微专题13 基因工程
一、选择题
1.下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验和“PCR扩增DNA片段及凝胶电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A.鉴定DNA时，将粗提取的DNA丝状物加入二苯胺，沸水浴后冷却，出现蓝色
B.DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶液度最大
C.进行琼脂糖凝胶电泳时，通过观察DNA片段在凝胶中的迁移距离判断其大小
D.利用PCR扩增3次后，得到的DNA含两种引物的DNA片段所占比例为3/4
2.（2025·广东佛山二模）枯草杆菌蛋白酶在洗涤剂工业中具有重要作用。研究人员利用蛋白质工程获得了在工业生产中有更好适用性的枯草杆菌蛋白酶突变体。这一过程中不涉及的操作是（ ）
A.基因定点突变
B.诱变处理枯草杆菌
C.PCR扩增基因
D.构建基因表达载体
3.（2025·甘肃白银二模）从苏云金杆菌中提取出来的Bt抗虫蛋白基因是基因工程中常用的抗虫基因。利用引物对某转基因抗虫植物中的Bt抗虫蛋白基因进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，发现电泳槽中出现了非特异性扩增条带。其原因不可能是（ ）
A.未加入模板
B.引物特异性差
C.DNA聚合酶质量不好
D.PCR循环次数过多
4.（2025·北京顺义二模）转基因抗虫棉的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。下列相关叙述正确的是（ ）
A.使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接
B.选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接
C.可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞
D.融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累
5.（2025·新课标卷6题）琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图所示（“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（ ）
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
6.（2025·江西宜春模拟）为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制酶的识别序列添加在了改造后的基因两侧。下图表示三种限制酶在改造后的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点。有关说法不正确的是（ ）
A.为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的DNA片段应当选择的限制酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
B.PCR扩增目的基因时先要将温度上升到90 ℃以上，使DNA变性
C.有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，即激活目的基因的表达
D.终止子使转录在所需要的地方停下来，是一段有特殊序列结构的DNA片段
7.（2025·北京东城二模）天然β-淀粉酶耐热性较差，难以满足工业化生产需求。通过PCR对天然β-淀粉酶基因进行改造，将其导入大肠杆菌表达后，获得了一种耐高温的β-淀粉酶。与天然酶相比，改造后的酶在第476位发生了氨基酸替换，由天冬氨酸改变为天冬酰胺。下列叙述错误的是（ ）
A.天冬酰胺与天冬氨酸的R基不同，该替换导致酶的空间结构改变
B.根据新的氨基酸序列可逆推出唯一对应的基因编码序列
C.PCR技术在此过程中实现了对β-淀粉酶基因的定点突变
D.这种通过设计并合成新蛋白质的技术属于蛋白质工程
8.细胞核定位信号（NLS）能够促进蛋白转移到细胞核中，科学家将 NLS 序列与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合插入到载体pRI101中，获得pRI101-NLS-GFP表达载体，利用农杆菌转化法在烟草中表达。载体pRI101-NLS-GFP的构建图谱见下图，下列有关描述正确的是（ ）
A.对融合基因PCR 时需在引物的3'端分别添加限制酶 NdeⅠ和SmaⅠ的识别序列
B.推测农杆菌细胞的解旋酶基因前端含有NLS核定位信号
C.融合基因插入到T-DNA 中确保其能整合到烟草的质 DNA 中
D.含该重组质粒的农杆菌侵染烟草，一段时间后观察发现荧光仅存在细胞核二、非选择题
9.（2025·广东梅州二模）苯丙酮尿症是由于患者体内苯丙氨酸代谢途径中的酶发生缺陷，使得苯丙氨酸及其代谢物酮酸在血液和组织中大量累积，进而阻碍脑的发育。研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因可在大肠杆菌中表达并降解苯丙氨酸。科学家将PAL基因导入到肠道益生菌Nissle1917大肠杆菌（EcN）中，构建工程菌EcN-PAL，用于治疗苯丙酮尿症。图1为2.7 kb的质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ和PvuⅠ两种限制酶的酶切位点与复制原点之间的距离分别为0.6 kb和0.8 kb。图2为含PAL基因的DNA片段。
回答下列问题：
（1）PAL是一种胞内酶，据此推测EcN-PAL的细胞膜上应具有 功能的蛋白质与PAL协同工作，完成EcN-PAL的预期作用。
（2）利用PCR技术扩增PAL基因，若该基因编码区其中一条链的序列为5'—AGCCCTCC…GAACCAGC—3'，下列可选用的一对引物是 。
A.5'—CCTCCCCA—3'
B.5'—AGCCCTCC—3'
C.5'—GCTGGTTC—3'
D.5'—GAACCAGC—3'
（3）据图分析，选用 酶切割PAL基因和质粒，构建重组表达载体。为确保目的基因正确插入质粒中，使用EcoRⅠ对重组DNA分子完全酶切后，进行凝胶电泳分析。若电泳图谱中出现长度为 kb的条带，则说明是符合要求的重组质粒。
（4）研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时间后会从胃肠道全部清除。据此推测，若服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症，需 （答出一点即可）。
微专题13 基因工程
1.A 鉴定DNA时，将丝状物溶于NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，A错误；DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度最大，利用DNA在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度的不同，通过控制其溶液的浓度去除杂质，B正确；琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段的大小与其迁移距离成反比（较小的片段迁移更快、距离更长），通过观察迁移距离可判断片段大小，C正确；PCR扩增3次即DNA复制3次，共形成8个DNA，根据半保留复制，有2个子代DNA含有其中一种引物，6个子代DNA同时含有两种引物，因此同时含有两种引物的DNA占6/8＝3/4，D正确。
2.B 需要对蛋白酶基因进行改造以获得更好的蛋白质，因此需要对该基因进行定点突变，A不符合题意；诱变处理枯草杆菌是为了获得更强的枯草杆菌，其原理是基因突变，而蛋白质工程是对枯草杆菌蛋白酶基因进行操作，B符合题意；蛋白质工程是基因工程的延伸，PCR扩增基因可以获得更多的基因，C不符合题意；蛋白质工程是基因工程的延伸，构建基因表达载体是基因工程的核心，蛋白质工程也会涉及，D不符合题意。
3.A 如果未加入模板DNA，PCR反应将无法进行，理论上不会产生任何扩增产物（包括非特异性扩增）。因此，未加入模板不会导致非特异性扩增，而是可能导致无扩增产物，A符合题意。
4.C DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸（如PCR中），而连接两个基因需要的是DNA连接酶（如T4 DNA连接酶），因此使用DNA连接酶催化C基因和Bt基因连接，A错误；PCR检测融合基因时，需选择位于两个基因外侧的引物（如C基因上游和Bt基因下游），确保仅当基因正确连接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正确连接，B错误；花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受精过程将基因整合到胚胎细胞中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞，C正确；C蛋白能结合纤维素（主要存在于细胞壁），融合基因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向积累至细胞壁附近，减少细胞质中的积累，从而避免非期望效应，D错误。
5.D 配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确；电泳时，样品向“＋”极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确；电泳中，DNA分子的迁移速率与分子大小、构象、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所以碱基对的数量可能不同，C正确；甲只有限制酶R的一个酶切位点，若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4才是甲被酶R完全酶切后的产物，D错误。
