专题八 生物技术与工程
【主干知识·网络构建】
醋酸菌 巴氏消毒法 湿热灭菌法 碳源、氮源、水、无机盐等 稀释涂布平板法 细胞的全能性
细胞增殖 膜的流动性 细胞核的全能性 10获能
11桑葚胚、囊胚 12将内细胞团均等分割 13DNA连接酶
14基因表达载体的构建 15基因
疑点必查
1.O2、糖源都充足 缺少糖源
2.防止杂菌污染
3.它们能合成脲酶，脲酶催化尿素分解产生NH3，NH3可作为细菌生长的氮源
4.当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
5.微生物菌体
6.杂交瘤细胞 足够数量的能分泌所需抗体的细胞
7.显微操作法 梯度离心、紫外线短时间照射和化学物质处理
8.两个极体或者雌、雄原核
9.发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚 内细胞团
10.RNA聚合酶识别和结合
11.T-DNA（可转移的DNA） 染色体DNA
12.凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象
13.乳腺中特异表达的基因的启动子
微专题1 发酵工程
【必备知识·自主落实】
主干知识整合
1.酵母菌 毛霉
3.诱变育种或基因工程育种 微生物数量、产物浓度 过滤、沉淀
4.（1）物理 化学或生物 干热灭菌法
（2）接种环 涂布器
（3） 灭菌 灼烧灭菌 平板冷却凝固 接种环 酚红 变红
易错易混辨析
1.（1）× （2）× （3）× （4）× （5）√
2.（1）× （2）× （3）√ （4）× （5）×
原因原理阐释
1.提示：没有接种菌种，而是利用了天然存在的菌种，菌种差异、杂菌情况不明和发酵过程的控制缺乏标准等，往往会造成发酵食品的品质不一
2.提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
3.提示：菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌
4.提示：由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个活菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个或多个活菌细胞连接在一起，而在计数时认为一个菌落对应着一个活菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目远低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量
5.提示：在无氮源培养基上培养细菌，若细菌能生长，则说明该细菌能利用空气中的氮气作为氮源
【命题前沿·深化拓展】
突破点
命题点1
典例引导
1.C 酵母菌是兼性厌氧微生物，在无氧条件下能进行酒精发酵，可用于酿酒、制作馒头和面包等，传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；发酵池是泥质老窖，多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在有氧环境中进行，因为酵母菌在有氧条件下可大量繁殖，C错误；谷物中含有大量淀粉，用谷物原料发酵形成酒糟的过程中，有淀粉分解形成糖浆的过程，因此，从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。
2.D 在氧气充足的条件下，黑曲霉可以利用糖类发酵产生柠檬酸，在相同菌体密度下，菌球体越大，越不容易获得氧气，柠檬酸产生速率越慢，A正确。由题目所给信息“菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制”可推出，发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量，B正确。大部分细菌适合在中性或弱碱性环境中生存，发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长，C正确。如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品；如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。柠檬酸属于代谢物，D错误。
针对练习
1.A 腐乳的制作中起主要作用的是毛霉，其可分泌蛋白酶来催化蛋白质的分解，生成小分子肽和氨基酸，A正确；果醋的制作需要醋酸菌的发酵，在葡萄糖和氧气充足时，将葡萄糖分解为乙醇，但其适宜的发酵温度为30～35 ℃，B错误；果酒的制作需要酵母菌的参与，酵母菌是在无氧条件下将葡萄糖分解成乙醇，C错误；泡菜的制作是依赖乳酸菌的无氧呼吸，即将葡萄糖分解为乳酸，无二氧化碳的生成，D错误。
