大题突破（五） 基因工程类
1.某实验室采用转基因技术构建表达葡聚糖酶基因（GluZ）的工程酵母菌，赋予了该酵母菌降解啤酒中葡聚糖的能力。MFa是酵母菌特有的信号肽基因，具有引导核糖体转移至内质网的作用，为了使GluZ表达出分泌型蛋白，将其与MFa连接形成融合基因。回答下列问题：
（1）基因工程的核心步骤是 。
质粒上的启动子是 酶识别和结合的位点，功能是驱动基因的 过程，并最终表达我们需要的蛋白质。
（2）为使MFa与GluZ连接形成融合基因，结合图3分析，引物R1与引物F2的5'端都引入了 的酶切序列。为使融合基因与质粒正确连接，在利用PCR技术扩增融合基因的过程中，应在引物F1和R2的5'端引入的碱基序列分别是 。
（3）将构建的重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，发现只有信号肽的氨基酸序列（转录、翻译过程正确），请结合图3分析原因可能是 。
（4）科研人员对（3）中的问题进行修正后，GluZ表达仍有异常，请继续结合图3分析原因可能是：
。
2.东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。
（1）乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利用 法对该培养基进行灭菌，并采用 法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养，选择对霉菌抑菌率高的菌株进行后续操作。
（2）研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对受体菌做进一步的检测与鉴定。如图是细菌素基因及构建的基因表达载体的示意图。
①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是 ，PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是 。
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲链结合的引物的5'端加入 （填“BamHⅠ”或“NdeⅠ”）的识别序列。
③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如下图。电泳结果表明 。
3.（2025·广东潮州模拟）微生物修复技术已成为当前石油污染土壤修复技术领域的研究热点，但石油污染土壤中氮元素限制直接影响了微生物的修复效果，土壤固氮菌的出现可以解决这一问题。土壤固氮菌在没有化合态氮（主要是铵）时可以进行固氮作用，不过土壤固氮菌对氧高度敏感，其产生的固氮酶在有氧条件下容易发生不可逆的失活。土壤固氮菌中部分固氮相关的基因结构及功能如图所示。请回答下列问题：
（1）从石油污染土壤中分离土壤固氮菌，可采用 （填方法）接种、培养并进行计数。使用的培养基中不需要有机氮源，原因是 。
（2）启动子位于固氮酶结构基因的上游，其功能是 。研究表明，nifA基因的表达产物对固氮基因σ54依赖型启动子的表达是必需的，而有铵时nifL基因会被激活，此时土壤固氮菌的固氮过程将停止，原因是 。
（3）为提高土壤固氮菌的固氮效率，某科研团队准备通过基因工程和蛋白质工程两个方向分别对土壤固氮菌进行改造，假如你是科研团队的一员，请选择一个方向简述你对土壤固氮菌的改造思路。
4.OsCYP2基因已被证实为水稻耐盐碱关键基因。科研人员通过克隆OsCYP2基因，构建OsCYP2基因表达载体，并将其转化到烟草中，探讨OsCYP2基因对烟草耐盐碱能力大小的影响。回答下列问题：
注：Bar基因为抗草甘膦（一种除草剂）基因
甲（1）构建OsCYP2基因表达载体时所用Ti质粒结构如图甲所示，在构建重组质粒时要将OsCYP2基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，当农杆菌侵染烟草细胞时，OsCYP2基因能随T-DNA整合到烟草细胞的 上。
（2）OsCYP2基因两端碱基序列如图乙所示，为了让OsCYP2基因和Ti质粒正确连接，利用PCR技术扩增OsCYP2基因时需要设计一对引物，这对引物的序列分别为
（从引物5'端开始书写，
只写前12个碱基即可）。
（3）科研人员将OsCYP2基因导入烟草细胞（烟草细胞无该基因），然后利用植物组织培养技术将含目的基因的受体细胞培养为转基因植株，利用反转录PCR技术等检测OsCYP2基因是否转录，其大致步骤为：提取转基因植株的RNA→ →利用PCR技术进行扩增→对扩增产物进行电泳分析。在构建PCR反应体系时需加入的物质有模板DNA、引物、缓冲液、 等（答出两种）。
（4）科研人员选择上述扩增产物出现特异性扩增条带（呈阳性）的转基因植株，在个体生物学水平检测“转OsCYP2基因烟草的耐盐碱性是否明显提高”，请写出实验的大致思路
。
（5）科研人员在研究转OsCYP2基因烟草的遗传稳定性时，发现有少部分阳性植株的遗传不符合孟德尔遗传规律，这可能是因为基因插入的 和数目是随机的，导致目的基因在转基因植株中的遗传变得复杂。此外，科研人员还发现OsCYP2基因在部分阳性植株中的表达水平低下，这影响了转基因植株从实验室走向农业生产应用，请分析可能的原因有 （答出一点即可）。
大题突破（五） 基因工程类
1.（1）构建基因表达载体 RNA聚合 转录
（2）NotⅠ 5'—GCTAGC—3'、5'—GGTACC—3'
（3）MFa基因编码链中存在TAG，转录后会形成终止密码子UAG，使翻译到此结束 （4）GluZ基因编码链的第一个碱基与NotⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取