6.C 从图中可以看出切割质粒只能用EcoRⅠ和Sau3A Ⅰ两种限制酶，但由于Sau3A Ⅰ会破坏目的基因，所以切割含有目的基因的DNA不能用Sau3A Ⅰ，但BamHⅠ与Sau3A Ⅰ切出的黏性末端相同，所以可以用BamHⅠ切割含有目的基因的DNA片段，得到的中间区段DNA片段，在左端为EcoRⅠ切出的黏性末端，右端为BamHⅠ切出的黏性末端，其两端与质粒EcoRⅠ和Sau3A Ⅰ切出的黏性末端相同，保证了目的基因和质粒正确连接，A正确；有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达，C错误。
7.B 不同氨基酸的差异在于R基不同，氨基酸的改变会影响蛋白质的空间结构，天冬酰胺与天冬氨酸的R基不同，该替换会导致酶的空间结构改变，A正确；由于密码子的简并性，根据新的氨基酸序列推导出的基因编码序列不是唯一的，B错误；通过PCR技术可以对基因进行定点突变，从而实现对天然β-淀粉酶基因的改造，C正确；题中通过对天然β-淀粉酶基因改造获得耐高温的β-淀粉酶属于蛋白质工程，D正确。
8.D 表达载体的目的基因两端分别是限制酶 NdeⅠ和SmaⅠ的酶切位点，为了让目的基因准确的连接到质粒上，PCR延伸方向是5'到3'，PCR时需要在特异性引物的5'端分别添加限制酶NdeⅠ和SmaⅠ的识别序列，A错误；解旋酶在核糖体上合成，再转运到细胞核中，推测真核细胞解旋酶基因前端有NLS核定位信号，而农杆菌属于原核细胞，没有细胞核，解旋酶基因前端没有NLS核定位信号，B错误；融合基因插入到T-DNA中，确保其能整合到烟草的染色体DNA中，不是质DNA中，C错误；将含pRI101-NLS-GFP重组质粒的农杆菌侵染烟草，表达后绿色荧光蛋白含有细胞核定位序列，会转移到细胞核中，观察烟草细胞荧光信号仅存在细胞核中，D正确。
9.（1）转运苯丙氨酸 （2）BC （3）PvuⅠ 1.2 kb和5.5 （4）持续服用足够剂量
解析：（1）由于PAL是一种胞内酶，它需要在细胞内发挥作用，而EcN-PAL要完成其预期作用，即降解苯丙氨酸，就需要将苯丙氨酸从细胞外运输到细胞内。因此，EcN-PAL膜上应存在具有转运苯丙氨酸功能的蛋白质，这些蛋白质能与PAL协同工作，确保苯丙氨酸能够顺利进入细胞内并被PAL降解。（2）PCR技术中，引物是与目的基因两端互补配对的一段短单链DNA，用于引导DNA聚合酶进行DNA的合成。已知该基因编码区其中一条链的序列为5'—AGCCCTCC…GAACCAGC—3'，则另一条互补链为3'—TCGGGAGG…CTTGGTCG—5'，PCR中的一对引物应分别与模板链的3'端互补配对，并与模板链反向平行，BC中的引物满足以上条件。（3）PAL基因的两端只含PvuⅠ限制酶切割位点，且质粒上也有PvuⅠ限制酶切割位点，所以应选用PvuⅠ酶切割PAL基因和质粒构建重组表达载体。经过限制酶切割后，PAL基因两端的黏性末端相同，有可能和质粒正向连接，也可以和质粒反向连接。由于EcoRⅠ在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用EcoRⅠ对质粒完全酶切后，进行电泳分析。质粒中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.2 kb，若是正向连接载体，重组质粒中2个EcoRⅠ酶切点之间的距离是0.2＋1.0＝1.2 kb ，重组质粒长度为：2.7＋4＝6.7 kb，故EcoRⅠ酶切后，正向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为1.2 kb和5.5 kb两条条带。（4）研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时候后会从胃肠道全部清除。据此推测，服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症时需注意持续服用足够剂量以维持治疗效果，因为一旦停止服用，工程菌就会从肠道中清除出去，无法继续发挥降解苯丙氨酸的作用。
3 / 3微专题13 基因工程
一、基因工程
1.判断下列关于基因工程表述的正误
（1）（2024·安徽卷）DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可用于纯化DNA粗提物。（ ）
（2）（2024·山东卷）“DNA的粗提取与鉴定”实验中，研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中。（ ）
（3）（2024·贵州卷）使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。（ ）
（4）（2024·湖南卷）将质粒DNA进行酶切时，发现DNA完全没有被酶切，原因是酶切条件不合适，可通过调整反应条件，如温度和酶的用量等。（ ）
（5）（2023·全国乙卷）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。（ ）
（6）（2025·四川卷）土豆DNA溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色。（ ）
2.（2022·福建卷节选）载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。
用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是
。
二、PCR技术和蛋白质工程
1.判断下列关于PCR技术和蛋白质工程表述的正误
（1）（2024·河北卷）配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。（ ）
（2）（2024·吉林卷）凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置。（ ）
（3）（2024·吉林卷）在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快。（ ）
（4）（2025·新课标卷）利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质。（ ）
2.（2022·湖南卷节选）在蛋白质工程中所使用的mRNA可能不同，而合成的蛋白质空间构象却相同，其原因是 。
蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有 、 和利用PCR技术扩增。3.（2025·新课标卷34题节选）（1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ，而PCR过程中解开双链的方法是 。
（2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
命题点1 基因表达载体的构建与目的基因的正确连接
【高考例证】
1.（2023·新课标卷6题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接
B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coli DNA连接酶连接
思维路径
剖析试题情境及图示中的关键信息，如图：
2.（2024·江西高考12题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）导入生产菌株E.coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-氨基丁酸的菌株E.coli B。下列叙述正确的是（ ）
A.上图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B.E.coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C.E.coli A和E.coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
【挖掘拓展】
限制酶的选择
1.根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。
（2）为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙）。
2.根据质粒的特点选择限制酶（如图）
3.农杆菌转化法中，酶切位点应位于Ti质粒的T-DNA内部
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取。
【对点即练】
1.采用单酶切后进行连接反应，T启动子容易出现正向连接（图中T启动子箭头向右，目的基因正常转录）和反向连接（图中T启动子箭头向左，目的基因无法转录）两种情况。选用引物 （填序号）进行扩增可以鉴定出T启动子是否正向连接，原因是 。
2.（2025·四川成都二模）相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动细胞内各类无膜凝聚体形成的重要机制。研究人员将未知蛋白与不具有相分离特性的Cry2蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，则在蓝光照射下会发生凝聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照。为了探究X蛋白是否具备相分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2蛋白和X蛋白的重组质粒，质粒中LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。图1表示质粒的结构，图2表示含有目的基因的DNA片段，其中P1、P2、P3表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题：
（1）据图1分析，应选用四种限制酶中的
和 切割质粒，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。
（2）已知X蛋白基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入5'—GCCACC—3'序列，会显著提高基因的表达效率。利用PCR技术获取X蛋白基因时，为保证X蛋白基因能正确插入载体并高效表达，除选择引物P1外，还需要选择引物 （填“P2”或“P3”），并在该引物5'端增加碱基序列5'— —3'。