2.D 谷氨酸棒状杆菌代谢类型为异养好氧型，性状优良的谷氨酸棒状杆菌可以通过基因工程育种或诱变育种获得，A正确；在利用发酵罐进行发酵的过程中，由于微生物的呼吸作用以及搅拌等产生大量的热，使发酵液温度升高，为防止温度过高降低酶的活性，进而降低谷氨酸产量，可通过水在发酵罐夹层中流动来达到冷却降温的目的，B正确；发酵过程中的搅拌会使营养物质和菌种充分接触且能增加溶解氧的量，故可满足菌体对氧气和养分的需求，C正确；中性和弱碱性条件下利于谷氨酸的积累，在酸性条件下容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺，D错误。
命题点2
典例引导
A 根据题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知，若要筛选出该内生菌，应该从未感染香蕉枯萎病的植株上采样，A错误。要筛选内生菌，同时防止样品表面杂菌对实验结果的影响，需要对样品进行消毒，用无菌水冲洗样品表面，收集冲洗液，对冲洗液进行无菌检测，B正确。稀释涂布平板法可用于分离微生物，将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离能获得内生菌的单菌落，C正确。要想判断内生菌对病原菌的抗性效果，需要比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小，D正确。
针对练习
3.C 筛选土壤中目的微生物即降解几丁质的微生物时，应用以几丁质为唯一碳源的培养基进行筛选，A正确；纯化培养时，可选择稀释涂布平板法或平板划线法接种，两种方法均可得到单菌落，B正确；在以几丁质为唯一碳源的培养基上生长的菌落不一定能分泌几丁质酶，可能部分是以几丁质的分解产物为碳源的微生物，C错误；水解圈是产生几丁质酶的微生物产生相关酶水解几丁质产生的，水解圈直径/菌落直径越大，说明该菌降解能力越强，故可依据单菌落周围“水解圈直径/菌落直径”的值来筛选目的菌株，D正确。
4.B 牛的瘤胃内是一个厌氧环境，所以要在牛的瘤胃中分离纤维素分解菌，需要创造厌氧条件，如在培养基表面加入一层石蜡，A正确；甲、乙、丙培养基中不仅只有乙培养基为选择培养基，3个都是添加纤维素作为唯一碳源的选择培养基，B错误；依据题干信息，刚果红可以与纤维素反应形成红色复合物，当纤维素被纤维素分解菌分解后，复合物无法形成，培养基中就会出现以这些菌为中心的透明圈，C正确；纤维素分解菌能分解纤维素是因为其可以产生纤维素酶，纤维素酶的活性越高，对纤维素的分解效果越好，以这些菌为中心的透明圈的直径与菌落直径的比值越大，据图比较菌落①的降解能力最强，最适用于生产实践，D正确。
微专题2 细胞工程和基因工程
【必备知识·自主落实】
主干知识整合
1.（1）无菌
（2）纤维素酶和果胶 离心 PEG融合 细胞壁
（3）①愈伤组织 ②细胞增殖
2.（2） 去核 取核 融合 移入
3.（1）超数排卵 囊胚
（2）同期发情 超数排卵 囊胚
4.（1） 磷酸二酯键 黏性 磷酸二酯键
（2）RNA聚合酶 转录
（3）新的蛋白质 蛋白质结构 脱氧核苷酸序列
易错易混辨析
1.（1）× （2）× （3）× （4）× （5）× （6）×
2.（1）× （2）× （3）× （4）√ （5）×
3.（1）√ （2）× （3）× （4）× （5）× （6）×
原因原理阐释
1.提示：细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织
2.提示：清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害
3.提示：胚胎细胞分化程度低，表现全能性相对容易
4.提示：鼠源单克隆抗体对人而言可能是异种抗原，经人源化后既能保留抗体的特异性，又能降低其异源性
5.提示：使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
6.提示：第1组引物Ⅰ和引物Ⅱ因局部发生碱基互补配对而失效；第2组引物Ⅰ'因自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。
7.提示：叶绿体基因不会通过花粉传给下一代
【命题前沿·深化拓展】
突破点1
命题点1
典例引导
1.D 在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，而愈伤组织细胞的分化过程是有丝分裂，所以不会发生基因重组，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D正确。
