课后限时作业(八) 生物技术与工程[A卷]
(建议用时：35分钟；本套共13小题，共55分。第1~6、8~12小题，每小题3分；第7小题10分；第13小题12分。)
1．(2025·陕晋青宁卷)我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如图。下列叙述错误的是( )
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源
B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同
D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
2．(2025·甘肃卷)我国葡萄酒酿造历史悠久、传统发酵技术延续至今。发酵工程通过选育菌种和控制发酵条件等措施可优化传统发酵工艺，改善葡萄酒品质。下列叙述错误的是( )
A．传统发酵时，葡萄果皮上的多种微生物参与了葡萄酒的发酵过程
B．工业化生产时，酵母菌需在无氧条件下进行扩大培养和酒精发酵
C．通过诱变育种或基因工程育种能够改良葡萄酒发酵菌种的性状
D．大规模发酵时，需要监测发酵温度、pH值、罐压及溶解氧等参数
3．(2025·黑吉辽蒙卷)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是( )
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
4．(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如下图。下列叙述正确的是( )
A．①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B．②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C．3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D．百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
5．(2025·四川卷)研究人员用花椰菜(BB，2n＝18)根与黑芥(CC，2n＝16)叶片分别制备原生质体，经PEG诱导融合形成杂种细胞，进一步培养获得再生植株，其中的植株N经鉴定有33条染色体。下列叙述正确的是( )
A．两个原生质体融合形成的细胞即为杂种细胞
B．再生植株N的形成证明杂种细胞仍具有全能性
C．花椰菜和黑芥的原生质体能融合，证明两种植物间不存在生殖隔离
D．植株N的B组和C组染色体不能正常联会配对，无法产生可育配子
6．(2025·湖北卷)水母雪莲是我国的一种名贵药材，主要活性成分为次生代谢产物黄酮。水母雪莲生长缓慢，长期的掠夺性采挖导致该药材资源严重匮乏。研究人员开展了悬浮培养水母雪莲细胞合成黄酮的工程技术研究，结果如表所示。下列叙述错误的是( )
转速(r/min) 55 65 75 85
相对生长速率 0.21 0.25 0.26 0.25
细胞干重(g/L) 7.50 9.70 11.4 9.50
黄酮产量(g/L) 0.20 0.27 0.32 0.25
A．黄酮产量与细胞干重呈正相关
B．黄酮是水母雪莲细胞生存和生长所必需的
C．氧气供给对于水母雪莲细胞生长、分裂和代谢是必需的
D．转速为75 r/min时，既利于细胞分裂，又利于黄酮的积累
7．(10分)(2025·湖南卷)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
(1)制备特定抗原
①获取基因A，构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和__________________等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物________对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为________bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________(答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有__________________(答出一种即可)。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和____________，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。
8．陈皮橄榄醋以优质的橄榄为原料，结合陈皮发酵而成。大致流程为先在灭菌的果肉匀浆中接种酵母菌，发酵6天后，再接入活化的醋酸菌，发酵5天。下列叙述错误的是( )
A．酵母菌发酵产生的乙醇既是乙酸发酵的底物，又可以抑制杂菌繁殖
B．发酵6天后，再接入活化的醋酸菌进行发酵时，需要适当降低温度
C．果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时的
D．酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵，而醋酸菌在有氧条件下进行乙酸发酵
9．(2025·重庆万州期中)发酵工程在食品、医药、农牧业等方面有着广泛地应用，下列有关说法正确的是( )
A．发酵工程的中心环节是灭菌，防止杂菌污染
B．pH能影响发酵产物，谷氨酸的发酵生产过程中，碱性条件下易产生谷氨酰胺
C．啤酒生产中的焙烤、蒸煮环节既可以杀菌，又可以使所有酶失活
D．微生物饲料中的单细胞蛋白除蛋白质外还含有糖类、脂质、维生素等
10．(2025·河南郑州模拟)腐乳制作是我国传统发酵技术的代表之一，其工艺流程如下所述。下列叙述正确的是( )
让豆腐上长出毛霉加盐腌制加卤汤装瓶密封腌制
A．毛霉主要通过分泌淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，促进腐乳风味的形成
B．腐乳制作过程中，有机物种类增多，但含有的总能量减少
C．卤汤中的酒精和香辛料可以调味并抑制杂菌污染，浓度越高效果越好
D．腐乳制作过程中，乳酸菌的无氧呼吸是产生氨基酸和甘油的关键环节
11．(2025·湖北武汉模拟)聚赖氨酸(PL)能抑制多种微生物的活性，科研人员欲从土壤中分离出分泌PL能力强的微生物，开展了如下图所示的实验(Ⅰ~Ⅳ表示过程，①~③表示菌落)，已知PL可使亚甲基蓝褪色，形成如乙培养基上的透明圈。下列有关叙述错误的是( )
A．设置甲培养基的目的是从土壤中分离出能分泌PL的微生物
B．乙是鉴别培养基，培养基中应添加了亚甲基蓝
C．制备培养基的过程为：配制培养基→调pH→高压蒸汽灭菌→倒平板
D．丙培养基上的微生物是从乙培养基中挑选①菌落中的微生物通过平板划线法接种的
12．(2025·陕西宝鸡模拟)枸杞是一味传统中药，野生黑果枸杞富含花青素，且抗逆性强，但比人工种植的宁夏枸杞个体小、产量低。研究人员尝试利用不对称植物体细胞杂交技术将野生黑果枸杞的抗逆性状转移到宁夏枸杞中，操作过程大体如图所示。下列叙述错误的是( )
A．可以用酶解法获得上述两种原生质体
B．杂交细胞含有两种枸杞的全部遗传信息
C．可用电融合、聚乙二醇等方法诱导融合
D．该杂交细胞经过脱分化和再分化后可获得幼苗
13．(12分)广东省是登革热的多发地区，尤其是今年夏、秋季特别严重，据统计确诊人数已超万人。登革热是由登革热病毒引起的一种急性发热性疾病，可通过伊蚊叮咬传染给人。登革热病毒的遗传物质是一段单链RNA。下图为登革热病毒的致病机理。回答下列问题：
(1)图示主要显示了人体对抗登革热病毒的________免疫过程。
(2)图中物质甲是________，在此免疫过程中的作用是___________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)登革热患者常出现局部组织水肿等症状，原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(4)对于登革热的重症患者，需要注射抗体来帮助病人抵抗病毒，如果你是医生，建议患者注射抗体________(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)来进行免疫治疗，效果更明显。
(5)医学上常利用单克隆抗体制备技术来制备抗体，既可以用于治疗，又可以用于精确检测，可以做到早发现，早治疗，以防登革热大面积传染。下图表示抗登革热病毒单克隆抗体的制备过程。
与诱导植物细胞融合相比，诱导动物细胞融合获得乙，特有的融合方法是___________________________________________________________________。
制备单克隆抗体过程中需要对细胞进行至少两次的筛选，第一次筛选过程中能在特定选择培养基上生长的是____________。单克隆抗体的特点是___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________。
课后限时作业(八)[A卷]
1．C [淀粉水解糖可以为微生物发酵提供碳源和能源，A正确；通过扩大培养可以获取更多的黑曲霉，B正确；常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，对空气灭菌一般不用高压蒸汽灭菌法，C错误；通气、搅拌可以增加溶解氧量，促进黑曲霉发酵，即促进柠檬酸积累，D正确。]
2．B [在传统发酵制作葡萄酒时，葡萄果皮上附着有多种微生物，如酵母菌等，这些微生物参与了葡萄酒的发酵过程，A正确；工业化生产时，酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸，能大量繁殖，进行扩大培养，在无氧条件下进行酒精发酵产生酒精，B错误；通过诱变育种(利用物理、化学等因素诱导基因突变)或基因工程育种(定向改造生物的基因)能够改良葡萄酒发酵菌种(如酵母菌)的性状，比如提高发酵效率等，C正确；大规模发酵时，发酵温度、pH值、罐压及溶解氧等参数会影响微生物的生长和代谢，进而影响发酵过程和产品质量，所以需要监测这些参数，D正确。]
3．D [该研究的目的是筛选出高耐受且降解金霉素能力强的菌株，可以以金霉素为唯一碳源制备选择培养基进行筛选，且逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株，A、B正确；微生物培养需要适宜的pH等，C正确；稀释涂布平板法不需要接种环，而是需要涂布器，D错误。]
4．D [在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，而愈伤组织细胞的分化过程中进行的是有丝分裂，所以不会发生基因重组，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D正确。]
5．B [两个原生质体融合形成的细胞不一定是杂种细胞，有可能是两个花椰菜原生质体融合或两个黑芥原生质体融合等，A 错误；全能性是指细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性，杂种细胞经过培养形成再生植株 N，这证明了杂种细胞仍具有全能性，B正确；花椰菜和黑芥是不同物种，它们之间存在生殖隔离，原生质体能融合并不能证明不存在生殖隔离，因为生殖隔离是指不同物种之间一般是不能相互交配的，即使交配成功，也不能产生可育的后代，C错误；植株 N 是花椰菜(BB，2n＝18)和黑芥(CC，2n＝16)，二者原生质体经 PEG 诱导融合形成杂种细胞后，染色体组成是 BBCC，存在同源染色体，在减数分裂时能正常联会配对，能产生可育配子，D错误。]
6．B [根据表格数据分析，随着细胞干重增加，黄酮产量也增加；随着细胞干重减少，黄酮产量也降低，说明黄酮产量与细胞干重呈正相关，A正确。黄酮属于次生代谢产物，不是细胞生存和生长所必需的，B错误。氧气的供给有利于细胞呼吸为生命活动提供能量，对于水母雪莲细胞生长、分裂和代谢是必需的，C正确。根据表格数据分析，转速为75 r/min时，细胞的相对生长速率最快，黄酮产量最高，D正确。]
7．解析：(1)①重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子、终止子和复制原点等，终止子能终止转录过程。 要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200＋582＝782 bp。②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养并离心后上清液中无蛋白A，可能的原因有：重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。(2)诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇(PEG)融合法。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
答案：(除标注外，每空2分，共10分)(1)①终止子、复制原点 P1 和 P3(1分) 782(1分) ②重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解 (2)聚乙二醇(PEG)融合法(或灭活病毒诱导法、电融合法) 抗体检测
8．B [当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为乙酸，同时乙醇还可以抑制杂菌繁殖，A正确；酒精发酵的温度为18～30 ℃，乙酸发酵的温度为30～35 ℃，因此发酵6天后，再接入活化的醋酸菌进行发酵时，需要适当升高温度，B错误；以酒精为底物进行乙酸发酵，酒精与氧气发生反应产生乙酸和水，几乎没有气泡产生，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时，C正确；酵母菌发酵过程中先通气使其大量繁殖，再密闭发酵产乙醇，醋酸菌为好氧菌，需持续通入无菌氧气，D正确。]
9．D [发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵，A错误；pH能影响发酵产物，谷氨酸发酵生产应在中性或弱碱性条件下进行，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺，B错误；焙烤是为了去除大麦种子中的水分，可以杀死大麦种子胚，但没有起到灭菌作用，也不能使淀粉酶失活，C错误；以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵能获得单细胞蛋白，单细胞蛋白含有丰富的蛋白质、糖类、脂质和维生素等物质，可以用作食品添加剂，D正确。]
10．B [毛霉在腐乳制作中主要分泌蛋白酶和脂肪酶，将豆腐中的蛋白质分解为小分子肽和氨基酸，脂肪分解为甘油和脂肪酸，淀粉的分解并非毛霉的主要作用，A错误；腐乳制作过程中，毛霉等微生物会分解原料中的大分子有机物为小分子有机物，这一过程中，有机物的种类会增多，但由于微生物的代谢活动会消耗能量，并且部分能量会以热能的形式散失，因此含有的总能量会减少，B正确；卤汤中的酒精和香辛料可以调味并抑制杂菌污染，浓度过高会抑制发酵微生物的作用，C错误；腐乳制作的核心微生物是毛霉，而非乳酸菌，乳酸菌主要参与泡菜、酸奶等发酵，其代谢产物(如乳酸)与腐乳风味无直接关联，D错误。]
11．A [设置甲培养基的目的是对土壤中的微生物进行稀释和初步培养，而不是直接分离出能分泌PL的微生物，A错误；乙培养基中添加亚甲基蓝，根据PL可使亚甲基蓝褪色形成透明圈的原理，来鉴别能分泌PL的微生物，所以乙是鉴别培养基，B正确；制备培养基的正确过程为：配制培养基→调pH→高压蒸汽灭菌→倒平板，C正确；透明圈直径与菌落直径之比越大，分泌PL的能力越强，由图可知，丙培养基上的微生物是从乙培养基中挑选①菌落中的微生物通过平板划线法接种的，D正确。]
12．B [可以用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁获得原生质体，A正确；根据图信息，黑果枸杞原生质体经辐射处理后，染色体片段断裂，因此杂交细胞不含有两种枸杞的全部遗传信息，B错误；可以用电融合、聚乙二醇等方法诱导原生质体的融合，C正确；该杂交细胞经过脱分化和再分化后可获得幼苗，D正确。]
13．解析：(1)图中显示了抗体的作用，抗体是体液免疫的关键物质，因而图中显示的是人体对抗登革热病毒的体液免疫过程。(2)图中物质甲是由辅助性T细胞合成并分泌的细胞因子，细胞因子在体液免疫中的具体作用是促进B细胞的分裂、分化过程。(3)登革热患者常出现局部组织水肿等症状，这是因为抗体Ⅰ与病毒结合形成的复合物会引起血管通透性增大，从而使血浆中的蛋白质等渗出，组织液渗透压相对升高，因而组织液增多，表现为组织水肿。(4)对于登革热的重症患者，需要注射抗体来帮助病人抵抗病毒，结合图示可以看出，抗体Ⅱ在清除病毒的过程中有重要作用，因此，建议患者注射抗体Ⅱ来进行免疫治疗，效果更明显。(5)与诱导植物细胞融合相比，诱导动物细胞融合获得乙，特有的融合方法是灭活病毒诱导法。制备单克隆抗体过程中需要对细胞进行至少两次的筛选，第一次筛选过程中能在特定选择培养基上生长的是杂交瘤细胞，即在该培养基上没有融合的两种细胞以及发生同种融合的细胞均不能生长，进而可将杂交瘤细胞筛选出来。由于杂交瘤细胞有多种类型，因而可通过抗原—抗体杂交的原理以及克隆化培养筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体的特点是能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，可大量制备。
答案：(1)(每空1.5分，共12分)体液 (2)细胞因子 促进B细胞的分裂、分化过程 (3)抗体Ⅰ与病毒结合形成的复合物引起血管通透性增大，从而使血浆中的蛋白质等渗出，组织液渗透压相对升高，组织液增多 (4)Ⅱ (5)灭活病毒诱导法 杂交瘤细胞 能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，可大量制备课后限时作业(八) 生物技术与工程[B卷]
(建议用时：35分钟；本套共13小题，共50分。第1~12小题，每小题3分；第13小题14分。)
1．(2025·广东卷)将人眼睑成纤维细胞传代培养后，再培养形成支架，在该支架上接种人口腔黏膜上皮细胞，培养一段时间后分离获得上皮细胞片层，可用于人工角膜的研究。上述过程不涉及( )
A．制备细胞悬液
B．置于5%CO2等适宜条件下培养
C．离心收集细胞
D．用胰蛋白酶消化支架后分离片层
2．(2025·安徽卷)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是( )
A．从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞
B．将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞
C．将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞
D．采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚，因这两个时期的细胞未发生分化
3．(2025·湖北卷)利用犬肾细胞MDCK扩增流感病毒，生产流感疫苗，具有标准化、产量高等优点。但MDCK细胞贴壁生长的特性不利于生产规模的扩大，严重制约疫苗的生产效率。研究人员通过筛选，成功获得一种无成瘤性的(多代培养不会癌变)、可悬浮培养的MDCK细胞——XF06。下列叙述错误的是( )
A．XF06悬浮培养可提高细胞密度，进而提升生产效率
B．细胞贴壁生长特性的改变是由于流感病毒感染
C．可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒
D．采用无成瘤性细胞生产疫苗，是为了避免疫苗中有致瘤DNA的污染
4．(2024·北京卷)我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。相关叙述错误的是( )
A．实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能
B．实验过程中使用的培养基含有糖类
C．类囊胚的获得利用了核移植技术
D．可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育
5．(2025·山东卷)利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛的过程如图所示，下列说法错误的是( )
A．对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞
B．卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅰ中期进行
C．培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液
D．可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛
6．(2025·云南卷)孕酮具有促进子宫内膜增生，为受精卵着床做准备的作用。某奶牛场发现一头高产奶量母牛生产两胎后重复配种均未成功妊娠，该牛可正常排卵但孕酮量低于正常母牛。为获得该母牛的后代，下列说法正确的是( )
A．运用体外受精或人工授精技术可提高该牛的妊娠率
B．使用外源促性腺激素处理该牛获得更多卵子进而可获得多枚胚胎
C．体外受精或人工授精后形成受精卵移植到健康受体可提高存活率
D．使用该牛MⅡ期卵母细胞的细胞核进行核移植一定可以获得可育后代
7．紫杉醇是一种重要的抗癌药物，主要来源于红豆杉属植物。为了提高紫杉醇的产量，研究人员利用植物细胞培养技术进行生产，部分流程如图。下列叙述正确的是( )
A．激素的种类、浓度和比例等会影响过程①
B．生产过程中需要对外植体做彻底的灭菌处理
C．紫杉醇在细胞内大量积累有利于提高其产量
D．该生产过程利用的原理是植物细胞的全能性
8．肿瘤类器官是将从患者肿瘤组织分离获得的肿瘤细胞(包括肿瘤干细胞)经一定培养后形成的微型肿瘤模型，其具有与肿瘤来源组织相似的结构特征和功能特性。下列叙述正确的是( )
A．可用胰蛋白酶处理肿瘤组织以获得单细胞悬液
B．培养肿瘤细胞时会出现细胞贴壁和接触抑制
C．体外培养获得的肿瘤类器官不具有分化能力
D．该肿瘤类器官不可用于肿瘤生长机制的研究
9．(2025·广东湛江模拟)Rag2基因缺陷导致大鼠无法产生B、T淋巴细胞。科研人员将正常大鼠的胚胎干细胞(ES细胞)注射到Rag2基因缺陷大鼠的桑葚胚中，使其产生具有正常ES细胞来源的淋巴细胞群的体细胞嵌合体，从而补充其缺失的淋巴细胞，其过程如图所示。下列分析正确的是( )
A．嵌合体大鼠产生的B、T淋巴细胞直接由ES细胞分化而来
B．获得的嵌合体大鼠的大部分细胞的Rag2基因没有缺陷
C．注入桑葚胚的ES细胞在囊胚期主要存在于内细胞团
D．该实验最终获得了嵌合体大鼠证明ES细胞具有全能性
10．(2025·安徽合肥模拟)为降低治疗人肺癌药物的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体—药物偶联物(ADC)，过程如图所示。下列叙述错误的是( )
A．图示注射的特定抗原应该是肺癌细胞特有的
B．①过程可在无菌条件下采用灭活病毒诱导融合
C．悬浮培养杂交瘤细胞时，接触抑制会使分裂受阻
D．该ADC能与肺癌细胞结合，源于其抗体的特异性
11．甲流主要是由甲型H1N1流感病毒(RNA病毒)引起的急性呼吸道传染病。为研制H1N1病毒疫苗，科研人员以牛为实验材料进行如下操作，并从牛奶中获取抗原蛋白。下列叙述正确的是( )
A．过程①为逆转录，需要脱氧核糖核苷酸和逆转录酶
B．细胞1为成熟的卵细胞，该细胞含一整套遗传信息
C．过程②的培养液中需加抗生素以防止代谢产物积累
D．过程③为胚胎分割，囊胚期的性别鉴定需取样内细胞团
12．(2025·湖北黄冈模拟)目的基因的单链DNA片段(ss-DNA)可作为探针，在科研和医学检测等方面有重要应用。利用不对称PCR技术可制作大量的探针ss-DNA，其基本原理是采用数量或浓度不同的一对引物(引物①和引物②)，经若干次循环后，低浓度的引物首先被消耗完毕，之后的循环只能产生高浓度引物的延伸产物，结果产生了大量的ss-DNA，下列有关叙述正确的是( )
A．制作探针ss-DNA需要检测目的基因的全部碱基排列顺序
B．若引物①与ss-DNA结合，则PCR仪中引物①的数量大于引物②的数量
C．在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活引物与母链碱基互补配对
D．PCR扩增目的基因时，若复性的温度过高，可能得不到ss-DNA
13．(14分)(2025·四川广安二模)干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因技术将大肠杆菌的耐旱基因(mtlD)整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。
限制酶 识别序列及切割位点(5'→3')
BamHⅠ G↓GATCC
BclⅠ T↓GATCA
SmaⅠ CCC↓GGG
(1)可采用PCR技术扩增目的基因，PCR扩增的原理是___________________________________________________________________。
在反应体系中除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入____________________________。
(2)为了保证mtlD基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD基因的引物时，应在两种引物的5'端分别添加________限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物为5'－________－3'(含12个碱基序列)。酶切后的目的基因片段和质粒通过________________(填“E．coliDNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)进行连接。
(3)为检测mtlD基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaⅠ和________进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现________个条带，则说明插入成功。
(4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法：____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
课后限时作业(八)[B卷]
1．D [动物细胞培养时，为增大细胞与培养液的接触面积，需要制备细胞悬液，A不符合题意；置于5%CO2等适宜条件下培养，其中5%的CO2可维持培养液的pH，B不符合题意；在成纤维细胞传代培养过程中需要通过离心收集细胞，C不符合题意；不能使用胰蛋白酶消化支架，避免将上皮细胞片层分离成单独细胞，D符合题意。]