（3）通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，该技术所依据的原理是
。
对PCR产物进行电泳检测，结果显示除X蛋白基因条带外，还有多条非特异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为减少非特异性条带的产生，可适当 （填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。
（4）为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经Ca2＋处理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上。培养一段时间后，培养基中颜色为 的菌落为目标菌落，原因是
。
（5）为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是 、 。
命题点2 PCR技术、基因编辑技术及其应用
【高考例证】
1.（2025·湖南高考21题节选）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
制备特定抗原
①获得基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是
（答出两点即可）。
2.（2024·新课标卷35题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（Ⅰ～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是
。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和 。
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是 ；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是
（答出2点即可）。
【挖掘拓展】
1.PCR引物的设计和修饰
（1）PCR引物的设计
①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模板链随机结合。
②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体。
（2）引物的修饰
①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。
②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点、引入启动子序列、插入突变序列等。
2.CRISPR/Cas9基因编辑技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合， 并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
3. Cre/LoxP重组酶系统
这个系统主要由两部分组成：Cre重组酶和LoxP位点。
（1）Cre重组酶：最早是从P1噬菌体中发现的，具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
（2）LoxP序列：来源于P1噬菌体的DNA序列，包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
（3）①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
【对点即练】
1.（2025·江西景德镇二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲除鼠的流程如图1所示。已知P1和P2是PCR的引物，下列相关分析错误的是（ ）
A.核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，引起的变异属于基因突变
B.如果想让某个基因失去功能，也可以利用基因编辑来破坏目的基因
C.欲将基因的2、3、4共3个片段切除，敲除前需要设计2个向导sgRNA
D.sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱靶率越低
2.某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控制。研究人员通过基因工程构建含质粒-A-B-D的大肠杆菌生产药物P，下图为基因表达载体的构建过程，其中AmpR代表氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。引物1序列为5'—GGTCTAGACCTAGG—3'，引物2序列为5'—GGCCATGGGGTTCC—3'。限制酶的识别序列及切割位点（从左向右均为5'→3'）为KpnⅠ
基因B和D转录的模板分别是a链和d链。根据所学知识回答下列问题：
（1）PCR扩增目的基因时，引物的作用是
。常采用 来鉴定PCR的产物。
（2）为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有
酶的识别序列，则据图判断A基因转录的模板链可能是 。一个A基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。
（3）为了实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物 的5'端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中 （填字母）杂交形成的DNA。
（4）为保证B-D融合基因与质粒-A按图中方式连接，需要在引物3和引物5中分别添加限制酶 的识别序列。若筛选导入基因A-B-D的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选
的大肠杆菌即为目的菌。
微专题13 基因工程
【核心知识·真题化梳理】
一、基因工程
1.（1）√ （2）× （3）√ （4）× （5）× （6）×
2.提示：正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）
二、PCR技术和蛋白质工程
1.（1）× （2）× （3）× （4）√
2.提示：密码子的简并性 从基因文库中获取 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
3.提示：（1）解旋酶 高温变性 （2）引物、脱氧核苷三磷酸
【命题要点·深挖式拓展】
命题点1 基因表达载体的构建与目的基因的正确连接
高考例证
1.C 只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A不合理；用酶1切割目的基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B不合理；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C合理；酶2和酶4切割后产生的黏性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不合理。
2.D 不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误；由题意知L-谷氨酸钠是合成γ-氨基丁酸的底物，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸盐）脱羧（谷氨酸→氨基丁酸＋CO2）生产γ-氨基丁酸，该过程L-谷氨酸钠的作用是底物而不是供能，B错误；菌株E.coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），不能表达产生L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E.coli B中导入L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）表达产生L-谷氨酸脱羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外还有其他的限制酶可选，D正确。
对点即练
1.①和③（或②和④） 使用引物①、③或引物②、④进行 PCR，正向连接时可获得预期产物，反向连接时无法获得扩增产物
2.（1）MunⅠ XhoⅠ （2）P2 GAATTCGCCACC
（3）不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同 提高 （4）白色 重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生β-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal产生蓝色物质 （5）不含X蛋白基因 用FUS蛋白基因替换X蛋白基因
解析：（1）据图可知，EcoRⅠ能将Cry2切掉，不能选用，SalⅠ位于终止子外，也不能选用，故只能选用MunⅠ和XhoⅠ切割质粒，产生不同的黏性末端，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。（2）根据图中X蛋白基因的编码链的方向及质粒中启动子方向可知，需要将编码链的5'端靠近启动子，由于X蛋白基因中含有MunⅠ的酶切位点，所以不能用MunⅠ进行切割，但是EcoRⅠ与MunⅠ切割产生的黏性末端相同，所以可以在设计引物的时候添加EcoRⅠ的识别序列（—GAATTC—），同时也不能选用含有SalⅠ识别序列的引物，所以还需要选择引物P2，并在其5'端增加碱基序列—GAATTCGCCACC—。（3）不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同，所以可以通过琼脂糖凝胶电泳将不同的DNA片段区分开来；可适当提高PCR中复性过程的温度，减少引物和模板不完全配对现象，从而减少非特异性条带的产生。（4）分析题意可知，LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，重组质粒中导入了目的基因，则重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生β-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal产生蓝色物质，培养一段时间后，培养基中颜色为白色的菌落为目标菌落。（5）由题意可知，对照组质粒与实验组质粒相比，不含有X蛋白基因，此外FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照，故为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是不含X蛋白基因、用FUS蛋白基因替换X蛋白基因。