解析：（1）基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；启动子是一段有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。（2）由图3可知，MFa与GluZ通过NotⅠ连接形成融合基因，因此需要在引物R1与引物F2的5'端都引入NotⅠ的酶切序列；由图1可知，为使融合基因能按正确的方向插入质粒上的启动子与终止子之间，需要在融合基因的MFa基因侧引入NdeⅠ限制酶的识别序列，在GluZ基因侧引入KPnⅠ限制酶的识别序列，结合图2分析可得，在利用PCR技术扩增融合基因的过程中，应在引物F1和R2的5'端引入的碱基序列分别是5'—GCTAGC—3'和5'—GGTACC—3'。（3）将融合基因和质粒分别酶切、连接后得到的重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检测发现融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的蛋白质中却只有信号肽的氨基酸序列，分析图3融合基因编码链的序列，发现在MFa基因编码链中对应的最后三个碱基是5'—TAG—3'，其模板链对应碱基为3'—ATC—5'，通过转录获得mRNA上碱基序列为5'—UAG—3'，属于终止密码子，会使翻译至此时终止，故翻译产物中只有信号肽的氨基酸序列。（4）科研人员对（3）中的问题进行修正后，即删除MFa编码序列的最后三个碱基，然后重新构建了重组质粒，将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检测发现融合基因转录、翻译出的融合蛋白质中信号肽的氨基酸序列正确，而GluZ对应的氨基酸序列却与葡聚糖酶不同，分析图3可知GluZ基因编码链的第一个碱基与NotⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，从而导致mRNA的密码子被错位读取，使GluZ表达仍有异常。
2.（1）高压蒸汽灭菌 平板划线（或稀释涂布平板）
（2）①引物2和引物3 30 ②BamHⅠ ③目的基因已成功导入受体细胞
解析：（1）常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，即可采用稀释涂布平板法和平板划线法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。（2）①PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，图中连接羟基的是3'端，因此利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是引物2和引物3。引物作用使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。每一条子链的形成都需要引物，故PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是2×24－2＝30。②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，图中细菌素基因转录方向为从右往左，即启动子位于右端，终止子位于左端，与甲链结合的引物为引物2，即在引物2的5'端加入BamHⅠ的识别序列。③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如图，通过比对可以看出只在受体菌中提取出来扩增产物DNA，这说明受体菌中含有目的基因，即目的基因已经成功导入受体细胞。
3.（1）稀释涂布平板法 土壤固氮菌能利用空气中的氮气作为氮源 （2）RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录 nifL的表达产物会使nifA表达产物丧失活性，而nifA的表达产物对固氮基因σ54依赖型启动子的表达是必须的 （3）基因工程方向：获取与改造能提高固氮效率的目的基因，构建基因表达载体，将表达载体导入土壤固氮菌细胞中并使其高效表达；蛋白质工程方向：分析高效固氮酶的结构与氨基酸序列，推测其基因的核苷酸序列，合成或改造相关基因，导入到土壤固氮菌中表达产生相关固氮酶。
解析：（1）可采用稀释涂布平板法、平板划线法进行接种、培养后筛选出目标菌，若用于目标菌的计数，则宜采用稀释涂布平板法。从石油污染土壤中分离土壤固氮菌，可使用选择培养基，因土壤固氮菌能利用空气中的氮气作为氮源，故该培养基中不需要有机氮源。（2）启动子指的是位于基因首端的能被RNA聚合酶识别与结合的核酸序列，其驱动基因的转录。nifA基因的表达产物对固氮基因σ54依赖型启动子的表达是必需的，铵的存在会激活nifL基因，nifL的表达产物使nifA表达产物丧失活性，此时土壤固氮菌的固氮过程将停止。（3）基因工程的基本操作包括获取目的基因、构建表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定四个阶段，据此可设计通过基因工程改造土壤固氮菌，其思路为：获取与改造能提高固氮效率的目的基因，构建基因表达载体，将表达载体导入土壤固氮菌细胞中并使其高效表达；由蛋白质工程基本原理与操作过程可知，可通过蛋白质工程对土壤固氮菌进行改造，其思路是：分析高效固氮酶的结构与氨基酸序列，推测其基因的核苷酸序列，合成或改造相关基因，导入到土壤固氮菌中表达产生相关固氮酶。
4.（1）染色体DNA （2）5'—AGATCTATGTCT—3' 5'—GCTAGCCTAGGA—3' （3）将提取的RNA反转录为cDNA 热稳定DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）、四种脱氧核苷酸（dNTP）、Mg2＋ （4）将等量、长势相同的转OsCYP2基因烟草和非转基因烟草分为甲、乙两组，用一定浓度NaCl溶液＋完全营养液进行水培，在其他条件相同且适宜条件下培养一段时间，观察并记录两组烟草的生长状况 （5）位点（或位置或部位） ①OsCYP2基因插入的位置不合适会阻碍基因转录过程，导致基因表达水平低下；②OsCYP2基因发生甲基化等表观遗传修饰，影响OsCYP2基因的表达；③细胞内可能存在与OsCYP2基因转录产生的mRNA互补的小RNA分子，抑制mRNA的翻译过程，使基因表达水平低下；④温度、光照等环境因素可能参与调节植物的基因表达，影响OsCYP2基因表达