2．B [从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为原代细胞，A错误；将特定基因或将特定蛋白导入已分化的T细胞可诱导其形成iPS细胞，B正确；将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合后形成的细胞不一定是能分泌所需抗体的细胞，如骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合形成的细胞，C错误；囊胚期的细胞已开始分化，D错误。]
3．B [根据题意，与贴壁生长的细胞培养相比，XF06悬浮培养能更充分利用空间，有利于提高细胞密度，从而提升生产疫苗的效率，A正确；细胞贴壁生长特性的改变是由遗传物质改变引起的，不是流感病毒感染导致的，B错误；细胞裂解液中，流感病毒和其他细胞裂解物的密度、质量等性质不同，可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒，C正确；根据题意可知，无成瘤性MDCK细胞经多代培养不会发生癌变，采用无成瘤性细胞生产疫苗，能避免疫苗中有致瘤DNA的污染，D正确。]
4．C [体外诱导食蟹猴胚胎干细胞， 形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，证实了食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能，A正确；实验过程中使用的培养基需含有糖类，糖类可为细胞培养提供能源物质，B正确；类囊胚的获得利用了动物细胞培养技术，并没有进行核移植，C错误；可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续胚胎发育，从而可以用来研究类囊胚的后续发育，D正确。]
5．B [胚胎工程中，往往需要对雌性供体进行超数排卵处理，即注射促性腺激素促使其产生更多的卵母细胞，A正确。卵母细胞培养至MⅡ期(减数分裂Ⅱ中期)进行去核，B错误。动物细胞培养时，培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，C正确。PCR技术可以检测受体细胞中是否导入目的基因，因此也可用RCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛，D正确。]
6．C [该母牛孕酮量低于正常母牛，子宫内膜增生可能不足，不利于受精卵着床，即使运用体外受精或人工授精技术，也难以提高妊娠率，A错误；使用外源促性腺激素处理该牛，可促使其超数排卵，获得更多卵子，但孕酮量低于正常母牛，受精卵难以成功着床，B错误；该牛可正常排卵但孕酮量低于正常母牛，故体外受精或人工授精后形成受精卵移植到健康受体可提高存活率，C正确；使用该牛MⅡ期卵母细胞的细胞核进行核移植，MⅡ期卵母细胞同源染色体已分离，不一定能获得可育后代，D错误。]
7．A [激素的种类、浓度和比例等会影响过程①脱分化，A正确；生产过程中需要对外植体做彻底的消毒处理，B错误；紫杉醇是次生代谢产物，不能在细胞内大量积累，C错误；该生产过程没有获得完整植株或各种细胞，没有利用植物细胞的全能性，D错误。]
8．A [制备细胞悬液时，可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织块使细胞分散开，A正确；贴附性细胞培养时会出现细胞贴壁和接触抑制现象，但肿瘤细胞一般表现出贴壁依赖性减弱或丧失以及接触抑制缺失，B错误；肿瘤类器官是将从患者肿瘤组织分离获得的肿瘤细胞(包括肿瘤干细胞)经一定培养后形成的微型肿瘤模型，具有与肿瘤来源组织相似的结构特征和功能特性，所以可推测体外培养获得的肿瘤类器官具有分化能力，C错误；肿瘤类器官具有与肿瘤来源组织相似的结构特征和功能特性，可用于肿瘤生长机制的研究，D错误。]
9．C [嵌合体大鼠中供体来源的ES细胞可分化形成造血干细胞，再分化成淋巴细胞，A错误；获得的嵌合体大鼠的大部分细胞还是有Rag2基因缺陷，B错误；桑葚胚注入的ES细胞在囊胚期主要存在于内细胞团，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，C正确；该实验获得的嵌合体大鼠是由大鼠胚胎发育而来，并不是ES细胞发育而来，不能体现其全能性，D错误。]
10．C [在构建抗体—药物偶联物(ADC)时，注射的特定抗原应该是肺癌细胞特有的，这样才能确保产生的抗体能够特异性地识别和结合肺癌细胞，A正确。在单克隆抗体制备过程中，①过程是细胞融合，通常采用灭活病毒(或PEG)诱导B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。这一过程需要在无菌条件下进行，以避免污染，B正确。接触抑制是指贴壁细胞在培养过程中，当细胞密度达到一定程度时，细胞会停止分裂，悬浮培养杂交瘤细胞时，细胞不会受到接触抑制的影响，C错误。ADC能够与肺癌细胞结合，是因为其抗体部分具有特异性，能够识别并结合肺癌细胞表面的特定抗原，D正确。]
11．A [该病毒遗传物质为RNA，抗原基因为DNA，过程①为逆转录，需要脱氧核糖核苷酸和逆转录酶，A正确；要从牛奶中获取抗原蛋白，需要培养转基因牛，因此需要把重组质粒导入受精卵，因为受精卵具有全能性，细胞1为受精卵，B错误；过程②的培养液中加抗生素是为了防止杂菌污染，防止代谢产物积累需要定期更换培养液，C错误；性别鉴定需取样滋养层细胞，并不是内细胞团，可以减少对胚胎的损伤，D错误。]
12．D [制作探针ss-DNA时，不需要知道目的基因的全部碱基排列顺序，只需要知道目的基因两端的碱基序列，以便合成两种引物，A错误；若引物①与ss-DNA结合，则引物①延伸的单链与ss-DNA互补，数量应该较少，故PCR仪中引物①的数量要小于引物②的数量，B错误；在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶，C错误；PCR扩增目的基因时，若复性的温度过高，则引物与模板母链无法通过氢键形成碱基对，使后面的延伸无法进行，DNA分子无法复制，得不到ss-DNA，D正确。]
13．解析：(1)PCR扩增的原理是DNA的半保留复制，在PCR反应体系中，除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入引物(为DNA聚合酶提供合成的起始位点)和耐高温的DNA聚合酶(能在高温下催化DNA合成)。(2)为将图中质粒和mtlD基因正确连接构建重组质粒，设计mtlD基因的引物时，由于目的基因中间有BclⅠ的识别序列，因此不能在引物中设计该序列，而只能选择与该限制酶能产生相同黏性末端的限制酶BamHⅠ，即需要在两种引物的5′端分别添加BamHⅠ、SmaⅠ酶的识别序列，所以在设计mtlD基因转录模板链的引物时，5′端应添加BamHⅠ限制酶的识别序列G↓GATCC，转录模板链的引物为5′—GGATCCATCTAC—3′，酶切后的目的基因片段和质粒通过T4 DNA连接酶进行连接。因为T4 DNA连接酶连接平末端的效率高。(3)结合(2)可知，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaⅠ和BamHⅠ进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现2个条带，则说明插入成功。(4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，可以将玉米栽种在干旱的环境中，看玉米能否正常生长。
答案：(除标注外，每空2分，共14分)(1)DNA的半保留复制 引物和耐高温的DNA聚合酶 (2)BamH Ⅰ和Sma Ⅰ GGATCCATCTAC T4 DNA连接酶 (3)BamHⅠ(1分) 2(1分) (4)将玉米栽种在干旱的环境中，看玉米能否正常生长热点拓展作业(八) 生物技术与工程
(建议用时：40分钟；本套共8小题，共60分。第1~4小题，每小题3分；第5、8小题，每小题10分；第6小题12分；第7小题16分。)
1．(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( )
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
2．安莎霉素主要用于治疗结核分枝杆菌导致的肺部感染。该抗生素是一种产自深海的赖氨酸缺陷型放线菌所产生的。为筛选出能产安莎霉素的菌种，科研工作者用紫外线对采自深海的放线菌进行诱变与选育，实验的部分流程如下图所示。下列叙述正确的是( )
注：原位影印可确保在一系列平板培养基的相同位置上接种并培养出相同菌落。
A．经过A处理，试管中大多数放线菌都可产生安莎霉素
B．在①中进行扩大培养时，接种后需对培养基进行灭菌处理
C．②和④是完全培养基，③是缺赖氨酸的不完全培养基
D．D菌落不能产生安莎霉素，而E菌落能产生安莎霉素
3．双特异性抗体，简称双抗，可同时与癌细胞和免疫细胞特异性结合，它一端与癌细胞结合，一端与T细胞结合，将T细胞拉近癌细胞，大大提高了杀灭癌细胞的效率。某些种类癌细胞表面有高表达的银蛋白PSMA；CD28位于T细胞表面，与抗体结合后，其免疫功能得到激活。研究者尝试构建双抗PSMA—CD28，设计流程如图所示，序号代表过程。下列说法错误的是( )
A．过程①使用到特定的选择培养基，过程②进行克隆化培养和抗体检测
B．过程③注射的抗原A是CD28，目的是使小鼠产生能分泌特定抗体的B淋巴细胞
C．图中“筛选②”所获得的细胞为杂交瘤细胞，既能大量增殖又能产生特异性抗体
D．过程⑤提取获得的双抗PSMA—CD28能准确识别并特异性结合多种抗原
4．(2025·新疆乌鲁木齐二模)下图表示用荧光PCR法检测目的DNA的过程。在PCR反应体系中，加入足量与目的DNA部分序列互补的探针，探针包含一段脱氧核苷酸单链和发光基团，在完整的探针中发光基团不发光。在PCR过程中，当子链延伸到探针处时，Taq DNA聚合酶催化探针水解并释放发光基团，此时发光基团能发光。下列叙述错误的是( )
A．PCR的每一次循环包含变性、复性和延伸三步
B．探针和引物在目的DNA单链上的结合位点不同
C．Taq DNA聚合酶沿着子链5'→3'的方向催化氢键的形成
D．经历相同的循环次数，起始目的DNA量越多荧光强度越强
5．(10分)(2025·北京西城二模)近年来，因高糖高脂饮食造成的高血脂症人数逐年上升，且趋于年轻化。高血脂症典型特点是血浆中胆固醇含量偏高。
(1)胆固醇与磷脂都属于________物质，与________等共同参与细胞膜的构成。
(2)由H基因编码的H酶是胆固醇合成的关键酶。如图1所示，当细胞内胆固醇含量高时，SP复合物被锚定在内质网膜上。当胆固醇含量低时，SP转移至高尔基体膜上被酶切，产生的转录因子与启动子结合，调控H基因的转录。用于治疗高血脂症的他汀类药物能抑制H酶活性，但疗效不理想，原因是细胞内胆固醇合成存在____________机制，导致使用他汀类药物后胆固醇代偿性增加。
(3)我国科学家发现小肠细胞能合成并分泌肠脂抑素(C)，给小鼠注射0.2 mg·Kg-1 C能显著降低血浆中胆固醇含量。通过特定技术检测到肝脏、肾脏、骨骼肌细胞存在____________，证明C是一种新发现的激素。
(4)给正常小鼠注射不同剂量C，H基因转录水平如图2所示。利用高血脂症模型鼠进行多组实验，检测不同药物的治疗效果，结果如图3所示。请分析C与他汀类药物联合使用治疗效果最佳的原因：____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
6．(12分)(2025·甘肃白银三模)拟南芥是科学研究中的模式植物。某科研人员将黄粉虫细胞内的抗冻蛋白基因TmAFP与Ti质粒连接形成基因表达载体导入拟南芥细胞中，以获得耐低温拟南芥，过程所用的基因、Ti质粒、限制酶的识别序列及切割位点如图1所示。请回答下列问题：
(1)对TmAFP基因进行PCR扩增，在PCR反应体系中加入的缓冲液中含有Mg2+，Mg2+的作用是________________________________________________________
___________________________________________________________________。
利用PCR的方法扩增TmAFP基因时需要引物，引物的作用是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(2)为了使TmAFP基因插入Ti质粒，设计引物时需要在A端引物的5'端和B端引物的5'端分别添加______________(填限制酶)的识别序列。结合目的基因的部分碱基序列，请设计引物的碱基序列。
引物1(A端的引物)：5'－____________－3'；
引物2(B端的引物)：5'－____________－3'。
(3)为了筛选出成功导入含抗冻蛋白基因TmAFP的重组质粒的农杆菌，一般可进行如下步骤。
第一步：让农杆菌在含________的培养基上培养，得到如图2所示的菌落。
第二步：再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含________的培养基上培养，得到如图3所示的结果(空圈表示与图2对照无菌落的位置)。
第三步：选出图2培养皿中的某些菌落进行培养，即可得到含重组质粒的农杆菌。其中图2中的菌落________(填数字)表示含重组质粒的农杆菌。
7．(16分)(2025·河南周口三模)3-岩藻糖基乳糖(3-FL)是一种母乳低聚糖，工业上用大肠杆菌K-12菌株发酵生产，结构与母乳中的3-FL完全一致，主要用于婴幼儿配方奶粉。回答下列问题：
(1)α-1，3-岩藻糖基转移酶基因是培育大肠杆菌K-12菌株的核心目的基因，______________可作为它进入受体细胞的“分子运输车”，而菌体常用________处理。大肠杆菌K-12菌种扩大培养后，采用____________等方法进行分离和干燥。
(2)培育的大肠杆菌K-12菌株出现了α-1，3-岩藻糖基转移酶基因表达水平低的现象，这可能与__________________有关，也可能与大肠杆菌对密码子的偏好性(生物在翻译过程中对决定相同氨基酸的不同密码子的使用频率存在差异)有关，密码子的偏好性主要由细胞质中对应的________的数量决定。
(3)研究发现，将编码精氨酸的稀有密码子AGA替换为高频密码子CGC，酶表达量能提高1.5~2倍。利用重叠延伸PCR技术可以实现对目的基因的优化，即分段扩增含突变位点的DNA片段，通过重叠序列连接生成完整的突变基因。过程如图：
通过①过程形成2个图示突变基因片段需要________(填“2种”或“4种”)引物，而要实现②过程，设计的有关引物还需要满足的两个要求是___________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
③过程能够延伸形成优化目的基因的重叠序列是________(填“a”或“b”)。
(4)若稀有密码子没有同义高频密码子，密码子替换要尽量满足的条件是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
8．(10分)(2024·北京卷)学习以下材料，回答(1)~(4)题。
筛选组织特异表达的基因
筛选组织特异表达的基因，对研究细胞分化和组织、器官的形成机制非常重要。“增强子捕获”是筛选组织特异表达基因的一种有效方法。
真核生物的基本启动子位于基因5'端附近，没有组织特异性，本身不足以启动基因表达。增强子位于基因上游或下游，与基本启动子共同组成基因表达的调控序列。基因工程所用表达载体中的启动子，实际上包含增强子和基本启动子。
很多增强子具有组织特异的活性，它们与特定蛋白结合后激活基本启动子，驱动相应基因在特定组织中表达(图A)。基于上述调控机理，研究者构建了由基本启动子和报告基因组成的“增强子捕获载体”(图B)，并转入受精卵。捕获载体会随机插入基因组中，如果插入位点附近存在有活性的增强子，则会激活报告基因的表达(图C)。
获得了一系列分别在不同组织中特异表达报告基因的个体后，研究者提取每个个体的基因组DNA，通过PCR扩增含有捕获载体序列的DNA片段。对PCR产物进行测序后，与相应的基因组序列比对，即可确定载体的插入位点，进而鉴定出相应的基因。
研究者利用各种遗传学手段，对筛选得到的基因进行突变、干扰或过表达，检测个体表型的改变，研究其在细胞分化和个体发育中的作用，从而揭示组织和器官形成的机理。
(1)在个体发育中，来源相同的细胞在形态、结构和功能上发生____________的过程称为细胞分化，分化是基因____________的结果。
(2)对文中“增强子”的理解，错误的是________。
A．增强子是含有特定碱基序列的DNA片段
B．增强子、基本启动子和它们调控的基因位于同一条染色体上
C．一个增强子只能作用于一个基本启动子
D．很多增强子在不同组织中的活性不同
(3)研究者将增强子捕获技术应用于斑马鱼，观察到报告基因在某幼体的心脏中特异表达。鉴定出捕获载体的插入位点后，发现位点附近有两个基因G和H，为了确定这两个基因是否为心脏特异表达的基因，应检测________________________________。
(4)真核生物编码蛋白的序列只占基因组的很少部分，因而在绝大多数表达报告基因的个体中，增强子捕获载体的插入位点位于基因外部，不会造成基因突变。研究者对图B所示载体进行了改造，期望改造后的载体随机插入基因组后，在“捕获”增强子的同时，也造成该增强子所调控的基因发生突变，以研究基因功能。请画图表示改造后的载体，并标出各部分名称。核心点1 发酵工程
1．厘清“3”种传统食品的制作技术
2．微生物培养中的无菌操作技术
3．两种纯化细菌方法的比较
4．酵母菌的纯培养及微生物分离与计数的实例
5．发酵工程的基本环节
6．啤酒的工业化生产流程
(1)啤酒发酵的工业化生产流程及操作目的
(2)“精酿”啤酒与“工业”啤酒的区别
1．使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一。(2025·河南卷) ( )
2．食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖越快发酵产物产率越高。(2025·河南卷) ( )
3．醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶。(2024·湖北卷) ( )
4．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境。(2023·北京卷) ( )
5．检测泡菜中亚硝酸盐的含量，可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低。(2023·山东卷) ( )
6．采集果园土壤进行微生物分离或计数。稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数。(2025·湖南卷) ( )
7．采集果园土壤进行微生物分离或计数。完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照。(2025·湖南卷) ( )
8．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落。(2024·河北卷)( )
9．研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，最可能筛选到目标菌的条件组合是c点时取样、角蛋白氮源培养基。(2023·广东卷) ( )
10．脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖。(2024·浙江6月卷) ( )
11．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。(2022·山东卷) ( )
12．啤酒的工业化生产中，焙烤是为了利用高温杀死大麦种子的胚并进行灭菌。(2022·山东卷)( )
13．选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是____________________________________________________________________
______________________________________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG(卡拉胶酶)活性最高的菌种。(2025·河南卷)
14．米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的________、________能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和________。(2021·全国乙卷)
15．从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯(一种磷脂类物质)为唯一碳源制备________培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有________、________、________等营养物质。(2024·江西卷)
16．有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明________________________________。(2023·北京卷)
17．将获得的能够高产磷脂酶的微生物接种到鉴别培养基(在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂)平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。(2024·江西卷)
核心点2 细胞工程
1．植物组织培养技术——原理：植物细胞的全能性
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会__________。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)图中过程①用______________处理去除细胞壁，得到的原生质体包括细胞膜、细胞质和细胞核三部分。
(2)酶解去壁前用较高渗透压溶液处理细胞：使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
(3)图中过程②的诱导方法有__________、离心法、__________________、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生质体融合成功的标志是____________________。
3．动物细胞培养——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
②区分原代培养和传代培养的关键是：是否分瓶培养。
(2)干细胞
4．单克隆抗体的制备
(1)3种细胞特点不同：①B淋巴细胞：能产生抗体，不能大量增殖。②骨髓瘤细胞：能迅速大量增殖，不能产生抗体。③杂交瘤细胞：既能产生抗体，又能迅速大量增殖。
(2)两次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
5．动物体细胞核移植技术
提醒：核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起表型改变。
6．胚胎工程的操作流程
7．胚胎移植的生理学基础
8．胚胎分割
1．利用组织培养技术实现兰花的快速繁殖和优良性状的保持。(2025·河北卷) ( )
2．细胞分裂素和生长素的比例会影响愈伤组织的形成。(2025·黑吉辽蒙卷) ( )
3．芽原基细胞由于基因选择性表达，不能用作外植体。(2025·黑吉辽蒙卷) ( )
4．佝偻病伴发的手足抽搐症状与人体内某种元素缺乏有关。该元素还可以用于诱导原生质体融合。(2025·陕晋青宁卷) ( )
5． 大豆叶片细胞的细胞壁被酶解后，获得的原生质体失去全能性。(2024·北京卷) ( )
6．体细胞杂交获得的杂种植株细胞具有来自亲本的2个细胞核。(2024·山东卷) ( )
7．研究者通过体细胞杂交技术，探索利用条斑紫菜和拟线紫菜培育杂种紫菜。从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶，用于去除细胞壁。(2023·江苏卷) ( )
8．次生代谢物是植物所必需的，但含量少，应选择产量高的细胞进行培养。(2023·山东卷) ( )
9．人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合。(2023·广东卷) ( )
10．在没有CO2的有氧环境中进行胚胎干细胞培养。(2025·河北卷) ( )
11．动物细胞培养基一般呈淡红色。某次实验时，调控pH的CO2耗尽，培养基转为黄色。由此推断使培养基呈淡红色的是酸碱指示剂。(2025·北京卷) ( )
12．大量悬浮培养产流感病毒的单克隆细胞，培养基pH不会影响单克隆细胞的病毒产量。(2023·辽宁卷) ( )
13．营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制。(2023·海南卷) ( )
14．研究者制备单克隆抗体过程要筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞。(2023·北京卷) ( )
15．甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，需要制备用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷) ( )
16． 生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊，对提供精子的波尔公山羊无需筛选。(2024·湖北卷) ( )
17．科学家采用体外受精技术获得藏羚羊胚胎，此过程涉及的操作可能包括超数排卵和精子获能处理。(2023·广东卷) ( )
18．在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术，其中胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷) ( )
19．科研人员通过对绵羊受精卵进行基因编辑和胚胎移植等操作，获得了羊毛长度显著长于对照组的优良品系。(2025·陕晋青宁卷)
(1)为获取足够的卵子，需对供体绵羊注射促性腺激素进行超数排卵处理。 ( )
(2)受精卵发育至桑葚胚阶段，细胞数量和胚胎总体积均增加。 ( )
20．研究显示，约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期，且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。(2025·黑吉辽蒙卷)
(1)移植前胚胎发育率低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态。 ( )
(2)胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化。 ( )
21．与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________。(2023·湖北卷)
核心点3 基因工程
1．基因工程的基本工具
提醒：两种不同的限制酶切割不同的DNA片段，产生相同的黏性末端，这两种限制酶称为同尾酶。
2．限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后仍有标记基因)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