2.D 动物细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所必需的。传代培养时，培养皿不能密封，A错误。处于指数增长期的细胞形态和生理特性相对稳定，适合进行传代培养，离体培养的细胞生命力比较脆弱，需要适应培养基的环境，传代最好在细胞生长覆盖瓶底80％～90％时进行，故选取②的细胞进行传代培养比①更合理，B错误。题干显示从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理，使之分散成单个细胞，然后再用离心法收集，C错误。悬浮培养的细胞会因细胞密度过大、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素而分裂受阻，因此，细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关，D正确。
针对练习
1.C 据图可知，同一植物的外植体通过不同的培养体系可得到不同的产物，如经悬浮细胞培养可得到转基因细胞系，经外植体诱导能够获得完整植株等，A正确；基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传，表达出新产物或新性状，将目标产物合成途径中的关键酶基因导入悬浮细胞，有望提高产量，B正确；为提高组织培养成功率，消毒处理时既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力，外植体的消毒处理时间并不是越长越好，C错误；由于不受土壤、气候条件限制，该技术能够实现工厂化生产，故利用该技术有利于缓解资源短缺问题，D正确。
2.A 分析题意，灌流式培养的动物细胞不出现贴壁生长现象，A错误；悬浮培养的动物细胞会因细胞密度过大、有害代谢产物积累等因素而分裂受阻，而灌流是在细胞密度达到一定浓度或者营养物质低于一定浓度时进行，B正确；过高的灌流速率，培养的细胞没有及时利用营养物质，会导致营养物质不能得到充分利用，造成培养基浪费，C正确；灌流式培养能及时清除细胞代谢产物，但不能实现细胞的无限增殖，D正确。
命题点2
典例引导
D 双抗同时含有抗体1和抗体2的部分结构，可同时与2种抗原结合，A正确；根据抗体与抗原特异性结合的特点，利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，B正确；筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原，才能刺激B细胞产生两种抗体，C正确；双抗是在体外解偶联后重新偶联获得的，同时注射2种抗原可刺激B细胞分化产生抗体1和抗体2的浆细胞，但不能产生双抗，D错误。
拓展归纳
1.（1）骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行图中两个途径而在HAT培养基上不能增殖，B淋巴细胞因存活时间有限，故无需筛选；杂交瘤细胞由于可以进行补救合成途径，能在HAT培养基上大量增殖 （2）不一定 上清液 抗原—抗体杂交
2.抗体与待测抗原结合，酶催化特定底物反应 产物量
针对练习
3.A 三特异性抗体指的是一种抗体，通过蛋白质工程构建三特异性抗体的基因表达载体，然后获得相应的杂交瘤细胞，最终获得三特异性抗体，不是三种单抗融合而成，A错误；筛选该三特异性抗体，利用抗原—抗体特异性杂交原理，由于三特异性抗体含有三种抗体，故制备该抗体时，需要使用三种抗原蛋白，B正确；从图中看出，三特异性抗体能促进T细胞活化产生并释放细胞因子，细胞因子会促进T淋巴细胞的活化，从而提高机体对MM细胞的杀伤力，C正确；从图中看出，一方面三特异性抗体与T细胞膜上的CD28结合，抑制T细胞死亡，另一方面特异性抗体与T细胞膜上的TCR结合，促进T细胞活化，所以三抗与TCR和CD28结合可保持较高的T细胞数量和活性，D正确。
4.D NV作为抗原，具有多个抗原结合位点，可以诱导机体产生多种特定抗体的B淋巴细胞，A正确；利用单克隆抗体技术制备的抗体1和抗体2是利用小鼠的骨髓瘤细胞和B淋巴细胞融合的杂交瘤细胞分泌产生的，对人来说属于异物，为了降低免疫排斥，需要对单克隆抗体进行改造，除抗原结合区域外，其他部分都替换为人抗体区段，B正确；若待测液中含NV，则检测线和质控线C处均出现红色，而仅C处呈红色，说明检测结果为阴性，则可初步判断待测液中不含NV，C正确；若检测结果为阳性，则该病毒表面的抗原与结合垫处的抗体1结合，随着抗体1移动到T处，同一抗原表面的不同结合位点与抗体2结合呈红色，未与该病毒表面抗原结合的抗体1移动到C处与抗体1的抗体结合，因此该过程共发生3次特异性结合，D错误。
突破点2
命题点1
典例引导
1.D 若用Hind Ⅲ酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段，用DNA连接酶将两者连接成重组质粒时，目的基因和质粒有正向连接和反向连接两种连接形式，因此，目的基因转录的产物可能不同，A正确；若用Pvu Ⅰ酶切，只会破坏氨苄青霉素抗性基因，在含Tet（四环素）培养基中的菌落可能是含有目的基因的重组质粒，也可能是普通质粒，因此，在含Tet（四环素）培养基中的菌落，不一定含有目的基因，B正确；若用Sph Ⅰ酶切，由于重组质粒和普通质粒的碱基对数不同，因此可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否，C正确；若用Sph Ⅰ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp（氨苄青霉素）的培养基中能形成菌落，在含Tet（四环素）的培养基中不能形成菌落，D错误。
