(共94张PPT)
专题提优
专题8 生物技术与工程
小专题3 基因工程
1．(多选)(☆2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 ，下列相关叙述正确的有 ( )
考向
1
基因工程操作与应用
BD
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
解析：由图示可知，基因A突变为a发生了碱基替换(T//A→G//C)，A错误；Hind Ⅲ切割产生黏性末端，AluⅠ切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；a基因有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后会产生1个约600 bp的片段，有3个AluⅠ切割位点，切割后会产生1个200 bp左右、1个400 bp左右的片段，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点数不同，产生的片段大小不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。
2．(2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：
图1
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是_________________。
(2)步骤②转化时，科研人员常用____________处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有____________的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是
______________。
EcoRⅠ、HindⅢ
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与__________结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是______(从图2的“A～D”中选填)。
图2
CaCl2
卡那霉素
S－F和P－R
启动子
C
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。
图3
①20 ℃时，加入NaCl后实验
结果是____________________
__________________________
_________________________。
SOD－ELP50组纯化蛋
白数量更多(或SOD－ELP50溶
液的蛋白质质量比SOD组高)
②100 ℃时，导致各组中所有
蛋白都沉淀的原因是
__________________。
③据图分析，融合表达SOD－
ELP50蛋白的优点有___________
____________________________
____________________________
__________。
高温使蛋白变性
低温下添
加NaCl有利于SOD蛋白纯化，
杂蛋白较少，有利于酶活性
的保持
图3
解析：(1)目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET－SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、HindⅢ。(2)将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET－SOD－ELP50重组质粒后，同时含有SOD和ELP50基因，结合图示可知，选引物S－F和P－R可特异性对SOD和ELP50进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，SOD和ELP50片段分别为462 bp和750 bp，转录出的mRNA有(462＋750)÷3＝404个密码子，则对应404个氨基酸，其脱水缩合形成的蛋白质相对分子质量约为404×0.11＝44.44 kDa，电泳后应该为条带C。
3．(☆2025·江苏卷)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有____________________________。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有________________________________。
川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺______________________获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成____________关系。
考向
2
DNA粗提取、PCR与电泳技术
种间关系(捕食)和种内关系
物理信息、化学信息、行为信息
(食物和空间等)资源
互利共生
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取①__________，加入乙醇
②_____________ 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③__________________________________________、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
上清液
溶解DNA
耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸(dNTP)
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基____________。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是______。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有__________。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用______________的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
互补配对
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基；“……”表示省略200个碱基。
丁
丙和丁
染色体DNA
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有______(填字母)。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
ab
解析：(1)捕食者与川金丝猴是种间关系，川金丝猴和同种个体之间是种内关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。(3)释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，溶解DNA→扩增DNA：需要将4种dNTP、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入反应管中，进行PCR。
(4)扩增的前提是引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基互补配对。因为植物甲、乙、丙的DNA长度一样，所以根据电泳条带分析能检出的样本是植物丁。图中的3种序列，因为甲、乙序列相同而无法区分，则可确定川金丝猴摄食的植物有丙、丁。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用染色体基因(细胞核基因)中保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。(5)建立川金丝猴生态廊道，可促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a可行；保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，提高其环境容纳量，能够保护川金丝猴，b可行；川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法调查种群密度，c不可行；保护川金丝猴主要依赖就地保护，d不可行。
4．(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有_____ _______，扩增程序中最主要的不同是____________。
图1
模板、
引物
退火温度
(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用_______。
A．－ATGGTG…CAACCA－ B．－TGGTTG…CACCAT－
C．－GACGAG…CTGCAG－ D．－CTGCAG…CTCGTC－
CD
EGFP基因序列：
5′－ATGGTGAGCAAGGGC…GACGAGCTGTACAAG 3′
AnB1基因序列：
5′ CATGTCCAGCTGCAG…CCAAAACCACAACCA 3′ＫＫ
图2
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有_______________________。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有__________。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
限制酶、DNA连接酶
ABC
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有___________。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是__________________ __________________________。
图3
P3、P4
电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列
解析：(1)PCR反应进行的条件包括引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)等。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)和引物。PCR过程包括变性、复性(退火)和延伸三个阶段，通过温度的变化进行控制，由于引物和模板存在差异，扩增程序中最主要的不同是退火温度。(2)据图分析可知，PCR扩增片段F1与片段F2后，需要通过重叠延伸的方式构建融合基因。引物F2－F的部分序列与引物F1－R的部分序列可互补，且引物F2－F的部分序列与F1片段(EGFP)靠近右侧(3′端)的序列一致；引物F1－R的部分序列与F2片段(AnB1)靠近左侧(5′端)的序列互补配对，因此引物F2－F和引物F1－R的序列分别与C和D对应。
(3)传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒，使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下发生同源重组形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。(4)采用含有抗生素的培养基筛选，利用稀释涂布平板法接种，可能形成的菌落数较少，不在30～300的范围内，A错误；抗性平板上未长出菌落的原因可能是重组质粒未能成功导入大肠杆菌，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。
(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，P1、P2的扩增产物电泳结果符合，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，但无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
重难整合
提升
1
基因工程的工具和程序
1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和解旋酶的比较
种类) (限制酶(限制性内切核酸酶) DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
种类) (限制酶(限制性内切核酸酶) DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用特点 切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 只能将单个脱氧核苷酸添加到已有的核苷酸链上，形成新的磷酸二酯键 将DNA两条链之间的氢键打开
作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子
2．基因工程核心步骤——构建表达载体的几个要点
(1)限制酶的选择
甲
乙
①首先应能切割出目的基因且不会破坏目的基因，如图甲可选择PstⅠ、EcoRⅠ(切割位点位于目的基因两端)，而不能选择SmaⅠ(切割位点在目的基因内部)。
②切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致(1种或2种限制酶)，或切割后能产生相同的末端。而为了避免自身连接，且确保目的基因与载体的正向连接，往往用两种限制酶切割质粒和目的基因。
③基因表达载体必须具备启动子、终止子、标记基因和复制原点等，所以选择的限制酶也不能破坏这些结构(图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因，则不能选用)。若质粒具有两个或多个标记基因时，要保证重组的质粒至少有一个标记基因。
(2)构建载体时，要确保目的基因插入启动子与终止子之间。另外，当需要目的基因在特定细胞中表达时，需要换成特定的启动子，如目的基因要在乳腺细胞中表达时，启动子要换成乳腺蛋白基因的启动子。
基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，而起始密码子在mRNA上；终止子位于目的基因的尾端，使转录在所需要的地方停止，而终止密码子在mRNA上。
┃易错提醒┃
提升
2
PCR技术原理和过程
1．条件及作用
条件 作用
缓冲液 提供相对稳定的pH环境
4种dNTP(脱氧核苷三磷酸) 作为合成DNA子链的原料，同时提供能量
DNA 作为DNA复制的模板
耐高温DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 催化合成DNA子链(耐高温)
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链
2．过程
变性 超过90 ℃，使DNA双链解开
复性(退火) 50 ℃左右，使解链的两条DNA单链分别与相应的引物结合
延伸 72 ℃左右，耐高温的DNA聚合酶催化子链合成
(1)PCR循环过程与温度的关系
①G—C碱基对间有3个氢键，A—T碱基对间只有2个氢键。变性和复性(退火)的温度都与目的基因中G＋C的含量有关。比如，引物中G＋C含量较高，则退火温度就较高。
②延伸的温度不能太高，以防止新合成的子链 DNA与母链 DNA解聚为单链；温度也不能太低，是为了保证Taq酶的活性。
(2)对时间的要求
①变性和延伸时间的长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，变性/延伸的时间就越长。
②复性时间的长短与引物的长短有关，引物越长，复性的时间就越长。
┃拓展延伸┃
3．相关数据
项目 n轮循环
DNA分子数 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 2n－2
共消耗的引物数量 2n+1－2
两端等长的DNA分子数 2n－2n
注：一般PCR第3次循环后，才会出现两端等长的目的基因片段。
提升
3
引物的选择与设计
1．引物的概念
引物是一小段寡核苷酸片段，它能与DNA母链的一段碱基互补配对(引物的5′端能与模板链的3′端通过碱基互补配对结合)，常见引物长度为18～30 bp。
2．引物存在的必要性(引物的作用)
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。而引物结合到目标DNA后，可以使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。细胞内DNA复制以RNA作引物，PCR反应以DNA作引物。