3．基因工程的基本操作程序
提醒：辨析农杆菌转化法中的“两次拼接与两次导入”
①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
4．蛋白质工程
5．DNA的粗提取与鉴定
6．PCR技术
7．DNA片段的电泳鉴定
提醒：DNA电泳鉴定中的“两液两剂”
①电泳缓冲液维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质，影响物质的电泳迁移率。②凝胶载样缓冲液(内含指示剂)主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置，有助于判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。③核酸染料是用来染色DNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带。
1．构建重组质粒需要使用DNA连接酶。属于DNA连接酶底物。(2023·湖北卷) ( )
2．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中。(2024·山东卷) ( )
3．关于“DNA 粗提取与鉴定”的实验，利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA。(2024·安徽卷) ( )
4．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。(2024·河北卷) ( )
5．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。(2023·全国乙卷) ( )
6．采用PCR方法进行目的基因监测，延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(2022·辽宁卷) ( )
7．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(2024·河北卷)( )
8．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小。在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快。(2024·吉林卷) ( )
9．图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为。
(2025·江苏卷)
(1)用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同。 ( )
(2)用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致。 ( )
10．要使基因ccdB(目的基因)在IR3C(受体细胞)中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有____________________________________________。(2025·云南卷)
11．可采用________技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要__________、____________、__________等“分子工具”。(2024·江西卷)
12．质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________________。(2024·全国甲卷)
13．某同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。(2024·全国甲卷)
14．将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是____________________________________________________________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。(2024·全国甲卷)
15．我国研究人员尝试用三菌混菌体系建立生产维生素C的一步发酵法。在氧化葡糖杆菌(原始菌MCS)中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图。(2025·云南卷)
绘制图需统计活菌数，常用方法是________________________。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是__________________，开始发挥作用的时间是__________，判断理由是___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
16．已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG(卡拉胶酶)的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
________。(2025·河南卷)
17．锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。转基因酵母功能鉴定：分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用________法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.000 6，然后各取10 μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为________________________。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______________，依据是______________________________________________________________
___________________________________________________________________。(2024·浙江1月卷)
注：OD600为波长600 nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
1/1热点1 微生物鉴定与筛选中的各种“圈”(透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈)、影印培养
1．(2024·甘肃卷节选)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶(如下图)，研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是______________________________________________________
___________________________________________________________________。
高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(2)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________(答出两点)。
生物质 原料 降解率(%) 协同系数
酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦 秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米 秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物。
2．(2024·安徽卷)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题：
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(2)使用BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是_______________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的____________________，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L-1和15 g·L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L-1、100 g·L-1、110 g·L-1)和酵母粉(12 g·L-1、15 g·L-1、18 g·L-1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置________(填数字)组实验(重复组不计算在内)。
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经________________，最终获得发酵产品。
创新解读
1．在高考题中，我们常常会遇到与微生物鉴定与筛选相关的题目，其中透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈等概念频繁出现，成为考查的重点。像是通过透明圈筛选能分解特定底物的微生物，利用变色圈判断微生物是否产生特定代谢产物，依据抑菌圈筛选抗生素产生菌，借助生长圈选育特定营养物质的生产菌，这些都是高考中常见的考查角度。
2．而在实际的科研与生物技术应用领域，这些微生物鉴定与筛选中的“圈”同样发挥着至关重要的作用。并且，影印培养技术也在微生物研究中有着独特的应用，它能够实现对微生物菌落的复制，从而进行多种条件下的对比培养。这些看似基础的微生物知识，正不断拓展和深化，在现代生物技术发展中绽放新的活力，其应用范围也在不断扩大，与基因工程、发酵工程等前沿生物技术紧密相连，推动着相关领域的发展。
1．抑菌圈
(1)原理：待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。
(2)关键指标分析
2．透明圈
(1)原理：在固体培养基中掺入可被特定菌利用的营养成分M，造成浑浊、不透明的培养基背景。同时加入能与M形成有色复合物的染色剂，待筛选菌的菌落周围会形成透明圈。
(2)实验：纤维素能与刚果红形成红色复合物，但其水解产物纤维二糖和葡萄糖不能与刚果红形成红色复合物。在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，接种土壤微生物培养，菌落周围出现透明圈，说明这些细菌能分解纤维素。
(3)关键指标分析
3．生长圈
(1)原理：利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌，工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。
(2)关键指标分析
4．变色圈
(1)原理：将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养时，目的菌株代谢物使指示剂变色，在菌落周围形成变色圈。
(2)实例
①分离尿素分解菌：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。接种土壤微生物(产生脲酶)培养，菌落周围出现红色，说明该细菌能够分解尿素。
②分离谷氨酸产生菌：在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，当pH在6.2以下时为黄色，pH 7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。
5．影印平板培养法
(1)定义：影印平板培养法是一种微生物培养技术，其通过特定的操作方式，实现在一系列培养皿的相同位置上接种并培养出相同遗传型的菌落。
(2)过程：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有一层灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其均匀地沾满来自母种培养皿平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择培养基平板上。经培养后，对各平板相同位置上的菌落进行对比，就可选出适当的突变型菌株。
(3)实例：以培养某种大肠杆菌(如转胰岛素基因大肠杆菌)为例
①选择具有标记基因青霉素抗性基因和四环素抗性基因，同时限制酶切点在青霉素抗性基因内部的质粒作载体，与目的基因构建表达载体。
②得到两种质粒：原有质粒重新连接而成的空质粒和重组质粒。
③将所得质粒与没有青霉素、四环素抗性的大肠杆菌混合、转化，将得到三种大肠杆菌，即未转化的大肠杆菌、导入空质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌。
④将所得大肠杆菌培养，增加数量。然后接种到完全培养基上，得如图所示的6个菌落。
⑤用影印接种法将菌落分别接种到含有四环素和青霉素的培养基上，培养结果如图。
⑥结果分析：2号、5号菌落无法在两种培养基上生存，说明所含大肠杆菌没有抗性基因，即所含大肠杆菌为未转化的大肠杆菌；1号、4号、6号菌落在两种培养基中均能生存，说明其大肠杆菌两种抗性都有，即所含大肠杆菌为导入空质粒的大肠杆菌；3号菌落能在含四环素的培养基上生存，说明其含有四环素的抗性，不能在含青霉素的培养基上生存，说明不含有青霉素的抗性(青霉素抗性基因酶切插入目的基因后丧失其作用)，综合分析其大肠杆菌含有重组质粒。3号菌落所含大肠杆菌即是要选择培养的大肠杆菌。
1．(2025·甘肃平凉模拟)牛瘤胃中的微生物包括细菌、产甲烷菌、真菌等，其中细菌包括纤维降解菌、淀粉降解菌、半纤维降解菌等。刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但不与纤维素水解产物发生这种反应。将从牛瘤胃中获取的四种微生物接种在含有刚果红—纤维素复合物的培养基中，培养在有氧环境中，一段时间后出现如图所示结果。下列说法错误的是( )
A．在含有土豆汁的培养基中加入纤维素粉和刚果红可制备该培养基
B．从培养基的功能来分，该培养基的种类是鉴别培养基
C．四种微生物中，d种微生物分解纤维素的能力最强，且在牛瘤胃中数量最多
D．对a种微生物扩大培养时，通常使用液体培养基，可提高营养物质的利用率
2．幽门螺杆菌(Hp)属于一类致癌物，Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能合成其特有的Ipp20蛋白质，科研人员据此利用基因工程制备Hp疫苗，该过程所选择的质粒及操作步骤如图所示。回答下列问题：
(1)通过PCR扩增Ipp20基因的反应需要在________液中进行，扩增Ipp20基因时的基本条件包括DNA模板、原料、耐高温的DNA聚合酶、________等。
(2)在PCR反应体系中一般需要加入Mg2+，原因是____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
科研人员探究了不同浓度的Mg2+对PCR扩增效果的影响，结果如表所示。科研人员认为PCR反应高效进行，Mg2+浓度并不是越高越好，据表分析，依据是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
Mg2+浓度 /(mmol·L-1) 0 2 3 4 5 6
Ipp20基因 相对含量 － ＋ ＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋
注：“－”表示未检测到基因，“＋”表示检测到Ipp20基因，且“＋”越多，检测到的含量越多。
(3)已知在构建基因表达载体时使用了限制酶Xho Ⅰ和Xba Ⅰ切割质粒和Ipp20基因。科研人员采用了影印法筛选含有目的基因的大肠杆菌，即使用无菌的线毡布压在培养基A(添加潮霉素)的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B(添加氯霉素)上。根据图示结果分析，含有目的基因的大肠杆菌应从培养基________中获取，理由是_______________________________________________________
___________________________________________________________________，
且符合要求的大肠杆菌菌落是________(填培养基中数字)。
热点2 单抗与双抗的制备及应用、抗原检测——双抗体夹心法
1．(2025·甘肃卷)肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种细胞因子，高浓度时可以引发疾病。研究者利用细胞工程技术制备了TNF-α的单克隆抗体，用于治疗由TNF-α引发的疾病，制备流程如下图。下列叙述正确的是( )
A．①是从小鼠的血液中获得的骨髓瘤细胞
B．②含未融合细胞、同种核及异种核融合细胞
C．③需用特定培养基筛选得到大量的杂交瘤细胞
D．④需在体外或小鼠腹腔进行克隆化培养和抗体检测
2．(2022·山东卷)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是( )
A．双抗可同时与2种抗原结合
B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞
C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原
D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞
创新解读
1．在高考生物学的试题中，双抗的制备及应用、抗原检测——双抗体夹心法，常常作为考查生物技术与工程板块知识的重要考点出现。从制备双抗时对动物细胞融合技术的考查，到双抗体夹心法中抗原抗体特异性结合原理的剖析，这些知识点以选择题、简答题等形式，检验着大家对生物学基础理论和实验操作的理解。比如在单克隆抗体的制备流程里，从抗原注射到小鼠体内获取B淋巴细胞，再到与骨髓瘤细胞融合筛选出杂交瘤细胞，每个步骤都可能成为高考出题点。
2．在当下的科研热点和实际应用场景中，这些知识正发挥着巨大的作用。双抗凭借其能同时靶向两种抗原的特性，在肿瘤免疫治疗领域取得了突破性进展，为癌症患者带来了新的希望；双抗体夹心法以其高灵敏度和特异性，广泛应用于病毒抗原检测、肿瘤标志物筛查等，在疾病的早期诊断和防控方面扮演着不可或缺的角色。从高考题到热点聚焦，看似是从理论迈向实践，实则是知识的一脉相承与拓展深化，它们共同构建起了现代生物技术蓬勃发展的基石。
1．双抗的制备及应用
(1)双特异性抗体：是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，目前最常利用杂交—杂交瘤的方法来制备。
(2)实例：长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉，其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用。图1是科研人员通过杂交—杂交瘤细胞技术(免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术)生产能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的部分过程，图2是某双特异性抗体作用图。
(3)优点：与直接使用抗肿瘤药物相比，将抗肿瘤药物与双特异性单克隆抗体结合后给药，对人体的副作用更小，原因是双特异性单克隆抗体能将药物送到肿瘤部位，对肿瘤进行特异性杀伤。
2．抗原检测——双抗体夹心法
(1)双抗体夹心法：是一种将两种特异性抗体结合在一起来检测目标抗原或抗体的方法。
(2)基本原理：
①先将一种特异性抗体(捕获抗体)固定在固相载体(如微量滴定板、磁珠等)上，形成固相抗体；
②然后加入待测样本，使样本中的目标抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；
③再加入另一种特异性抗体(检测抗体或酶标抗体)，该抗体与目标抗原的另一个表位结合，形成双抗体夹心结构；
④最后通过加入底物产生颜色反应或触发信号反应(如光信号、电信号)，根据反应的程度进行目标抗原或抗体的定性或定量检测。
1．普通的肿瘤治疗——单克隆抗体(单抗)只能结合单一的抗原，无法有效地聚集于肿瘤组织处。双特异性单克隆抗体(双抗)可以将抗肿瘤的药物直接导至靶细胞，通过靶向多个抗原发挥协同抗肿瘤作用。基因工程制备双抗的原理是对传统单抗进行基因工程方面的改造，从而形成双特异性抗体。利用杂交瘤细胞融合也可以制备双抗，先将每个杂交瘤细胞受抗原刺激产生单克隆抗体，然后将这两个杂交瘤细胞融合在一起，此融合的杂交瘤细胞能够重新随机组合“双亲”单抗肽段，从而产生双抗。下列叙述正确的是( )
A．诱导两个杂交瘤细胞融合，一定会产生双抗
B．基因工程改造传统单抗，操作对象是肽链
C．制备杂交瘤细胞的过程中需要将能分泌特定抗体的浆细胞与骨髓瘤细胞融合
D．相比于普通化疗，双抗治疗能减少药物的用量并降低正常组织的不良反应
2．如图表示双抗体夹心法检测抗原的过程，该方法是医学上常用的定量检测抗原的方法，利用细胞工程技术制备的单克隆抗体能增强该过程的有效性。下列叙述错误的是( )
A．图示两种抗体与样品中待测抗原的结合位点不同
B．温度、pH等会影响双抗体夹心法检测抗原的结果
C．用双抗体夹心法检测抗原需要制备两种能与抗原结合的单克隆抗体
D．双抗体夹心法与只使用单克隆抗体相比，能增加可识别抗原的种类
热点3 同尾酶、启动子与转录调控
1．(2025·河南卷节选)为构建携带cg(高活性卡拉胶酶CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(如图)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E．coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5'端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是___________________________________________________________________
____________________________。限制酶的识别序列和切割位点如下：
2．(2025·广东卷)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及________检测，筛选获得重组菌株W1。
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有__________________(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________________________________。培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为________________________________________________。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
创新解读
1．在高考生物学的试题中，同尾酶、启动子与转录调控等知识是考查基因工程和基因表达相关内容的关键要点。像同尾酶这一概念，常结合基因表达载体的构建进行考查，要求同学们理解不同同尾酶切割DNA后产生相同黏性末端的原理，以及如何巧妙利用这一特性，在不破坏目的基因关键片段的前提下，完成载体与目的基因的连接，防止质粒自身环化，进而实现基因的稳定导入与表达。而启动子和转录调控更是高考命题的热门方向，常常以简答题的形式，让大家阐述启动子作为RNA聚合酶识别、结合位点，如何开启转录过程，以及转录调控中各类顺式作用元件和反式作用因子如何协同，精准控制基因表达的时间和强度，比如乳糖操纵子模型中启动子与操纵基因、阻遏蛋白之间的相互作用，决定了结构基因转录的开启与关闭。
2．当我们将目光从高考题转向科研热点和实际应用场景时，会发现这些知识正不断闪耀着创新的光芒。在生物医药领域，利用同尾酶进行复杂基因片段的拼接，为新型药物研发开辟了新路径；对于启动子与转录调控的深入研究，则助力科学家们设计出更高效、精准的基因治疗方案，通过调控特定基因的表达来攻克疑难病症。从高考考场迈向科研前沿，同尾酶、启动子与转录调控知识不仅是知识的传承，更是科技进步的强大助力，引领着我们探索生命奥秘、改善人类生活。
1．同尾酶
(1)同尾酶，即能切割产生相同末端的限制酶，一般是指能产生相同黏性末端的限制酶。所有平末端酶产生的末端均是相同的，但一般不把它作为同尾酶来研究。同尾酶是不同的酶，它们只是切割DNA产生的末端相同，同尾酶之间的识别序列可以相同也可以不同，但基因工程中识别序列不同的同尾酶的应用性最大。在构建基因表达载体的过程中，若选择的某种限制酶会破坏目的基因或质粒的重要片段时，可尝试使用该酶的同尾酶进行切割。
(2)同尾酶作用特点
同尾酶产生的黏性末端可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接，但是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是，连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点，但是，少数情况下，也能被某一种同尾酶识别并切割。例如，由BamHⅠ和Sau3AⅠ识别和切割的序列分别是5'-ATC-3'，切割重组后，一般不能被BamHⅠ识别和切割，但仍能被Sau3AⅠ识别和切割。
这样用同尾酶进行体外重组时，在限制酶切割反应之后不必将原有的限制酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中原有的限制酶的存在，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷酸反应而得到最高的连接效率，即不需要将5'端突出的磷酸基团消化掉，使质粒载体自身不能形成闭合的环状结构。
2．启动子与转录调控
(1)启动子的类型
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游，启动子本身不被转录。
启动子对转录起始有调节和控制作用，决定着基因表达过程的起始以及在什么条件下开始。
参照转录调控模式，启动子又可以分为：
①组成型启动子，该类启动子能够调控结构基因的表达基本恒定在一定程度上，在不同部位或组织表达水平差异不明显。
②组织特异型启动子，该类启动子的调控作用使得基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，且表现出发育调节的特性。如构建乳腺生物反应器使用的即为乳腺细胞中特异表达基因的启动子。
③诱导型启动子，即在某些特定的物理或化学信号刺激后，基因转录水平在该类型启动子调控下大幅度地提升。目前已经分离了众多启动子如热诱导表达基因启动子、光诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等。