2.② 解析：正向连接与反向连接的基因表达载体的大小为6 700 bp，有HpaⅠ酶和BamHⅠ酶两个切割位点，切割后形成两个片段；正向连接的基因表达载体HpaⅠ酶和BamHⅠ酶切割位点之间的长度为700 bp，则剩余片段大小为6 000 bp；反向连接的基因表达载体HpaⅠ酶和BamHⅠ酶切割位点之间的长度为200 bp，则剩余片段大小为6 500 bp。故②泳道显示所鉴定的载体是正向连接的。
3.F2和R1或F1与R2
解析：据图可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图中的引物F2和R1或F1与R2。
针对练习
1.B 根据GNA—ACA融合基因的两端序列设计合适的引物，可以利用PCR技术检测GNA和ACA基因是否导入棉花细胞中，A不符合题意；由于重组质粒含有卡那霉素的抗性基因，故将棉花细胞接种在含卡那霉素的培养基上可筛选出转基因细胞，B符合题意；雪花莲凝集素基因（GNA）和尾穗苋凝集素基因（ACA）均有BsaBⅠ酶切位点，所以用限制酶BsaBⅠ和DNA连接酶处理两种基因可获得GNA—ACA融合基因，C不符合题意；图中质粒与ACA—GNA上都含有KpnⅠ和XhoⅠ的酶切位点，与只用KpnⅠ相比，KpnⅠ和XhoⅠ处理融合基因和载体可保证基因转录方向正确，D不符合题意。
2.C 由图可知，NotⅠ的酶切位点靠近GhMnaA2基因转录的起始端，其转录方向是A→B，A错误；①过程得到的表达载体可能为反义表达载体，也可能为正义表达载体，B错误；反义GhMnaA2基因转录出来的RNA与正常转录的mRNA互补，从而阻止其与核糖体结合，即反义GhMnaA2基因可能通过抑制GhMnaA2基因的翻译来保证棉纤维长度，C正确；用SmaⅠ和NotⅠ切割正义表达载体可获得3 kb、18 kb、28 kb、59 kb 4种长度的DNA片段，据此判断左侧SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是59 kb，A位置处的SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是3 kb，B位置处的SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是18 kb，右上角E6位置处的SmaⅠ和NotⅠ之间的长度是28 kb。故用NotⅠ切割反义表达载体获得的DNA片段的长度应分别为18 kb＋28 kb＝46 kb和3 kb＋59 kb＝62 kb，D错误。
命题点2
典例引导
1.D 分析反应管①～④中分别加入的适量单链DNA可知，①中两条单链DNA分子之间具有互补的序列（10个连续碱基对），但双链DNA区之外的3'端无模板，因此无法进行DNA合成，不能得到带有荧光标记的DNA探针；②中单链DNA分子内具有互补的序列，由于在本实验的温度条件下不能产生小于9个连续碱基对的双链DNA区，故该条单链DNA分子不发生自身环化，但两条链可以形成双链DNA区，由于DNA合成的序列（5'-TCT-3'）中不含碱基A，不能得到带有荧光标记的DNA探针；③中两条单链DNA分子之间具有互补的序列（10个连续碱基对），且双链DNA区之外的5'端有凸出的碱基（含碱基T），因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针；④中单链DNA分子内具有自身互补的序列，结合题中信息知该条单链DNA分子不发生自身环化，两条链可以形成双链DNA区，且双链DNA区之外的5'端有凸出的碱基（含碱基T），因此进行DNA合成能得到带有荧光标记的DNA探针。综上，能得到带有荧光标记的DNA探针的反应管有③④，故答案选D。
2.包含BamHⅠ的识别序列 将GTG改为ATG
3.D 增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少非特异性条带，A错误；延长热变性的时间和延长延伸的时间会影响变性延伸过程，但对于延伸中的配对影响不大，故不能有效减少反应非特异性条带，B、C错误；非特异性产物增加的原因可能是复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异性条带的产生，D正确。