3．引物的设计原则
(1)引物的4种碱基分布尽可能均匀，一般使G＋C含量为40%～60%。
(2)引物的5′端决定了扩增产物的5′端位置，3′端必须与扩增DNA严格互补。
(3)①引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，特别是避免3′端的互补重叠，否则会形成引物二聚体；②引物内部应避免多对碱基互补形成发夹结构(即引物内部也不能有互补序列)；③引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其他序列也不能存在6个以上碱基的同源序列，以免引物与其他位点结合，导致非特异性扩增；④引物3′端应避免碱基堆积，即避免连续的3个或更多的G、C或A、T；⑤引物3′端终止位置是PCR扩增的起始位置，因此应尽量选择在模板区的G、C含量较高的位置。
(4)引物不能太短。长度应大于16个核苷酸，防止引物与待扩增靶DNA的其他序列发生错误结合，导致非特异性扩增。
(5)引物与靶序列间的解链温度(Tm)不应过低；引物越长，G＋C比例越高，退火温度越高。
4．引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，但可在5′端进行修饰而不影响扩增特异性。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，这样可保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。另外，还要加上启动子(或终止子)序列(见下图)。
正向引物结构图
反向引物结构图
5．引物的选择和互补链的判断
(1)DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5′端的碱基与DNA母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物的5′端向3′端延伸。可利用这一特点判断引物及引物的互补链。
(2)下图中，扩增目的基因用引物②③，扩增目的基因两侧的序列用引物①④，检测目的基因是否正向插入载体用引物③⑥或②⑦(包含目的基因和左侧或者右侧的序列)。
考能晋级
命题
1
DNA的粗提取与鉴定
(2025·宿迁四模)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是 ( )
A．研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．将实验材料的研磨液倒入离心管中，离心后取沉淀物备用
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．将析出的丝状物加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热可出现蓝色
A
1
解析：研磨液中的物质有利于DNA溶解，若换为蒸馏水，无法像研磨液那样有效溶解和保护DNA，会使DNA提取效率降低，A正确；DNA溶解在上清液中，故离心后应取上清液备用，B错误；鉴定过程中，在沸水浴条件下，DNA双链会解开，双螺旋结构发生改变，C错误；将析出的丝状物先溶解在2 mol·L－1的NaCl溶液中，再加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热，会出现蓝色，而不能直接将丝状物加入二苯胺试剂，D错误。
命题
2
基因工程的操作工具和程序
(2025·南通四模)为了使酵母菌表达流感病毒抗原蛋白来生产流感疫苗，研究人员通过构建基因表达载体进行相关研究，流程如图1。请回答下列问题：
2
图1
(1)目的DNA片段中，启动子的作用是___________________________________。
(2)过程①除图中物质外还需要_______________________________。下表为相关引物序列，目的DNA片段的编码链(非模板链)碱基序列为5′－TGTG AAATACCG CACA……CGGTTGAGACCG AA－3′，则F2、F3分别是______、_____。
a 5′－ACAACATTTGGTCACACAATCGATATTTAC－3′
b 5′－TTAAGAAAATCCTTGCTTAATTATAAACTATAATG CGAGA－3′
c 5′－AAGCAAGGATGATCTTAATGTGAAATACCGCACAG ATGCGT－3′
d 5′－GACTCTTATGGGAGCTGCATTAGGCACGGTTGAGA CCGAA－3′
e 5′－CGGTTGAGACCGAATAGCGTGAAACTGGGCATTAA CA－3′
f 5′－GGTTACCAGATCTACACCGTTCCCGATTTCA－3′
与RNA聚合酶结合，驱动基因的转录
缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP
c
e
(3)过程②使用__________(限制酶)切割质粒pHC11。图2为甲、乙、丙、丁4条引物在正确重组质粒中的相应位置，可选择引物____________________通过PCR鉴定正确插入目的基因的重组质粒。
(4)过程③将重组质粒导入大肠杆菌，并接种到含______的培养基中进行筛选，过程③的目的是____________。
图2
(5)用BamHⅠ、SalⅠ切割重组质粒来筛选pHC11R，pHC11R被酶切的长度大约是_______________________。将pHC11R和目的DNA片段导入酵母菌后，接种在______________的培养基中培养筛选。
Sal Ⅰ
甲、丙(或乙、丁)
青霉素
扩增质粒
2.2 kb、12.5 kb
不含亮氨酸
(6)与酶切再连法相比，本实验进行细胞内同源重组获得重组酵母的优点有__________。
①重组质粒的构建和转化更加便捷
②重组位点精确，不会引入多余的序列
③去除标记基因防止其在环境中扩散
④表达流感病毒抗原蛋白的量多且纯度更高
①②③
解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合部位，可以驱动基因的转录。(2)过程①图中已经有模板和引物，所以还需要缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP。根据启动子的方向，确定F2结合模板链上，F2靠近3′端的部分序列与非模板链5′端的部分序列应一致，通过比对可知F2的碱基序列是c。同理，F3靠近终止子，其5′端部分序列应与非模板链3′端部分序列一致，则可确定F3是e。(3)因为LEU2两侧的限制酶XhoⅠ、SalⅠ是同尾酶，所以过程②使用SalⅠ切割质粒pHC11后，可以将LEU2与pHC11重组。
(4)重组质粒上含有青霉素抗性基因，所以将大肠杆菌接种到含青霉素的培养基中进行筛选。由④的结果可知，过程③的目的是扩增重组质粒pHC11R。(5)用BamHⅠ、SalⅠ切割重组质粒pHC11R，分别只能切割一次(原先pHC11被SalⅠ切割后形成的末端可以与XhoⅠ切割形成的末端连接起来，但不能再被SalⅠ切割)，所以pHC11R被酶切的长度大约是2.2 kb、12.5 kb。因为受体酵母菌是亮氨酸合成缺陷型，而重组质粒pHC11R上含有亮氨酸合成酶基因，所以将酵母菌接种在不含亮氨酸的培养基中培养筛选。(6)同源重组时，酶切和连接可同时进行，重组位点可以通过同源序列控制，重组过程中可以切除质粒上的青霉素抗性基因。一般情况下，酶切法和同源重组产生的重组质粒在受体细胞中表达量和产物纯度没有太大差别。
命题
3
PCR技术
(多选)(2025·启东中学)人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因(右图)，下列说法正确的有 ( )
A．可通过人工合成获取突变型目的基因
3
B．上述方法可将待突变序列改造成5′－AAGCCC－3′
C．需要在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸
D．通过电泳检测PCR产物，可确定基因是否改造成功
ABC
解析：在基因工程中，可以通过人工合成的方法获取目的基因，包括突变型目的基因，A正确；根据图示，突变引物延伸方向是从5′到3′及突变引物的序列，按照碱基互补配对原则，得到的突变序列应该是5′－AAGCCC－3′，B正确；PCR技术需要在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸，这是PCR技术的基本条件之一，C正确；原基因与改造后的基因大小是相同的，而电泳只能检测PCR产物的大小和数量，应采用测序的办法来确定，D错误。
[反向PCR、引物的选择](2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题：
4
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种__________________________酶，它通过识别特定的______________切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成______________。PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得______________。Taq DNA聚合酶的作用是催化________________________________。
限制性内切核酸(或限制)
核苷酸序列
磷酸二酯键
DNA单链
以DNA为模板的DNA链的延伸
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知
序列
PCR
引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′
②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′
③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′
④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
②④
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是______。
A．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′
B
解析：(3)引物是一小段单链DNA，两个引物5′端的碱基可以分别与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与已知序列左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ 切割得到的，EcoR Ⅰ识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是5′－AATTC，3′端是GAATT－3′。
PCR的几种类型
(1)反转录PCR(RT－PCR)：以mRNA为模板，利用反转录酶获得cDNA(互补DNA)，再以cDNA为模板进行常规PCR扩增。
(2)反向PCR：利用DNA中间的已知序列，扩增已知序列两端的未知序列。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是同向的，从而扩增出未知序列。
┃题后点拨┃
(3)实时PCR：一般用于定量测定。在反应体系中加入带荧光标记的PCR引物，通过荧光监测扩增产物的量。获得反应动力学曲线后推导样品中模板DNA的初始量。
长题演示
8
基因工程的应用
(2025·河北卷改编)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。请回答下列问题：
5
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是______________和________。模板与引物在PCR反应的________阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为_______________ ________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(2)PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会导致_______________ _____，最终会导致反应效率降低。退火温度过高，则会因_____________________ _____，导致目标产物的量________。
脱氧核苷酸
引物
复性
PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(超过90 ℃使双链DNA解旋为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行
双链不能充分解开
引物不能与模板充分配对
减少
(3)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加___________________(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成____________键。
图1
Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ
磷酸二酯
(4)构建的融合表达载体，除了上述的____________________________4种基因编码序列，其组成还应包括启动子、____________________和复制原点。
(5)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为________________________，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁的镉离子含量比野生型衣藻细胞壁的______，则表明融合蛋白能结合镉离子。
SP7、CADR、GP1、YFP
终止子、标记基因
细胞表面发出黄色荧光
高
(6)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 d后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是_____________________________ ___________________________________________。
图2
240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是______________________________________________________________ __________。
注：镉离子对渗透压的影响忽略不计。
转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用
镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用
(7)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是______和______。(填序号)
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖
②衣藻生长速率受镉离子浓度影响
③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质
④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
①
③
解析：在PCR反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在PCR过程中会结合到模板DNA上参与子链合成，也会逐渐减少。观察图1，要避免错误连接，GP1两端应添加Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GP1连接到载体时应该用Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ。融合表达载体中有黄色荧光蛋白YFP的编码序列，其表达后会发出黄色荧光。
热练
一、 单项选择题
1．(2025·常州测试)同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。右图为EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是 ( )
A．BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ属于同尾酶，它们的识别序列相同