(2)启动子位置及转录模板链的判断
基于图1中的信息能否判断启动子位置及转录模板链 答案是否定的，若要对转录情况做出准确判断，必须要明确以下三个要素：
①链方向
②链性质(编码链或模板链)
③功能区域(启动子或终止子)
确定其中2个要素即可确定第3个要素。
举例分析如下：
a．基于图2中模板链①及其方向，判断启动子的位置。
由于转录产生的RNA新链的合成方向为5'→3'，转录过程的发生是从启动子到终止子，则推导出非编码区2为启动子。
b．基于图3中启动子位置及DNA链的方向，判断模板链位置。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录产生的RNA新链的合成方向为5'→3'，且与模板链反向平行，推导出②为该基因的模板链。
c．基于图4中的模板链(①)及启动子位置，判断DNA链的方向。
转录过程的发生是从启动子到终止子，转录出来的mRNA的5'端位于左侧，3'端位于右侧，由于①为模板链，其与转录产生的mRNA互补，且反向平行，所以①的方向从左至右为3'→5'，②的方向从左至右为5'→3'。
1．(2025·浙江杭州二模)同尾酶指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶；同裂酶指具有相同识别序列的限制酶(切割位点相同或不同均可)。几种基因工程中常用的限制酶如表所示。下列叙述错误的是( )
限制酶的名称 识别和切割位点
HinPⅡ 5'—G↓CGC—3'
GlaⅠ 5'—GC↓GC—3'
HhaⅠ 5'—GCG↓C—3'
HpaⅡ 5'—C↓CGG—3'
NarⅠ 5'—GG↓CGCC—3'
A．HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶，切出的黏性末端不同
B．HinPⅡ和HpaⅡ切割的产物连接后，其序列不能被GlaⅠ切割
C．HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶，它们切割的产物连接后的序列不能被GlaⅠ切割
D．某质粒仅含1个GlaⅠ的识别位点，则该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16
2．种子成熟过程受脱落酸(ABA)等植物激素调控。为研究种子成熟的调控机制，研究者以拟南芥为材料进行了实验。
(1)ABA是对植物生长发育起________作用的微量有机物，其主要作用有___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。(答一点)
(2)研究发现，种子成熟阶段S蛋白和J蛋白均有表达。研究者检测了不同拟南芥种子的成熟程度，结果如图1，根据图分析，S蛋白和J蛋白对种子成熟的调控作用分别是__________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)S蛋白可与J蛋白结合。为探究两蛋白在植物体中的作用关系，研究者在纯化的J蛋白溶液中分别加入野生型及S蛋白缺失突变体的种子细胞裂解液，使用药剂M进行相关处理，检测结果如图2，结果说明：S蛋白可使J蛋白________。
(4)检测发现，S蛋白缺失突变体比野生型体内的ABA含量低。编码S蛋白基因的启动子区有转录调控因子T的结合序列，T可被ABA激活。J蛋白也为一种转录调控因子。为研究T、J蛋白对S蛋白基因表达的调控，研究者构建了图3所示质粒并转化烟草叶肉原生质体，实验结果如图4。
图4结果说明：______________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(5)种子成熟对于种子提高萌发活力等具有重要作用。综合上述研究，分析ABA对种子成熟的调控机制。
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
热点4 PCR技术及其应用
1．(2025·全国卷)为在大肠杆菌中表达酶X，某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0，构建重组质粒PX，并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示，→表示引物5'→3'方向)。
该同学进行PCR实验时，所用模板与引物见下表。实验中①和④的作用是：________；②无扩增产物，原因是______________________________________；③、⑤和⑥有扩增产物，扩增出的DNA产物分别是___________________________________________________________________。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 PX 无 P0 PX
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
2．(2025·河南卷)某二倍体植物松散株型与紧凑株型是一对相对性状，紧凑株型适合高密度种植，利于增产。研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，控制该相对性状的基因为A/a。回答下列问题：
(1)该紧凑株型性状由________(填“A”或“a”)基因控制。
(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图1)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短。造成此现象的原因是____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
(3)研究人员设计了3条引物(P1~P3)，位置如图1(→表示引物5'→3'方向)。以3个F2单株(甲、乙、丙)的DNA为模板，使用不同引物组合进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果分别为图2-A和2-B(不考虑PCR结果异常)。
①图2-A中使用的引物组合是________；丙单株无扩增条带的原因是___________________________________________________________________
____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
②结合图2-A的扩增结果，在图2-B中，参照甲的条带补充乙与丙的电泳条带(将正确条带涂黑)。
③使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型∶无扩增条带松散株型＝________。
创新解读
1．在高考生物学的试卷上，PCR技术一直是个常客。如根据特定的实验目的，设计PCR引物的题目，不仅考查对碱基互补配对原则的理解，还检验能否根据模板DNA的序列，合理设计出能特异性扩增目的基因的引物。还有一些实验分析题，会呈现PCR扩增后产物的电泳结果，要求你根据条带的位置和亮度，判断扩增是否成功、是否存在非特异性扩增等问题，这些都在考查你对PCR技术的掌握程度。
2．PCR技术早已成为生命科学领域的明星技术。从医疗领域的疾病诊断，到科研前沿的基因编辑、生物制药等研究，PCR技术的身影无处不在。它能够在短时间内大量扩增特定的DNA片段，为科学家们深入研究基因的结构和功能提供了关键支持。在刑侦破案中，PCR技术可以从微量的生物样本中提取并扩增DNA，帮助警方锁定犯罪嫌疑人。PCR技术跨越了理论与实践的界限，不断推动着生命科学和社会发展的进步。
1．PCR引物的设计和修饰
(1)PCR引物的设计原则
①引物长度要适宜，通常为20~30个核苷酸。过长会导致其延伸温度大于74 ℃，不适于耐高温的DNA聚合酶进行反应；引物过短特异性差，可导致引物与模版链随机结合。
②引物内部应避免自身互补。引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹状结构(如图)，这种结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。
③引物之间应避免互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补，尤其应避免3'端的互补重叠以防形成引物二聚体(如图所示)。
(2)引物的特异性和修饰
①引物的特异性是指针对目标DNA片段设计出来的引物只能扩增出此目标DNA片段，而不能扩增出其他DNA片段。
②引物的修饰
ⅰ．引物3'端不可修饰。引物的延伸是从3'端开始的，不能进行任何修饰。
ⅱ．引物5'端可以修饰。引物5'端常见修饰包括：添加酶切位点；引入启动子序列、插入突变序列等。
2．实时荧光定量RT-PCR技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。
3．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理：用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如图。
4．巢式PCR
首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物扩增出非目的片段的可能性也极小。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如图。
1．(2025·安徽芜湖二模)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术，其过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B．设计的引物不宜过短，否则扩增的特异性会下降
C．PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子
D．整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
2．荧光定量PCR技术可定量检测样本中核酸含量，其原理是：在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当Taq DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接受到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成(如下图)。Ct值(循环阈值)的含义为：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。下列说法正确的是( )
A．该项技术可用来直接检测样本中新冠病毒核酸的含量
B．Ct值的大小与待测样本中核酸数量成正相关
C．1个双链DNA分子经过3轮循环一共会生成8个荧光分子
D．该PCR技术中DNA聚合酶既催化形成磷酸二酯键，又催化断裂磷酸二酯键
热点5 基因编辑技术
(2025·甘肃卷)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起，严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术，对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”，编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如下图)。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后，可通过______________(方法)将该质粒转入植物细胞，并将____________________整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞，需要在植物组织培养基中添加__________。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为__________，对其消毒时需依次使用酒精和__________处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素，原因是______________________________________________。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用__________技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑；然后，在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较__________来验证抗病性。
(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为____________________________________________________________________
___________________________________________________________________。
创新解读
1．在高考生物学的考场上，基因编辑技术是个频繁出现的考点，常常和遗传定律、基因工程这些知识结合起来考查。比如，给出CRISPR/Cas9系统的作用机制图，让你分析基因编辑过程中DNA的切割与修复原理，或者设计实验利用基因编辑技术探究某个基因的功能。这类题目不仅考查对基因编辑基础知识的掌握，还考验能不能灵活运用这些知识，分析解决实际问题。
2．把视线从高考卷移开，在科研前沿和社会生活里，基因编辑技术早已成为焦点。在医疗领域，基因编辑为攻克疑难杂症带来希望，像镰状细胞贫血、地中海贫血等单基因遗传病，科学家们尝试用基因编辑技术修正致病基因，开启个性化精准医疗的大门。农业方面，它帮助培育更优质、抗逆性更强的农作物品种，保障全球粮食安全。在科研探索中，基因编辑助力解析基因功能，加速新药研发进程。从高考题中对理论知识的考查，到现实里多领域的创新应用，基因编辑技术不断推动生命科学的发展，改变着人类的生活。
1．CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas系统是细菌和古菌在长期演化过程中形成的一种免疫系统，用来抵抗外源遗传物质的入侵，为它们提供获得性免疫。CRISPR/Cas系统可以识别出外源DNA，并将它们切断，沉默外源基因的表达。正是由于这种精确的靶向功能，CRISPR/Cas系统已被开发成一种高效的基因组编辑工具。其中最常见的是CRISPR/Cas9基因编辑技术。
(1)系统构成：向导RNA＋限制性内切核酸酶Cas9。由具有核酸内切酶功能的Cas9蛋白和一条人为重组的一段目的基因的单链向导RNA(SgRNA)组成，向导RNA可以指导Cas9蛋白对靶基因进行敲除、插入和突变修饰。
(2)编辑原理：向导RNA能与基因组DNA中特定碱基序列通过碱基互补配对结合在一起，引导Cas9到特定的基因位点进行切割；通过设计向导RNA中的20个碱基的识别序列，可人为选择DNA上的目标位点进行切割。根据CRISPR/Cas9精准攻击外源DNA的工作原理，就可以实现基因敲除。如果在此基础上为细胞引入一个修复的模板质粒(供体DNA分子)，就可以实现基因的定点突变。
2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图：
3．PCR定点突变——大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如图。
1．(2025·湖北武汉模拟)CRISPR-Cas9基因编辑技术，是对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。利用CRISPR-Cas9技术可以使红眼基因B突变获得果蝇突变体，如图为技术原理图。下列相关叙述正确的是( )
A．细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切，引起果蝇发生染色体结构变异
B．该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA的作用类似于限制酶的作用
C．敲除后需要DNA聚合酶对DNA上的切口进行修复
D．sgRNA与红眼基因B的部分序列配对，不会出现的碱基互补配对方式是A—T
2．(2025·陕西安康三模)PCR技术可实现基因的定点突变。研究人员设计了与蛋白A基因结合的两对引物(引物B和C中都替换了一个碱基)如图1所示。研究人员按照如图2所示的方式进行4次PCR扩增，以获得定点突变的新的蛋白A基因。下列相关叙述错误的是( )
A．PCR1体系和PCR2体系必须分开进行
B．PCR3体系中应该加入引物B和C
C．PCR4体系中应该加入引物A和D
D．DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
专题八 生物技术与工程
核心整合
核心点1 发酵工程
1．18～30 30～35 无氧，常温 2．化学药物 湿热灭菌 培养基 3．接种环 涂布器 4．灭菌 灼烧灭菌 尿素 酚红 纤维素 红色复合物 透明圈 6．(1)大麦种子发芽，释放淀粉酶 淀粉分解，形成糖浆 酵母菌将糖转化为酒精和CO2 (2)长 低 高
[判断与表述]
1．√
2．× 提示：黄酒发酵过程中，酵母菌繁殖在有氧条件下，产酒精要在无氧条件下，繁殖越快则发酵产物酒精产率越低。
3．√
4．× 提示：向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无氧环境，不能创造无菌环境。
5．× 提示：检测泡菜中亚硝酸盐的含量，腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少。
6．× 提示：稀释涂布平板法可通过菌落数进行计数，而平板划线法仅用于分离纯化菌种，无法计数。
7．√
8．× 提示：为了避免高温杀死菌种，接种环烧红后需要在酒精灯火焰旁冷却，才能蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落。
9．√ 10．√ 11．√
12．× 提示：焙烤可以杀死大麦种子的胚，但不使淀粉酶失活，没有进行灭菌。
13．提示： 在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
14．提示：蛋白酶 脂肪酶 氨基酸
15．提示：选择 水 无机盐 氮源
16．提示：A菌能在培养平板中生长繁殖
17．提示：同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀
核心点2 细胞工程
1．再分化 (4)选择性地表达 2．(1)纤维素酶和果胶酶 (3)电融合法 聚乙二醇(PEG)融合法 (4)杂种细胞再生出细胞壁 3．(1)悬浮生长 细胞贴壁生长 5．MⅡ期 去核 重构胚 6．超数排卵 囊胚 内细胞团
[判断与表述]
1．√ 2．√
3．× 提示：芽原基细胞虽已分化，但在离体条件及激素调控下仍可脱分化形成愈伤组织，即可用作外植体。
4．√
5．× 提示：分离出的原生质体具有全能性，可用于植物体细胞杂交，为杂种植株的获得提供了理论基础。
6．× 提示：体细胞杂交获得的杂种植株细胞中具有来自亲本的遗传物质，只有1个细胞核。
7．× 提示：紫菜细胞的细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，用蛋白酶无法去除细胞壁。
8．× 提示：次生代谢物不是植物生长所必需的，其含量少，可以通过增加细胞的数量来增加次生代谢物的产量。
9．√
10．× 提示：胚胎干细胞培养时，需要一定浓度的CO2，CO2的作用是维持培养液的pH，所以不能在没有CO2的环境中进行胚胎干细胞培养。
11．√
12．× 提示：细胞的正常生命活动需要适宜的pH，培养基pH会影响细胞代谢，进而影响单克隆细胞的病毒产量。
13．× 提示：营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞也会发生接触抑制。
14．× 提示：由于一种B细胞经分化形成浆细胞后通常只能产生一种抗体，故筛选出的单个杂交瘤细胞无法分泌多种抗体。
15．√
16．× 提示：生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子。
17．√
18．× 提示：胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活率越小。
19．(1)√
(2)× 提示：桑葚胚阶段的细胞通过卵裂增殖，细胞数量增加，但胚胎总体积不变，或略有减小。
20．(1)√
(2)× 提示：孵化是胚胎从透明带中伸展出来(不是滋养层)。
21．提示：不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
核心点3 基因工程
1．磷酸二酯键 T4 DNA连接酶 3．PCR RNA聚合酶识别和结合的部位 农杆菌转化法 显微注射技术 4．基因合成 新的蛋白质 蛋白质结构 脱氧核苷酸序列
[判断与表述]
1．√
2．× 提示：研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中。
3．√ 4．√
5．× 提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。
6．× 提示：延伸过程需引物参与。
7．× 提示：配制PCR反应体系时，加入等量的4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料。
8．× 提示：在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢。
9．(1)√
(2)× 提示：a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个AluⅠ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致。
10．提示：标记基因、目的基因、终止子、复制原点
11．提示：基因工程(或转基因) 限制酶 DNA连接酶 载体(或质粒)
12．提示：避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4 DNA连接酶
13．提示：变性 氢键
14．提示：细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
15．提示：稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15 h 在15 h之前，IR3C数量不断增加，在15 h之后，IR3C数量不断减少
16．提示：44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
17．提示：梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母＋空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多
热点拓展
热点1 微生物鉴定与筛选中的各种“圈”(透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈)、影印培养
[真题引领]
1．解析：(1)选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈大，说明纤维素分解菌分解纤维素的能力强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。(2)分析表格可知，表中协同系数共3行2列，彼此都不同，因此需要对行、列分别进行分析，各自得出一个原因，正好满足题干要求的2点。 对比同一列的协同系数，如倒数第2列(混1)的3行，从上到下分别为74.33、24.98、1.82，它们有差异的原因在于这三行的“生物质原料”不同(分别是小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯)，这是3个数据的自变量，也是因变量协同系数不同的原因。最后一列(混2)的数据也是如此。 对比同一行的协同系数，如第1行(小麦秸秆)的2列，从左到右的分别为74.33、114.64，这两个数据有差异的原因显然在于混1、混2的不同，混1、混2表示酶A、酶B、酶C三种酶的混合物，由于三种酶的配比不同，即混合物中不同酶的含量不同，导致混1、混2协同系数有差异。下方两行(玉米秸秆、玉米芯)的数据也是如此。 综上，表中3行2列的协同系数存在差异的原因有两个，其一是生物质原料存在差异，其二是混合物中不同酶的含量不同。
答案：(1)只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖 菌落产生的纤维素酶的活性和量 (2)生物质原料不同；混合物中不同酶的含量不同
2．解析：(1)在PCR反应中，变性的温度需要90 ℃ 以上，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。(2)据图可知，使用BamH Ⅰ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。(3)碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3＝9组实验。(4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离和纯化，最终获得发酵产品。
答案：(1)在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性 (2)在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成 (3)乳酸或有机酸 9 (4)大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量 (5)提取、分离和纯化
[迁移应用]
1．C [土豆汁可以为微生物的生长提供碳源和氮源，在含有土豆汁的培养基中加入纤维素粉和刚果红可制备该培养基，A正确；该培养基能够鉴别微生物是否能分解纤维素，从培养基的功能来分，该培养基的种类是鉴别培养基，B正确；动物消化道中一般都是缺氧环境，而该实验是在有氧条件下进行的，d种微生物分解纤维素的能力最强，但不一定适合在牛瘤胃中生存，数量不一定最多，C错误；扩大培养时，通常使用液体培养基，因为使用液体培养基能促进培养液和菌种的接触，提高营养物质的利用率，D正确。]