命题点2 PCR技术、基因编辑技术及其应用
高考例证
1.①终止子、复制原点 P1和P3 782 ②重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解
解析：重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子、复制原点等，终止子能终止转录过程。要确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物P1和P3。因为P1与基因A下游的非编码区互补配对，P3与基因A上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200＋582＝782 bp。将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白A，可能的原因有：重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外，转速过高使蛋白A发生沉淀，蛋白A亲水性较差发生沉淀，蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。
2.（1）磷酸二酯键 不破坏N基因，且能保证N基因正常表达 （2）C—G、U—A、A—T （3）N基因的两条链 无扩增产物 （4）实现废物利用，减少环境污染
解析：（1）限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，且不破坏N基因，从而使N基因能在菌株B2中表达。（2）向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。（3）由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为N基因的两条链。结合题图分析可知，P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故N基因的两条链为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。（4）焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。
对点即练
1.D 核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，这种变异是由于基因中碱基对的缺失导致的，属于基因突变，A正确；因为基因编辑技术可以通过对基因进行切割、修复等操作改变基因结构，所以如果想让某个基因失去功能，利用基因编辑来破坏目的基因是可行的，B正确；要将基因的2、3、4共3个片段切除，需要在2片段的上游和4片段的下游分别设计一个向导sgRNA，共2个向导sgRNA，这样才能精准定位并切割相应区域，C正确；sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越长，与靶序列的特异性结合越强，脱靶率越低；序列越短，特异性越差，脱靶率越高，D错误。
2.（1）使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 琼脂糖凝胶电泳 （2）XbaⅠ和NcoⅠ m 1/8 （3）4和6 b'、d' （4）NcoⅠ、BamHⅠ 能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长
解析：（1）PCR扩增目的基因时，引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR扩增的产物常采用琼脂糖凝胶电泳的方法来鉴定。（2）据图可知，A基因扩增选择引物1和引物2，结合引物和限制酶识别序列可知，引物1序列为5'—GGTCTAGACCTAGG—3'，对应限制酶XbaⅠ识别序列，引物2序列为5'—GGCCATGGGGTTCC—3'，对应限制酶NcoⅠ识别序列。基因转录的起点是启动子，XbaⅠ识别序列靠近启动子，而NcoⅠ识别序列靠近终止子，转录的方向是从模板链的3'开始，结合引物的序列方向，说明A基因转录的模板链可能是m。A基因在第一轮循环的时候，产生的两个DNA分子均是一条链含有引物，一条链不含引物，第二次循环时，以不含引物的DNA单链为模板扩增的DNA只有一种引物，以含一种引物的DNA单链为模板进行扩增的DNA含有两种引物，经过4轮循环，共得到16个DNA分子，其中有14个含有两种引物，2个含有一种引物，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8。（3）基因B和D转录的模板分别是a链和d链，要将B基因和D基因重叠延伸，且保证B、D基因的正常表达，需要模板链在DNA的同一条链上，结合图示B基因和D基因的引物可知，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物4和6的5'端添加互补序列。引物6与d互补配对，引物4和b互补配对，引物4和引物6的末端互补配对形成杂交双链，因此能延伸得到B-D融合基因的为图中b'、d'杂交形成的DNA。（4）利用XbaⅠ和NcoⅠ限制酶获得质粒-A，为了使B、D基因表达，B、D基因也必须连接在启动子和终止子之间，若选择XbaⅠ，则A基因会被切割破坏，因此只能选择NcoⅠ、BamHⅠ的识别序列。由于含基因A-B-D的大肠杆菌没有四环素抗性基因，有的是氨苄青霉素抗性基因，因此应筛选能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
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微专题13 基因工程
目录
核心知识·真题化梳理
命题要点·深挖式拓展
跟踪检测·巩固中提升
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核心知识·真题化梳理
一、基因工程
1. 判断下列关于基因工程表述的正误
（1）（2024·安徽卷）DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，该原理可
用于纯化DNA粗提物。 （ √ ）
（2）（2024·山东卷）“DNA的粗提取与鉴定”实验中，研磨液在4 ℃冰
箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中。 （ × ）
（3）（2024·贵州卷）使用不同的限制酶也能产生相同的黏性末端。
（ √ ）
√
×
√
（4）（2024·湖南卷）将质粒DNA进行酶切时，发现DNA完全没有被酶切，原因是酶切条件不合适，可通过调整反应条件，如温度和酶的用量等。 （ × ）
（5）（2023·全国乙卷）启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基
因翻译。 （ × ）
（6）（2025·四川卷）土豆DNA溶于酒精后，与二苯胺试剂混合呈蓝色。
（ × ）
×
×
×
2. （2022·福建卷节选）载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切抗性基因序列如图所示。
用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和图中载体连接，CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定，理由是
。
正向连接的重组DNA有这两种酶的酶切
没有这两种酶的酶切位点（没有限制酶的识别序列）
位点（限制酶的识别序列）；而反向连接的重组DNA会形成新的序列，
二、PCR技术和蛋白质工程
1. 判断下列关于PCR技术和蛋白质工程表述的正误
（1）（2024·河北卷）配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶
液作为扩增原料。 （ × ）
（2）（2024·吉林卷）凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的
具体位置。 （ × ）
（3）（2024·吉林卷）在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速
率越快。 （ × ）
（4）（2025·新课标卷）利用蛋白质工程可获得氨基酸序列改变的蛋白质。 （ √ ）
×
×
×
√
2. （2022·湖南卷节选）在蛋白质工程中所使用的mRNA可能不同，而合
成的蛋白质空间构象却相同，其原因是 。蛋白质工程
是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有
、 和利用PCR技术
扩增。
密码子的简并性
从基因文库
中获取
通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
3. （2025·新课标卷34题节选）（1）PCR是根据DNA复制原理在体外扩增
DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ，而PCR过
程中解开双链的方法是 。
（2）PCR过程中，因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有
。
解旋酶
高温变性