B．使用同尾酶构建基因表达载体时，切割位点的选择范围扩大
C．选用两种不同的限制酶切割目的基因，都可以防止目的基因自身环化
D．用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，可被二者重新切开
B
解析：BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，属于同尾酶，A错误；图中BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，故选用两种不同的限制酶切割目的基因，不一定可以防止目的基因自身环化，C错误；用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，碱基序列可能与BamHⅠ识别的序列不同，不能被BamHⅠ重新切开，D错误。
2．(2025·安徽卷)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。
科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是 ( )
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
C
解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；由于仅含卡那霉素，未添加X－gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X－gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)且成功表达目标蛋白，但也可能是虽然导入了重组质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白等，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β－半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β－半乳糖苷酶，分解X－gal形成蓝色菌落，D正确。
3．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是 ( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
解析：酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误。
B
4．(2025·南京、盐城一模)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”“利用PCR扩增DNA片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是 ( )
A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置在4 ℃冰箱中静置，DNA存在于上清液中
B．将丝状物溶于体积分数为95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定
C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量
D．PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致的
B
解析：在该实验中，破碎细胞释放出DNA等物质，经过离心或静置分层后，DNA会溶解在上清液中，A正确；应该将丝状物溶于2 mol·L－1的NaCl溶液，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定，B错误；PCR扩增反应体系中dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)可以为扩增提供原料，同时在形成磷酸二酯键时，dNTP脱去两个磷酸基团，释放的能量可用于子链的合成，C正确；PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强，导致引物与模板结合位点不唯一，扩增出多种不同的DNA片段，D正确。
5．(2025·苏锡常镇一模)关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述正确的是 ( )
A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察
D
解析：配制琼脂糖溶液时，应该用缓冲液而不是无菌水，这样才能维持合适的离子强度和pH等条件，保证电泳效果，A错误；应该是先将琼脂糖加入缓冲液中，在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化，冷却至50～60 ℃时再加入适量的核酸染料，而不是先加染料再加热熔化琼脂糖，B错误；PCR产物和凝胶载样缓冲液混合，而不是和电泳缓冲液混合，然后用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，C错误；待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察，这样可以清晰地观察到DNA条带的位置和情况，D正确。
6．(2025·苏州考前指导)蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是 ( )
A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA
B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化
C．加入预冷的体积分数95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中
D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色
D
解析：在细胞裂解环节充分研磨样本，能破坏细胞结构，使更多DNA释放出来，A正确；因为DNA在水相中，所以转移DNA时需吸取水相溶液，重复抽提步骤可进一步去除杂质，纯化DNA，B正确；DNA不溶于预冷的体积分数为95%的酒精，加入后离心，DNA会沉淀下来，分布于沉淀物中，C正确；提取的DNA复溶后加入二苯胺试剂，需沸水浴并冷却后才会呈现蓝色，D错误。
二、 多项选择题
7．(2025·如东期末)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法错误的有 ( )
A．PCR扩增依据的是DNA分子边解旋边复制的特点
B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
ABC
解析：PCR扩增依据的是DNA分子复制的原理，该过程是先高温变性使双链DNA完全解旋后复制，不需要解旋酶，A、B错误；DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；T－DNA的插入会改变基因的排列顺序，通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置，D正确。
8．(2025·苏州中学)蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度。下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1～4表示DNA上引物可能结合的位置，下列叙述正确的有 ( )
A．若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能
B．若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏2个磷酸二酯键
C．若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置
D．选择图中适宜引物进行PCR扩增，经过5次循环可获得32个等长的蛛丝蛋白基因
AC
解析：大肠杆菌为原核生物，细胞中只有核糖体一种细胞器，没有内质网和高尔基体，无法对蛋白质进行加工，因此蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能，A正确；若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，DNA每条单链上均会破坏2个磷酸二酯键，共会破坏4个磷酸二酯键，B错误；磷酸基团所在的一端为5′端，羟基所在的一端为3′端，DNA合成的方向为5′→3′，因此引物应与两条单链的3′端配对，即图中2、3分别是2种引物结合的位置，C正确；PCR扩增5次，共得到25＝32个DNA片段，其中等长的蛛丝蛋白基因数为25－2×5＝22个，D错误。
9．等位基因特异性PCR(AS－PCR)可用于对已知突变基因进行检测。TaqDNA聚合酶缺少3′，5′外切酶活性，引物3′端的碱基若与该模板形成错配，子链延伸反应就会因3′，5′－磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸。依据待检样本分别设计4条引物，突变位置设计在引物2和引物3的3′端最后一个位置，如图所示。下列相关叙述错误的是 ( )
A．基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带
B．基因A及a经过AS－PCR、电泳鉴定，条带数和长度均相同
C．PCR反应体系中会出现引物2和引物3扩增得到的短片段
D．可通过增加引物3′端碱基错配率以避免出现假阳性的结果
BC
解析：基因型为Aa的样品，含有基因A和基因a，根据图示，以基因A为模板时，用引物1和引物3进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，用引物1和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，以基因a为模板时，用引物1和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，用引物2和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，共4种，其中基因A和基因a用引物1和引物4进行PCR扩增可得到相同的双链等长的条带，所以基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带，A正确，B错误；
由于TaqDNA聚合酶缺少3′，5′外切酶活性，对于基因A，引物2的3′端碱基与模板形成错配，子链延伸反应受阻，对于基因a，引物3的3′端碱基与模板形成错配，子链延伸反应受阻，所以PCR反应体系中不会出现引物2和引物3扩增得到的短片段，C错误；因为引物3′端的碱基若与核酸模板形成错配，链延伸反应就会因3′，5′－磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸，所以增加引物3′端碱基错配率，能使非目标基因的扩增受到抑制，从而避免出现假阳性的结果，D正确。
三、 非选择题
10．(2025·徐州四模)金黄色葡萄球菌(Sa)可引起肺炎等疾病，不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。为验证Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关，进行以下实验。请回答下列问题：
注：Y是可被脱水四环素(不作为抗生素起作用)诱导表达的Sa致死基因。
(1)为获得R基因的上游、下游两个片段，设计了如图所示的两组引物分别进行PCR扩增，在每种引物的_______端应添加相应的限制酶识别序列，其中使用引物组合________________可扩增得到含R基因和上游片段的DNA，使用另一组引物可扩增得到含R基因和下游片段的DNA。对两次PCR的产物均用________________ 进行酶切，回收上、下游片段，与用SacⅡ酶切质粒1所得大片段通过______________酶连接，最终可以获得质粒2。
(2)将质粒2与用一定浓度的_________________处理过的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa混合，一段时间后涂布在含______________________________的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落(S1)。
5′
引物1和引物3
SacⅡ和EcoRⅠ
DNA连接
CaCl2(或Ca2+)
氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)
(3)质粒2与Sa的基因组发生同源重组，可敲除R基因。将S1多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含______________的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含___________的平板上，若无法增殖，则对应菌落(S2)中细菌的R基因可能被敲除。
(4)以S2菌株基因组为模板，分别用引物组合A(引物1＋引物4)、B(引物2＋引物3)、C(引物1＋引物3)、D(引物2＋引物4)进行PCR，再用__________________技术鉴定。若仅扩增出长度为__________的DNA片段，则可确认R基因被敲除，从而证明Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关。
脱水四环素
头孢霉素
琼脂糖凝胶电泳
1.9 kb
解析：(1)限制酶识别序列需加在引物的5′端，否则会影响子链向3′端延伸。要扩增含R基因和上游片段的DNA，需覆盖上游片段与R基因，选引物1和引物3。上游、下游片段含SacⅡ和EcoRⅠ酶切位点，用这两种酶切PCR产物。质粒1经SacⅡ酶切后，与回收片段用DNA连接酶连接构建质粒2。(2)用CaCl2(或Ca2+)处理Sa使其成为感受态细胞，便于吸收质粒2。质粒2含氯霉素抗性基因，将混合菌涂布在含氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)的平板，筛选出含质粒2的Sa(S1)。
(3)Y是脱水四环素诱导的致死基因，要筛选并获得不含质粒2的菌落，需将菌液稀释涂布在含有脱水四环素的平板上，含有质粒2的菌体会因为脱水四环素诱导Y基因表达而死亡，从而达到筛选目的。敲除R基因后Sa对头孢霉素敏感，涂布在含头孢霉素的平板，无法增殖的菌落(S2)可能是R基因被敲除的菌株。(4)PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳分离，依据片段大小鉴定。R基因被敲除后，上游片段(0.7 kb)与下游片段(1.2 kb)连接，扩增出1.9 kb(0.7＋1.2)的DNA片段，可确认R基因被敲除。
11．(2025·如皋期初)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题：
胰岛素基因
(1)由于________________________________，“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。“BCA”法是利用人体______________中的mRNA，再由mRNA经__________得到的胰岛素基因，________________(填“AB”“BCA”或“AB和BCA”)法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
一种氨基酸可能对应多种密码子
胰岛B细胞
逆转录
AB和BCA
(2)如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶____________ __________的识别序列，PCR引物应该添加在识别序列的_______(填“3′”或“5′”)端。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为－CCTTTCAGCTCA－，则其中一种引物设计的序列是5′－___________________________－3′。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，若计划用1个胰岛素基因作模板获得m(m大于2)个胰岛素基因，则消耗的引物总量是__________个。
XhoⅠ和
MunⅠ
3′
CTCGAGCCTTTCAGCTCA
2m－2
(3)PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列叙述错误的有____________。