2．解析：(1)PCR技术是在体外进行DNA片段的复制，通过PCR扩增Ipp20基因的反应需要在缓冲液中进行，保证PCR过程中pH的稳定，扩增Ipp20基因时的基本条件包括DNA模板、原料、耐高温的DNA聚合酶和2种引物等。(2)在PCR反应体系中一般需要加入Mg2+，因为耐高温的DNA聚合酶需要Mg2+激活，即Mg2+的加入能促进反应的进行；从表中可以看出，在不含Mg2+的缓冲液中Ipp20基因几乎无法扩增(未检测到基因)，在一定的范围内，随着Mg2+浓度的增加，Ipp20基因相对含量逐渐增加，当Mg2+浓度为4 mmol·L-1时，Ipp20基因相对含量最高，扩增效果最好，Mg2+浓度高于4 mmol·L-1后，Ipp20基因相对含量降低，扩增效果反而下降，因此科研人员认为PCR反应高效进行，Mg2+浓度并不是越高越好。(3)已知在构建基因表达载体时使用了限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割质粒和Ipp20基因，结合图示可以看出，质粒上含有潮霉素和氯霉素抗性基因，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，因此导入空质粒或重组质粒的大肠杆菌都能在含有潮霉素的培养基A中生长，但含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基B上生长，从而会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落。科研人员采用了影印法筛选含有Ipp20基因的大肠杆菌，即使用无菌的线毡布压在培养基A(添加潮霉素)的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B(添加氯霉素)上。根据图示结果分析，含有Ipp20基因的大肠杆菌应从培养基A中获取，这是因为带有目的基因的大肠杆菌不具有氯霉素的抗性，不能在培养基B中生长，结合图示可以看出，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5。
答案：(1)缓冲 引物 (2)耐高温的DNA聚合酶需要Mg2+激活 表中Mg2+浓度为4 mmol·L-1时，Ipp20基因相对含量最高，Mg2+浓度高于4 mmol·L-1时，Ipp20基因相对含量降低 (3)A 切割后，重组质粒中不含有氯霉素抗性基因，因此含目的基因的大肠杆菌不能在添加了氯霉素的培养基B中生长 3、5
热点2 单抗与双抗的制备及应用、抗原检测——双抗体夹心法
[真题引领]
1．B [骨髓瘤细胞应该从骨髓中获取，A错误；B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合是随机的，可能有些细胞不发生融合，有些两两融合，有些多个融合，有同种核融合细胞，也有异种核融合细胞，B正确；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，但不能得到大量的，C错误；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养，抗体检测不是在小鼠腹腔内进行，D错误。]
2．D [根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，双抗可同时与2种抗原结合，A正确； 根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确； 在两种不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成两种抗体，因此，筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原—抗体检测，从而实现对双抗的筛选，C正确； 同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。]
[迁移应用]
1．D [诱导两个杂交瘤细胞融合，结果有不融合的单个杂交瘤细胞、融合成功的双杂交瘤细胞，不一定会产生双抗，即使融合成功的细胞，单抗肽段随机组合，也不一定能产生双抗，A错误；基因工程改造传统单抗，应在基因水平操作，操作对象是DNA分子(或基因)，B错误；制备杂交瘤细胞的过程中是免疫后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，但是此时的B淋巴细胞包括多种产生不同抗体的浆细胞，C错误；将抗肿瘤的药物直接导至靶细胞，能减少药物的用量，避免了药物作用于正常组织细胞，降低正常组织的不良反应，D正确。]
2．D [据图可知，用双抗体夹心法检测抗原时需要用到与抗原不同位点结合的两种抗体，因此用双抗体夹心法检测抗原需要制备两种能与抗原结合的单克隆抗体，A、C正确；据图可知，双抗体夹心法利用酶标抗体中的酶水解相应物质，通过检测水解产物的量来反映样品中抗原的含量，由于酶活性受温度、pH等因素的影响，因此温度、pH等会影响双抗体夹心法检测抗原的结果，B正确；抗原与抗体的结合具有特异性，该技术可用于定量检测抗原，双抗体夹心法与只使用单克隆抗体相比，未增加识别抗原的种类，D错误。]
热点3 同尾酶、启动子与转录调控
[真题引领]
1．解析：E．coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率较低，因此为保证连接的效率，切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自身环化甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′端应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
答案：BamHⅠ 重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列
2．解析：(1)质粒中存在红色荧光蛋白基因，可根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及荧光检测，筛选获得重组菌株W1。(2)检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法(通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度)、显微镜直接计数法(利用细菌计数板在显微镜下直接对细胞进行计数)。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰。进入生长稳定期后，由于PGeo在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。(3)在重组菌株W2中，启动子PX被阻遏蛋白X阻遏转录。在细胞快速生长阶段，阻遏蛋白X 阻遏mKate2基因的表达；随着细胞进入生长稳定期，阻遏蛋白X停止表达并被降解，对PX启动子的阻遏作用降低，mKate2基因开始表达，荧光强度开始上升，由于原料的限制，最后保持稳定，所以培养期间荧光强度的变化趋势为快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定。(4)为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出的重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；然后将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，使相关代谢途径关键酶在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶降解，减少对莽草酸的转化；同时将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因的稳定表达，从而大量积累莽草酸，最后将两种质粒导入野生型菌株。
答案：(1)荧光 (2)稀释涂布平板法(或显微镜直接计数法) 排除培养基本身荧光对实验结果的干扰 PGeo在生长稳定期停止基因转录，且带有SsrA短肽的mKate2被降解 (3)快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上升后保持稳定 (4)先敲除野生型菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生型菌株中
[迁移应用]
1．C [同裂酶是指具有相同识别序列的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5′—G↓CGC—3′，HhaⅠ识别和切割位点是5′—GCG↓C—3′，二者识别序列均为GCGC，所以HinPⅡ和HhaⅠ为同裂酶。 判断黏性末端是否不同：HinPⅡ切割后产生的黏性末端是—G和CGC—，HhaⅠ切割后产生的黏性末端是 —GCG和C—，二者黏性末端不同，A正确。HinPⅡ识别和切割位点是5′—G↓CGC—3′，HpaⅡ识别和切割位点是5′—C↓CGG—3′，二者切割产物连接后的序列为—GCGG—。GlaⅠ识别和切割位点是5′—GC↓GC—3′，连接后的—GCGG— 序列不能被GlaⅠ识别和切割，B正确。同尾酶是指识别位点不同但能切出相同黏性末端的限制酶。HinPⅡ识别和切割位点是5′—G↓CGC—3′，NarⅠ识别和切割位点是5′—GG↓CGCC—3′，二者切割后产生的黏性末端相同，所以HinPⅡ和NarⅠ为同尾酶。 分析连接后的序列能否被GlaⅠ切割：HinPⅡ和NarⅠ切割产物连接后的序列为—GCGC—，GlaⅠ识别和切割位点是5′—GC↓GC—3′，该序列能被GlaⅠ识别和切割，C错误。GlaⅠ识别和切割位点是5′—GC↓GC—3′，NarⅠ识别和切割位点是5′—GG↓CGCC—3′，可以看出NarⅠ识别位点包含了GlaⅠ的识别位点。在仅含1个GlaⅠ识别位点的情况下，该质粒能被NarⅠ切割的概率为1/16(因为在GlaⅠ识别位点的基础上，前后各增加一个碱基，共16种可能情况，其中有一种是NarⅠ的识别位点)，D正确。]
2．解析：(1) ABA是植物激素，在植物生长发育过程中起调节作用。其主要作用有四点：抑制细胞分裂；促进气孔关闭；促进叶和果实的衰老和脱落；维持种子休眠。(2)S蛋白缺失，种子成熟程度低，因此S蛋白促进种子成熟，而J蛋白过表达植株种子成熟度低，因此J蛋白抑制种子成熟。(3)药剂M抑制蛋白质的降解，与用药剂M处理相比，不用药剂M处理时，S蛋白缺失突变体组J蛋白含量比野生型多，说明J蛋白会被S蛋白降解。(4)质粒1＋2组作为对照，与1＋2组相比，1＋3组中T基因表达T蛋白，使得LUC/REN荧光强度比值明显增大，且REN、LUC不受T蛋白的影响，说明T蛋白能与S蛋白基因启动子结合，从而使得LUC增多，而1＋4组与1＋3＋4组均与1＋2组相同，说明第四组表达的J蛋白会抑制T蛋白与S蛋白基因启动子的结合，抑制LUC的合成。(5)ABA激活T蛋白，T蛋白可与S蛋白基因启动子结合，启动S基因的表达，S蛋白增多，S蛋白可使J蛋白降解，而J蛋白抑制种子成熟，因此S蛋白可促进种子成熟，即ABA促进种子成熟。
答案：(1)调节 抑制细胞分裂/促进气孔关闭/促进叶和果实的衰老和脱落/维持种子休眠 (2)促进、抑制 (3)降解
(4)T蛋白与S蛋白基因的启动子结合，促进S基因的表达，而J基因抑制T蛋白与S蛋白基因启动子的结合 (5)ABA激活T蛋白，T蛋白促进S蛋白合成，S蛋白可使抑制种子成熟的J蛋白降解，从而促进种子成熟
热点4 PCR技术及其应用
[真题引领]
1．解析：实验中①和④的作用是作为对照。①无模板且引物对与②③相同，④无模板且引物对与⑤⑥相同，可对比说明模板对扩增的影响。②之所以无扩增产物，是因为P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列，无法扩增出子链DNA序列。③以PX为模板，引物1和引物2扩增出的是目的基因；⑤以P0为模板，引物3和引物4扩增出的是质粒P0上一段DNA片段；⑥以PX为模板，引物3和引物4扩增出的是含目的基因和部分质粒序列的DNA片段。
答案： 作为对照(或答：鉴定反应体系是否有模板污染) P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段
2．解析：(1)根据题意可知，研究人员获得了一个紧凑株型的植株，为研究控制该性状的基因，将其与纯合松散株型植株杂交，F1均为松散株型，F2中松散株型∶紧凑株型＝3∶1，说明紧凑株型为隐性性状，由a基因控制。(2)在A基因编码蛋白质的区域中插入一段序列得到a基因(图1)，a基因表达的肽链比A基因表达的肽链短，说明终止密码子提前出现，因此推测可能是A基因内部插入一段序列后，使a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译。(3)①子二代的基因型为AA、Aa、aa，根据图示可知，A和a基因上均含有P1和P2引物互补的序列，而P3引物识别的序列只有a基因中才存在，若选择引物P1和P2进行扩增，则A基因和a基因均能扩增出相应产物，只是a基因扩增的产物长度要大于A基因扩增的产物，即AA的个体扩增产物的电泳条带与aa的个体扩增产物的电泳条带不同，且Aa的个体扩增产物的电泳条带应为两条，与图A不符，若选择引物P3和P2进行扩增，则只有Aa和aa的个体中因含有a基因而能扩增出产物，且扩增出的产物电泳条带相同，而AA的个体由于不含与P3引物结合的序列，因此不能扩增出产物，没有对应的电泳条带。即图2-A中使用的引物组合是P2和P3，丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物。②图A是利用引物P3和P2扩增后电泳的结果，则图B是利用引物P1和P2扩增的产物电泳的结果，由于a基因扩增出来的产物长度大于A基因扩增的产物，因此AA(松散株型)、aa(紧凑株型)基因的个体扩增的产物电泳时均只有一个条带，且aa基因的个体扩增的产物电泳时形成的电泳条带距离点样孔近，而Aa(松散株型)的个体扩增的产物电泳时会出现两个电泳条带，故乙与丙的电泳条带见答案。③使用图2-A中的引物组合(P3和P2)扩增F2全部样本，由于只有含a基因的个体才能扩增出相应产物，且A－为松散株型，而子二代中Aa∶AA＝2∶1，所以使用图2-A中的引物组合扩增F2全部样本，有扩增条带松散株型(Aa)∶无扩增条带松散株型(AA)＝2∶1。
答案：(1)a (2)插入序列后，a基因中编码终止密码子的序列提前，a基因转录产生的mRNA提前终止翻译 (3)①P2和P3 丙的基因型为AA，无引物P3的结合序列，利用引物P2和P3扩增时，无法得到扩增产物
② ③2∶1
[迁移应用]
1．C [DNA子链合成的方向为5′端到3′端，因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增，A正确；设计的引物不宜过短，否则扩增的特异性会下降，B正确；PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子，C错误；整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶，D正确。]
2．D [荧光定量PCR技术是在已知核酸序列信息的基础上，通过特定引物和荧光探针来检测核酸，新冠病毒的核酸为RNA，若要使用该技术检测，需先经逆转录将其转化为DNA，不能直接检测样本中新冠病毒核酸(RNA)的含量，A错误；Ct值是荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数，待测样本中核酸数量越多，扩增产生足够荧光信号达到阈值所需的循环数越少，即Ct值越小，所以Ct值的大小与待测样本中核酸数量成负相关，B错误；根据PCR的原理，1个双链DNA分子经过1轮循环形成2个DNA分子，经过2轮循环形成22＝4个DNA分子，经过3轮循环形成23＝8个DNA分子，由于每扩增一次就有一个荧光分子生成，从第1轮循环开始产生荧光分子，第1轮产生1个，第2轮产生2个，第3轮产生4个，一共会生成1＋2＋4＝7个荧光分子(注意：这里是按照每一轮新产生的DNA对应产生一个荧光分子计算)，C错误；在该PCR技术中，Taq DNA聚合酶一方面催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键，从而合成子链，另一方面当子链延伸至探针处时，催化断裂荧光探针中的磷酸二酯键，使荧光分子释放出来，D正确。]
热点5 基因编辑技术
[真题引领]
解析：(1)将重组Ti质粒转入植物细胞常用农杆菌转化法。农杆菌中的Ti质粒上的T-DNA(可转移DNA)能够整合到植物细胞的染色体DNA上。利用农杆菌侵染植物细胞，从而将重组Ti质粒导入植物细胞。为了筛选出转化成功的细胞，由于重组Ti质粒上含有潮霉素抗性基因(HygR)，所以需要在植物组织培养的培养基中添加潮霉素，只有成功导入重组Ti质粒的细胞才能在含有潮霉素的培养基上存活。 (2)在植物组织培养中，离体的植物器官、组织或细胞被称为外植体，所以实验中用到的水稻幼胚被称为外植体。 对水稻幼胚消毒时需依次使用酒精、次氯酸钠处理。 在植物组织培养诱导形成再生植株的过程中，生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素。不同浓度的生长素和细胞分裂素的配比可以调控细胞的分裂和分化方向，从而诱导形成根和芽等不同的器官，最终形成再生植株。(3)为了检测基因编辑水稻是否成功，首先需采用PCR-测序技术检测目标基因的启动子区是否编辑成功。通过PCR扩增目标基因的启动子区片段，然后进行测序，与编辑前的序列进行对比，看是否发生了预期的改变。 在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌，通过比较病斑的大小(或病斑面积、发病情况等)来验证抗病性。如果基因编辑后的水稻病斑明显小于野生型水稻，说明其抗病性增强。(4)在该研究中，基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为：对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻，从而使水稻获得了抗病性。
答案：(1)农杆菌转化法 Ti质粒上的T-DNA 潮霉素 (2)外植体 次氯酸钠 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 (3)PCR-测序 病斑的大小(或病斑面积、发病情况等合理答案) (4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后，白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻
[迁移应用]
1．B [细胞内的Cas9酶在配对区域定点剪切，引起果蝇发生基因突变，A错误；该过程中，sgRNA和Cas9酶共同剪切DNA，sgRNA和Cas9酶类似于限制酶的作用，B正确；敲除后需要DNA连接酶对DNA上的切口进行修复，C错误；sgRNA与红眼基因B的部分序列配对，碱基互补配对方式中A—T可能会出现，D错误。]
2．B [PCR1和PCR2分别以不同的引物对蛋白A基因的不同片段进行扩增，如果不分开进行，引物会相互干扰，无法准确地扩增出所需的特定片段，所以PCR1体系和PCR2体系必须分开进行，A正确；从图2可以看出，PCR3是对PCR1和PCR2产物混合复性后的产物进行扩增，其目的是将两个带有部分突变序列的片段连接起来，此时不需要引物B和C，因为引物B和C是用于PCR1和PCR2中引入突变碱基的，在PCR3中应利用PCR1和PCR2产物的互补配对来进行延伸，B错误；PCR4是最终获得完整的新的蛋白A基因的步骤，此时需要扩增出完整的基因，引物A和D可以分别结合在基因两端，从而扩增出完整的含有定点突变的新的蛋白A基因，所以PCR4体系中应该加入引物A和D，C正确；DNA聚合酶具有特定的作用特点，它能够从引物的3′端开始，按照模板链的碱基序列，连接脱氧核苷酸，合成新的DNA链，这是PCR技术能够实现DNA扩增的基础原理之一，D正确。]
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专题八 生物技术与工程
第一部分
专题素能提升
水、碳源、氮源和
灭菌
酵母菌
毛霉
尿素
稀释涂布平板法
扩大培养
分离、提纯产物
输卵管和子宫
桑葚胚、囊胚
充分发挥雌性优
细胞的全能性、细胞膜的流动性
细胞增殖
动物细胞核的全能性
给小鼠注射特定的抗原
产生专一抗体的杂交瘤细胞
无机盐等
良个体的繁殖潜力
E.coli DNA
黏性末端
质粒
花粉管通道法、
显微注射法
连接酶
农杆菌转化法
核心整合
核心点1 发酵工程
1．厘清“3”种传统食品的制作技术
18～30
30～35
无氧，常温
2．微生物培养中的无菌操作技术
化学药物
湿热灭菌
培养基
3．两种纯化细菌方法的比较
接种环
涂布器
4．酵母菌的纯培养及微生物分离与计数的实例
灭菌
灼烧灭菌
尿素
酚红
纤维素
红色
透
复合物
明圈
5．发酵工程的基本环节
6．啤酒的工业化生产流程
(1)啤酒发酵的工业化生产流程及操作目的
大麦种子发芽，释放淀粉酶
淀粉分解，形成糖浆
酵母菌将糖转化为酒精和CO2
(2)“精酿”啤酒与“工业”啤酒的区别
长
低
高
√
×
1．使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一。(2025·河南卷) ( )
2．食醋和黄酒发酵过程中，微生物繁殖越快发酵产物产率越高。(2025·河南卷) ( )
提示：黄酒发酵过程中，酵母菌繁殖在有氧条件下，产酒精要在无氧条件下，繁殖越快则发酵产物酒精产率越低。
3．醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶。(2024·湖北卷) ( )
√
×
4．向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境。(2023·北京卷) ( )
提示：向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无氧环境，不能创造无菌环境。
5．检测泡菜中亚硝酸盐的含量，可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低。(2023·山东卷) ( )
×
提示：检测泡菜中亚硝酸盐的含量，腌制泡菜过程中亚硝酸盐的含量先增多后减少。
6．采集果园土壤进行微生物分离或计数。稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数。(2025·湖南卷) ( )
提示：稀释涂布平板法可通过菌落数进行计数，而平板划线法仅用于分离纯化菌种，无法计数。
×
7．采集果园土壤进行微生物分离或计数。完成平板划线后，培养时需增加一个未接种的平板作为对照。(2025·湖南卷) ( )
8．将接种环烧红，迅速蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落。(2024·河北卷) ( )
提示：为了避免高温杀死菌种，接种环烧红后需要在酒精灯火焰旁冷却，才能蘸取酵母菌液在培养基上划线培养，获得单菌落。
√
×
9．研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，最可能筛选到目标菌的条件组合是c点时取样、角蛋白氮源培养基。(2023·广东卷) ( )
√
10．脲酶催化尿素水解，产生的氨可作为细菌的氮源。产脲酶细菌可在以NH4Cl为唯一氮源的培养基生长繁殖。(2024·浙江6月卷) ( )
11．选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。(2022·山东卷) ( )
12．啤酒的工业化生产中，焙烤是为了利用高温杀死大麦种子的胚并进行灭菌。(2022·山东卷) ( )
提示：焙烤可以杀死大麦种子的胚，但不使淀粉酶失活，没有进行灭菌。
√
×
√
13．选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是________
_________________________________________________________________________。将培养后的菌液混匀并充分________，再接种至微孔板中，经培养和筛选获得了CG(卡拉胶酶)活性最高的菌种。(2025·河南卷)
提示：在富含卡拉胶的环境中，存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大 稀释
14．米曲霉发酵过程的主要目的是使米曲霉充分生长繁殖，大量分泌制作酱油过程所需的酶类，这些酶中的________、________能分别将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分，如将蛋白质分解为小分子的肽和________。(2021·全国乙卷)
提示：蛋白酶 脂肪酶 氨基酸
15．从土壤等环境样品中筛选高产磷脂酶的微生物。以磷脂酰乙醇酯(一种磷脂类物质)为唯一碳源制备________培养基，可提高该方法的筛选效率。除碳源外，该培养基中至少还应该有________、________、________等营养物质。(2024·江西卷)
提示：选择 水 无机盐 氮源
16．有些细菌具有溶菌特性，能够破坏其他细菌的结构使细胞内容物释出。科学家试图从某湖泊水样中分离出有溶菌特性的细菌。A菌通常被用作溶菌对象。研究者将含有一定浓度A菌的少量培养基倾倒在固体培养平板上，凝固形成薄层。培养一段时间后，薄层变浑浊(如图)，表明____________________________。(2023·北京卷)
提示：A菌能在培养平板中生长繁殖
17．将获得的能够高产磷脂酶的微生物接种到鉴别培养基(在牛肉膏蛋白胨液体培养基中添加2%的琼脂粉和适量的卵黄磷脂)平板上培养，可以通过观察卵黄磷脂水解圈的大小，初步判断微生物产磷脂酶的能力，但不能以水解圈大小作为判断微生物产磷脂酶能力的唯一依据。从平板制作的角度分析，其原因可能是________________
___________________________________________。(2024·江西卷)
提示：同平板中培养基量的差异以及平板内和平板间培养基厚度不均匀
核心点2 细胞工程
1．植物组织培养技术——原理：植物细胞的全能性
再分化
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：在特定的时间和空间条件下，细胞中的基因会____________。
选择性地表达
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性
(1)图中过程①用________________处理去除细胞壁，得到的原生质体包括细胞膜、细胞质和细胞核三部分。
(2)酶解去壁前用较高渗透压溶液处理细胞：使细胞处于微弱的质壁分离状态，有利于完整的原生质体的释放，防止原生质体被破坏。
(3)图中过程②的诱导方法有________、离心法、________________
__________、高Ca2+—高pH融合法等。
(4)原生质体融合成功的标志是______________________。
纤维素酶和果胶酶
电融合法
杂种细胞再生出细胞壁
聚乙二醇(PEG)
融合法
3．动物细胞培养——原理：细胞增殖
(1)动物细胞培养过程
悬浮生
细胞贴壁
生长
长
①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
②区分原代培养和传代培养的关键是：是否分瓶培养。
(2)干细胞
4．单克隆抗体的制备
(1)3种细胞特点不同：①B淋巴细胞：能产生抗体，不能大量增殖。②骨髓瘤细胞：能迅速大量增殖，不能产生抗体。③杂交瘤细胞：既能产生抗体，又能迅速大量增殖。
(2)两次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
5．动物体细胞核移植技术
MⅡ期
去核
重构胚
提醒：核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。③外界环境可能引起表型改变。
6．胚胎工程的操作流程
超数排卵
囊胚
内细胞
团
7．胚胎移植的生理学基础
8．胚胎分割
1．利用组织培养技术实现兰花的快速繁殖和优良性状的保持。(2025·河北卷) ( )
√
×