解析：（1）Ti质粒的T-DNA中可以将目的基因导入受体细胞的染色体DNA上，故在构建重组质粒时要将OsCYP2基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，当农杆菌侵染烟草细胞时，OsCYP2基因能随T-DNA整合到烟草细胞的染色体DNA上。（2）应将目的基因导入启动子和终止子之间，且为避免反向连接和自身环化，应选择两种限制酶进行切割，据图可知，应选择启动子2与终止子之间的限制酶，故应选择的是BglⅡ和NheⅠ，再结合图乙的转录方向及碱基序列可知，利用PCR技术扩增OsCYP2基因时需要设计一对引物，该对引物需要与模板的3'端结合，且需要在首端加上上述两种酶的碱基序列，故最终为5'—AGATCTATGTCT—3'和 5'—GCTAGCCTAGGA—3'。（3）逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，利用逆转录PCR技术等检测OsCYP2基因是否转录，其大致步骤为：提取转基因植株的RNA→将提取的RNA逆转录为cDNA→利用PCR技术进行扩增→对扩增产物进行电泳分析；PCR是一项体外扩增DNA的技术，在构建PCR反应体系时需加入的物质有模板DNA、引物、缓冲液、热稳定DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）、四种脱氧核苷酸（dNTP）、Mg2＋等。（4）在个体生物学水平检测“转OsCYP2基因烟草的耐盐碱性是否明显提高”，需要将转基因植物与非转基因植物进行比较，实验设计应遵循对照与单一变量原则，故可设计实验如下：将等量、长势相同的转OsCYP2基因烟草和非转基因烟草分为甲、乙两组，用一定浓度NaCl溶液＋完全营养液进行水培，在其他条件相同且适宜条件下培养一段时间，观察并记录两组烟草的生长状况。（5）基因工程过程中，基因插入的位置和数目是随机的，故有少部分阳性植株的遗传不符合孟德尔遗传规律；基因的表达包括转录和翻译过程，科研人员还发现OsCYP2基因在部分阳性植株中的表达水平低下，可能的原因有：①OsCYP2基因插入的位置不合适会阻碍基因转录过程，导致基因表达水平低下；②OsCYP2基因发生甲基化等表观遗传修饰，影响OsCYP2基因的表达；③细胞内可能存在与OsCYP2基因转录产生的mRNA互补的小RNA分子，抑制mRNA的翻译过程，使基因表达水平低下；④温度、光照等环境因素可能参与调节植物的基因表达，影响OsCYP2基因表达。
2 / 3大题突破（五） 基因工程类
【典例示范】
（12分）（2024·山东高考25题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲：载体信息
LB/RB：T-DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr：氨苄青霉素抗性基因
图乙：目标基因L部分序列
图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用Bsa Ⅰ酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经Bsa Ⅰ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【命题立意】
本题以“利用基因工程技术编辑基因L，培育耐盐碱大豆品系”的科学实验和探究为情境，从基础性、综合性、应用性考查基因工程与遗传的基本规律的基础知识、基本方法和基本技能，侧重对理解能力、实验探究能力、解决问题能力的考查。
【解题思路】
1.信息获取与处理——明确向导DNA序列和目标序列的作用
2.数学模型的构建与运用[第（1）小题]
若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，图中给出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaⅠ切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序。根据图甲所示的载体信息，在载体的碱基序列上有两个酶切位点，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'—GTTT—3'和5'—CAAT—3'（注意是载体上保留的黏性末端序列，也就是靠近LB和RB边界的保留，中间切下来的那段换成大豆基因L的向导DNA序列），酶切情况如图所示：
3.逻辑推理[第（2）小题]
4.概念模型的构建与运用及演绎推理[第（3）小题]
由图可知，抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，根据分离定律，其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，因此，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案与评分标准】
（1）低（1分，唯一答案） 256（或44或28，共2分） GTTT（1分） CAAT（1分）（后两空顺序可调，答案中多写5'或3'不扣分）（2）Kan/卡那霉素（2分，不能写卡那霉素抗性基因或Kanr） SacⅠ（2分，SacⅠ不区分大小写，Ⅰ写成罗马数字和普通1都给分） ④（1分，不带圈也给分）
（3）1/4（给分答案：四分之一、25％、0.25、1∶4，共2分）
【类题演练】
一、阐释与推理类
1.（2025·黑吉辽蒙高考25题节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