A．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
B．向凝固的凝胶中加入没过凝胶的电泳缓冲液后，小心拔出梳子
C．将PCR产物与电泳缓冲液混合，用微量移液器缓慢注入加样孔内
D．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
(4)β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。先用________________处理大肠杆菌后，与重组质粒混合培养一段时间，将大肠杆菌接种到添加了______________________的培养基上筛选出________的菌落即为工程菌种。
ABCD
钙离子(CaCl2)
氨苄青霉素和X－gal
白色
解析：(1)AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能对应多种密码子，所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。胰岛素基因存在于所有细胞中，但只在胰岛B细胞中表达，结合题意“BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素”可知，BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA，再由mRNA经逆转录过程得到胰岛素基因，在基因的结构中，启动子在非编码区，是不会被转录和翻译的；结合题干可知，AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素，故由AB法中的“胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列”和BCA法中的“胰岛B细胞中的mRNA”得到的目的基因中均不含人胰岛素基因启动子。
(2)由图可知，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoⅠ和MunⅠ和EcoRⅠ中选择；同时质粒上EcoRⅠ的其中一个作用位点是在标记基因(氨苄青霉素抗性基因)上，所以只能选择XhoⅠ和MunⅠ两种限制酶，则需要在设计PCR引物时添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列。由于DNA复制时，子链的延伸是从引物的3′端开始的，因此引物需要在模板的3′端开始进行碱基互补配对，即PCR引物应该添加在识别序列的3′端。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，若计划用1个胰岛素基因为模板获得m(m大于2)个胰岛素基因，由于子链的延伸都需要从引物的3′端开始，即新合成的子链均带有引物，因此，消耗的引物总量是2m－2个，其中只有原来的模板链上没有引物连接。
(3)PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，A错误；待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内，再将电泳缓冲液加入电泳槽中，B错误；将扩增的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合后，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，C错误；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，只是作为电泳进度的指示分子，D错误。(4)结合图示可知，目的基因的插入位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β－半乳糖苷酶，根据题干信息“β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β－半乳糖苷酶，底物X－gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X－gal的培养基上应选择白色的菌落。小专题3 基 因 工 程
考向1 基因工程操作与应用
1．(多选)(☆2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有( BD )
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
解析：由图示可知，基因A突变为a发生了碱基替换(T//A→G//C)，A错误；Hind Ⅲ切割产生黏性末端，AluⅠ切割后产生的是平末端，二者末端类型不相同，B正确；a基因有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后会产生1个约600 bp的片段，有3个AluⅠ切割位点，切割后会产生1个200 bp左右、1个400 bp左右的片段，C错误；因为正常基因A和致病基因a的HindⅢ切割位点数不同，产生的片段大小不同，所以产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定，D正确。
2．(2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：
图1
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是__EcoRⅠ、HindⅢ__。
(2)步骤②转化时，科研人员常用__CaCl2__处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有__卡那霉素__的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是__S－F和P－R__。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与__启动子__结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是__C__(从图2的“A～D”中选填)。
图2
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。
图3
①20 ℃时，加入NaCl后实验结果是__SOD－ELP50组纯化蛋白数量更多(或SOD－ELP50溶液的蛋白质质量比SOD组高)__。
②100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是__高温使蛋白变性__。
③据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有__低温下添加NaCl有利于SOD蛋白纯化，杂蛋白较少，有利于酶活性的保持__。
解析：(1)目的基因应插入启动子和终止子之间，结合题意可知，ELP50应插入pET－SOD之后，由图可知，限制酶a和限制酶b分别是EcoR Ⅰ、HindⅢ。(2)将目的基因导入细菌时常用CaCl2处理细菌，使其处于感受态。由图可知，重组DNA含有标记基因卡那霉素抗性基因，所以转化后的大肠杆菌采用含有卡那霉素的培养基进行筛选。成功导入pET－SOD－ELP50重组质粒后，同时含有SOD和ELP50基因，结合图示可知，选引物S－F和P－R可特异性对SOD和ELP50进行扩增。(3)RNA聚合酶与启动子结合后，启动转录。由图可知，SOD和ELP50片段分别为462 bp和750 bp，转录出的mRNA有(462＋750)÷3＝404个密码子，则对应404个氨基酸，其脱水缩合形成的蛋白质相对分子质量约为404×0.11＝44.44 kDa，电泳后应该为条带C。
考向2 DNA粗提取、PCR与电泳技术
3．(☆2025·江苏卷)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有__种间关系(捕食)和种内关系__。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有__物理信息、化学信息、行为信息__。
川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺__(食物和空间等)资源__获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成__互利共生__关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取①__上清液__，加入乙醇
②__溶解DNA__ 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③__耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸(dNTP)__、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基__互补配对__。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是__丁__。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有__丙和丁__。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用__染色体DNA__的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基；“……”表示省略200个碱基。
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有__ab__(填字母)。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
解析：(1)捕食者与川金丝猴是种间关系，川金丝猴和同种个体之间是种内关系。生态系统中信息的种类有物理信息、化学信息和行为信息。川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺食物和空间等资源获得更多机会。(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物从川金丝猴胃内获取营养物质，又能为川金丝猴分解纤维素，两者构成互利共生关系。(3)释放DNA：在去杂后的样本中加入裂解液，细胞裂解，内容物释放→析出DNA：DNA呈溶解状态，离心后取上清液，再加入乙醇，DNA不溶于酒精→故在沉淀物中加入纯水，溶解DNA→扩增DNA：需要将4种dNTP、耐高温的DNA聚合酶、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入反应管中，进行PCR。(4)扩增的前提是引物F和R的碱基能与rbcL基因的保守序列的碱基互补配对。因为植物甲、乙、丙的DNA长度一样，所以根据电泳条带分析能检出的样本是植物丁。图中的3种序列，因为甲、乙序列相同而无法区分，则可确定川金丝猴摄食的植物有丙、丁。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用染色体基因(细胞核基因)中保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。(5)建立川金丝猴生态廊道，可促进种群间基因交流，能够保护川金丝猴遗传多样性和物种多样性，a可行；保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物，提高其环境容纳量，能够保护川金丝猴，b可行；川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，不能用标记重捕法调查种群密度，c不可行；保护川金丝猴主要依赖就地保护，d不可行。
4．(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有__模板、引物__，扩增程序中最主要的不同是__退火温度__。
(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用__CD__。
EGFP基因序列：
5′－ATGGTGAGCAAGGGC…GACGAGCTGTACAAG3′
AnB1基因序列：
5′CATGTCCAGCTGCAG…CCAAAACCACAACCA3′
图2
A．－ATGGTG…CAACCA－
B．－TGGTTG…CACCAT－
C．－GACGAG…CTGCAG－
D．－CTGCAG…CTCGTC－
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有__限制酶、DNA连接酶__。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有__ABC__。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有__P3、P4__。
图3
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是__电泳只能测定DNA长度，不能确定碱基序列__。
解析：(1)PCR反应进行的条件包括引物、酶、dNTP、模板和缓冲液(其中需要Mg2+)等。分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有模板(片段F1、片段F2)和引物。PCR过程包括变性、复性(退火)和延伸三个阶段，通过温度的变化进行控制，由于引物和模板存在差异，扩增程序中最主要的不同是退火温度。(2)据图分析可知，PCR扩增片段F1与片段F2后，需要通过重叠延伸的方式构建融合基因。引物F2－F的部分序列与引物F1－R的部分序列可互补，且引物F2－F的部分序列与F1片段(EGFP)靠近右侧(3′端)的序列一致；引物F1－R的部分序列与F2片段(AnB1)靠近左侧(5′端)的序列互补配对，因此引物F2－F和引物F1－R的序列分别与C和D对应。(3)传统重组质粒构建需要使用限制酶切割质粒，使其具有与目的基因相同的黏性末端，之后再用DNA连接酶将目的基因和质粒连接成重组质粒。将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶的作用下发生同源重组形成环化质粒，不需要使用限制酶和DNA连接酶。(4)采用含有抗生素的培养基筛选，利用稀释涂布平板法接种，可能形成的菌落数较少，不在30～300的范围内，A错误；抗性平板上未长出菌落的原因可能是重组质粒未能成功导入大肠杆菌，B错误；转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，一般含有重组质粒的大肠杆菌才能发展为菌落，故不会出现大量杂菌形成的菌落，C错误；稀释涂布平板和平板划线法均为分离纯化细菌的方法，用稀释涂布平板法在抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化，D正确。(5)EGFP为720 bp，AnB1为390 bp，二者的总大小为720＋390＝1 100 bp，用引物F1－F和F2－R进行PCR扩增，P1、P2的扩增产物电泳结果符合，可以舍弃的质粒有P3、P4。(6)琼脂糖凝胶电泳技术仅能用于分析待检测DNA分子的大小，但无法确定待检测DNA分子的碱基序列，因此对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认。
提升1 基因工程的工具和程序
1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和解旋酶的比较
种类) (限制酶(限制性内切核酸酶) DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
作用特点 切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 只能将单个脱氧核苷酸添加到已有的核苷酸链上，形成新的磷酸二酯键 将DNA两条链之间的氢键打开
作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子
2．基因工程核心步骤——构建表达载体的几个要点
(1)限制酶的选择
,甲) ,乙
①首先应能切割出目的基因且不会破坏目的基因，如图甲可选择PstⅠ、EcoRⅠ(切割位点位于目的基因两端)，而不能选择SmaⅠ(切割位点在目的基因内部)。
②切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致(1种或2种限制酶)，或切割后能产生相同的末端。而为了避免自身连接，且确保目的基因与载体的正向连接，往往用两种限制酶切割质粒和目的基因。
③基因表达载体必须具备启动子、终止子、标记基因和复制原点等，所以选择的限制酶也不能破坏这些结构(图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因，则不能选用)。若质粒具有两个或多个标记基因时，要保证重组的质粒至少有一个标记基因。