2．细胞分裂素和生长素的比例会影响愈伤组织的形成。(2025·黑吉辽蒙卷) ( )
3．芽原基细胞由于基因选择性表达，不能用作外植体。(2025·黑吉辽蒙卷) ( )
提示：芽原基细胞虽已分化，但在离体条件及激素调控下仍可脱分化形成愈伤组织，即可用作外植体。
√
4．佝偻病伴发的手足抽搐症状与人体内某种元素缺乏有关。该元素还可以用于诱导原生质体融合。(2025·陕晋青宁卷) ( )
√
×
5．大豆叶片细胞的细胞壁被酶解后，获得的原生质体失去全能性。(2024·北京卷) ( )
提示：分离出的原生质体具有全能性，可用于植物体细胞杂交，为杂种植株的获得提供了理论基础。
6．体细胞杂交获得的杂种植株细胞具有来自亲本的2个细胞核。(2024·山东卷) ( )
提示：体细胞杂交获得的杂种植株细胞中具有来自亲本的遗传物质，只有1个细胞核。
7．研究者通过体细胞杂交技术，探索利用条斑紫菜和拟线紫菜培育杂种紫菜。从食用紫菜的动物消化道内提取蛋白酶，用于去除细胞壁。(2023·江苏卷) ( )
提示：紫菜细胞的细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，用蛋白酶无法去除细胞壁。
×
×
8．次生代谢物是植物所必需的，但含量少，应选择产量高的细胞进行培养。(2023·山东卷) ( )
提示：次生代谢物不是植物生长所必需的，其含量少，可以通过增加细胞的数量来增加次生代谢物的产量。
9．人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。高Ca2+—高pH溶液可促进细胞融合。(2023·广东卷) ( )
√
×
10．在没有CO2的有氧环境中进行胚胎干细胞培养。(2025·河北卷) ( )
提示：胚胎干细胞培养时，需要一定浓度的CO2，CO2的作用是维持培养液的pH，所以不能在没有CO2的环境中进行胚胎干细胞培养。
11．动物细胞培养基一般呈淡红色。某次实验时，调控pH的CO2耗尽，培养基转为黄色。由此推断使培养基呈淡红色的是酸碱指示剂。(2025·北京卷) ( )
√
×
12．大量悬浮培养产流感病毒的单克隆细胞，培养基pH不会影响单克隆细胞的病毒产量。(2023·辽宁卷) ( )
提示：细胞的正常生命活动需要适宜的pH，培养基pH会影响细胞代谢，进而影响单克隆细胞的病毒产量。
13．营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞不会发生接触抑制。(2023·海南卷) ( )
提示：营养供应充足时，传代培养的胚胎干细胞也会发生接触抑制。
×
×
14．研究者制备单克隆抗体过程要筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞。(2023·北京卷) ( )
提示：由于一种B细胞经分化形成浆细胞后通常只能产生一种抗体，故筛选出的单个杂交瘤细胞无法分泌多种抗体。
15．甲状旁腺激素(PTH)水平是人类多种疾病的重要诊断指标。研究者制备单克隆抗体用于快速检测PTH，需要制备用PTH免疫的小鼠。(2023·北京卷) ( )
√
×
16．生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊，对提供精子的波尔公山羊无需筛选。(2024·湖北卷) ( )
提示：生产中需选择品质良好的波尔公山羊提供精子。
17．科学家采用体外受精技术获得藏羚羊胚胎，此过程涉及的操作可能包括超数排卵和精子获能处理。(2023·广东卷) ( )
√
×
18．在家畜优良品种培育过程中常涉及胚胎工程的相关技术，其中胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。(2023·浙江1月卷) ( )
提示：胚胎分割可以获得多个胚胎，分割次数越多，分割后胚胎成活率越小。
×
19．科研人员通过对绵羊受精卵进行基因编辑和胚胎移植等操作，获得了羊毛长度显著长于对照组的优良品系。(2025·陕晋青宁卷)
(1)为获取足够的卵子，需对供体绵羊注射促性腺激素进行超数排卵处理。 ( )
(2)受精卵发育至桑葚胚阶段，细胞数量和胚胎总体积均增加。 ( )
提示：桑葚胚阶段的细胞通过卵裂增殖，细胞数量增加，但胚胎总体积不变，或略有减小。
√
×
20．研究显示，约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期，且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。(2025·黑吉辽蒙卷)
(1)移植前胚胎发育率低，可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态。 ( )
(2)胚胎移植到代孕母鼠后成活率低，可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化。 ( )
提示：孵化是胚胎从透明带中伸展出来(不是滋养层)。
√
×
21．与小鼠骨髓瘤细胞融合前，已免疫的脾细胞(含浆细胞)________(填“需要”或“不需要”)通过原代培养扩大细胞数量；添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是___________________________________________________
________________________________________。(2023·湖北卷)
提示：不需要 使细胞接触处的磷脂分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合
核心点3 基因工程
1．基因工程的基本工具
磷酸二酯键
T4 DNA连接酶
提醒：两种不同的限制酶切割不同的DNA片段，产生相同的黏性末端，这两种限制酶称为同尾酶。
2．限制酶的选择原则
(1)根据目的基因两端的限制酶切割位点确定限制酶的种类
①应选择切割位点位于目的基因两端的限制酶，以便将目的基因“切出”，如图可选择PstⅠ。
②不能选择切割位点位于目的基因内部的限制酶，防止破坏目的基因，如图不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切割位点，而且这两种限制酶切割后仍有标记基因)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
3．基因工程的基本操作程序
PCR
RNA聚合酶识别和结
农杆菌转化法
显微注射技术
合的部位
提醒：辨析农杆菌转化法中的“两次拼接与两次导入”
①两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA中；第二次拼接指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞的染色体DNA上。
②两次导入：第一次导入是将含目的基因的Ti质粒导入农杆菌；第二次导入是指将含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
4．蛋白质工程
基因合成
新的
蛋白质结构
脱氧核苷酸序列
蛋白质
5．DNA的粗提取与鉴定
6．PCR技术
7．DNA片段的电泳鉴定
提醒：DNA电泳鉴定中的“两液两剂”
①电泳缓冲液维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质，影响物质的电泳迁移率。②凝胶载样缓冲液(内含指示剂)主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置，有助于判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。③核酸染料是用来染色DNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带。
1．构建重组质粒需要使用DNA连接酶。
×
属于DNA连接酶底物。(2023·湖北卷) ( )
2．关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中。(2024·山东卷) ( )
提示：研磨液在4 ℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中。
√
3．关于“DNA 粗提取与鉴定”的实验，利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，可初步分离DNA。(2024·安徽卷) ( )
√
×
4．利用添加核酸染料的凝胶对PCR产物进行电泳后，在紫外灯下观察结果。(2024·河北卷) ( )
5．启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。(2023·全国乙卷) ( )
提示：启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录。
√
6．采用PCR方法进行目的基因监测，延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。(2022·辽宁卷) ( )
×
提示：延伸过程需引物参与。
7．配制PCR反应体系时，加入等量的4种核糖核苷酸溶液作为扩增原料。(2024·河北卷) ( )
提示：配制PCR反应体系时，加入等量的4种脱氧核糖核苷酸溶液作为扩增原料。
×
8．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小。在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快。(2024·吉林卷) ( )
×
提示：在琼脂糖凝胶电泳中，当电场作用时，DNA片段实际上是向正极迁移的，而不是向负极迁移。同时，DNA片段的迁移速率与其大小成反比，即DNA片段越长，迁移速率越慢。
9．图示人体正常基因A突变为致病基因a及HindⅢ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 。
(2025·江苏卷)
(1)用两种限制酶分别酶切A基因后，形成的末端类型不同。 ( )
√
×
(2)用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小一致。 ( )
提示：a基因中有2个Hind Ⅲ切割位点，切割后产生3个片段，有3个AluⅠ切割位点，切割后产生4个片段，用两种限制酶分别酶切a基因后，产生的片段大小不一致。
10．要使基因ccdB(目的基因)在IR3C(受体细胞)中稳定遗传、表达并发挥作用，构建的基因表达载体除启动子外，还必须有________________________________。(2025·云南卷)
提示：标记基因、目的基因、终止子、复制原点
11．可采用________技术定向改造现有微生物，以获得高产磷脂酶的微生物。除了编码磷脂酶的基因外，该技术还需要__________、____________、__________等“分子工具”。(2024·江西卷)
提示：基因工程(或转基因) 限制酶 DNA连接酶 载体(或质粒)
12．质粒载体上有限制酶a、b、c的酶切位点，限制酶的切割位点如图所示。构建重组质粒时，与用酶a单酶切相比，用酶a和酶b双酶切的优点体现在___________________________________________
___________________________________________________________
(答出两点即可)；使用酶c单酶切构建重组质粒时宜选用的连接酶是________________。(2024·全国甲卷)
提示：避免目的基因和质粒的任意连接、防止目的基因和质粒的自身环化 T4 DNA连接酶
13．某同学利用PCR扩增目的基因。PCR的每次循环包括变性、复性、延伸3个阶段，其中DNA双链打开成为单链的阶段是________，引物与模板DNA链碱基之间的化学键是________。(2024·全国甲卷)
提示：变性 氢键
14．将重组质粒转入大肠杆菌前，通常先将受体细胞处理成感受态，感受态细胞的特点是__________________________________；若要验证转化的大肠杆菌中含有重组质粒，简要的实验思路和预期结果是________________________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________
_________________________________________。(2024·全国甲卷)
提示：细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态 利用DNA分子杂交技术，将大肠杆菌的基因组DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作标记，以此作为探针，使探针与基因组DNA杂交，如果显示出杂交带，表明大肠杆菌中含有重组质粒
15．我国研究人员尝试用三菌混菌体系建立生产维生素C的一步发酵法。在氧化葡糖杆菌(原始菌MCS)中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB，得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时，活菌数变化曲线如图。(2025·云南卷)
绘制图需统计活菌数，常用方法是________________________。当活菌达到一定数量时，基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用，推测该蛋白质的作用是__________________，开始发挥作用的时间是__________，判断理由是_____________________________________
_________________________________________________________。
提示：稀释涂布平板法 能抑制细菌增殖 15 h 在15 h之前，IR3C数量不断增加，在15 h之后，IR3C数量不断减少
16．已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键，从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG(卡拉胶酶)的耐热性，研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键)，如图所示。根据分析结果，选择第________位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适，原因是______________________________
___________________________________________________________
__________________________________________。(2025·河南卷)
提示：44 该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近，容易形成二硫键，而且保守度低，替换后对酶功能的影响较小
17．锌转运蛋白在某种植物根部细胞特异性表达并定位于细胞质膜，具有吸收和转运环境中Zn2+的功能。为研究该植物2种锌转运蛋白M和N与吸收Zn2+相关的生物学功能，在克隆M、N基因基础上，转化锌吸收缺陷型酵母，并进行细胞学鉴定。转基因酵母功能鉴定：分别将转化了M、N基因的酵母菌株于液体培养基中培养至OD600为0.6。将菌液用________法逐级稀释至OD600为0.06、0.006和0.000 6，然后各取10 μL菌液用涂布器均匀涂布在固体培养基上，培养2天，菌落生长如图。该实验中阴性对照为________________________。由实验结果可初步推测：转运蛋白M和N中，转运Zn2+能力更强的是______________，依据是______________________________________________
____________________________________________________________________________________________________________________。(2024·浙江1月卷)
注：OD600为波长600 nm下的吸光值，该值越大，菌液浓度越高；空载体为未插入M或N基因的表达载体。
提示：梯度稀释 锌吸收缺陷型酵母＋空载体 N 转入N基因的这组酵母菌数量多
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课后限时作业(八) 生物技术与工程[A卷]
1．(2025·陕晋青宁卷)我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸，流程如图。下列叙述错误的是( )
A．淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源
B．扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C．培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同
D．通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
√
题号
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C [淀粉水解糖可以为微生物发酵提供碳源和能源，A正确；通过扩大培养可以获取更多的黑曲霉，B正确；常用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，对空气灭菌一般不用高压蒸汽灭菌法，C错误；通气、搅拌可以增加溶解氧量，促进黑曲霉发酵，即促进柠檬酸积累，D正确。]
题号
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√
2．(2025·甘肃卷)我国葡萄酒酿造历史悠久、传统发酵技术延续至今。发酵工程通过选育菌种和控制发酵条件等措施可优化传统发酵工艺，改善葡萄酒品质。下列叙述错误的是( )
A．传统发酵时，葡萄果皮上的多种微生物参与了葡萄酒的发酵过程
B．工业化生产时，酵母菌需在无氧条件下进行扩大培养和酒精发酵
C．通过诱变育种或基因工程育种能够改良葡萄酒发酵菌种的性状
D．大规模发酵时，需要监测发酵温度、pH值、罐压及溶解氧等参数
题号
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B [在传统发酵制作葡萄酒时，葡萄果皮上附着有多种微生物，如酵母菌等，这些微生物参与了葡萄酒的发酵过程，A正确；工业化生产时，酵母菌在有氧条件下进行有氧呼吸，能大量繁殖，进行扩大培养，在无氧条件下进行酒精发酵产生酒精，B错误；通过诱变育种(利用物理、化学等因素诱导基因突变)或基因工程育种(定向改造生物的基因)能够改良葡萄酒发酵菌种(如酵母菌)的性状，比如提高发酵效率等，C正确；大规模发酵时，发酵温度、pH值、罐压及溶解氧等参数会影响微生物的生长和代谢，进而影响发酵过程和产品质量，所以需要监测这些参数，D正确。]
题号
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√
3．(2025·黑吉辽蒙卷)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株，旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是( )
A．以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B．逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C．配制选择培养基时，需确保pH满足实验要求
D．用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
题号
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D [该研究的目的是筛选出高耐受且降解金霉素能力强的菌株，可以以金霉素为唯一碳源制备选择培养基进行筛选，且逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株，A、B正确；微生物培养需要适宜的pH等，C正确；稀释涂布平板法不需要接种环，而是需要涂布器，D错误。]
题号
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4．(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染，造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗，操作流程如下图。下列叙述正确的是( )
题号
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√
A．①为脱分化过程，1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B．②为再分化过程，愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C．3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D．百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，可以作为该研究中的外植体
题号
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D [在脱分化过程中，1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块，A错误；愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变，但基因重组发生在减数分裂过程中，而愈伤组织细胞的分化过程中进行的是有丝分裂，所以不会发生基因重组，B错误；3号培养基用于诱导生根，其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1，C错误；百合分生区附近的病毒极少，甚至无病毒，因此可以作为该研究中的外植体，D正确。]
题号
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5．(2025·四川卷)研究人员用花椰菜(BB，2n＝18)根与黑芥(CC，2n＝16)叶片分别制备原生质体，经PEG诱导融合形成杂种细胞，进一步培养获得再生植株，其中的植株N经鉴定有33条染色体。下列叙述正确的是
( )
A．两个原生质体融合形成的细胞即为杂种细胞
B．再生植株N的形成证明杂种细胞仍具有全能性
C．花椰菜和黑芥的原生质体能融合，证明两种植物间不存在生殖隔离
D．植株N的B组和C组染色体不能正常联会配对，无法产生可育配子
√
题号
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B [两个原生质体融合形成的细胞不一定是杂种细胞，有可能是两个花椰菜原生质体融合或两个黑芥原生质体融合等，A 错误；全能性是指细胞经分裂和分化后，仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性，杂种细胞经过培养形成再生植株 N，这证明了杂种细胞仍具有全能性，B正确；花椰菜和黑芥是不同物种，它们之间存在生殖隔离，原生质体能融合并不能证明不存在生殖隔离，因为生殖隔离是指不同物种之间一般是不能相互交配的，即使交配成功，也不能产生可育的后代，C错误；植株 N 是花椰菜(BB，2n＝18)和黑芥(CC，2n＝16)，二者原生质体经 PEG 诱导融合形成杂种细胞后，染色体组成是 BBCC，存在同源染色体，在减数分裂时能正常联会配对，能产生可育配子，D错误。]
题号
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6．(2025·湖北卷)水母雪莲是我国的一种名贵药材，主要活性成分为次生代谢产物黄酮。水母雪莲生长缓慢，长期的掠夺性采挖导致该药材资源严重匮乏。研究人员开展了悬浮培养水母雪莲细胞合成黄酮的工程技术研究，结果如表所示。下列叙述错误的是( )
题号
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转速(r/min) 55 65 75 85
相对生长速率 0.21 0.25 0.26 0.25
细胞干重(g/L) 7.50 9.70 11.4 9.50
黄酮产量(g/L) 0.20 0.27 0.32 0.25
√
A．黄酮产量与细胞干重呈正相关
B．黄酮是水母雪莲细胞生存和生长所必需的
C．氧气供给对于水母雪莲细胞生长、分裂和代谢是必需的
D．转速为75 r/min时，既利于细胞分裂，又利于黄酮的积累
题号
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B [根据表格数据分析，随着细胞干重增加，黄酮产量也增加；随着细胞干重减少，黄酮产量也降低，说明黄酮产量与细胞干重呈正相关，A正确。黄酮属于次生代谢产物，不是细胞生存和生长所必需的，B错误。氧气的供给有利于细胞呼吸为生命活动提供能量，对于水母雪莲细胞生长、分裂和代谢是必需的，C正确。根据表格数据分析，转速为75 r/min时，细胞的相对生长速率最快，黄酮产量最高，D正确。]
题号
1
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7．(10分)(2025·湖南卷)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A，其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题：
题号
1
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(1)制备特定抗原
①获取基因A，构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和_________________等；为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确，应选用图中的一对引物_______________对待测质粒进行PCR扩增，预期扩增产物的片段大小为________bp。
题号
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终止子、复制原点
P1 和 P3(1分)
782(1分)
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌，诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心，发现上清液中无蛋白A，可能的原因是_____________________________________
___________________________________________________________
(答出两点即可)。
题号
1