可从 中查询基因N的编码序列，设计特定引物。如图所示，a链为转录模板链，为保证基因N与质粒pYL正确连接，需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性酶切后，利用 连接DNA片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
2.（2025·陕晋青宁高考21题节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
限制酶 识别序列及切割位点
Bgl Ⅱ 5'-A↓GATC T-3' 3'-TCTAG↑A-5'
Nde Ⅰ 5'-CA↓TA TG-3' 3'-GTAT↑AC-5'
Xho Ⅰ 5'-C↓TCGA G-3' 3'-GAGCT↑C-5'
EcoR Ⅰ 5'-G↓AATT C-3' 3'-C TTAA↑ G-5'
BamH Ⅰ 5'-G↓GATC C-3' 3'-CCTAG↑G-5'
Sal Ⅰ 5'-G↓TCGA C-3' 3'-CAGCT↑G-5'
Xba Ⅰ 5'-T↓CTAG A-3' 3'-AGATC↑T-5'
PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、 、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。
3.（2025·河南高考21题节选）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题：
（1）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是
。
限制酶的识别序列和切割位点如下：
（2）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，目的是
，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
二、实验探究类
4.（2025·新课标卷34题节选）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如图所示，→表示引物5'→3'方向）。回答下列问题：
（1）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：
；
②无扩增产物，原因是 ；
③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是 。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 Px 无 P0 Px
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
（2）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期结果
。
大题突破（五） 基因工程类
类题演练
一、阐释与推理类
1.提示：序列数据库 Xho Ⅰ Xba Ⅰ DNA连接酶
2.提示：dNTP（或4种脱氧核苷酸） 延伸
3.提示：（1）Bam HⅠ 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列 （2）使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 卡拉胶 四环素
二、实验探究类
4.提示：（1）作为对照（或答：鉴定反应体系是否有模板污染） P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 （2）提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生成。有产物生成，则证明酶X有活性
4 / 5(共56张PPT)
大题突破（五） 基因工程类
【典例示范】
（12分）（2024·山东高考25题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号
途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐
碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA
序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性结合
基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相
关结果等如图所示。
图甲：载体信息
LB/RB：T-DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr：氨苄青霉
素抗性基因
图乙：目标基因L部分序列
图丙：限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
（1）用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越
短，引物特异性越 （填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双
链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用Bsa Ⅰ酶切大豆基因组DNA，
理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示，经Bsa Ⅰ
酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -
3'。
LB/RB：T-DNA的边界序列；Kanr：卡那霉素抗性基因；Ampr：氨苄青霉
素抗性基因
（2）重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素 筛选到具