(2)构建载体时，要确保目的基因插入启动子与终止子之间。另外，当需要目的基因在特定细胞中表达时，需要换成特定的启动子，如目的基因要在乳腺细胞中表达时，启动子要换成乳腺蛋白基因的启动子。
┃ 易错提醒 ┃
基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，而起始密码子在mRNA上；终止子位于目的基因的尾端，使转录在所需要的地方停止，而终止密码子在mRNA上。
提升2 PCR技术原理和过程
1．条件及作用
条件 作用
缓冲液 提供相对稳定的pH环境
4种dNTP(脱氧核苷三磷酸) 作为合成DNA子链的原料，同时提供能量
DNA 作为DNA复制的模板
耐高温DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 催化合成DNA子链(耐高温)
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链
2．过程
变性 超过90 ℃，使DNA双链解开
复性(退火) 50 ℃左右，使解链的两条DNA单链分别与相应的引物结合
延伸 72 ℃左右，耐高温的DNA聚合酶催化子链合成
┃ 拓展延伸 ┃
(1)PCR循环过程与温度的关系
①G—C碱基对间有3个氢键，A—T碱基对间只有2个氢键。变性和复性(退火)的温度都与目的基因中G＋C的含量有关。比如，引物中G＋C含量较高，则退火温度就较高。
②延伸的温度不能太高，以防止新合成的子链 DNA与母链 DNA解聚为单链；温度也不能太低，是为了保证Taq酶的活性。
(2)对时间的要求
①变性和延伸时间的长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，变性/延伸的时间就越长。
②复性时间的长短与引物的长短有关，引物越长，复性的时间就越长。
3．相关数据
项目 n轮循环
DNA分子数 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 2n－2
共消耗的引物数量 2n+1－2
两端等长的DNA分子数 2n－2n
注：一般PCR第3次循环后，才会出现两端等长的目的基因片段。
提升3 引物的选择与设计
1．引物的概念
引物是一小段寡核苷酸片段，它能与DNA母链的一段碱基互补配对(引物的5′端能与模板链的3′端通过碱基互补配对结合)，常见引物长度为18～30 bp。
2．引物存在的必要性(引物的作用)
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。而引物结合到目标DNA后，可以使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。细胞内DNA复制以RNA作引物，PCR反应以DNA作引物。
3．引物的设计原则
(1)引物的4种碱基分布尽可能均匀，一般使G＋C含量为40%～60%。
(2)引物的5′端决定了扩增产物的5′端位置，3′端必须与扩增DNA严格互补。
(3)①引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，特别是避免3′端的互补重叠，否则会形成引物二聚体；②引物内部应避免多对碱基互补形成发夹结构(即引物内部也不能有互补序列)；③引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其他序列也不能存在6个以上碱基的同源序列，以免引物与其他位点结合，导致非特异性扩增；④引物3′端应避免碱基堆积，即避免连续的3个或更多的G、C或A、T；⑤引物3′端终止位置是PCR扩增的起始位置，因此应尽量选择在模板区的G、C含量较高的位置。
(4)引物不能太短。长度应大于16个核苷酸，防止引物与待扩增靶DNA的其他序列发生错误结合，导致非特异性扩增。
(5)引物与靶序列间的解链温度(Tm)不应过低；引物越长，G＋C比例越高，退火温度越高。
4．引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，但可在5′端进行修饰而不影响扩增特异性。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，这样可保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。另外，还要加上启动子(或终止子)序列(见下图)。
正向引物结构图
反向引物结构图
5．引物的选择和互补链的判断
(1)DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5′端的碱基与DNA母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物的5′端向3′端延伸。可利用这一特点判断引物及引物的互补链。
(2)下图中，扩增目的基因用引物②③，扩增目的基因两侧的序列用引物①④，检测目的基因是否正向插入载体用引物③⑥或②⑦(包含目的基因和左侧或者右侧的序列)。
命题1 DNA的粗提取与鉴定
(2025·宿迁四模)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( A )
A．研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．将实验材料的研磨液倒入离心管中，离心后取沉淀物备用
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．将析出的丝状物加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热可出现蓝色
解析：研磨液中的物质有利于DNA溶解，若换为蒸馏水，无法像研磨液那样有效溶解和保护DNA，会使DNA提取效率降低，A正确；DNA溶解在上清液中，故离心后应取上清液备用，B错误；鉴定过程中，在沸水浴条件下，DNA双链会解开，双螺旋结构发生改变，C错误；将析出的丝状物先溶解在2 mol·L－1的NaCl溶液中，再加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热，会出现蓝色，而不能直接将丝状物加入二苯胺试剂，D错误。
命题2 基因工程的操作工具和程序
(2025·南通四模)为了使酵母菌表达流感病毒抗原蛋白来生产流感疫苗，研究人员通过构建基因表达载体进行相关研究，流程如图1。请回答下列问题：
图1
(1)目的DNA片段中，启动子的作用是__与RNA聚合酶结合，驱动基因的转录__。
(2)过程①除图中物质外还需要__)缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP__。下表为相关引物序列，目的DNA片段的编码链(非模板链)碱基序列为5′－TGTG AAATACCGCACA……CGGTTGAGACCG AA－3′，则F2、F3分别是__c__、__e__。
a 5′－ACAACATTTGGTCACACAATCGATATTTAC－3′
b 5′－TTAAGAAAATCCTTGCTTAATTATAAACTATAATG CGAGA－3′
c 5′－AAGCAAGGATGATCTTAATGTGAAATACCGCACAG ATGCGT－3′
d 5′－GACTCTTATGGGAGCTGCATTAGGCACGGTTGAGA CCGAA－3′
e 5′－CGGTTGAGACCGAATAGCGTGAAACTGGGCATTAA CA－3′
f 5′－GGTTACCAGATCTACACCGTTCCCGATTTCA－3′
(3)过程②使用__Sal_Ⅰ__(限制酶)切割质粒pHC11。图2为甲、乙、丙、丁4条引物在正确重组质粒中的相应位置，可选择引物__甲、丙(或乙、丁)__通过PCR鉴定正确插入目的基因的重组质粒。
图2
(4)过程③将重组质粒导入大肠杆菌，并接种到含__青霉素__的培养基中进行筛选，过程③的目的是__扩增质粒__。
(5)用BamHⅠ、SalⅠ切割重组质粒来筛选pHC11R，pHC11R被酶切的长度大约是__2.2_kb、12.5_kb__。将pHC11R和目的DNA片段导入酵母菌后，接种在__不含亮氨酸__的培养基中培养筛选。
(6)与酶切再连法相比，本实验进行细胞内同源重组获得重组酵母的优点有__①②③__。
①重组质粒的构建和转化更加便捷
②重组位点精确，不会引入多余的序列
③去除标记基因防止其在环境中扩散
④表达流感病毒抗原蛋白的量多且纯度更高
解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合部位，可以驱动基因的转录。(2)过程①图中已经有模板和引物，所以还需要缓冲液、TaqDNA聚合酶、dNTP。根据启动子的方向，确定F2结合模板链上，F2靠近3′端的部分序列与非模板链5′端的部分序列应一致，通过比对可知F2的碱基序列是c。同理，F3靠近终止子，其5′端部分序列应与非模板链3′端部分序列一致，则可确定F3是e。(3)因为LEU2两侧的限制酶XhoⅠ、SalⅠ是同尾酶，所以过程②使用SalⅠ切割质粒pHC11后，可以将LEU2与pHC11重组。(4)重组质粒上含有青霉素抗性基因，所以将大肠杆菌接种到含青霉素的培养基中进行筛选。由④的结果可知，过程③的目的是扩增重组质粒pHC11R。(5)用BamHⅠ、SalⅠ切割重组质粒pHC11R，分别只能切割一次(原先pHC11被SalⅠ切割后形成的末端可以与XhoⅠ切割形成的末端连接起来，但不能再被SalⅠ切割)，所以pHC11R被酶切的长度大约是2.2 kb、12.5 kb。因为受体酵母菌是亮氨酸合成缺陷型，而重组质粒pHC11R上含有亮氨酸合成酶基因，所以将酵母菌接种在不含亮氨酸的培养基中培养筛选。(6)同源重组时，酶切和连接可同时进行，重组位点可以通过同源序列控制，重组过程中可以切除质粒上的青霉素抗性基因。一般情况下，酶切法和同源重组产生的重组质粒在受体细胞中表达量和产物纯度没有太大差别。
命题3 PCR技术
(多选)(2025·启东中学)人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因(下图)，下列说法正确的有( ABC )
A．可通过人工合成获取突变型目的基因
B．上述方法可将待突变序列改造成5′－AAGCCC－3′
C．需要在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸
D．通过电泳检测PCR产物，可确定基因是否改造成功
解析：在基因工程中，可以通过人工合成的方法获取目的基因，包括突变型目的基因，A正确；根据图示，突变引物延伸方向是从5′到3′及突变引物的序列，按照碱基互补配对原则，得到的突变序列应该是5′－AAGCCC－3′，B正确；PCR技术需要在耐高温的DNA聚合酶作用下延伸，这是PCR技术的基本条件之一，C正确；原基因与改造后的基因大小是相同的，而电泳只能检测PCR产物的大小和数量，应采用测序的办法来确定，D错误。
[反向PCR、引物的选择](2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种__限制性内切核酸(或限制)__酶，它通过识别特定的__核苷酸序列__切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成__磷酸二酯键__。PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得__DNA单链__。Taq DNA聚合酶的作用是催化__以DNA为模板的DNA链的延伸__。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__②④__(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是__B__。
A．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′
解析：(3)引物是一小段单链DNA，两个引物5′端的碱基可以分别与DNA两条链的3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，子链的延伸方向从5′→3′，据题图分析，结合已知序列可知，能与已知序列左边配对的引物为④，与右边配对的引物为②，故步骤Ⅲ选用的PCR引物应当为②④。(4)对PCR产物测序，得到片段F的完整序列，因为片段F是被限制酶EcoR Ⅰ 切割得到的，EcoR Ⅰ识别的序列是GAATTC，且在G与A之间切割，所以5′端应该是5′－AATTC，3′端是GAATT－3′。
┃ 题后点拨 ┃
PCR的几种类型
(1)反转录PCR(RT－PCR)：以mRNA为模板，利用反转录酶获得cDNA(互补DNA)，再以cDNA为模板进行常规PCR扩增。
(2)反向PCR：利用DNA中间的已知序列，扩增已知序列两端的未知序列。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是同向的，从而扩增出未知序列。
(3)实时PCR：一般用于定量测定。在反应体系中加入带荧光标记的PCR引物，通过荧光监测扩增产物的量。获得反应动力学曲线后推导样品中模板DNA的初始量。
基因工程的应用
(2025·河北卷改编)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。请回答下列问题：
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是__脱氧核苷酸__和__引物__。模板与引物在PCR反应的__复性__阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为__PCR反应需要在高温条件下进行变性步骤(超过90_℃使双链DNA解旋为单链)，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而耐高温的DNA聚合酶能在高温环境中保持活性，保证PCR反应的正常进行__。
(2)PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会导致__双链不能充分解开__，最终会导致反应效率降低。退火温度过高，则会因__引物不能与模板充分配对__，导致目标产物的量__减少__。
(3)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加__Sma_Ⅰ和EcoR_Ⅰ__(填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成__磷酸二酯__键。
图1
(4)构建的融合表达载体，除了上述的__SP7、CADR、GP1、YFP__4种基因编码序列，其组成还应包括启动子、__终止子、标记基因__和复制原点。
(5)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为__细胞表面发出黄色荧光__，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁的镉离子含量比野生型衣藻细胞壁的__高__，则表明融合蛋白能结合镉离子。
(6)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 d后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是__转基因衣藻表达的融合蛋白能结合镉离子，降低了镉离子对衣藻的毒害作用__。
240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是__镉离子浓度过高，超出了融合蛋白的吸附能力，对衣藻产生了严重的毒害作用__。
图2
注：镉离子对渗透压的影响忽略不计。
(7)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是__①__和__③__。(填序号)
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖
②衣藻生长速率受镉离子浓度影响
③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质
④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
解析：在PCR反应中，原料是脱氧核苷酸，随着反应进行不断被消耗，分子数量逐渐减少；引物在PCR过程中会结合到模板DNA上参与子链合成，也会逐渐减少。观察图1，要避免错误连接，GP1两端应添加Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ的识别序列。因为将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，使用这两种限制酶切割可以产生不同的黏性末端，能保证目的基因准确插入载体。又因为Nhe Ⅰ和Xba Ⅰ限制酶切割后产生的黏性末端相同，所以这两种限制酶只能选一个，按照连接的顺序在将GP1连接到载体时应该用Sma Ⅰ和EcoR Ⅰ。融合表达载体中有黄色荧光蛋白YFP的编码序列，其表达后会发出黄色荧光。