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重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后，将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，诱导融合的常用方法有__________________________________
______________(答出一种即可)。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和____________，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体，可用于非洲猪瘟的早期诊断。
题号
1
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13
聚乙二醇(PEG)融合法(或灭活病毒诱导
抗体检测
法、电融合法)
[解析] (1)①重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子、终止子和复制原点等，终止子能终止转录过程。要确定基因 A 已连接到质粒中且插入方向正确，应选用引物 P1 和 P3。因为 P1 与基因 A 下游的非编码区互补配对，P3 与基因 A 上游且靠近启动子的区域互补配对，这样扩增的片段大小为200＋582＝782 bp。②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌，培养并离心后上清液中无蛋白A，可能的原因有：重组菌没
题号
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有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解。(2)诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等，这里答出其中一种即可，比如聚乙二醇(PEG)融合法。选择培养时，对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
题号
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√
8．陈皮橄榄醋以优质的橄榄为原料，结合陈皮发酵而成。大致流程为先在灭菌的果肉匀浆中接种酵母菌，发酵6天后，再接入活化的醋酸菌，发酵5天。下列叙述错误的是( )
A．酵母菌发酵产生的乙醇既是乙酸发酵的底物，又可以抑制杂菌繁殖
B．发酵6天后，再接入活化的醋酸菌进行发酵时，需要适当降低温度
C．果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时的
D．酵母菌在无氧条件下进行酒精发酵，而醋酸菌在有氧条件下进行乙酸发酵
题号
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B [当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为乙酸，同时乙醇还可以抑制杂菌繁殖，A正确；酒精发酵的温度为18～30 ℃，乙酸发酵的温度为30～35 ℃，因此发酵6天后，再接入活化的醋酸菌进行发酵时，需要适当升高温度，B错误；以酒精为底物进行乙酸发酵，酒精与氧气发生反应产生乙酸和水，几乎没有气泡产生，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时，C正确；酵母菌发酵过程中先通气使其大量繁殖，再密闭发酵产乙醇，醋酸菌为好氧菌，需持续通入无菌氧气，D正确。]
题号
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√
9．(2025·重庆万州期中)发酵工程在食品、医药、农牧业等方面有着广泛地应用，下列有关说法正确的是( )
A．发酵工程的中心环节是灭菌，防止杂菌污染
B．pH能影响发酵产物，谷氨酸的发酵生产过程中，碱性条件下易产生谷氨酰胺
C．啤酒生产中的焙烤、蒸煮环节既可以杀菌，又可以使所有酶失活
D．微生物饲料中的单细胞蛋白除蛋白质外还含有糖类、脂质、维生素等
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D [发酵工程的中心环节是发酵罐内发酵，A错误；pH能影响发酵产物，谷氨酸发酵生产应在中性或弱碱性条件下进行，在酸性条件下则容易形成谷氨酰胺和N-乙酰谷氨酰胺，B错误；焙烤是为了去除大麦种子中的水分，可以杀死大麦种子胚，但没有起到灭菌作用，也不能使淀粉酶失活，C错误；以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵能获得单细胞蛋白，单细胞蛋白含有丰富的蛋白质、糖类、脂质和维生素等物质，可以用作食品添加剂，D正确。]
题号
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√
10．(2025·河南郑州模拟)腐乳制作是我国传统发酵技术的代表之一，其工艺流程如下所述。下列叙述正确的是( )
让豆腐上长出毛霉―→加盐腌制―→加卤汤装瓶―→密封腌制
A．毛霉主要通过分泌淀粉酶将淀粉分解为葡萄糖，促进腐乳风味的形成
B．腐乳制作过程中，有机物种类增多，但含有的总能量减少
C．卤汤中的酒精和香辛料可以调味并抑制杂菌污染，浓度越高效果越好
D．腐乳制作过程中，乳酸菌的无氧呼吸是产生氨基酸和甘油的关键环节
题号
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B [毛霉在腐乳制作中主要分泌蛋白酶和脂肪酶，将豆腐中的蛋白质分解为小分子肽和氨基酸，脂肪分解为甘油和脂肪酸，淀粉的分解并非毛霉的主要作用，A错误；腐乳制作过程中，毛霉等微生物会分解原料中的大分子有机物为小分子有机物，这一过程中，有机物的种类会增多，但由于微生物的代谢活动会消耗能量，并且部分能量会以热能的形式散失，因此含有的总能量会减少，B正确；卤汤中的酒精和香辛料可以调味并抑制杂菌污染，浓度过高会抑制发酵微生物的作用，C错误；腐乳制作的核心微生物是毛霉，而非乳酸菌，乳酸菌主要参与泡菜、酸奶等发酵，其代谢产物(如乳酸)与腐乳风味无直接关联，D错误。]
题号
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11．(2025·湖北武汉模拟)聚赖氨酸(PL)能抑制多种微生物的活性，科研人员欲从土壤中分离出分泌PL能力强的微生物，开展了如下图所示的实验(Ⅰ～Ⅳ表示过程，①～③表示菌落)，已知PL可使亚甲基蓝褪色，形成如乙培养基上的透明圈。下列有关叙述错误的是( )
题号
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√
A．设置甲培养基的目的是从土壤中分离出能分泌PL的微生物
B．乙是鉴别培养基，培养基中应添加了亚甲基蓝
C．制备培养基的过程为：配制培养基→调pH→高压蒸汽灭菌→倒平板
D．丙培养基上的微生物是从乙培养基中挑选①菌落中的微生物通过平板划线法接种的
题号
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A [设置甲培养基的目的是对土壤中的微生物进行稀释和初步培养，而不是直接分离出能分泌PL的微生物，A错误；乙培养基中添加亚甲基蓝，根据PL可使亚甲基蓝褪色形成透明圈的原理，来鉴别能分泌PL的微生物，所以乙是鉴别培养基，B正确；制备培养基的正确过程为：配制培养基→调pH→高压蒸汽灭菌→倒平板，C正确；透明圈直径与菌落直径之比越大，分泌PL的能力越强，由图可知，丙培养基上的微生物是从乙培养基中挑选①菌落中的微生物通过平板划线法接种的，D正确。]
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12．(2025·陕西宝鸡模拟)枸杞是一味传统中药，野生黑果枸杞富含花青素，且抗逆性强，但比人工种植的宁夏枸杞个体小、产量低。研究人员尝试利用不对称植物体细胞杂交技术将野生黑果枸杞的抗逆性状转移到宁夏枸杞中，操作过程大体如图所示。下列叙述错误的是( )
题号
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√
A．可以用酶解法获得上述两种原生质体
B．杂交细胞含有两种枸杞的全部遗传信息
C．可用电融合、聚乙二醇等方法诱导融合
D．该杂交细胞经过脱分化和再分化后可获得幼苗
题号
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B [可以用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁获得原生质体，A正确；根据图信息，黑果枸杞原生质体经辐射处理后，染色体片段断裂，因此杂交细胞不含有两种枸杞的全部遗传信息，B错误；可以用电融合、聚乙二醇等方法诱导原生质体的融合，C正确；该杂交细胞经过脱分化和再分化后可获得幼苗，D正确。]
题号
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13．(12分)广东省是登革热的多发地区，尤其是今年夏、秋季特别严重，据统计确诊人数已超万人。登革热是由登革热病毒引起的一种急性发热性疾病，可通过伊蚊叮咬传染给人。登革热病毒的遗传物质是一段单链RNA。下图为登革热病毒的致病机理。回答下列问题：
题号
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(1)图示主要显示了人体对抗登革热病毒的__________免疫过程。
(2)图中物质甲是________，在此免疫过程中的作用是____________
__________________。
(3)登革热患者常出现局部组织水肿等症状，原因是______________
___________________________________________________________
_________________________________________________________。
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体液
细胞因子
促进B细胞
抗体Ⅰ与病毒结合形成的复合物引起血管通透性增大，从而使血浆中的蛋白质等渗出，组织液渗透压相对升高，组织液增多
的分裂、分化过程
(4)对于登革热的重症患者，需要注射抗体来帮助病人抵抗病毒，如果你是医生，建议患者注射抗体________(填“Ⅰ”或“Ⅱ”)来进行免疫治疗，效果更明显。
题号
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Ⅱ
(5)医学上常利用单克隆抗体制备技术来制备抗体，既可以用于治疗，又可以用于精确检测，可以做到早发现，早治疗，以防登革热大面积传染。下图表示抗登革热病毒单克隆抗体的制备过程。
题号
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与诱导植物细胞融合相比，诱导动物细胞融合获得乙，特有的融合方法是__________________。制备单克隆抗体过程中需要对细胞进行至少两次的筛选，第一次筛选过程中能在特定选择培养基上生长的是____________。单克隆抗体的特点是_______________________________________________________________________________。
题号
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灭活病毒诱导法
杂交瘤细胞
能准确地识别抗原的细
微差异，与特定抗原发生特异性结合，可大量制备
[解析] (1)图中显示了抗体的作用，抗体是体液免疫的关键物质，因而图中显示的是人体对抗登革热病毒的体液免疫过程。(2)图中物质甲是由辅助性T细胞合成并分泌的细胞因子，细胞因子在体液免疫中的具体作用是促进B细胞的分裂、分化过程。(3)登革热患者常出现局部组织水肿等症状，这是因为抗体Ⅰ与病毒结合形成的复合物会引起血管通透性增大，从而使血浆中的蛋白质等渗出，组织液渗透压相对升高，因而组织液增多，表现为组织水肿。(4)对于登革热的重症患者，需要注射抗体来帮助病人抵抗病毒，结合图示可以
题号
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看出，抗体Ⅱ在清除病毒的过程中有重要作用，因此，建议患者注射抗体Ⅱ来进行免疫治疗，效果更明显。(5)与诱导植物细胞融合相比，诱导动物细胞融合获得乙，特有的融合方法是灭活病毒诱导法。制备单克隆抗体过程中需要对细胞进行至少两次的筛选，第一次筛选过程中能在特定选择培养基上生长的是杂交瘤细胞，即在该培养基上没有融合的两种细胞以及发生同种融合的细胞均不能生长，进而可将杂交瘤细胞筛选出来。由于杂交瘤细胞有多种类型，因而可通过抗原—抗体杂交的原理以及克隆化培养筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。单克隆抗体的特点是能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，可大量制备。
题号
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课后限时作业(八) 生物技术与工程[B卷]
1．(2025·广东卷)将人眼睑成纤维细胞传代培养后，再培养形成支架，在该支架上接种人口腔黏膜上皮细胞，培养一段时间后分离获得上皮细胞片层，可用于人工角膜的研究。上述过程不涉及( )
A．制备细胞悬液
B．置于5%CO2等适宜条件下培养
C．离心收集细胞
D．用胰蛋白酶消化支架后分离片层
√
D [动物细胞培养时，为增大细胞与培养液的接触面积，需要制备细胞悬液，A不符合题意；置于5%CO2等适宜条件下培养，其中5%的CO2可维持培养液的pH，B不符合题意；在成纤维细胞传代培养过程中需要通过离心收集细胞，C不符合题意；不能使用胰蛋白酶消化支架，避免将上皮细胞片层分离成单独细胞，D符合题意。]
题号
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√
2．(2025·安徽卷)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是( )
A．从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞
B．将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞，可将其诱导形成iPS细胞
C．将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞
D．采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚，因这两个时期的细胞未发生分化
题号
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B [从动物体内取出组织，用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为原代细胞，A错误；将特定基因或将特定蛋白导入已分化的T细胞可诱导其形成iPS细胞，B正确；将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合，经诱导融合后形成的细胞不一定是能分泌所需抗体的细胞，如骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合形成的细胞，C错误；囊胚期的细胞已开始分化，D错误。]
题号
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√
3．(2025·湖北卷)利用犬肾细胞MDCK扩增流感病毒，生产流感疫苗，具有标准化、产量高等优点。但MDCK细胞贴壁生长的特性不利于生产规模的扩大，严重制约疫苗的生产效率。研究人员通过筛选，成功获得一种无成瘤性的(多代培养不会癌变)、可悬浮培养的MDCK细胞——XF06。下列叙述错误的是( )
A．XF06悬浮培养可提高细胞密度，进而提升生产效率
B．细胞贴壁生长特性的改变是由于流感病毒感染
C．可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒
D．采用无成瘤性细胞生产疫苗，是为了避免疫苗中有致瘤DNA的污染
题号
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B [根据题意，与贴壁生长的细胞培养相比，XF06悬浮培养能更充分利用空间，有利于提高细胞密度，从而提升生产疫苗的效率，A正确；细胞贴壁生长特性的改变是由遗传物质改变引起的，不是流感病毒感染导致的，B错误；细胞裂解液中，流感病毒和其他细胞裂解物的密度、质量等性质不同，可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒，C正确；根据题意可知，无成瘤性MDCK细胞经多代培养不会发生癌变，采用无成瘤性细胞生产疫苗，能避免疫苗中有致瘤DNA的污染，D正确。]
题号
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4．(2024·北京卷)我国科学家体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，为研究灵长类胚胎发育机制提供了实验体系(如图)。相关叙述错误的是( )
题号
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√
A．实验证实食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能
B．实验过程中使用的培养基含有糖类
C．类囊胚的获得利用了核移植技术
D．可借助胚胎移植技术研究类囊胚的后续发育
题号
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C [体外诱导食蟹猴胚胎干细胞，形成了类似囊胚的结构(类囊胚)，证实了食蟹猴胚胎干细胞具有分化潜能，A正确；实验过程中使用的培养基需含有糖类，糖类可为细胞培养提供能源物质，B正确；类囊胚的获得利用了动物细胞培养技术，并没有进行核移植，C错误；可借助胚胎移植技术将类囊胚移植到相应的雌性受体中继续胚胎发育，从而可以用来研究类囊胚的后续发育，D正确。]
题号
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5．(2025·山东卷)利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛的过程如图所示，下列说法错误的是( )
题号
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A．对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞
B．卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅰ中期进行
C．培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液
D．可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛
√
B [胚胎工程中，往往需要对雌性供体进行超数排卵处理，即注射促性腺激素促使其产生更多的卵母细胞，A正确。卵母细胞培养至MⅡ期(减数分裂Ⅱ中期)进行去核，B错误。动物细胞培养时，培养液需要定期更换，以便清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，C正确。PCR技术可以检测受体细胞中是否导入目的基因，因此也可用RCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛，D正确。]
题号
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√
6．(2025·云南卷)孕酮具有促进子宫内膜增生，为受精卵着床做准备的作用。某奶牛场发现一头高产奶量母牛生产两胎后重复配种均未成功妊娠，该牛可正常排卵但孕酮量低于正常母牛。为获得该母牛的后代，下列说法正确的是( )
A．运用体外受精或人工授精技术可提高该牛的妊娠率
B．使用外源促性腺激素处理该牛获得更多卵子进而可获得多枚胚胎
C．体外受精或人工授精后形成受精卵移植到健康受体可提高存活率
D．使用该牛MⅡ期卵母细胞的细胞核进行核移植一定可以获得可育后代
题号
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C [该母牛孕酮量低于正常母牛，子宫内膜增生可能不足，不利于受精卵着床，即使运用体外受精或人工授精技术，也难以提高妊娠率，A错误；使用外源促性腺激素处理该牛，可促使其超数排卵，获得更多卵子，但孕酮量低于正常母牛，受精卵难以成功着床，B错误；该牛可正常排卵但孕酮量低于正常母牛，故体外受精或人工授精后形成受精卵移植到健康受体可提高存活率，C正确；使用该牛MⅡ期卵母细胞的细胞核进行核移植，MⅡ期卵母细胞同源染色体已分离，不一定能获得可育后代，D错误。]
题号
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√
7．紫杉醇是一种重要的抗癌药物，主要来源于红豆杉属植物。为了提高紫杉醇的产量，研究人员利用植物细胞培养技术进行生产，部分流程如图。下列叙述正确的是( )
A．激素的种类、浓度和比例等会影响过程①
B．生产过程中需要对外植体做彻底的灭菌处理
C．紫杉醇在细胞内大量积累有利于提高其产量
D．该生产过程利用的原理是植物细胞的全能性
题号
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A [激素的种类、浓度和比例等会影响过程①脱分化，A正确；生产过程中需要对外植体做彻底的消毒处理，B错误；紫杉醇是次生代谢产物，不能在细胞内大量积累，C错误；该生产过程没有获得完整植株或各种细胞，没有利用植物细胞的全能性，D错误。]
题号
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√
8．肿瘤类器官是将从患者肿瘤组织分离获得的肿瘤细胞(包括肿瘤干细胞)经一定培养后形成的微型肿瘤模型，其具有与肿瘤来源组织相似的结构特征和功能特性。下列叙述正确的是( )
A．可用胰蛋白酶处理肿瘤组织以获得单细胞悬液
B．培养肿瘤细胞时会出现细胞贴壁和接触抑制
C．体外培养获得的肿瘤类器官不具有分化能力
D．该肿瘤类器官不可用于肿瘤生长机制的研究
题号
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A [制备细胞悬液时，可用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织块使细胞分散开，A正确；贴附性细胞培养时会出现细胞贴壁和接触抑制现象，但肿瘤细胞一般表现出贴壁依赖性减弱或丧失以及接触抑制缺失，B错误；肿瘤类器官是将从患者肿瘤组织分离获得的肿瘤细胞(包括肿瘤干细胞)经一定培养后形成的微型肿瘤模型，具有与肿瘤来源组织相似的结构特征和功能特性，所以可推测体外培养获得的肿瘤类器官具有分化能力，C错误；肿瘤类器官具有与肿瘤来源组织相似的结构特征和功能特性，可用于肿瘤生长机制的研究，D错误。]
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9．(2025·广东湛江模拟)Rag2基因缺陷导致大鼠无法产生B、T淋巴细胞。科研人员将正常大鼠的胚胎干细胞(ES细胞)注射到Rag2基因缺陷大鼠的桑葚胚中，使其产生具有正常ES细胞来源的淋巴细胞群的体细胞嵌合体，从而补充其缺失的淋巴细胞，其过程如图所示。下列分析正确的是( )
题号
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√
A．嵌合体大鼠产生的B、T淋巴细胞直接由ES细胞分化而来
B．获得的嵌合体大鼠的大部分细胞的Rag2基因没有缺陷
C．注入桑葚胚的ES细胞在囊胚期主要存在于内细胞团
D．该实验最终获得了嵌合体大鼠证明ES细胞具有全能性
题号
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C [嵌合体大鼠中供体来源的ES细胞可分化形成造血干细胞，再分化成淋巴细胞，A错误；获得的嵌合体大鼠的大部分细胞还是有Rag2基因缺陷，B错误；桑葚胚注入的ES细胞在囊胚期主要存在于内细胞团，内细胞团将来发育成胎儿的各种组织，C正确；该实验获得的嵌合体大鼠是由大鼠胚胎发育而来，并不是ES细胞发育而来，不能体现其全能性，D错误。]
题号
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10．(2025·安徽合肥模拟)为降低治疗人肺癌药物的副作用，科研人员尝试在单克隆抗体技术的基础上，构建抗体—药物偶联物(ADC)，过程如图所示。下列叙述错误的是( )
题号
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√
A．图示注射的特定抗原应该是肺癌细胞特有的
B．①过程可在无菌条件下采用灭活病毒诱导融合
C．悬浮培养杂交瘤细胞时，接触抑制会使分裂受阻
D．该ADC能与肺癌细胞结合，源于其抗体的特异性
题号
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C [在构建抗体—药物偶联物(ADC)时，注射的特定抗原应该是肺癌细胞特有的，这样才能确保产生的抗体能够特异性地识别和结合肺癌细胞，A正确。在单克隆抗体制备过程中，①过程是细胞融合，通常采用灭活病毒(或PEG)诱导B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。这一过程需要在无菌条件下进行，以避免污染，B正确。接触抑制是指贴壁细胞在培养过程中，当细胞密度达到一定程度时，细胞会停止分裂，悬浮培养杂交瘤细胞时，细胞不会受到接触抑制的影响，C错误。ADC能够与肺癌细胞结合，是因为其抗体部分具有特异性，能够识别并结合肺癌细胞表面的特定抗原，D正确。]
题号
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11．甲流主要是由甲型H1N1流感病毒(RNA病毒)引起的急性呼吸道传染病。为研制H1N1病毒疫苗，科研人员以牛为实验材料进行如下操作，并从牛奶中获取抗原蛋白。下列叙述正确的是( )
题号
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√
A．过程①为逆转录，需要脱氧核糖核苷酸和逆转录酶
B．细胞1为成熟的卵细胞，该细胞含一整套遗传信息
C．过程②的培养液中需加抗生素以防止代谢产物积累
D．过程③为胚胎分割，囊胚期的性别鉴定需取样内细胞团
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A [该病毒遗传物质为RNA，抗原基因为DNA，过程①为逆转录，需要脱氧核糖核苷酸和逆转录酶，A正确；要从牛奶中获取抗原蛋白，需要培养转基因牛，因此需要把重组质粒导入受精卵，因为受精卵具有全能性，细胞1为受精卵，B错误；过程②的培养液中加抗生素是为了防止杂菌污染，防止代谢产物积累需要定期更换培养液，C错误；性别鉴定需取样滋养层细胞，并不是内细胞团，可以减少对胚胎的损伤，D错误。]