有该抗生素抗性的植株①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性
植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，部分序列信息及可选用的
酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图
可判断选用的限制酶是 ，其中纯合的突变植株是 （填序
号）。
（3）实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗
性，检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这
个植株的自交子代，其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例
为 ，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【命题立意】
本题以“利用基因工程技术编辑基因L，培育耐盐碱大豆品系”的科学实
验和探究为情境，从基础性、综合性、应用性考查基因工程与遗传的基本
规律的基础知识、基本方法和基本技能，侧重对理解能力、实验探究能
力、解决问题能力的考查。
【解题思路】
1. 信息获取与处理——明确向导DNA序列和目标序列的作用
2. 数学模型的构建与运用[第（1）小题]
若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA，
图中给出的只是载体信息，大豆
基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaⅠ切割产生的黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序。根据图甲所示的载体信息，在载体的碱基序列上有两个酶切位点，经BsaⅠ酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'—GTTT—3'和5'—CAAT—3'（注意是载体上保留的黏性末端序列，也就是靠近LB和RB边界的保留，中间切下来的那段换成大豆基因L的向导DNA序列），酶切情况如图所示：
3. 逻辑推理[第（2）小题]
4. 概念模型的构建与运用及演绎推理[第（3）小题]
由图可知，抗生素抗性基因在
T-DNA片段上，因此如果用抗生
素来筛选该植株进行自交，根据
分离定律，其配子中含有抗生素
抗性基因的比例为1/2，不含T-
DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2＝1/4，因此，突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【答案与评分标准】
（1）低（1分，唯一答案） 256（或44或28，共2分） GTTT（1分）
CAAT（1分）（后两空顺序可调，答案中多写5'或3'不扣分）
（2）Kan/卡那霉素（2分，不能写卡那霉素抗性基因或Kanr） SacⅠ（2
分，SacⅠ不区分大小写，Ⅰ写成罗马数字和普通1都给分） ④（1分，不带
圈也给分）
（3）1/4（给分答案：四分之一、25％、0.25、1∶4，共2分）
【类题演练】
一、阐释与推理类
1. （2025·黑吉辽蒙高考25题节选）香树脂醇具有抗炎等功效，从植物中
提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N，可
高效生产香树脂醇。回答下列问题。
可从 中查询基因N的编
码序列，设计特定引物。如图所示，a
链为转录模板链，为保证基因N与质粒
pYL正确连接，需在引物1和引物2的5‘
端分别引入 和 限制
酶识别序列。PCR扩增基因N，特异性
酶切后，利用 连接DNA
片段，构建重组质粒，大小约9.5 kb
（kb为千碱基对），假设构建重组质粒前后，质粒pYL对应部分大小基本不变。
序列数据库
Xho Ⅰ
Xba Ⅰ
DNA连接酶
2. （2025·陕晋青宁高考21题节选）马铃薯作为重要农作物，提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现，野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关，将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
限制酶 识别序列及切割位点
Bgl Ⅱ 5'-A↓GATC T-3'
3'-T CTAG↑ A-5'
Nde Ⅰ 5'-CA↓TA TG-3'
3'-GT AT↑AC-5'
Xho Ⅰ 5'-C↓TCGA G-3'
3'-G AGCT↑C-5'
EcoR Ⅰ 5'-G↓AATT C-3'
3'-C TTAA↑G-5'
限制酶 识别序列及切割位点
BamH Ⅰ 5'-G↓GATC C-3'
3'-C CTAG↑ G-5'
Sal Ⅰ 5'-G↓TCGA C-3'
3'-C AGCT↑ G-5'
Xba Ⅰ 5'-T↓CTAG A-3'
3'-A GATC↑ T-5'
PCR扩增目的基因时，需要模板DNA、引物、
、含Mg2＋的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR
的 步骤中起作用。
dNTP（或4种脱氧核苷
酸）
延伸
3. （2025·河南高考21题节选）卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子
多糖，可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究
小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶（CG）的菌种用于生产卡拉胶寡糖。