一、 单项选择题
1．(2025·常州测试)同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是( B )
A．BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ属于同尾酶，它们的识别序列相同
B．使用同尾酶构建基因表达载体时，切割位点的选择范围扩大
C．选用两种不同的限制酶切割目的基因，都可以防止目的基因自身环化
D．用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，可被二者重新切开
解析：BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，属于同尾酶，A错误；图中BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ识别序列不同，但切出的黏性末端相同，故选用两种不同的限制酶切割目的基因，不一定可以防止目的基因自身环化，C错误；用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，碱基序列可能与BamHⅠ识别的序列不同，不能被BamHⅠ重新切开，D错误。
2．(2025·安徽卷)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( C )
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，无论吸收的是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)还是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，都可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数，A正确；由于仅含卡那霉素，未添加X－gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X－gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；筛选平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)且成功表达目标蛋白，但也可能是虽然导入了重组质粒但目的基因没有成功表达目标蛋白等，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β－半乳糖苷酶基因完整，能表达活性β－半乳糖苷酶，分解X－gal形成蓝色菌落，D正确。
3．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( B )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
解析：酶切条件不合适通常会使切割效果下降，此时应有部分DNA被酶切，B错误。
4．(2025·南京、盐城一模)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”“利用PCR扩增DNA片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是( B )
A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置在4 ℃冰箱中静置，DNA存在于上清液中
B．将丝状物溶于体积分数为95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定
C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量
D．PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致的
解析：在该实验中，破碎细胞释放出DNA等物质，经过离心或静置分层后，DNA会溶解在上清液中，A正确；应该将丝状物溶于2 mol·L－1的NaCl溶液，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定，B错误；PCR扩增反应体系中dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸)可以为扩增提供原料，同时在形成磷酸二酯键时，dNTP脱去两个磷酸基团，释放的能量可用于子链的合成，C正确；PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强，导致引物与模板结合位点不唯一，扩增出多种不同的DNA片段，D正确。
5．(2025·苏锡常镇一模)关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述正确的是( D )
A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察
解析：配制琼脂糖溶液时，应该用缓冲液而不是无菌水，这样才能维持合适的离子强度和pH等条件，保证电泳效果，A错误；应该是先将琼脂糖加入缓冲液中，在沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖熔化，冷却至50～60 ℃时再加入适量的核酸染料，而不是先加染料再加热熔化琼脂糖，B错误；PCR产物和凝胶载样缓冲液混合，而不是和电泳缓冲液混合，然后用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔，C错误；待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察，这样可以清晰地观察到DNA条带的位置和情况，D正确。
6．(2025·苏州考前指导)蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是( D )
A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA
B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化
C．加入预冷的体积分数95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中
D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色
解析：在细胞裂解环节充分研磨样本，能破坏细胞结构，使更多DNA释放出来，A正确；因为DNA在水相中，所以转移DNA时需吸取水相溶液，重复抽提步骤可进一步去除杂质，纯化DNA，B正确；DNA不溶于预冷的体积分数为95%的酒精，加入后离心，DNA会沉淀下来，分布于沉淀物中，C正确；提取的DNA复溶后加入二苯胺试剂，需沸水浴并冷却后才会呈现蓝色，D错误。
二、 多项选择题
7．(2025·如东期末)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法错误的有( ABC )
A．PCR扩增依据的是DNA分子边解旋边复制的特点
B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
解析：PCR扩增依据的是DNA分子复制的原理，该过程是先高温变性使双链DNA完全解旋后复制，不需要解旋酶，A、B错误；DNA的两条链反向平行，子链从引物的3′端开始延伸，则利用图中的引物①④组合可扩增出两侧的未知序列，C错误；T－DNA的插入会改变基因的排列顺序，通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置，D正确。
8．(2025·苏州中学)蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度。下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1～4表示DNA上引物可能结合的位置，下列叙述正确的有( AC )
A．若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能
B．若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏2个磷酸二酯键
C．若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置
D．选择图中适宜引物进行PCR扩增，经过5次循环可获得32个等长的蛛丝蛋白基因
解析：大肠杆菌为原核生物，细胞中只有核糖体一种细胞器，没有内质网和高尔基体，无法对蛋白质进行加工，因此蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能，A正确；若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，DNA每条单链上均会破坏2个磷酸二酯键，共会破坏4个磷酸二酯键，B错误；磷酸基团所在的一端为5′端，羟基所在的一端为3′端，DNA合成的方向为5′→3′，因此引物应与两条单链的3′端配对，即图中2、3分别是2种引物结合的位置，C正确；PCR扩增5次，共得到25＝32个DNA片段，其中等长的蛛丝蛋白基因数为25－2×5＝22个，D错误。
9．等位基因特异性PCR(AS－PCR)可用于对已知突变基因进行检测。TaqDNA聚合酶缺少3′，5′外切酶活性，引物3′端的碱基若与该模板形成错配，子链延伸反应就会因3′，5′－磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸。依据待检样本分别设计4条引物，突变位置设计在引物2和引物3的3′端最后一个位置，如图所示。下列相关叙述错误的是( BC )
A．基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带
B．基因A及a经过AS－PCR、电泳鉴定，条带数和长度均相同
C．PCR反应体系中会出现引物2和引物3扩增得到的短片段
D．可通过增加引物3′端碱基错配率以避免出现假阳性的结果
解析：基因型为Aa的样品，含有基因A和基因a，根据图示，以基因A为模板时，用引物1和引物3进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，用引物1和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，以基因a为模板时，用引物1和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，用引物2和引物4进行PCR扩增可得到1种双链等长的条带，共4种，其中基因A和基因a用引物1和引物4进行PCR扩增可得到相同的双链等长的条带，所以基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带，A正确，B错误；由于TaqDNA聚合酶缺少3′，5′外切酶活性，对于基因A，引物2的3′端碱基与模板形成错配，子链延伸反应受阻，对于基因a，引物3的3′端碱基与模板形成错配，子链延伸反应受阻，所以PCR反应体系中不会出现引物2和引物3扩增得到的短片段，C错误；因为引物3′端的碱基若与核酸模板形成错配，链延伸反应就会因3′，5′－磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸，所以增加引物3′端碱基错配率，能使非目标基因的扩增受到抑制，从而避免出现假阳性的结果，D正确。
三、 非选择题
10．(2025·徐州四模)金黄色葡萄球菌(Sa)可引起肺炎等疾病，不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。为验证Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关，进行以下实验。请回答下列问题：
注：Y是可被脱水四环素(不作为抗生素起作用)诱导表达的Sa致死基因。
(1) 为获得R基因的上游、下游两个片段，设计了如图所示的两组引物分别进行PCR扩增，在每种引物的__5′__端应添加相应的限制酶识别序列，其中使用引物组合__引物1和引物3__可扩增得到含R基因和上游片段的DNA，使用另一组引物可扩增得到含R基因和下游片段的DNA。对两次PCR的产物均用__SacⅡ和EcoRⅠ__进行酶切，回收上、下游片段，与用SacⅡ酶切质粒1所得大片段通过__DNA连接__酶连接，最终可以获得质粒2。
(2) 将质粒2与用一定浓度的__CaCl2(或Ca2+)__处理过的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa混合，一段时间后涂布在含__氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)__的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落(S1)。
(3) 质粒2与Sa的基因组发生同源重组，可敲除R基因。将S1多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含__脱水四环素__的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含__头孢霉素__的平板上，若无法增殖，则对应菌落(S2)中细菌的R基因可能被敲除。
(4) 以S2菌株基因组为模板，分别用引物组合A(引物1＋引物4)、B(引物2＋引物3)、C(引物1＋引物3)、D(引物2＋引物4)进行PCR，再用__琼脂糖凝胶电泳__技术鉴定。若仅扩增出长度为__1.9_kb__的DNA片段，则可确认R基因被敲除，从而证明Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关。
解析：(1) 限制酶识别序列需加在引物的5′端，否则会影响子链向3′端延伸。要扩增含R基因和上游片段的DNA，需覆盖上游片段与R基因，选引物1和引物3。上游、下游片段含SacⅡ和EcoRⅠ酶切位点，用这两种酶切PCR产物。质粒1经SacⅡ酶切后，与回收片段用DNA连接酶连接构建质粒2。(2) 用CaCl2(或Ca2+)处理Sa使其成为感受态细胞，便于吸收质粒2。质粒2含氯霉素抗性基因，将混合菌涂布在含氯霉素(或氯霉素＋头孢霉素)的平板，筛选出含质粒2的Sa(S1)。(3) Y是脱水四环素诱导的致死基因，要筛选并获得不含质粒2的菌落，需将菌液稀释涂布在含有脱水四环素的平板上，含有质粒2的菌体会因为脱水四环素诱导Y基因表达而死亡，从而达到筛选目的。敲除R基因后Sa对头孢霉素敏感，涂布在含头孢霉素的平板，无法增殖的菌落(S2)可能是R基因被敲除的菌株。(4) PCR产物常用琼脂糖凝胶电泳分离，依据片段大小鉴定。R基因被敲除后，上游片段(0.7 kb)与下游片段(1.2 kb)连接，扩增出1.9 kb(0.7＋1.2)的DNA片段，可确认R基因被敲除。
11．(2025·如皋期初)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题：
胰岛素基因
(1) 由于__一种氨基酸可能对应多种密码子__，“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。“BCA”法是利用人体__胰岛B细胞__中的mRNA，再由mRNA经__逆转录__得到的胰岛素基因，__AB和BCA__(填“AB”“BCA”或“AB和BCA”)法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2) 如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶__XhoⅠ和MunⅠ__的识别序列，PCR引物应该添加在识别序列的__3′__(填“3′”或“5′”)端。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为－CCTTTCAGCTCA－，则其中一种引物设计的序列是5′－__CTCGAGCCTTTCAGCTCA__－3′。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，若计划用1个胰岛素基因作模板获得m(m大于2)个胰岛素基因，则消耗的引物总量是__2m－2__个。
(3) PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列叙述错误的有__ABCD__。
A．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
B．向凝固的凝胶中加入没过凝胶的电泳缓冲液后，小心拔出梳子
C．将PCR产物与电泳缓冲液混合，用微量移液器缓慢注入加样孔内