引
物、脱氧核苷三磷酸
命题要点·深挖式拓展
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命题点1 基因表达载体的构建与目的基因的正确连接
【高考例证】
1. （2023·新课标卷6题）某同学拟用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA连接酶为工具，将目的基因（两端含相应限制酶的识别序列和切割位点）和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。
下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是（ ）
A. 质粒和目的基因都用酶3切割，用E. coli DNA连接酶连接
B. 质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接
C. 质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接
D. 质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E. coli DNA连接酶连接
√
解析： 只用一种限制酶切割质粒和目的基因，会使质粒和目的基因发生自身环化或者使目的基因在质粒中反向连接，A不合理；用酶1切割目的
基因，产生的是黏性末端，用酶3切割质粒，产生的是平末端，无法连接，B不合理；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可使用T4 DNA连接
酶连接，使目的基因定向插到质粒中，C合理；酶2和酶4切割后产生的黏
性末端相同，易导致目的基因和质粒自身环化或者使目的基因在质粒中反
向连接，并且用酶4切割会破坏标记基因，D不合理。
思维路径
剖析试题情境及图示中的关键信息，如图：
2. （2024·江西高考12题）γ-氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利
用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸脱羧是高效生产γ-氨基丁酸的重
要途径之一。研究人员采用如图方法将酿酒酵母S的L-谷氨酸脱羧酶基因
（gadB）导入生产菌株E. coli A，构建了以L-谷氨酸钠为底物高效生产γ-
氨基丁酸的菌株E. coli B。下列叙述正确的是（ ）
A. 如图表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB
B. E. coli B发酵生产γ-氨基丁酸时，L-谷氨酸钠的作用是供能
C. E. coli A和E. coli B都能高效降解γ-氨基丁酸
D. 可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒
√
解析： 不能直接从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB，只能分离得到含有目的基因gadB序列的染色体DNA，如题图所示，若要获取目的基因，需要进行PCR，A错误；由题意知L-谷氨酸钠是合成γ-氨基丁酸的底物，用L-谷氨酸脱羧酶（GadB）催化L-谷氨酸（或L-谷氨酸盐）脱羧（谷氨酸→氨基丁酸＋CO2）生产γ-氨基丁酸，该过程L-谷氨酸钠的作用是底物而不是供能，B错误；菌株E. coli A中没有L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），不能表达产生L-谷氨酸脱羧酶（GadB），因而不能降解L-谷氨酸，而E. coli B中导入L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB），L-谷氨酸脱羧酶基因（gadB）表达产生L-谷氨酸脱羧酶（gadB），能高效降解L-谷氨酸钠生成γ-氨基丁酸，而不是高效降解γ-氨基丁酸，C错误；图中质粒下方括号内备注含多克隆位点，表明质粒上含有多种限制酶的识别序列，除了Nco Ⅰ和Kpn Ⅰ外还有其他的限制酶可选，D正确。
【挖掘拓展】
限制酶的选择
1. 根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
（1）应选择切点位于目的基因两端的限制酶，不能选择切点位于目的基
因内部的限制酶，如图甲不能选择限制酶SmaⅠ。
（2）为避免目的基因和质粒
的自身环化和反向连接，也可
使用不同的限制酶切割目的基
因和质粒，如图甲可选择PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也能被切出相同的黏性末端，如图乙）。
2. 根据质粒的特点选择限制酶（如图）
3. 农杆菌转化法中，酶切位点应位于Ti质粒的T-DNA内部
图中甲、乙、丁Ti质粒均不宜选取，而丙Ti质粒宜选取。
【对点即练】
1. 采用单酶切后进行连接反应，T启动子容易出现正向连接（图中T启动
子箭头向右，目的基因正常转录）和反向连接（图中T启动子箭头向左，
目的基因无法转录）两种情况。选用引物 （填序
号）进行扩增可以鉴定出T启动子是否正向连接，原因是
。
①和③（或②和④）
使用引物①、
③或引物②、④进行 PCR，正向连接时可获得预期产物，反向连接时无法
获得扩增产物
2. （2025·四川成都二模）相分离是蛋白质具有的一种物理特性，是驱动
细胞内各类无膜凝聚体形成的重要机制。研究人员将未知蛋白与不具有相
分离特性的Cry2蛋白相连，如果未知蛋白具有相分离特性，则在蓝光照射
下会发生凝聚，从而开发出检测蛋白是否有相分离特性的工具。FUS蛋白
作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照。为了探究X蛋白是否具备相
分离特性，科学家需要构建能同时表达Cry2蛋白和X蛋白的重组质粒，质
粒中LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌
落呈现蓝色，否则菌落为白色。
图1表示质粒的结构，图2表示含有目的基因的DNA片段，其中P1、P2、P3表示引物，其余箭头处表示相关限制酶的识别位点。回答下列问题：
（1）据图1分析，应选用四种限制酶中的 和 切割质
粒，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。
解析：据图可知，EcoRⅠ能将Cry2切掉，不能选用，SalⅠ位于终止子外，也不能选用，故只能选用MunⅠ和XhoⅠ切割质粒，产生不同的黏性末端，以保证目的基因插入后能够正常表达出Cry2蛋白和X蛋白。
MunⅠ
XhoⅠ
（2）已知X蛋白基因转录得到的mRNA前三个碱基为起始密码子AUG。研
究发现在紧邻起始密码子AUG之前加入5'—GCCACC—3'序列，会显著提
高基因的表达效率。利用PCR技术获取X蛋白基因时，为保证X蛋白基因能
正确插入载体并高效表达，除选择引物P1外，还需要选择引物 （填
“P2”或“P3”），并在该引物5'端增加碱基序列5'—
—3'。
P2
GAATTCGCCACC
解析：根据图中X蛋白基因的编码链的方向及质粒中启动子方向可知，需要将编码链的5'端靠近启动子，由于X蛋白基因中含有MunⅠ的酶切位点，所以不能用MunⅠ进行切割，但是EcoRⅠ与MunⅠ切割产生的黏性末端相同，所以可以在设计引物的时候添加EcoRⅠ的识别序列（—GAATTC—），同时也不能选用含有SalⅠ识别序列的引物，所以还需要选择引物P2，并在其5'端增加碱基序列—GAATTCGCCACC—。
（3）通过琼脂糖凝胶电泳可将不同的DNA片段区分开来，该技术所依据
的原理是
。
对PCR产物进行电泳检测，结果显示除X蛋白基因条带外，还有多条非特
异性条带（引物和模板不完全配对导致）。为减少非特异性条带的产生，
可适当 （填“提高”或“降低”）PCR中复性过程的温度。
解析：不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不同，所以可以通过琼脂糖凝胶电泳将不同的DNA片段区分开来；可适当提高PCR中复性过程的温度，减少引物和模板不完全配对现象，从而减少非特异性条带的产生。
不同DNA分子的大小和构象不同，在凝胶中的迁移速率不
同
提高
（4）为筛选出成功导入重组质粒的目标菌，需要将重组质粒与经Ca2＋处
理的大肠杆菌混匀，再将大肠杆菌接种到含有四环素和X-gal的培养基上。
培养一段时间后，培养基中颜色为 的菌落为目标菌落，原因
是
。
解析：分析题意可知，LacZ基因编码产生的β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色，重组质粒中导入了目的基因，则重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生β-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal产生蓝色物质，培养一段时间后，培养基中颜色为白色的菌落为目标菌落。
白色
重组质粒中不含LacZ基因，不能编码产生β-半乳糖苷酶，故不能分解
X-gal产生蓝色物质
（5）为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，
对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是
、 。
解析：由题意可知，对照组质粒与实验组质粒相比，不含有X蛋白基因，此外FUS蛋白作为经典的相分离蛋白，经常用作实验对照，故为了确认X蛋白的相分离特性，还可以构建两种重组质粒作为对照，对照组质粒与实验组质粒相比，所含基因的差异分别是不含X蛋白基因、用FUS蛋白基因替换X蛋白基因。
不含X蛋白基
因
用FUS蛋白基因替换X蛋白基因
命题点2 PCR技术、基因编辑技术及其应用
【高考例证】
1. （2025·湖南高考21题节选）非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引
起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主
细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