4.D 引物与探针均具特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；题干中提出“每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针”，并且“每扩增一次，就有一个荧光分子生成”，因此反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B正确；由于cDNA是以某基因转录形成的mRNA为模板逆转录形成的，所以若用cDNA作模板，上述技术也可检测某基因的转录水平，C正确；由图可知，耐高温的DNA聚合酶催化DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸的，D错误。
5.B 题图可知，利用重叠延伸PCR 技术对 DNA 分子进行定点突变的过程中，通过 PCR2 获得产物 CD时所用的引物组合为引物c、d。引物d与转录模板链的3'端结合，因此引物 d 的序列为5'GTCACGTG，引物 2 符合该序列。现要利用重叠延伸PCR 技术对抗菌肽基因进行改造以获得抑菌性更强的抗菌肽，则需要将第52位的脯氨酸替换成苏氨酸。根据两种氨基酸的密码子可知，需要将 mRNA上的第 154号碱基由C替换为A，则需要将DNA非转录模板链上对应部分的碱基由C 替换为 A。因此引物c的碱基序列为5'CCTGTTAT，引物6符合该序列。综上所述，B项符合题意，A、C、D不符合题意。
6.（1）限制性内切核酸（或限制） 核苷酸序列 （2）磷酸二酯键 DNA单链 以DNA为模板的DNA链的延伸
（3）②④ （4）B
解析：（1）根据题图可知，步骤Ⅰ是获取目的DNA片段，所用的EcoRⅠ酶是一种限制酶，其能识别特定的核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。（2）步骤Ⅱ是将目的DNA片段连接成环状，其中DNA连接酶的作用是催化相邻核苷酸之间的3'-羟基和5'-磷酸间形成磷酸二酯键。PCR循环中，升高温度到95 ℃是为了打开氢键使双链解旋，获得DNA单链，Taq DNA聚合酶的作用是催化游离的脱氧核苷酸连接到引物3'端，合成DNA子链。（3）引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始延伸DNA子链，因为DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸，故为扩增未知序列，选择的与模板链相结合的引物应为5'-TCATGAGCGCATAGTT-3'（引物④）和5'-GCAATGCGTAGCCTCT-3'（引物②）。（4）分析题意可知，片段F的两端为限制酶EcoRⅠ切割后产生的黏性末端，因此其5'端序列应为AATT-，3'端序列应为-TTAA，B正确。
针对练习
3.D PCR（聚合酶链式反应）是一种分子生物学技术，用于在体外扩增特定的DNA片段， PCR反应缓冲液中需要加入Mg2＋激活DNA聚合酶，A正确；因为同时和两套引物都互补的靶序列很少，所以巢式PCR能减少非特异性产物的形成，B正确；第一轮扩增的产物是第二轮扩增的模板，第二轮扩增产物更短，C正确；如果第一次PCR引物过量，剩余引物在第二次PCR后由于有模板存在，仍会有产物，D错误。
4.C 为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，第一轮PCR过程中复性所用的温度应低于第二轮PCR复性的温度，A正确；若要使得目的基因可以表达出蛋白质，则需要在产物上具备启动子和终止子，诱导基因转录和翻译，B正确；第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物外，第二轮PCR仍需加入的引物是另一种侧翼引物，以便进行另一条链的延伸，C错误；将某蛋白质的第21位组氨酸（CAC）改造成酪氨酸（UAC），应将诱变引物设计包含—ATG—或—TAC—序列，该过程属于蛋白质工程技术范畴，D正确。
5.（1）①a和b a和d ②在引物b和c上引入突变 引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效 ③用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因
（2）①DNA两端序列未知，无法设计引物 ②逆时针 含有
解析：（1）①PCR扩增DNA的过程中，新合成的两条单链延伸方向相反，根据图中引物的方向可知，PCR1应选择引物a和b，得到产物AB。PCR2应选择引物c和d，得到产物CD。突变产物AD扩增选择的引物是a和d。重叠延伸时，可以分别以AB上链和CD下链为引物进行延伸，所以不需要引物。②重叠延伸PCR通过在引物b和c上引入突变实现定点突变，引物b和c分别和第一代DNA的两条单链的对应碱基互补，则其上的突变位点的碱基应互补配对。由于引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效，所以PCR1和PCR2需要分别进行。③据题意可知，若正常基因可被限制酶DpnⅠ识别并切割，特定位点突变后的基因不能被DpnⅠ识别，因此要鉴定获得的突变产物AD是否为突变基因，实验设计思路为：用限制酶DpnⅠ分别处理正常基因和上述过程获得的突变产物AD，然后进行电泳；若上述过程获得的突变产物AD的电泳条带只有一条且大于正常基因的电泳条带，则为突变基因。（2） ①利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列作为引物，由于该DNA分子两端的脱氧核苷酸序列未知，故无法设计引物，所以不能直接在图1中DNA分子的两端设计引物并进行扩增。②据图中未知序列的位置可知，图3中环状DNA进行PCR的过程中，沿引物A逆时针延伸子链，沿引物a顺时针延伸子链，才能扩增到未知序列，由于碱基互补配对，环化后的DNA分子含有EcoRⅠ的切割位点，则PCR产物含有EcoRⅠ的酶切位点。