D．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
(4) β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。先用__钙离子(CaCl2)__处理大肠杆菌后，与重组质粒混合培养一段时间，将大肠杆菌接种到添加了__氨苄青霉素和X－gal__的培养基上筛选出__白色__的菌落即为工程菌种。
解析：(1) AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，由于密码子具有简并性，即一种氨基酸可能对应多种密码子，所以AB法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。胰岛素基因存在于所有细胞中，但只在胰岛B细胞中表达，结合题意“BCA法是利用人体某细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素”可知，BCA法是从人体胰岛B细胞中获取mRNA，再由mRNA经逆转录过程得到胰岛素基因，在基因的结构中，启动子在非编码区，是不会被转录和翻译的；结合题干可知，AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素，故由AB法中的“胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列”和BCA法中的“胰岛B细胞中的mRNA”得到的目的基因中均不含人胰岛素基因启动子。(2) 由图可知，对于目的基因，SalⅠ和NheⅠ的作用位点在目的基因的中间，会破坏目的基因，则在引物设计时不能选用这两种限制酶，那么只能在XhoⅠ和MunⅠ和EcoRⅠ中选择；同时质粒上EcoRⅠ的其中一个作用位点是在标记基因(氨苄青霉素抗性基因)上，所以只能选择XhoⅠ和MunⅠ两种限制酶，则需要在设计PCR引物时添加限制酶XhoⅠ和MunⅠ的识别序列。由于DNA复制时，子链的延伸是从引物的3′端开始的，因此引物需要在模板的3′端开始进行碱基互补配对，即PCR引物应该添加在识别序列的3′端。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，若计划用1个胰岛素基因为模板获得m(m大于2)个胰岛素基因，由于子链的延伸都需要从引物的3′端开始，即新合成的子链均带有引物，因此，消耗的引物总量是2m－2个，其中只有原来的模板链上没有引物连接。(3) PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程起作用，A错误；待凝胶溶液完全凝固后，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内，再将电泳缓冲液加入电泳槽中，B错误；将扩增的PCR产物与凝胶载样缓冲液(内含指示剂)混合后，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内，C错误；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，只是作为电泳进度的指示分子，D错误。(4) 结合图示可知，目的基因的插入位置是在lacZ基因中，会破坏lacZ基因的结构，不能产生β－半乳糖苷酶，根据题干信息“β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质”，故目的基因的插入破坏了lacZ基因的结构，使其不能正常表达产生β－半乳糖苷酶，底物X－gal不会被分解，所以筛选导入重组质粒的大肠杆菌时，在添加了氨苄青霉素和X－gal的培养基上应选择白色的菌落。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)小专题3 基 因 工 程
考向1 基因工程操作与应用
1．(多选)(☆2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为，下列相关叙述正确的有( )
A．基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B．用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同
C．用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致
D．产前诊断时，该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
2．(2024·江苏卷)为了高效纯化超氧化物歧化酶(SOD)，科研人员将ELP50片段插入pET－SOD构建重组质粒pET－SOD－ELP50，以融合表达SOD－ELP50蛋白，过程如图1。其中，ELP50是由人工合成的DNA片段，序列为：限制酶a识别序列－(GTTCCTGGTGTTGGC)50－限制酶b识别序列，50为重复次数。请回答下列问题：
图1
(1)步骤①双酶切时，需使用的限制酶a和限制酶b分别是__ __ 。
(2)步骤②转化时，科研人员常用__ __处理大肠杆菌，使细胞处于感受态；转化后的大肠杆菌采用含有__ __的培养基进行筛选。用PCR技术筛选成功导入pET－SOD－ELP50的大肠杆菌，应选用的一对引物是__ __。
(3)步骤③大肠杆菌中RNA聚合酶与__ __结合，驱动转录，翻译SOD－ELP50蛋白。已知蛋白质中氨基酸残基的平均相对分子质量约为0.11 kDa，将表达的蛋白先进行凝胶电泳，然后用SOD抗体进行杂交，显示的条带应是__ __(从图2的“A～D”中选填)。
图2
(4)步骤④为探寻高效纯化SOD－ELP50蛋白的方法，科研人员研究了温度、NaCl对SOD－ELP50蛋白纯化效果的影响，部分结果如图3。
图3
①20 ℃时，加入NaCl后实验结果是__ __ 。
②100 ℃时，导致各组中所有蛋白都沉淀的原因是__ __ 。
③据图分析，融合表达SOD－ELP50蛋白的优点有__ __ 。
考向2 DNA粗提取、PCR与电泳技术
3．(☆2025·江苏卷)川金丝猴是我国特有的珍稀濒危物种，为了更好地保护这一物种，研究者开展了以下研究。请回答下列问题：
(1)川金丝猴警戒行为具有监测捕食者和同种个体的功能，这说明生物之间的关系有__ __。川金丝猴的警戒行为依赖于环境中获取的信息，信息类型有__ __ 。
川金丝猴根据这些信息及时作出反应，一方面可以降低被捕食风险，另一方面为争夺__ __获得更多机会。
(2)川金丝猴以植食为主，消化道中部分微生物直接参与高纤维食物的消化，这些微生物与川金丝猴构成__ __关系。
(3)研究者为了进一步研究川金丝猴的食性，采集其粪便样本，进行DNA提取、扩增，部分实验过程如下。请完成下表：
实验目的 简要操作步骤
释放DNA 在去杂后的样本中加入裂解液
析出DNA 离心后取①__ __，加入乙醇
②__ __ 在沉淀物中加入纯水
扩增DNA 将③__ __、引物、样本DNA、含有Mg2+缓冲液、超纯水等加入PCR管中，进行PCR
(4)为分析川金丝猴摄食的植物种类，研究者设计一对引物F和R，能同时扩增出不同种植物叶绿体中的rbeL基因片段，是因为引物F和R的碱基能与rbeL基因的保守序列的碱基__ __。用引物F和R对4种植物样本甲～丁的叶绿体基因组DNA进行扩增测序，结果如图所示。若对4个样本的扩增产物进行DNA电泳条带分析，能检出的样本是__ __。研究者用引物F和R对川金丝猴粪便DNA进行扩增并测序，得到的序列有图中的3种序列，据此可确定川金丝猴摄食的植物有__ __。若要更准确鉴定出川金丝猴摄食的植物，参照叶绿体基因库，还需选用__ __的保守序列设计引物，对川金丝猴粪便DNA进行扩增、测序分析。
注：“·”表示与植物甲对应位置上相同的碱基；“……”表示省略200个碱基。
(5)依据上述研究，保护川金丝猴可采取的措施有__ __(填字母)。
a．建立川金丝猴生态廊道，促进种群间基因交流
b．保护川金丝猴栖息地的植被和它喜食的植物
c．需用标记重捕法定期重捕，以精确监测种群数量
d．主要依赖迁地保护，扩大川金丝猴种群数量
4．(2023·江苏卷)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达，运用重组酶技术构建质粒，如图1所示。请回答下列问题：
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时，配制的两个反应体系中不同的有__ __，扩增程序中最主要的不同是__ 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2－F、F1－R应在下列选项中选用__ 。
EGFP基因序列：
5′－ATGGTGAGCAAGGGC…GACGAGCTGTACAAG3′
AnB1基因序列：
5′CATGTCCAGCTGCAG…CCAAAACCACAACCA3′
图2
A．－ATGGTG…CAACCA－
B．－TGGTTG…CACCAT－
C．－GACGAG…CTGCAG－
D．－CTGCAG…CTCGTC－
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后，在重组酶作用下可形成环化质粒，直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比，无需使用的酶主要有__ __。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选，下列叙述错误的有__ __。
A．稀释涂布平板需控制每个平板30～300个菌落
B．抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C．抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D．抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计，用不同菌落的质粒为模板，用引物F1－F和F2－R进行了PCR扩增，质粒P1～P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断，可以舍弃的质粒有__ __。
图3
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒，通常需进一步通过基因测序确认，原因是__ __ 。
提升1 基因工程的工具和程序
1．限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶和解旋酶的比较
种类) (限制酶(限制性内切核酸酶) DNA连接酶 DNA聚合酶 解旋酶
作用底物 DNA分子 DNA分子片段 脱氧核苷酸 DNA分子
作用部位 磷酸二酯键 磷酸二酯键 磷酸二酯键 碱基对间的氢键
作用特点 切割目的基因及载体，能专一性识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 只能将单个脱氧核苷酸添加到已有的核苷酸链上，形成新的磷酸二酯键 将DNA两条链之间的氢键打开
作用结果 形成黏性末端或平末端 形成重组DNA分子 形成新的DNA分子 形成单链DNA分子
2．基因工程核心步骤——构建表达载体的几个要点
(1)限制酶的选择
,甲) ,乙
①首先应能切割出目的基因且不会破坏目的基因，如图甲可选择PstⅠ、EcoRⅠ(切割位点位于目的基因两端)，而不能选择SmaⅠ(切割位点在目的基因内部)。
②切割质粒的限制酶要与切割目的基因的限制酶一致(1种或2种限制酶)，或切割后能产生相同的末端。而为了避免自身连接，且确保目的基因与载体的正向连接，往往用两种限制酶切割质粒和目的基因。
③基因表达载体必须具备启动子、终止子、标记基因和复制原点等，所以选择的限制酶也不能破坏这些结构(图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因，则不能选用)。若质粒具有两个或多个标记基因时，要保证重组的质粒至少有一个标记基因。
(2)构建载体时，要确保目的基因插入启动子与终止子之间。另外，当需要目的基因在特定细胞中表达时，需要换成特定的启动子，如目的基因要在乳腺细胞中表达时，启动子要换成乳腺蛋白基因的启动子。
┃ 易错提醒 ┃
基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，而起始密码子在mRNA上；终止子位于目的基因的尾端，使转录在所需要的地方停止，而终止密码子在mRNA上。
提升2 PCR技术原理和过程
1．条件及作用
条件 作用
缓冲液 提供相对稳定的pH环境
4种dNTP(脱氧核苷三磷酸) 作为合成DNA子链的原料，同时提供能量
DNA 作为DNA复制的模板
耐高温DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶) 催化合成DNA子链(耐高温)
引物 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始延伸DNA链
2．过程
变性 超过90 ℃，使DNA双链解开
复性(退火) 50 ℃左右，使解链的两条DNA单链分别与相应的引物结合
延伸 72 ℃左右，耐高温的DNA聚合酶催化子链合成
┃ 拓展延伸 ┃
(1)PCR循环过程与温度的关系
①G—C碱基对间有3个氢键，A—T碱基对间只有2个氢键。变性和复性(退火)的温度都与目的基因中G＋C的含量有关。比如，引物中G＋C含量较高，则退火温度就较高。
②延伸的温度不能太高，以防止新合成的子链 DNA与母链 DNA解聚为单链；温度也不能太低，是为了保证Taq酶的活性。
(2)对时间的要求
①变性和延伸时间的长短与目的基因的长短有关，目的基因越长，变性/延伸的时间就越长。
②复性时间的长短与引物的长短有关，引物越长，复性的时间就越长。
3．相关数据
项目 n轮循环
DNA分子数 2n
含引物A(或B)的DNA分子数 2n－1
同时含引物A、B的DNA分子数 2n－2
共消耗的引物数量 2n+1－2
两端等长的DNA分子数 2n－2n
注：一般PCR第3次循环后，才会出现两端等长的目的基因片段。
提升3 引物的选择与设计
1．引物的概念
引物是一小段寡核苷酸片段，它能与DNA母链的一段碱基互补配对(引物的5′端能与模板链的3′端通过碱基互补配对结合)，常见引物长度为18～30 bp。
2．引物存在的必要性(引物的作用)
DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。而引物结合到目标DNA后，可以使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。细胞内DNA复制以RNA作引物，PCR反应以DNA作引物。
3．引物的设计原则
(1)引物的4种碱基分布尽可能均匀，一般使G＋C含量为40%～60%。
(2)引物的5′端决定了扩增产物的5′端位置，3′端必须与扩增DNA严格互补。
(3)①引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，特别是避免3′端的互补重叠，否则会形成引物二聚体；②引物内部应避免多对碱基互补形成发夹结构(即引物内部也不能有互补序列)；③引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其他序列也不能存在6个以上碱基的同源序列，以免引物与其他位点结合，导致非特异性扩增；④引物3′端应避免碱基堆积，即避免连续的3个或更多的G、C或A、T；⑤引物3′端终止位置是PCR扩增的起始位置，因此应尽量选择在模板区的G、C含量较高的位置。
(4)引物不能太短。长度应大于16个核苷酸，防止引物与待扩增靶DNA的其他序列发生错误结合，导致非特异性扩增。
(5)引物与靶序列间的解链温度(Tm)不应过低；引物越长，G＋C比例越高，退火温度越高。
4．引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，但可在5′端进行修饰而不影响扩增特异性。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列，这样可保证目的基因定向插入载体并可避免目的基因自身环化。另外，还要加上启动子(或终止子)序列(见下图)。
正向引物结构图
反向引物结构图
5．引物的选择和互补链的判断
(1)DNA聚合酶只能特异性地复制处于2个引物之间的DNA序列，引物5′端的碱基与DNA母链3′端的碱基进行碱基互补配对，可作为DNA复制的起始点，DNA子链的合成方向是从引物的5′端向3′端延伸。可利用这一特点判断引物及引物的互补链。
(2)下图中，扩增目的基因用引物②③，扩增目的基因两侧的序列用引物①④，检测目的基因是否正向插入载体用引物③⑥或②⑦(包含目的基因和左侧或者右侧的序列)。
命题1 DNA的粗提取与鉴定
(2025·宿迁四模)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．研磨液有利于DNA的溶解，换为蒸馏水，DNA提取的效率会降低