回答下列问题：
（1）为构建携带cg（CG的编码基因）的大肠杆菌表达载体（下图1），对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E. coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位
点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上
述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建
表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是
。
Bam HⅠ
重组质粒连接处的序列不再
是原来的限制酶识别序列
限制酶的识别序列和切割位点如下：
（2）为将构建好的表达载体转入大肠杆菌，需要先用Ca2＋处理大肠杆菌
细胞，目的是
，随后在含 和 的培养基中培养一段时间后，根
据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状
态
卡拉胶
四环素
二、实验探究类
4. （2025·新课标卷34题节选）为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶
X的基因（目的基因）插入质粒P0，构建重组质粒Px，并转入大肠杆菌。
该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功（引物1～4结合位置如
图所示，→表示引物5'→3'方向）。回答下列问题：
（1）该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作
用是： ；
②无扩增产物，原因是 ；
③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是
。
作为对照（或答：鉴定反应体系是否有模板污染）
P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列
目的基因、质粒片
段、含目的基因和部分质粒序列的片段
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 Px 无 P0 Px
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
（2）设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性，简要写出实验思路和预期
结果
。
提取酶X，催化相应底物（反应物）的反应，检测是否有产物生
成。有产物生成，则证明酶X有活性
跟踪检测·巩固中提升
>
<
1. 某实验室采用转基因技术构建表达葡聚糖酶基因（GluZ）的工程酵母
菌，赋予了该酵母菌降解啤酒中葡聚糖的能力。MFa是酵母菌特有的信号
肽基因，具有引导核糖体转移至内质网的作用，为了使GluZ表达出分泌型
蛋白，将其与MFa连接形成融合基因。回答下列问题：
1
2
3
4
（1）基因工程的核心步骤是 。
质粒上的启动子是 酶识别和结合的位点，功能是驱动基因
的 过程，并最终表达我们需要的蛋白质。
构建基因表达载体
RNA聚合
转录
1
2
3
4
解析：基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建；启动子是一段有特殊序列的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA。
1
2
3
4
（2）为使MFa与GluZ连接形成融合基因，结合图3分析，引物R1与引物F2
的5'端都引入了 的酶切序列。为使融合基因与质粒正确连接，在
利用PCR技术扩增融合基因的过程中，应在引物F1和R2的5'端引入的碱基序
列分别是 。
NotⅠ
5'—GCTAGC—3'、5'—GGTACC—3'
1
2
3
4
解析：由图3可知，MFa与GluZ通过NotⅠ连接形成融合基因，因此需要在引物R1与引物F2的5'端都引入NotⅠ的酶切序列；由图1可知，为使融合基因能按正确的方向插入质粒上的启动子与终止子之间，需要在融合基因的MFa基因侧引入NdeⅠ限制酶的识别序列，在GluZ基因侧引入KPnⅠ限制酶的识别序列，结合图2分析可得，在利用PCR技术扩增融合基因的过程中，应在引物F1和R2的5'端引入的碱基序列分别是5'—GCTAGC—3'和5'—
GGTACC—3'。
1
2
3
4
（3）将构建的重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，发现只有信号肽的
氨基酸序列（转录、翻译过程正确），请结合图3分析原因可能是
。
MFa
基因编码链中存在TAG，转录后会形成终止密码子UAG，使翻译到此结
束
1
2
3
4
解析：将融合基因和质粒分别酶切、连接后得到的重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检测发现融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的蛋白质中却只有信号肽的氨基酸序列，分析图3融合基因编码链的序列，发现在MFa基因编码链中对应的最后三个碱基是5'—TAG—3'，其模板链对应碱基为3'—ATC—5'，通过转录获得mRNA上碱基序列为5'—UAG—3'，属于终止密码子，会使翻译至此时终止，故翻译产物中只有信号肽的氨基酸序列。
1
2
3
4
（4）科研人员对（3）中的问题进行修正后，GluZ表达仍有异常，请继续
结合图3分析原因可能是：
。
GluZ基因编码链的第一个碱基与NotⅠ识别序
列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导致mRNA的密码子被错位读取
1
2
3
4