①获得基因A，构建重组质粒（该质粒的部分结构如图所示）。重组质粒
的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和
等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选
用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的
片段大小为 bp。
终止
子、复制原点
P1和P3
782
制备特定抗原
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱
导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能
的原因是
（答出两点即可）。
重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋
白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降
解
解析：重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、
启动子和终止子、复制原点等，终止子能终止转录过程。要确定基因A已
连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物P1和P3。因为P1与基因A下游
的非编码区互补配对，P3与基因A上游且靠近启动子的区域互补配对，这
样扩增的片段大小为200＋582＝782 bp。将DNA测序正确的重组质粒转入
大肠杆菌构建重组菌，培养后上清液中无蛋白A，可能的原因有：重组菌
没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外，转速过高使蛋白A发生沉淀，蛋白
A亲水性较差发生沉淀，蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。
2. （2024·新课标卷35题）某研究小组将纤维素酶基因（N）插入某种细菌（B1）的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株（B2）。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点（Ⅰ～Ⅳ）、引物（P1～P4）的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
（1）限制酶切割的化学键是 。
为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分
别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是
。
磷酸二酯键
不破坏N基因，且能
保证N基因正常表达
解析：限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可保证片段甲含有启动子和终止子，且不破坏N基因，从而使N基因能在菌株B2中表达。
（2）CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的
DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C
和 。
解析：向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C和C—G、A—T、U—A。
C—G、U—A、A—T
（3）用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的
模板是 ；
若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是 。
解析：由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为N基因的两条链。结合题图分析可知，P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物，故N基因的两条链为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。
N基因的两条链
无扩增产物
（4）与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点
是 （答出2点即可）。
解析：焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。
实现废物利用，减少环境污染
【挖掘拓展】
1. PCR引物的设计和修饰
（1）PCR引物的设计
①引物长度要适宜，一般引物的长度为15～23 bp。过长会导致其延伸温度
大于74 ℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致
引物与模板链随机结合。
②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免
形成发夹状结构，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避
免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体。
（2）引物的修饰
①引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。
②引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点、引入启动子
序列、插入突变序列等。
2. CRISPR/Cas9基因编辑技术
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA（sgRNA）引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割（如图）。CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因（目的基因）上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合， 并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其
明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入
宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因
治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用
前景。
3. Cre/LoxP重组酶系统
这个系统主要由两部分组成：Cre重组酶和LoxP位点。
（1）Cre重组酶：最早是从P1噬菌体中发现的，具有限制酶特性，能够特
异性识别LoxP位点。能使LoxP位点间的基因序列被删除或重组。
（2）LoxP序列：来源于P1噬菌体的DNA序列，包括两个13 bp的反向重复
序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，
而间隔区域决定了LoxP位点的方向。
（3）①同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，
Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
②反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重
组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
【对点即练】
1. （2025·江西景德镇二模）CRISPR/Cas9基因编辑技术根据靶基因序列设
计向导sgRNA，精确引导核酸酶Cas9切割与sgRNA配对的DNA，相关酶在
修复断裂DNA的过程中会改变连接部位的碱基序列。科研人员通过删除编
码PD-1蛋白基因的2、3、4片段造成蛋白质的功能缺失，制作PD-1基因敲
除鼠的流程如图1所示。已知P1和P2是PCR的引物，下列相关分析错误的
是（ ）
A. 核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，引起的变异属于基因
突变
B. 如果想让某个基因失去功能，也可以利用基因编辑来破坏目的基因
C. 欲将基因的2、3、4共3个片段切除，敲除前需要设计2个向导sgRNA
D. sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列越短，脱
靶率越低
√
解析： 核酸酶Cas9敲除2、3、4片段作用在磷酸二酯键，这种变异是由
于基因中碱基对的缺失导致的，属于基因突变，A正确；因为基因编辑技
术可以通过对基因进行切割、修复等操作改变基因结构，所以如果想让某
个基因失去功能，利用基因编辑来破坏目的基因是可行的，B正确；要将
基因的2、3、4共3个片段切除，需要在2片段的上游和4片段的下游分别设
计一个向导sgRNA，共2个向导sgRNA，这样才能精准定位并切割相应区
域，C正确；sgRNA会因错误结合而出现“脱靶”现象，一般sgRNA序列
越长，与靶序列的特异性结合越强，脱靶率越低；序列越短，特异性越
差，脱靶率越高，D错误。
2. 某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控
制。研究人员通过基因工程构建含质粒-A-B-D的大肠杆菌生产药物P，如
图为基因表达载体的构建过程，其中AmpR代表氨苄青霉素抗性基因，TetR
表示四环素抗性基因。引物1序列为5'—GGTCTAGACCTAGG—3'，引物2
序列为5'—GGCCATGGGGTTCC—3'。限制酶的识别序列及切割位点（从
左向右均为5'→3'）为KpnⅠ
基因B和D转录的模板分别是a链和d链。根据所学知识回答下列问题：
（1）PCR扩增目的基因时，引物的作用是
。
常采用 来鉴定PCR的产物。
解析：PCR扩增目的基因时，引物的作用是使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。PCR扩增的产物常采用琼脂糖凝胶电泳的方法来鉴定。