B．将实验材料的研磨液倒入离心管中，离心后取沉淀物备用
C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变
D．将析出的丝状物加入4 mL二苯胺试剂后沸水浴加热可出现蓝色
命题2 基因工程的操作工具和程序
(2025·南通四模)为了使酵母菌表达流感病毒抗原蛋白来生产流感疫苗，研究人员通过构建基因表达载体进行相关研究，流程如图1。请回答下列问题：
图1
(1)目的DNA片段中，启动子的作用是__ __ 。
(2)过程①除图中物质外还需要__ __ 。下表为相关引物序列，目的DNA片段的编码链(非模板链)碱基序列为5′－TGTG AAATACCGCACA……CGGTTGAGACCG AA－3′，则F2、F3分别是__ __、__ __。
a 5′－ACAACATTTGGTCACACAATCGATATTTAC－3′
b 5′－TTAAGAAAATCCTTGCTTAATTATAAACTATAATG CGAGA－3′
c 5′－AAGCAAGGATGATCTTAATGTGAAATACCGCACAG ATGCGT－3′
d 5′－GACTCTTATGGGAGCTGCATTAGGCACGGTTGAGA CCGAA－3′
e 5′－CGGTTGAGACCGAATAGCGTGAAACTGGGCATTAA CA－3′
f 5′－GGTTACCAGATCTACACCGTTCCCGATTTCA－3′
(3)过程②使用__ __(限制酶)切割质粒pHC11。图2为甲、乙、丙、丁4条引物在正确重组质粒中的相应位置，可选择引物__ 通过PCR鉴定正确插入目的基因的重组质粒。
图2
(4)过程③将重组质粒导入大肠杆菌，并接种到含__ __的培养基中进行筛选，过程③的目的是__ __。
(5)用BamHⅠ、SalⅠ切割重组质粒来筛选pHC11R，pHC11R被酶切的长度大约是__ __。将pHC11R和目的DNA片段导入酵母菌后，接种在__ __的培养基中培养筛选。
(6)与酶切再连法相比，本实验进行细胞内同源重组获得重组酵母的优点有__ __。
①重组质粒的构建和转化更加便捷
②重组位点精确，不会引入多余的序列
③去除标记基因防止其在环境中扩散
④表达流感病毒抗原蛋白的量多且纯度更高
命题3 PCR技术
(多选)(2025·启东中学)人胰岛素分子容易聚合导致药效降低，可采用PCR技术改造人胰岛素基因(下图)，下列说法正确的有( )
A．可通过人工合成获取突变型目的基因
B．上述方法可将待突变序列改造成5′－AAGCCC－3′
C．需要在耐高温的DNA聚合酶作用下进行延伸
D．通过电泳检测PCR产物，可确定基因是否改造成功
[反向PCR、引物的选择](2020·江苏卷)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如下图所示(以EcoR Ⅰ酶切为例)。请据图回答问题：
(1)步骤Ⅰ用的EcoR Ⅰ是一种__ __酶，它通过识别特定的__ __切割特定位点。
(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成__ __。PCR循环中，升温到95 ℃是为了获得__ __ 。Taq DNA聚合酶的作用是催化__ __ 。
(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是__ __(从引物①②③④中选择，填编号)。
DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)
已知 序列
PCR 引物 ①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′ ②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′ ③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′ ④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′
(4)对PCR产物测序，经分析得到了片段F的完整序列。下列DNA单链序列中(虚线处省略了部分核苷酸序列)，结果正确的是__ __。
A．5′－AACTATGCG……AGCCCTT－3′
B．5′－AATTCCATG……CTGAATT－3′
C．5′－GCAATGCGT……TCGGGAA－3′
D．5′－TTGATACGC……CGAGTAC－3′
┃ 题后点拨 ┃
PCR的几种类型
(1)反转录PCR(RT－PCR)：以mRNA为模板，利用反转录酶获得cDNA(互补DNA)，再以cDNA为模板进行常规PCR扩增。
(2)反向PCR：利用DNA中间的已知序列，扩增已知序列两端的未知序列。原理是：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是同向的，从而扩增出未知序列。
(3)实时PCR：一般用于定量测定。在反应体系中加入带荧光标记的PCR引物，通过荧光监测扩增产物的量。获得反应动力学曲线后推导样品中模板DNA的初始量。
基因工程的应用
(2025·河北卷改编)为治理水体中对生物有毒害的镉污染，研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体，转入单细胞衣藻，实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁，以吸附水体中的镉离子。请回答下列问题：
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中，随着PCR反应进行，分子数量逐渐减少的是__ __和__ __。模板与引物在PCR反应的__ __阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温，其原因为__ __ 。
(2)PCR过程中，温度的控制至关重要，变性温度过低会导致__ _ _，最终会导致反应效率降低。退火温度过高，则会因__ __ ，导致目标产物的量__ __。
(3)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时，为避免错误连接，需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列，其中GP1两端应添加__ __ (填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时，可催化载体和目的基因之间形成__ __键。
图1
(4)构建的融合表达载体，除了上述的__ __ 4种基因编码序列，其组成还应包括启动子、__ __ 和复制原点。
(5)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为__ __ ，初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后，若转基因衣藻细胞壁的镉离子含量比野生型衣藻细胞壁的__ __，则表明融合蛋白能结合镉离子。
(6)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 d后，检测细胞密度，结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是__ __ 。
240 μmol·L－1镉离子浓度下，转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是__ __ 。
图2
注：镉离子对渗透压的影响忽略不计。
(7)转基因衣藻可用于水体镉污染治理，与施加化学药物法相比，能体现出其环境治理优势的两个特性是__ __和__ __。(填序号)
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖
②衣藻生长速率受镉离子浓度影响
③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质
④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
一、 单项选择题
1．(2025·常州测试)同尾酶是指一组识别序列不同，但切出的黏性末端相同的限制酶。下图为EcoRⅠ、BamHⅠ、BglⅡ和MboⅠ四种限制酶的识别序列及酶切位点。下列说法正确的是( )
A．BamHⅠ、BglⅡ、MboⅠ属于同尾酶，它们的识别序列相同
B．使用同尾酶构建基因表达载体时，切割位点的选择范围扩大
C．选用两种不同的限制酶切割目的基因，都可以防止目的基因自身环化
D．用DNA连接酶将BamHⅠ和MboⅠ形成的黏性末端连接后，可被二者重新切开
2．(2025·安徽卷)质粒K中含有β－半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X－gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( )
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
3．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
4．(2025·南京、盐城一模)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”“利用PCR扩增DNA片段及电泳鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．洋葱切碎加研磨液研磨过滤后，滤液放置在4 ℃冰箱中静置，DNA存在于上清液中
B．将丝状物溶于体积分数为95%的酒精，再加入二苯胺试剂在沸水浴中进行DNA鉴定
C．PCR扩增反应体系中dNTP既可以为扩增提供原料，也可以为子链的合成提供能量
D．PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果不止一条条带，可能是引物特异性不强导致的
5．(2025·苏锡常镇一模)关于“琼脂糖凝胶电泳”实验，下列叙述正确的是( )
A．根据待分离DNA片段的大小，需用无菌水配制0.8%～1.2%的琼脂糖溶液
B．向琼脂糖溶液中加入适量的核酸染料后，需在沸水浴内加热至琼脂糖熔化
C．将PCR产物和电泳缓冲液混合后，需用微量移液器将混合液缓慢注入加样孔
D．待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，需及时断电并取出凝胶置于紫外灯下观察
6．(2025·苏州考前指导)蛋白质表面含有很多极性基团，易溶于苯酚，可采用苯酚/氯仿法分离蛋白质和DNA。图示提取纯化草莓DNA的具体过程。下列相关叙述错误的是( )
A．在细胞裂解环节需对样本进行充分研磨以释放更多的DNA
B．转移DNA时需吸取水相溶液，并可重复上一步骤进一步纯化
C．加入预冷的体积分数95%的乙醇后离心，DNA分布于沉淀物中
D．提取出的DNA复溶后加入适量的二苯胺试剂，即可呈现出蓝色
二、 多项选择题
7．(2025·如东期末)农杆菌Ti质粒上的T－DNA可以转移并随机插入被侵染植物的染色体DNA中。研究者将图中被侵染植物的DNA片段连接成环，并以此环为模板进行PCR，扩增出T－DNA插入位置两侧的未知序列，以此可确定T－DNA插入的具体位置。下列说法错误的有( )
A．PCR扩增依据的是DNA分子边解旋边复制的特点
B．进行PCR扩增需要的酶有解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．利用图中的引物②③组合可扩增出两侧的未知序列
D．通过与受体细胞的基因组序列比对，可确定T－DNA的插入位置
8．(2025·苏州中学)蜘蛛丝(丝蛋白)被称为“生物钢”，有着超强的抗张强度。下图为蛛丝蛋白基因对应的DNA片段结构示意图，其中1～4表示DNA上引物可能结合的位置，下列叙述正确的有( )
A．若受体细胞为大肠杆菌，则蛛丝蛋白需要进一步加工才具有相应的功能
B．若从该DNA片段中直接获取蛛丝蛋白基因，会破坏2个磷酸二酯键
C．若用PCR技术获取目的基因，则图中的2、3分别是2种引物结合的位置
D．选择图中适宜引物进行PCR扩增，经过5次循环可获得32个等长的蛛丝蛋白基因
9．等位基因特异性PCR(AS－PCR)可用于对已知突变基因进行检测。TaqDNA聚合酶缺少3′，5′外切酶活性，引物3′端的碱基若与该模板形成错配，子链延伸反应就会因3′，5′－磷酸二酯键形成障碍而受阻，无法进行PCR延伸。依据待检样本分别设计4条引物，突变位置设计在引物2和引物3的3′端最后一个位置，如图所示。下列相关叙述错误的是( )
A．基因型为Aa的样品经PCR扩增可得到3种双链等长的条带
B．基因A及a经过AS－PCR、电泳鉴定，条带数和长度均相同
C．PCR反应体系中会出现引物2和引物3扩增得到的短片段
D．可通过增加引物3′端碱基错配率以避免出现假阳性的结果
三、 非选择题
10．(2025·徐州四模)金黄色葡萄球菌(Sa)可引起肺炎等疾病，不规范使用抗生素易出现多重抗药性Sa。为验证Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关，进行以下实验。请回答下列问题：
注：Y是可被脱水四环素(不作为抗生素起作用)诱导表达的Sa致死基因。
(1) 为获得R基因的上游、下游两个片段，设计了如图所示的两组引物分别进行PCR扩增，在每种引物的__ __端应添加相应的限制酶识别序列，其中使用引物组合__ __可扩增得到含R基因和上游片段的DNA，使用另一组引物可扩增得到含R基因和下游片段的DNA。对两次PCR的产物均用__ __ 进行酶切，回收上、下游片段，与用SacⅡ酶切质粒1所得大片段通过__ __酶连接，最终可以获得质粒2。
(2) 将质粒2与用一定浓度的__ __ 处理过的具有头孢霉素抗性、对氯霉素敏感的Sa混合，一段时间后涂布在含__ __的平板上，经培养获得含质粒2的Sa单菌落(S1)。
(3) 质粒2与Sa的基因组发生同源重组，可敲除R基因。将S1多次传代以增加同源重组敲除R基因的概率，随后稀释涂布在含__ __ 的平板上，筛选并获得不再含有质粒2的菌落。从这些菌落分别挑取少许菌体，依次接种到含__ __的平板上，若无法增殖，则对应菌落(S2)中细菌的R基因可能被敲除。
(4) 以S2菌株基因组为模板，分别用引物组合A(引物1＋引物4)、B(引物2＋引物3)、C(引物1＋引物3)、D(引物2＋引物4)进行PCR，再用__ __ 技术鉴定。若仅扩增出长度为__ __的DNA片段，则可确认R基因被敲除，从而证明Sa对头孢霉素的抗性与R基因有关。
11．(2025·如皋期初)1965年中国科学家人工合成了具有生物活性的结晶牛胰岛素，摘取了人工合成蛋白质的桂冠。此后科学家又提出了利用基因工程改造大肠杆菌生产人胰岛素的两种方法：AB法是根据胰岛素A、B两条肽链的氨基酸序列人工合成两种DNA片段，利用工程菌分别合成两条肽链后将其混合自然形成胰岛素；BCA法是利用胰岛B细胞中的mRNA得到胰岛素基因，导入工程菌获得胰岛素。这两种方法使用同一种质粒作为载体。请回答下列问题：
胰岛素基因
(1) 由于__ _ _，“AB”法中人工合成的两种DNA片段均有多种可能的序列。“BCA”法是利用人体__ __中的mRNA，再由mRNA经__ __ 得到的胰岛素基因，__ __(填“AB”“BCA”或“AB和BCA”)法获取的目的基因中不含人胰岛素基因启动子。
(2) 如图是利用基因工程生产人胰岛素过程中使用的质粒及目的基因的部分结构。为使目的基因与载体正确连接，在设计PCR引物时可添加限制酶__ __ 的识别序列，PCR引物应该添加在识别序列的__ __(填“3′”或“5′”)端。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，已知胰岛素基因左端①处的碱基序列为－CCTTTCAGCTCA－，则其中一种引物设计的序列是5′－__ __ －3′。通过上述方法获得人的胰岛素基因后，需要通过PCR技术进行扩增，若计划用1个胰岛素基因作模板获得m(m大于2)个胰岛素基因，则消耗的引物总量是__ __个。
(3) PCR扩增的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定，下列叙述错误的有__ __ 。
A．PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在复性过程起作用
B．向凝固的凝胶中加入没过凝胶的电泳缓冲液后，小心拔出梳子
C．将PCR产物与电泳缓冲液混合，用微量移液器缓慢注入加样孔内
D．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
(4) β－半乳糖苷酶可以分解无色的X－gal产生蓝色物质使菌落呈现蓝色，否则菌落为白色。先用__ __处理大肠杆菌后，与重组质粒混合培养一段时间，将大肠杆菌接种到添加了__ __ 的培养基上筛选出__ __的菌落即为工程菌种。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)