解析：科研人员对（3）中的问题进行修正后，即删除MFa编码序列的最后三个碱基，然后重新构建了重组质粒，将重组质粒导入酵母菌细胞中进行表达，检测发现融合基因转录、翻译出的融合蛋白质中信号肽的氨基酸序列正确，而GluZ对应的氨基酸序列却与葡聚糖酶不同，分析图3可知GluZ基因编码链的第一个碱基与NotⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个
基酸，从而导致mRNA的密码子被错位读取，使GluZ表达仍有异常。
1
2
3
4
2. 东北酸菜是白菜经腌制而成的传统食品。发酵过程中若霉菌等微生物大
量繁殖会导致酸菜腐败发臭。研究人员从酸菜中分离出具有抑菌活性的乳
酸菌，该类乳酸菌因能分泌新型细菌素（多肽）而具有抑菌活性。为获得
细菌素表达量更高的工程菌用于生产，进行了相关研究。回答下列问题。
1
2
3
4
（1）乳酸菌产生的乳酸能溶解碳酸钙而产生溶钙圈。研究人员为从市售
多个品牌的酸菜中分离纯化乳酸菌，配制含有碳酸钙的固体培养基，利
用 法对该培养基进行灭菌，并采用
法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进
行纯培养，选择对霉菌抑菌率高的菌株进行后续操作。
高压蒸汽灭菌
平板划线（或稀释
涂布平板）
解析：常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。分离微生物常用的接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，即可采用稀释涂布平板法和平板划线法将酸菜液接种到培养基中，选择有溶钙圈的菌落并继续进行纯培养。
1
2
3
4
（2）研究人员从上述乳酸菌中提取细菌素基因，将其导入受体菌，再对
受体菌做进一步的检测与鉴定。如图是细菌素基因及构建的基因表达载体
的示意图。
①利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是
，PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是 。
引物2和引物
3
30
1
2
3
4
②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，为构建基因表达载体，应在与甲
链结合的引物的5'端加入 （填“BamHⅠ”或“NdeⅠ”）的识别
序列。
③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对
扩增产物进行电泳检测，结果如图。电泳结果表明
。
BamHⅠ
目的基因已成功导入
受体细胞
1
2
3
4
解析：①PCR过程需要两种引物，能分别与目的基因两条链的3'端通过碱基互补配对结合，图中连接羟基的是3'端，因此利用PCR技术扩增细菌素基因时，应选择的一对引物是引物2和引物3。引物作用使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。每一条子链的形成都需要引物，故PCR过程中，经过4轮循环，消耗引物的个数是2×24－2＝30。②若以细菌素基因甲链为转录的模板链，图中细菌素基因转录方向为从右往左，即启动子位于右端，终止子位于左端，与甲链结合的引物为引物2，即在引物2的5'端加入BamHⅠ的识别序列。③转化操作后提取受体细胞中的DNA，并利用选择的引物进行扩增，再对扩增产物进行电泳检测，结果如图，通过比对可以看出只在受体菌中提取出来扩增产物DNA，这说明受体菌中含有目的基因，即目的基因已经成功导入受体细胞。
1
2
3
4
3. （2025·广东潮州模拟）微生物
修复技术已成为当前石油污染土壤
修复技术领域的研究热点，但石油
污染土壤中氮元素限制直接影响了
微生物的修复效果，土壤固氮菌的
出现可以解决这一问题。土壤固氮
菌在没有化合态氮（主要是铵）时可以进行固氮作用，不过土壤固氮菌对氧高度敏感，其产生的固氮酶在有氧条件下容易发生不可逆的失活。土壤固氮菌中部分固氮相关的基因结构及功能如图所示。请回答下列问题：
1
2
3
4
（1）从石油污染土壤中分离土壤固氮菌，可采用
（填方法）接种、培养并进行计数。使用的培养基中不需要有机氮源，原
因是 。
解析：可采用稀释涂布平板法、平板划线法进行接种、培养后筛选出目标菌，若用于目标菌的计数，则宜采用稀释涂布平板法。从石油污染土壤中分离土壤固氮菌，可使用选择培养基，因土壤固氮菌能利用空气中的氮气作为氮源，故该培养基中不需要有机氮源。
稀释涂布平板法
土壤固氮菌能利用空气中的氮气作为氮源
1
2
3
4
（2）启动子位于固氮酶结构基因的上游，其功能是
。研究表明，nifA基因的表达产物对固氮基
因σ54依赖型启动子的表达是必需的，而有铵时nifL基因会被激活，此时土
壤固氮菌的固氮过程将停止，原因是
。
解析：启动子指的是位于基因首端的能被RNA聚合酶识别与结合的核酸序列，其驱动基因的转录。nifA基因的表达产物对固氮基因σ54依赖型启动子的表达是必需的，铵的存在会激活nifL基因，nifL的表达产物使nifA表达产物丧失活性，此时土壤固氮菌的固氮过程将停止。
RNA聚合酶识别和
结合的部位，驱动基因转录
nifL的表达产物会使nifA表达产物
丧失活性，而nifA的表达产物对固氮基因σ54依赖型启动子的表达是必须
的
1
2
3
4
（3）为提高土壤固氮菌的固氮效率，某科研团队准备通过基因工程和蛋
白质工程两个方向分别对土壤固氮菌进行改造，假如你是科研团队的一
员，请选择一个方向简述你对土壤固氮菌的改造思路。
答案：基因工程方向：获取与改造能提高固氮效率的目的基因，构建基因
表达载体，将表达载体导入土壤固氮菌细胞中并使其高效表达；蛋白质工
程方向：分析高效固氮酶的结构与氨基酸序列，推测其基因的核苷酸序
列，合成或改造相关基因，导入到土壤固氮菌中表达产生相关固氮酶。
1
2
3
4
