Ca2＋处理微生物细胞，使之处于一种能够吸收周围环境中DNA
分子的生理状态。如果目的基因转化效果好，则在含有氨苄青霉
素的培养基中培养的大肠杆菌的致死率会较低。细菌计数法有显
微镜计数法和稀释涂布平板法，显微镜计数法计数的大肠杆菌包
括活菌和死亡的细菌，而稀释涂布平板法计数的都是活菌，因此
大肠杆菌的致死率＝（A－B）/A×100％。
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