使DNA聚合酶从引物的3'端开
始连接脱氧核苷酸
琼脂糖凝胶电泳
（2）为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有 酶的识别序列，则据图判断A基因转录的模板链可能是 。一个A基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为 。
XbaⅠ和NcoⅠ
m
1/8
解析：据图可知，A基因扩增选择引物1和引物2，结合引物和限制酶识别序列可知，引物1序列为5'—GGTCTAGACCTAGG—3'，对应限制酶XbaⅠ识别序列，引物2序列为5'—GGCCATGGGGTTCC—3'，对应限制酶NcoⅠ识别序列。基因转录的起点是启动子，XbaⅠ识别序列靠近启动子，而NcoⅠ识别序列靠近终止子，转录的方向是从模板链的3'开始，结合引物的序列方向，说明A基因转录的模板链可能是m。A基因在第一轮循环的时候，产生的两个DNA分子均是一条链含有引物，一条链不含引物，第二次循环时，以不含引物的DNA单链为模板扩增的DNA只有一种引物，以含一种引物的DNA单链为模板进行扩增的DNA含有两种引物，经过4轮循环，共得到16个DNA分子，其中有14个含有两种引物，2个含有一种引物，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8。
（3）为了实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要
分别在引物 的5'端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种
杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中 （填字母）杂
交形成的DNA。
4和6
b'、d'
解析：基因B和D转录的模板分别是a链和d链，要将B基因和D基因重叠延伸，且保证B、D基因的正常表达，需要模板链在DNA的同一条链上，结合图示B基因和D基因的引物可知，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物4和6的5'端添加互补序列。引物6与d互补配对，引物4和b互补配对，引物4和引物6的末端互补配对形成杂交双链，因此能延伸得到B-D融合基因的为图中b'、d'杂交形成的DNA。
（4）为保证B-D融合基因与质粒-A按图中方式连接，需要在引物3和引物5
中分别添加限制酶 的识别序列。若筛选导入基因A-B-D
的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中
培养，筛选
的大肠杆菌即为目的菌。
NcoⅠ、BamHⅠ
能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的
培养基中生长
解析：利用XbaⅠ和NcoⅠ限制酶获得质粒-A，为了使B、D基因表达，B、D基因也必须连接在启动子和终止子之间，若选择XbaⅠ，则A基因会被切割破坏，因此只能选择NcoⅠ、BamHⅠ的识别序列。由于含基因A-B-D的大肠杆菌没有四环素抗性基因，有的是氨苄青霉素抗性基因，因此应筛选能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
跟踪检测·巩固中提升
>
<
一、选择题
1. 下列有关“DNA的粗提取和鉴定”实验和“PCR扩增DNA片段及凝胶
电泳鉴定”实验的叙述，错误的是（ ）
A. 鉴定DNA时，将粗提取的DNA丝状物加入二苯胺，沸水浴后冷却，出
现蓝色
B. DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在2 mol/L的NaCl溶液中溶
液度最大
C. 进行琼脂糖凝胶电泳时，通过观察DNA片段在凝胶中的迁移距离判断
其大小
D. 利用PCR扩增3次后，得到的DNA含两种引物的DNA片段所占比例为3/4
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5
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7
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9
√
解析： 鉴定DNA时，将丝状物溶于NaCl溶液后加入二苯胺试剂，在沸
水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，A错误；DNA在2 mol/L的NaCl
溶液中溶解度最大，利用DNA在不同浓度的NaCl 溶液中溶解度的不同，
通过控制其溶液的浓度去除杂质，B正确；琼脂糖凝胶电泳中，DNA片段
的大小与其迁移距离成反比（较小的片段迁移更快、距离更长），通过观
察迁移距离可判断片段大小，C正确；PCR扩增3次即DNA复制3次，共形
成8个DNA，根据半保留复制，有2个子代DNA含有其中一种引物，6个子
代DNA同时含有两种引物，因此同时含有两种引物的DNA占6/8＝3/4，D
正确。
1
2
3
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8
9
2. （2025·广东佛山二模）枯草杆菌蛋白酶在洗涤剂工业中具有重要作
用。研究人员利用蛋白质工程获得了在工业生产中有更好适用性的枯草杆
菌蛋白酶突变体。这一过程中不涉及的操作是（ ）
A. 基因定点突变
B. 诱变处理枯草杆菌
C. PCR扩增基因
D. 构建基因表达载体
√
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3
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7
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9
解析： 需要对蛋白酶基因进行改造以获得更好的蛋白质，因此需要对
该基因进行定点突变，A不符合题意；诱变处理枯草杆菌是为了获得更强
的枯草杆菌，其原理是基因突变，而蛋白质工程是对枯草杆菌蛋白酶基因
进行操作，B符合题意；蛋白质工程是基因工程的延伸，PCR扩增基因可
以获得更多的基因，C不符合题意；蛋白质工程是基因工程的延伸，构建
基因表达载体是基因工程的核心，蛋白质工程也会涉及，D不符合题意。
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3. （2025·甘肃白银二模）从苏云金杆菌中提取出来的Bt抗虫蛋白基因是
基因工程中常用的抗虫基因。利用引物对某转基因抗虫植物中的Bt抗虫蛋
白基因进行PCR扩增，并进行琼脂糖凝胶电泳，发现电泳槽中出现了非特
异性扩增条带。其原因不可能是（ ）
A. 未加入模板 B. 引物特异性差
C. DNA聚合酶质量不好 D. PCR循环次数过多
√
解析： 如果未加入模板DNA，PCR反应将无法进行，理论上不会产生
任何扩增产物（包括非特异性扩增）。因此，未加入模板不会导致非特异
性扩增，而是可能导致无扩增产物，A符合题意。
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4. （2025·北京顺义二模）转基因抗虫棉
的Bt蛋白在细胞质积累，可能与内源蛋白
相互作用，产生非期望效应。C蛋白能结
合纤维素，科研人员将C基因与Bt基因连接构建融合基因（如图）导入棉花细胞。下列相关叙述正确的是（ ）
A. 使用DNA聚合酶催化C基因和Bt基因连接
B. 选择引物2和4进行PCR以确定基因正确连接
C. 可通过花粉管通道法将融合基因导入棉花细胞
D. 融合基因表达可促进Bt蛋白在细胞膜定向积累
√
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解析： DNA聚合酶的功能是催化DNA链的延伸（如PCR中），而连接
两个基因需要的是DNA连接酶（如T4 DNA连接酶），因此使用DNA连接
酶催化C基因和Bt基因连接，A错误；PCR检测融合基因时，需选择位于两
个基因外侧的引物（如C基因上游和Bt基因下游），确保仅当基因正确连
接时才能扩增出目标片段，因此选择引物1和4进行PCR才可以确定基因正
确连接，B错误；花粉管通道法通过将外源DNA直接导入花粉管，利用受
精过程将基因整合到胚胎细胞中，因此可通过花粉管通道法将融合基因导
入棉花细胞，C正确；C蛋白能结合纤维素（主要存在于细胞壁），融合基
因表达后，Bt蛋白通过与C蛋白的结合被定向积累至细胞壁附近，减少细
胞质中的积累，从而避免非期望效应，D错误。
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5. （2025·新课标卷6题）琼脂糖凝胶电泳常用
于核酸样品的分析，样品1～4的电泳结果如图
所示（“＋”“－”分别代表电泳槽的阳极和
阴极）。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲
和乙，甲只有限制酶R的一个酶切位点，样品3
和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是（ ）
A. 配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B. 该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C. 甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D. 据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
√
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3
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解析： 配制琼脂糖凝胶时选用适当缓冲溶液，可维持电泳过程中体
系的pH稳定，保证核酸分子正常泳动，A正确；电泳时，样品向“＋”极移动，说明在该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电