解析：基因工程的基本操作包括获取目的基因、构建表达载体、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定四个阶段，据此可设计通过基因工程改造土壤固氮菌，其思路为：获取与改造能提高固氮效率的目的基因，构建基因表达载体，将表达载体导入土壤固氮菌细胞中并使其高效表达；由蛋白质工程基本原理与操作过程可知，可通过蛋白质工程对土壤固氮菌进行改造，其思路是：分析高效固氮酶的结构与氨基酸序列，推测其基因的核苷酸序列，合成或改造相关基因，导入到土壤固氮菌中表达产生相关固氮酶。
1
2
3
4
4. OsCYP2基因已被证实为水稻耐盐碱关键基因。科研人员通过克隆
OsCYP2基因，构建OsCYP2基因表达载体，并将其转化到烟草中，探讨
OsCYP2基因对烟草耐盐碱能力大小的影响。回答下列问题：
注：Bar基因为抗草甘膦（一种除草剂）基因
甲
1
2
3
4
（1）构建OsCYP2基因表达载体时所用Ti质粒结构如图甲所示，在构
建重组质粒时要将OsCYP2基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，当农杆
菌侵染烟草细胞时，OsCYP2基因能随T-DNA整合到烟草细胞的
上。
染色
体DNA
注：Bar基因为抗草甘膦（一种除草剂）基因
甲
1
2
3
4
解析：Ti质粒的T-DNA中可以将目的基因导入受体细胞的染色体DNA上，故在构建重组质粒时要将OsCYP2基因插入农杆菌Ti质粒的T-DNA中，当农杆菌侵染烟草细胞时，OsCYP2基因能随T-DNA整合到烟草细胞的染色体DNA上。
1
2
3
4
（2）OsCYP2基因两端碱基序列如图乙所示，为了让OsCYP2基因和Ti质粒
正确连接，利用PCR技术扩增OsCYP2基因时需要设计一对引物，这对引物
的序列分别为
（从引物5'端开始书写，只写前12个碱基即可）。
5'—AGATCTATGTCT—3' 5'—GCTAGCCTAGGA—3'
1
2
3
4
解析：应将目的基因导入启动子和终止子之间，且为避免反向连接和自身环化，应选择两种限制酶进行切割，据图可知，应选择启动子2与终止子之间的限制酶，故应选择的是BglⅡ和NheⅠ，再结合图乙的转录方向及碱基序列可知，利用PCR技术扩增OsCYP2基因时需要设计一对引物，该对引物需要与模板的3'端结合，且需要在首端加上上述两种酶的碱基序
列，故最终为5'—AGATCTATGTCT—3'和 5'—GCTAGCCTAGGA—3'。
1
2
3
4
（3）科研人员将OsCYP2基因导入烟草细胞（烟草细胞无该基因），然后
利用植物组织培养技术将含目的基因的受体细胞培养为转基因植株，利用
反转录PCR技术等检测OsCYP2基因是否转录，其大致步骤为：提取转基因
植株的RNA→ →利用PCR技术进行扩增
→对扩增产物进行电泳分析。在构建PCR反应体系时需加入的物质有模板
DNA、引物、缓冲液、
等（答出两种）。
将提取的RNA反转录为cDNA
热稳定DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）、四种脱
氧核苷酸（dNTP）、Mg2＋
1
2
3
4
解析：逆转录是以RNA为模板合成DNA的过程，利用逆转录PCR技术等检测OsCYP2基因是否转录，其大致步骤为：提取转基因植株的RNA→将提取的RNA逆转录为cDNA→利用PCR技术进行扩增→对扩增产物进行电泳分析；PCR是一项体外扩增DNA的技术，在构建PCR反应体系时需加入的物质有模板DNA、引物、缓冲液、热稳定DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶）、四种脱氧核苷酸（dNTP）、Mg2＋等。
1
2
3
4
（4）科研人员选择上述扩增产物出现特异性扩增条带（呈阳性）的转基
因植株，在个体生物学水平检测“转OsCYP2基因烟草的耐盐碱性是否明显
提高”，请写出实验的大致思路
。
将等量、长势相同的转OsCYP2基因烟草
和非转基因烟草分为甲、乙两组，用一定浓度NaCl溶液＋完全营养液进行
水培，在其他条件相同且适宜条件下培养一段时间，观察并记录两组烟草
的生长状况
1
2
3
4
解析：在个体生物学水平检测“转OsCYP2基因烟草的耐盐碱性是否明显提高”，需要将转基因植物与非转基因植物进行比较，实验设计应遵循对照与单一变量原则，故可设计实验如下：将等量、长势相同的转OsCYP2基因烟草和非转基因烟草分为甲、乙两组，用一定浓度NaCl溶液＋完全营养液进行水培，在其他条件相同且适宜条件下培养一段时间，观察并记录两组烟草的生长状况。
1
2
3
4
（5）科研人员在研究转OsCYP2基因烟草的遗传稳定性时，发现有少部分
阳性植株的遗传不符合孟德尔遗传规律，这可能是因为基因插入的
和数目是随机的，导致目的基因在转基因植株中的遗
传变得复杂。此外，科研人员还发现OsCYP2基因在部分阳性植株中的表达
水平低下，这影响了转基因植株从实验室走向农业生产应用，请分析可能
的原因有
（答出一点即可）。
位点
（或位置或部位）
①OsCYP2基因插入的位置不合适会阻碍基因转录过程，导致基
因表达水平低下；②OsCYP2基因发生甲基化等表观遗传修饰，影响
OsCYP2基因的表达；③细胞内可能存在与OsCYP2基因转录产生的mRNA
互补的小RNA分子，抑制mRNA的翻译过程，使基因表达水平低下；④温
度、光照等环境因素可能参与调节植物的基因表达，影响OsCYP2基因表
达
1
2
3
4
解析：基因工程过程中，基因插入的位置和数目是随机的，故有少部分阳性植株的遗传不符合孟德尔遗传规律；基因的表达包括转录和翻译过程，科研人员还发现OsCYP2基因在部分阳性植株中的表达水平低下，可能的原因有：①OsCYP2基因插入的位置不合适会阻碍基因转录过程，导致基因表达水平低下；②OsCYP2基因发生甲基化等表观遗传修饰，影响OsCYP2基因的表达；③细胞内可能存在与OsCYP2基因转录产生的mRNA互补的小RNA分子，抑制mRNA的翻译过程，使基因表达水平低下；④温度、光照等环境因素可能参与调节植物的基因表达，影响OsCYP2基因表达。
1
2
3
4
THANKS
感谢您的观看