命题点3
典例引导
（1）磷酸二酯键 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达 （2）A—U、A—T （3）N基因的两条链 无扩增产物 （4）实现废物利用，减少环境污染
解析：（1）限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，且不破坏N基因，从而使N基因能在菌株B2中表达。（2）向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C、A—U、A—T。（3）由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为N基因的两条链。结合题图分析可知，P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故N基因的两条链为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。（4）焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。
针对练习
6.D 由于CRISPR-Cas9基因编辑技术可以对特定位点进行编辑，因此CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用，内切核酸酶Cas9具有专一性，能使特定部位的磷酸二酯键断开，A、C正确；CRISPR-Cas系统中的CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列，当病毒入侵后，某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到 CRISPR，当病毒再次入侵细胞的时候起到免疫作用，这是细菌与病毒协同进化的结果，该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化，B正确；CRISPR-Cas9是由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成，即CRISPR基因经过转录之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割，D错误。
7.（1）磷酸二酯键 （2）启动子、终止子 （3）耐高温 琼脂糖凝胶电泳 （4）定点编辑基因，实验操作更加精准、高效
解析：（1）由图可知，Cas9蛋白切断的化学键是核苷酸之间的磷酸二酯键。（2）基因表达载体上除了含有目的基因和标记基因，还必须有启动子、终止子。（3）目的基因在与运载体结合前需要用PCR技术进行大量扩增，该过程需要Taq DNA聚合酶，与普通DNA聚合酶相比，其特点是耐高温。获得PCR产物后，常用琼脂糖凝胶电泳法对PCR产物进行鉴定。（4）利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将目的基因导入受体细胞，可使目的基因精确定点敲入，实验操作更加精准、高效。
大题突破（五） 生物工程类
典例示范
（1）低 256 GTTT CAAT （2）卡那霉素 SacⅠ ④
（3）1/4
同向题组
1.（1）耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） 预变性时间较长可增大模板DNA彻底变性的概率，使模板DNA充分解旋 （2）引物2和引物3必须具有碱基互补配对的片段 （3）限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶 磷酸二酯键 （4）引物1和引物4 BamHⅠ （5）B