荷，符合核酸分子在电泳中的带电特性，B正确；电泳中，DNA分子
的迁移速率与分子大小、构象、电荷的多少等多种因素有关。甲、乙
电泳条带位置虽然相同，但影响DNA分子的迁移速率的因素很多，所
以碱基对的数量可能不同，C正确；甲只有限制酶R的一个酶切位点，
若被酶R完全酶切，只会得到2种DNA片段（2个条带），这两个条带
的碱基数量比甲要少，电泳跑的距离要比甲更远，所以据图推测样品4
才是甲被酶R完全酶切后的产物，D错误。
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6. （2025·江西宜春模拟）为了能够便于被限制酶切割，科研人员将限制
酶的识别序列添加在了改造后的基因两侧。如图表示三种限制酶在改造后
的β-淀粉酶基因和pLN23质粒载体上的酶切位点。有关说法不正确的是
（ ）
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A. 为了保证目的基因和质粒能够正确连接，切割含有β-淀粉酶基因的
DNA片段应当选择的限制酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
B. PCR扩增目的基因时先要将温度上升到90 ℃以上，使DNA变性
C. 有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存
在时，即激活目的基因的表达
D. 终止子使转录在所需要的地方停下来，是一段有特殊序列结构的DNA
片段
√
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解析： 从图中可以看出切割质粒只能用EcoRⅠ和Sau3A Ⅰ两种限制酶，
但由于Sau3A Ⅰ会破坏目的基因，所以切割含有目的基因的DNA不能用
Sau3A Ⅰ，但BamHⅠ与Sau3A Ⅰ切出的黏性末端相同，所以可以用BamHⅠ切
割含有目的基因的DNA片段，得到的中间区段DNA片段，在左端为EcoRⅠ
切出的黏性末端，右端为BamHⅠ切出的黏性末端，其两端与质粒EcoRⅠ和
Sau3A Ⅰ切出的黏性末端相同，保证了目的基因和质粒正确连接，A正确；
有时为满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在
时，可以激活或抑制目的基因的表达，C错误。
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7. （2025·北京东城二模）天然β-淀粉酶耐热性较差，难以满足工业化生产
需求。通过PCR对天然β-淀粉酶基因进行改造，将其导入大肠杆菌表达
后，获得了一种耐高温的β-淀粉酶。与天然酶相比，改造后的酶在第476位
发生了氨基酸替换，由天冬氨酸改变为天冬酰胺。下列叙述错误的是
（ ）
A. 天冬酰胺与天冬氨酸的R基不同，该替换导致酶的空间结构改变
B. 根据新的氨基酸序列可逆推出唯一对应的基因编码序列
C. PCR技术在此过程中实现了对β-淀粉酶基因的定点突变
D. 这种通过设计并合成新蛋白质的技术属于蛋白质工程
√
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解析： 不同氨基酸的差异在于R基不同，氨基酸的改变会影响蛋白质的
空间结构，天冬酰胺与天冬氨酸的R基不同，该替换会导致酶的空间结构
改变，A正确；由于密码子的简并性，根据新的氨基酸序列推导出的基因
编码序列不是唯一的，B错误；通过PCR技术可以对基因进行定点突变，
从而实现对天然β-淀粉酶基因的改造，C正确；题中通过对天然β-淀粉酶基因改造获得耐高温的β-淀粉酶属于蛋白质工程，D正确。
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8. 细胞核定位信号（NLS）能
够促进蛋白转移到细胞核中，
科学家将 NLS 序列与绿色荧光
蛋白（GFP）基因融合插入到载体pRI101中，获得pRI101-NLS-GFP表达载体，利用农杆菌转化法在烟草中表达。载体pRI101-NLS-GFP的构建图谱如图，下列有关描述正确的是（ ）
A. 对融合基因PCR 时需在引物的3'端分别添加限制酶 NdeⅠ和SmaⅠ的识别
序列
B. 推测农杆菌细胞的解旋酶基因前端含有NLS核定位信号
C. 融合基因插入到T-DNA 中确保其能整合到烟草的质 DNA 中
D. 含该重组质粒的农杆菌侵染烟草，一段时间后观察发现荧光仅存在细
胞核
√
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解析： 表达载体的目的基因两端分别是限制酶 NdeⅠ和SmaⅠ的酶切位点，为了让目的基因准确的连接到质粒上，PCR延伸方向是5'到3'，PCR时需要在特异性引物的5'端分别添加限制酶NdeⅠ和SmaⅠ的识别序列，A错误；解旋酶在核糖体上合成，再转运到细胞核中，推测真核细胞解旋酶基因前端有NLS核定位信号，而农杆菌属于原核细胞，没有细胞核，解旋酶基因前端没有NLS核定位信号，B错误；融合基因插入到T-DNA中，确保其能整合到烟草的染色体DNA中，不是质DNA中，C错误；将含pRI101-NLS-GFP重组质粒的农杆菌侵染烟草，表达后绿色荧光蛋白含有细胞核定位序列，会转移到细胞核中，观察烟草细胞荧光信号仅存在细胞核中，D正确。
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二、非选择题
9. （2025·广东梅州二模）苯丙酮尿
症是由于患者体内苯丙氨酸代谢途径
中的酶发生缺陷，使得苯丙氨酸及其
代谢物酮酸在血液和组织中大量累积，进而阻碍脑的发育。研究发现，苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因可在大肠杆菌中表达并降解苯丙氨酸。科学家将PAL基因导入到肠道益生菌Nissle1917大肠杆菌（EcN）中，构建工程菌EcN-PAL，用于治疗苯丙酮尿症。图1为2.7 kb的质粒，其中Ap为氨苄青霉素抗性基因，EcoRⅠ和PvuⅠ两种限制酶的酶切位点与复制原点之间的距离分别为0.6 kb和0.8 kb。图2为含PAL基因的DNA片段。
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回答下列问题：
（1）PAL是一种胞内酶，据此推测EcN-PAL的细胞膜上应具有
功能的蛋白质与PAL协同工作，完成EcN-PAL的预期作用。
解析：由于PAL是一种胞内酶，它需要在细胞内发挥作用，而EcN-PAL要完成其预期作用，即降解苯丙氨酸，就需要将苯丙氨酸从细胞外运输到细胞内。因此，EcN-PAL膜上应存在具有转运苯丙氨酸功能的蛋白质，这些蛋白质能与PAL协同工作，确保苯丙氨酸能够顺利进入细胞内并被PAL降解。
转运苯丙
氨酸
1
2
3
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5
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8
9
（2）利用PCR技术扩增PAL基因，若该基因编码区其中一条链的序列为
5'—AGCCCTCC…GAACCAGC—3'，下列可选用的一对引物是 。
A. 5'—CCTCCCCA—3‘ B. 5'—AGCCCTCC—3'
C. 5'—GCTGGTTC—3‘ D. 5'—GAACCAGC—3'
BC
解析：PCR技术中，引物是与目的基因两端互补配对的一段短单链DNA，用于引导DNA聚合酶进行DNA的合成。已知该基因编码区其中一条链的序列为5'—AGCCCTCC…GAACCAGC—3'，则另一条互补链为3'—TCGGGAGG…CTTGGTCG—5'，PCR中的一对引物应分别与模板链的3'端
互补配对，并与模板链反向平行，BC中的引物满足以上条件。
1
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9
（3）据图分析，选用 酶切割PAL基因和质粒，构建重组表达载
体。为确保目的基因正确插入质粒中，使用EcoRⅠ对重组DNA分子完全酶
切后，进行凝胶电泳分析。若电泳图谱中出现长度为 kb的
条带，则说明是符合要求的重组质粒。
PvuⅠ
1.2 kb和5.5
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4
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8
9
解析：PAL基因的两端只含PvuⅠ限制酶切割位点，且质粒上也有PvuⅠ限制酶切割位点，所以应选用PvuⅠ酶切割PAL基因和质粒构建重组表达载体。经过限制酶切割后，PAL基因两端的黏性末端相同，有可能和质粒正向连接，也可以和质粒反向连接。由于EcoRⅠ在目的基因和质粒上都有酶切位点，为选出正向连接的重组质粒，使用EcoRⅠ对质粒完全酶切后，进行电泳分析。质粒中EcoRⅠ酶切位点与PvuⅠ酶切位点之间的距离为0.2 kb，若是正向连接载体，重组质粒中2个EcoRⅠ酶切点之间的距离是0.2＋1.0＝1.2 kb，重组质粒长度为：2.7＋4＝6.7 kb，故EcoRⅠ酶切后，正向连接载体的情况下，电泳图谱中出现长度为1.2 kb和5.5 kb两条条带。
1
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3
4
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6
7
8
9
（4）研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时间后会从胃肠道全
部清除。据此推测，若服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症，需
（答出一点即可）。
解析：研究表明EcN菌株不会在人体肠道中定殖，一段时候后会从胃肠道全部清除。据此推测，服用EcN-PAL治疗苯丙酮尿症时需注意持续服用足够剂量以维持治疗效果，因为一旦停止服用，工程菌就会从肠道中清除出去，无法继续发挥降解苯丙氨酸的作用。
持续服用足够
剂量
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5
6
7
8
9
THANKS
感谢您的观看