解析：（1）重叠延伸PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2＋，以激活耐高温的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶），PCR中预变性时间比循环过程中变性时间长，其原因是预变性时间较长可增大模板DNA彻底变性的概率，使模板DNA充分解旋。（2）PCR扩增时需要引物，由阶段2“变性后杂交”的原理可知，引物2和引物3在碱基序列上的要求是引物2和引物3必须具有碱基互补配对的片段。（3）阶段3构建基因表达载体需要的酶有限制性内切核酸酶（限制酶）和DNA连接酶，它们作用的化学键是磷酸二酯键。（4）由图可知，T7启动子上含有BamHⅠ的酶切位点，因此在阶段3需破坏基础质粒上T7启动子的结构，构建基因表达载体仅使用1种限制酶，在设计阶段1和2的引物时，需确保引物1和引物4上含有BamHⅠ的识别序列。（5）利用与阶段3相同的限制酶酶切，如果受体细胞中成功导入了重组DNA分子，酶切后会得到两个DNA片段，已知Atu5117启动子、GFP基因、基础质粒的序列大小分别约为490 bp、750 bp、2 750 bp，所以酶切后得到两个DNA片段的大小分别是1 240 bp和2 750 bp，符合细胞B的电泳图。
2.（1）高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 平板划线（稀释涂布平板） （2）L3 （3）①引物2和引物3 使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 30 ②BamHⅠ ③判断PCR反应体系是否受到污染 目的基因已成功导入受体细胞
解析：（1）常用高压蒸汽灭菌（湿热灭菌）对培养基进行灭菌。分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，即可采用稀释涂布平板法和平板划线法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。（2）表格中，乳酸菌编号为L3的菌株对霉菌的抑菌率最高，因此应选择乳酸菌编号为L3的菌株进行后续操作。（3）①PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，因此利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是引物2和引物3。引物作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是2×24－2＝30。②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，图中细菌素基因转录方向为从右往左，即启动子位于右端，终止子位于左端，与甲链结合的引物为引物2，即在引物2的5'端加入BamHⅠ的识别序列。③4号为无菌水组，设置4号的目的是判断PCR反应体系是否受到污染。3号为转化操作后受体菌的DNA，提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，3号中出现500 bp的DNA片段，已知细菌素基因为500 bp，由此可知目的基因已成功导入受体细胞。
69 / 72专题八 生物技术与工程
疑｜点｜必｜查
1.（选择性必修3 P7正文）醋酸菌是好氧细菌，当 时能通过复杂的化学反应将糖分解成乙酸；当 时则直接将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。
2.（选择性必修3 P10正文）获得纯净的微生物培养物的关键是 。
3.（选择性必修3 P16思考·讨论）尿素分解菌之所以能分解尿素，是因为
。
4.（选择性必修3 P18正文）利用稀释涂布平板法计数，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为
。
5.（选择性必修3 P27正文） 单细胞蛋白是通过发酵获得了大量的 。
6.（选择性必修3 P48～49图2—16）单克隆抗体制备过程中涉及两次筛选，第一次是利用特定的选择培养基，筛选出 ；第二次是进行克隆化培养和抗体检测，目的是筛选出
。
7.（选择性必修3 P54相关信息）目前动物细胞核移植技术中普遍使用的去核方法是 。也有人采用 等方法。这些方法是在没有穿透卵母细胞透明带的情况下去核或使其中的DNA变性。
8.（选择性必修3 P58相关信息）在实际胚胎工程操作中，常以观察到 作为受精的标志。
9.（选择性必修3 P62正文）在进行胚胎分割时，应选择 。分割囊胚阶段的胚胎时，要注意将 均等分割。
10.（选择性必修3 P80正文）启动子位于基因的上游，是 的部位；终止子位于基因的下游，使转录在所需要的地方停下来。
11.（选择性必修3 P81资料卡）农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的 转移到被侵染的细胞，并且将其整合到该细胞的 上。
12.（选择性必修3 P84 探究·实践）在凝胶中DNA分子的迁移速率与 等有关。
13.（选择性必修3 P90正文）构建乳腺生物反应器时需要将药用蛋白基因与 等调控元件重组在一起。
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