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√
12．(2025·湖北黄冈模拟)目的基因的单链DNA片段(ss-DNA)可作为探针，在科研和医学检测等方面有重要应用。利用不对称PCR技术可制作大量的探针ss-DNA，其基本原理是采用数量或浓度不同的一对引物(引物①和引物②)，经若干次循环后，低浓度的引物首先被消耗完毕，之后的循环只能产生高浓度引物的延伸产物，结果产生了大量的ss-DNA，下列有关叙述正确的是( )
A．制作探针ss-DNA需要检测目的基因的全部碱基排列顺序
B．若引物①与ss-DNA结合，则PCR仪中引物①的数量大于引物②的数量
C．在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活引物与母链碱基互补配对
D．PCR扩增目的基因时，若复性的温度过高，可能得不到ss-DNA
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D [制作探针ss-DNA时，不需要知道目的基因的全部碱基排列顺序，只需要知道目的基因两端的碱基序列，以便合成两种引物，A错误；若引物①与ss-DNA结合，则引物①延伸的单链与ss-DNA互补，数量应该较少，故PCR仪中引物①的数量要小于引物②的数量，B错误；在反应缓冲液中加入Mg2+的作用是激活耐高温的DNA聚合酶，C错误；PCR扩增目的基因时，若复性的温度过高，则引物与模板母链无法通过氢键形成碱基对，使后面的延伸无法进行，DNA分子无法复制，得不到ss-DNA，D正确。]
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13．(14分)(2025·四川广安二模)干旱胁迫是限制作物产量和品质的一个重要影响因素。科研人员通过转基因技术将大肠杆菌的耐旱基因(mtlD)整合进玉米基因组，增强了玉米的抗旱性。据图回答问题。
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限制酶 识别序列及切割位点(5′→3′)
BamHⅠ GGATCC
BclⅠ TGATCA
SmaⅠ CCCGGG
↓
↓
↓
(1)可采用PCR技术扩增目的基因，PCR扩增的原理是____________
_________。
在反应体系中除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入____________________________。
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DNA的半保
引物和耐高温的DNA聚合酶
留复制
(2)为了保证mtlD基因正确连接到质粒中以构建重组质粒，在设计mtlD基因的引物时，应在两种引物的5′端分别添加_______________限制酶的识别序列，请据此设计转录模板链的引物为5′－
__________________－3′(含12个碱基序列)。酶切后的目的基因片段和质粒通过__________________(填“E．coliDNA连接酶”或“T4 DNA连接酶”)进行连接。
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BamH Ⅰ和Sma Ⅰ
GGATCCATCTAC
T4 DNA连接酶
(3)为检测mtlD基因是否成功插入质粒中，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaⅠ和______________进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现___________个条带，则说明插入成功。
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BamHⅠ(1分)
2(1分)
(4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，请写出鉴定方法：_________________________________________________。
将玉米栽种在干旱的环境中，看玉米能否正常生长
[解析] (1)PCR扩增的原理是DNA的半保留复制，在PCR反应体系中，除加入模板、dNTP、含Mg2+的缓冲液外，还需要加入引物(为DNA聚合酶提供合成的起始位点)和耐高温的DNA聚合酶(能在高温下催化DNA合成)。(2)为将图中质粒和mtlD基因正确连接构建重组质粒，设计mtlD基因的引物时，由于目的基因中间有BclⅠ的识别序列，因此不能在引物中设计该序列，而只能选择与该限制酶能产生相同黏性末端的限制酶BamHⅠ，即需要在两种引物的5′端分别
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添加BamHⅠ、SmaⅠ酶的识别序列，所以在设计mtlD基因转录模板链的引物时，5′端应添加BamHⅠ限制酶的识别序列GGATCC，转录模板链的引物为5′—GGATCCATCTAC—3′，酶切后的目的基因片段和质粒通过T4 DNA连接酶进行连接。因为T4 DNA连接酶连接平末端的效率高。(3)结合(2)可知，研究人员从受体菌中提取质粒，使用SmaⅠ和BamHⅠ进行双酶切，通过电泳检测酶切结果，若电泳结果出现2个条带，则说明插入成功。(4)从个体水平上检测耐旱基因是否在玉米体内正常表达，可以将玉米栽种在干旱的环境中，看玉米能否正常生长。
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热点拓展
热点1 微生物鉴定与筛选中的各种“圈”(透明圈、变色圈、抑菌
圈、生长圈)、影印培养
1．(2024·甘肃卷节选)源于细菌的纤维素酶是一种复合酶，能降解纤维素。为了提高纤维素酶的降解效率，某课题组通过筛选高产纤维素酶菌株，克隆表达降解纤维素的三种酶(如下图)，研究了三种酶混合的协同降解作用，以提高生物质资源的利用效率。回答下列问题。
(1)过程①②采用以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基筛选菌株X，能起到筛选作用的原因是______________________________________________。
高产纤维素酶菌株筛选时，刚果红培养基上的菌落周围透明圈大小反映了__________________________________。
只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物
才能生长繁殖
菌落产生的纤维素酶的活性和量
(2)课题组用三种酶及酶混合物对不同生物质原料进行降解处理，结果如下表。表中协同系数存在差异的原因是________________________________________(答出两点)。
生物质原料 降解率(%) 协同系数 酶A 酶B 酶C 混1 混2 混1 混2
小麦秸秆 7.08 6.03 8.19 8.61 26.98 74.33 114.64
玉米秸秆 2.62 1.48 3.76 3.92 9.88 24.98 77.02
玉米芯 0.62 0.48 0.86 0.98 6.79 1.82 11.34
注：混1和混2表示三种酶的混合物。
生物质原料不同；混合物中不同酶的含量不同
[解析] (1)选择培养基是指一类根据特定微生物的特殊营养要求或其对某理化因素抗性的原理而设计的培养基。具有只允许特定的微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的功能。在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的选择培养基中，只有能利用羧甲基纤维素钠的微生物才能生长繁殖。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，使得含有纤维素的培养基呈现红色。当纤维素被纤维素酶分解时，刚果红与纤维素的复合物无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。这个透明圈的大小直接反映了纤维素分解菌分解纤维素的能力。透明圈大，说明纤维素分解菌分解纤维
素的能力强，即菌落产生的纤维素酶的活性强、量多。(2)分析表格可知，表中协同系数共3行2列，彼此都不同，因此需要对行、列分别进行分析，各自得出一个原因，正好满足题干要求的2点。对比同一列的协同系数，如倒数第2列(混1)的3行，从上到下分别为74.33、24.98、1.82，它们有差异的原因在于这三行的“生物质原料”不同(分别是小麦秸秆、玉米秸秆、玉米芯)，这是3个数据的自变量，也是因变量协同系数不同的原因。最后一列(混2)的数据也是如此。对比同一行的协同系数，如第1行(小麦秸秆)的2列，从左到
右的分别为74.33、114.64，这两个数据有差异的原因显然在于混1、混2的不同，混1、混2表示酶A、酶B、酶C三种酶的混合物，由于三种酶的配比不同，即混合物中不同酶的含量不同，导致混1、混2协同系数有差异。下方两行(玉米秸秆、玉米芯)的数据也是如此。综上，表中3行2列的协同系数存在差异的原因有两个，其一是生物质原料存在差异，其二是混合物中不同酶的含量不同。
2．(2024·安徽卷)丁二醇广泛应用于化妆品和食品等领域。兴趣小组在已改造的大肠杆菌中引入合成丁二醇的关键基因X，以提高丁二醇的产量。回答下列问题：
(1)扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶，原因是______________________________________________________________________________________________________________________
_________________________________________________________。
在PCR反应中，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性
(2)使用BamH Ⅰ和 Sal Ⅰ限制酶处理质粒和X基因，连接后转化大肠杆菌，并涂布在无抗生素平板上(如图)。在此基础上，进一步筛选含目的基因菌株的实验思路是______________________________
___________________________________________________________
__________________________________________________________________________。
在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成
(3)研究表明，碳源和氮源的种类、浓度及其比例会影响微生物生长和发酵产物积累。如果培养基中碳源相对过多，容易使其氧化不彻底，形成较多的____________________，引起发酵液pH值下降。兴趣小组通过单因子实验确定了木薯淀粉和酵母粉的最适浓度分别为100 g·L-1和15 g·L-1。在此基础上，设置不同浓度的木薯淀粉(90 g·L-1、
100 g·L-1、110 g·L-1)和酵母粉(12 g·L-1、15 g·L-1、18 g·L-1)筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，以获得较高发酵产量，理论上应设置________(填数字)组实验(重复组不计算在内)。
乳酸或有机酸
9
(4)大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高，其原因是_______________________________________。
(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经_________________，最终获得发酵产品。
大肠杆菌进行细胞呼吸时会释放大量热量
提取、分离和纯化
[解析] (1)在PCR反应中，变性的温度需要90 ℃ 以上，需要利用高温使DNA双链解旋，普通的DNA聚合酶在高温下会变性失活，而Taq DNA聚合酶能够耐高温，在高温条件下依然具有活性，因此扩增X基因时，PCR反应中需要使用Taq DNA聚合酶。(2)据图可知，使用BamH Ⅰ和SalⅠ限制酶处理质粒和X基因，四环素抗性基因被破坏，氯霉素抗性基因保留，因此能在氯霉素培养基上生存，不能在四环素培养基上生存的大肠杆菌即是含目的基因菌株，因此实验思路为：在平板中添加氯霉素，再将在含氯霉素的培养基中生长的菌落利用影印法影印到添加四环素的培养基中，在含有四环素的培
养基中不能正常生长的菌落由导入目的基因的菌株形成。(3)碳源是微生物生长所需的主要能量来源，而氮源则是构成细胞物质和合成蛋白质、核酸等生物大分子的基本原料。当培养基中碳源相对过多时，微生物可能会优先利用碳源进行能量代谢，而氮源的消耗相对较慢。这会导致碳源氧化不完全，形成较多的乳酸或有机酸。这些乳酸或有机酸会在溶液中解离，使发酵液的pH值下降。因为要筛选碳源和氮源浓度的最佳组合，木薯淀粉浓度有3种，酵母粉浓度也有3种，因此理论上应设置3×3＝9组实验。(4)大肠杆菌进行细胞呼
吸时会释放大量能量，绝大多数以热能形式释放，因此大肠杆菌在发酵罐内进行高密度发酵时，温度会升高。(5)发酵工业中通过菌种选育、扩大培养和发酵后，再经提取、分离和纯化，最终获得发酵产品。
创新解读
1．在高考题中，我们常常会遇到与微生物鉴定与筛选相关的题目，其中透明圈、变色圈、抑菌圈、生长圈等概念频繁出现，成为考查的重点。像是通过透明圈筛选能分解特定底物的微生物，利用变色圈判断微生物是否产生特定代谢产物，依据抑菌圈筛选抗生素产生菌，借助生长圈选育特定营养物质的生产菌，这些都是高考中常见的考查角度。
2．而在实际的科研与生物技术应用领域，这些微生物鉴定与筛选中的“圈”同样发挥着至关重要的作用。并且，影印培养技术也在微生物研究中有着独特的应用，它能够实现对微生物菌落的复制，从而进行多种条件下的对比培养。这些看似基础的微生物知识，正不断拓展和深化，在现代生物技术发展中绽放新的活力，其应用范围也在不断扩大，与基因工程、发酵工程等前沿生物技术紧密相连，推动着相关领域的发展。
1．抑菌圈
(1)原理：待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质，或能分泌某种酶并将无毒的物质水解成对工具菌有毒的物质，从而在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈。该法常用于抗生素产生菌的筛选，工具菌常是抗生素敏感菌。
(2)关键指标分析
2．透明圈
(1)原理：在固体培养基中掺入可被特定菌利用的营养成分M，造成浑浊、不透明的培养基背景。同时加入能与M形成有色复合物的染色剂，待筛选菌的菌落周围会形成透明圈。
(2)实验：纤维素能与刚果红形成红色复合物，但其水解产物纤维二糖和葡萄糖不能与刚果红形成红色复合物。在以纤维素为唯一碳源的培养基中加入刚果红，接种土壤微生物培养，菌落周围出现透明圈，说明这些细菌能分解纤维素。
(3)关键指标分析
3．生长圈
(1)原理：利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，若待分离的菌在缺乏上述营养物的条件下，能合成该营养物，或能分泌酶将该营养物的前体转化成营养物，那么，在这些菌的周围就会有工具菌生长，形成环绕菌落生长的生长圈。该法常用来选育氨基酸、核苷酸和维生素的生产菌，工具菌往往都是对应的营养缺陷型菌株。
(2)关键指标分析
4．变色圈
(1)原理：将指示剂直接掺入固体培养基中，进行待筛选菌悬液的单菌落培养时，目的菌株代谢物使指示剂变色，在菌落周围形成变色圈。
(2)实例
①分离尿素分解菌：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。接种土壤微生物(产生脲酶)培养，菌落周围出现红色，说明该细菌能够分解尿素。
②分离谷氨酸产生菌：在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，当pH在6.2以下时为黄色，pH 7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。
5．影印平板培养法
(1)定义：影印平板培养法是一种微生物培养技术，其通过特定的操作方式，实现在一系列培养皿的相同位置上接种并培养出相同遗传型的菌落。
(2)过程：把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有一层灭菌丝绒布的木质圆柱印章上，使其均匀地沾满来自母种培养皿平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择培养基平板上。经培养后，对各平板相同位置上的菌落进行对比，就可选出适当的突变型菌株。
(3)实例：以培养某种大肠杆菌(如转胰岛素基因大肠杆菌)为例
①选择具有标记基因青霉素抗性基因和四环素抗性基因，同时限制酶切点在青霉素抗性基因内部的质粒作载体，与目的基因构建表达载体。
②得到两种质粒：原有质粒重新连接而成的空质粒和重组质粒。
③将所得质粒与没有青霉素、四环素抗性的大肠杆菌混合、转化，将得到三种大肠杆菌，即未转化的大肠杆菌、导入空质粒的大肠杆菌和导入重组质粒的大肠杆菌。
④将所得大肠杆菌培养，增加数量。然后接种到完全培养基上，得如图所示的6个菌落。
⑤用影印接种法将菌落分别接种到含有四环素和青霉素的培养基上，培养结果如图。
⑥结果分析：2号、5号菌落无法在两种培养基上生存，说明所含大肠杆菌没有抗性基因，即所含大肠杆菌为未转化的大肠杆菌；1号、4号、6号菌落在两种培养基中均能生存，说明其大肠杆菌两种抗性都有，即所含大肠杆菌为导入空质粒的大肠杆菌；3号菌落能在含四环素的培养基上生存，说明其含有四环素的抗性，不能在含青霉素的培养基上生存，说明不含有青霉素的抗性(青霉素抗性基因酶切插入目的基因后丧失其作用)，综合分析其大肠杆菌含有重组质粒。3号菌落所含大肠杆菌即是要选择培养的大肠杆菌。
1．(2025·甘肃平凉模拟)牛瘤胃中的微生物包括细菌、产甲烷菌、真菌等，其中细菌包括纤维降解菌、淀粉降解菌、半纤维降解菌等。刚果红可以与纤维素形成红色复合物，但不与纤维素水解产物发生这种反应。将从牛瘤胃中获取的四种微生物接种在含有刚果红—纤维素复合物的培养基中，培养在有氧环境中，一段时间后出现如图所示结果。下列说法错误的是( )
A．在含有土豆汁的培养基中加入纤维素粉和刚果红可制备该培养基
B．从培养基的功能来分，该培养基的种类是鉴别培养基
C．四种微生物中，d种微生物分解纤维素的能力最强，且在牛瘤胃中数量最多
D．对a种微生物扩大培养时，通常使用液体培养基，可提高营养物质的利用率
√
C [土豆汁可以为微生物的生长提供碳源和氮源，在含有土豆汁的培养基中加入纤维素粉和刚果红可制备该培养基，A正确；该培养基能够鉴别微生物是否能分解纤维素，从培养基的功能来分，该培养基的种类是鉴别培养基，B正确；动物消化道中一般都是缺氧环境，而该实验是在有氧条件下进行的，d种微生物分解纤维素的能力最强，但不一定适合在牛瘤胃中生存，数量不一定最多，C错误；扩大培养时，通常使用液体培养基，因为使用液体培养基能促进培养液和菌种的接触，提高营养物质的利用率，D正确。]
2．幽门螺杆菌(Hp)属于一类致癌物，Hp与胃炎、消化性溃疡和胃癌等多种疾病有关。Hp的Ipp20基因能合成其特有的Ipp20蛋白质，科研人员据此利用基因工程制备Hp疫苗，该过程所选择的质粒及操作步骤如图所示。回答下列问题：
(1)通过PCR扩增Ipp20基因的反应需要在________液中进行，扩增Ipp20基因时的基本条件包括DNA模板、原料、耐高温的DNA聚合酶、________等。
(2)在PCR反应体系中一般需要加入Mg2+，原因是________________
_________________________________________________________。
缓冲
引物
耐高温的DNA聚
合酶需要Mg2+激活
科研人员探究了不同浓度的Mg2+对PCR扩增效果的影响，结果如表所示。科研人员认为PCR反应高效进行，Mg2+浓度并不是越高越好，据表分析，依据是______________________________________________________________________________________________________________________________________。
Mg2+浓度/(mmol·L-1) 0 2 3 4 5 6
Ipp20基因相对含量 － ＋ ＋＋ ＋＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋＋
注：“－”表示未检测到基因，“＋”表示检测到Ipp20基因，且“＋”越多，检测到的含量越多。
表中Mg2+浓度为4 mmol·L-1时，Ipp20基因相对含量最高，Mg2+浓度高于
4 mmol·L-1时，Ipp20基因相对含量降低
(3)已知在构建基因表达载体时使用了限制酶Xho Ⅰ和Xba Ⅰ切割质粒和Ipp20基因。科研人员采用了影印法筛选含有目的基因的大肠杆菌，即使用无菌的线毡布压在培养基A(添加潮霉素)的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B(添加氯霉素)上。根据图示结果分析，含有目的基因的大肠杆菌应从培养基________中获取，理由是___________________________________________________________
__________________________________________，且符合要求的大肠杆菌菌落是________(填培养基中数字)。
A
切割后，重组质粒中不含有氯霉素抗性基因，因此含目的基因的大肠杆菌不能在添加了氯霉素的培养基B中生长
3、5
[解析] (1)PCR技术是在体外进行DNA片段的复制，通过PCR扩增Ipp20基因的反应需要在缓冲液中进行，保证PCR过程中pH的稳定，扩增Ipp20基因时的基本条件包括DNA模板、原料、耐高温的DNA聚合酶和2种引物等。(2)在PCR反应体系中一般需要加入Mg2+，因为耐高温的DNA聚合酶需要Mg2+激活，即Mg2+的加入能促进反应的进行；从表中可以看出，在不含Mg2+的缓冲液中Ipp20基因几乎无法扩增(未检测到基因)，在一定的范围内，随着Mg2+浓度的增加，Ipp20基因相对含量逐渐增加，当Mg2+浓度为4 mmol·L-1时，Ipp20基因相对含量最高，扩增效果最好，Mg2+浓度高于4 mmol·L-1后，Ipp20基因相对含量降低，扩增效果反而下降，因此科研人员认为PCR反应高效进
行，Mg2+浓度并不是越高越好。(3)已知在构建基因表达载体时使用了限制酶XhoⅠ和XbaⅠ切割质粒和Ipp20基因，结合图示可以看出，质粒上含有潮霉素和氯霉素抗性基因，在构建目的基因表达载体的过程中氯霉素抗性基因被切割掉，保留了潮霉素抗性基因，因此导入空质粒或重组质粒的大肠杆菌都能在含有潮霉素的培养基A中生长，但含有重组质粒的大肠杆菌不能在含有氯霉素的培养基B上生长，从而会消失一些菌落，对照两个平板上减少的菌落就是符合要求的大肠杆菌菌落。科研人员采用了影印法筛选含有Ipp20基因的大肠杆菌，即使用
无菌的线毡布压在培养基A(添加潮霉素)的菌落上，带出少许菌种，平移并压在培养基B(添加氯霉素)上。根据图示结果分析，含有Ipp20基因的大肠杆菌应从培养基A中获取，这是因为带有目的基因的大肠杆菌不具有氯霉素的抗性，不能在培养基B中生长，结合图示可以看出，符合要求的大肠杆菌菌落是3和5。
热点2 单抗与双抗的制备及应用、抗原检测——双抗体夹心法
1．(2025·甘肃卷)肿瘤坏死因子α(TNF-α)是一种细胞因子，高浓度时可以引发疾病。研究者利用细胞工程技术制备了TNF-α的单克隆抗体，用于治疗由TNF-α引发的疾病，制备流程如下图。下列叙述正确的是( )
√
A．①是从小鼠的血液中获得的骨髓瘤细胞
B．②含未融合细胞、同种核及异种核融合细胞
C．③需用特定培养基筛选得到大量的杂交瘤细胞
D．④需在体外或小鼠腹腔进行克隆化培养和抗体检测
B [骨髓瘤细胞应该从骨髓中获取，A错误；B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合是随机的，可能有些细胞不发生融合，有些两两融合，有些多个融合，有同种核融合细胞，也有异种核融合细胞，B正确；诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，利用选择培养基筛选出杂交瘤细胞，但不能得到大量的，C错误；进行克隆化培养，即用培养基培养和注入小鼠腹腔中培养，抗体检测不是在小鼠腹腔内进行，D错误。]
2．(2022·山东卷)如图所示，将由2种不同的抗原分别制备的单克隆抗体分子，在体外解偶联后重新偶联可制备双特异性抗体，简称双抗。下列说法错误的是( )
√
A．双抗可同时与2种抗原结合
B．利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞
C．筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原
D．同时注射2种抗原可刺激B细胞分化为产双抗的浆细胞
D [根据抗原和抗体发生特异性结合的原理推测，双抗可同时与2种抗原结合，A正确；根据抗原与抗体能够发生特异性结合的特性，利用双抗可以将蛋白类药物运送至靶细胞，从而使药物发挥相应的作用，B正确；在两种不同的抗原刺激下，B细胞增殖、分化产生不同的浆细胞分泌形成两种抗体，因此，筛选双抗时需使用制备单克隆抗体时所使用的2种抗原来进行抗原—抗体检测，从而实现对双抗的筛选，C正确；同时注射2种抗原可刺激B细胞分化形成不同的浆细胞，而不是分化成产双抗的浆细胞，D错误。]
创新解读
1．在高考生物学的试题中，双抗的制备及应用、抗原检测——双抗体夹心法，常常作为考查生物技术与工程板块知识的重要考点出现。从制备双抗时对动物细胞融合技术的考查，到双抗体夹心法中抗原抗体特异性结合原理的剖析，这些知识点以选择题、简答题等形式，检验着大家对生物学基础理论和实验操作的理解。比如在单克隆抗体的制备流程里，从抗原注射到小鼠体内获取B淋巴细胞，再到与骨髓瘤细胞融合筛选出杂交瘤细胞，每个步骤都可能成为高考出题点。
2．在当下的科研热点和实际应用场景中，这些知识正发挥着巨大的作用。双抗凭借其能同时靶向两种抗原的特性，在肿瘤免疫治疗领域取得了突破性进展，为癌症患者带来了新的希望；双抗体夹心法以其高灵敏度和特异性，广泛应用于病毒抗原检测、肿瘤标志物筛查等，在疾病的早期诊断和防控方面扮演着不可或缺的角色。从高考题到热点聚焦，看似是从理论迈向实践，实则是知识的一脉相承与拓展深化，它们共同构建起了现代生物技术蓬勃发展的基石。
1．双抗的制备及应用
(1)双特异性抗体：是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，目前最常利用杂交—杂交瘤的方法来制备。
(2)实例：长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉，其所含的长春碱具有良好的抗肿瘤作用。图1是科研人员通过杂交—杂交瘤细胞技术(免疫的B淋巴细胞和杂交瘤细胞杂交技术)生产能同时识别癌胚抗原和长春碱的双特异性单克隆抗体的部分过程，图2是某双特异性抗体作用图。
(3)优点：与直接使用抗肿瘤药物相比，将抗肿瘤药物与双特异性单克隆抗体结合后给药，对人体的副作用更小，原因是双特异性单克隆抗体能将药物送到肿瘤部位，对肿瘤进行特异性杀伤。
2．抗原检测——双抗体夹心法
(1)双抗体夹心法：是一种将两种特异性抗体结合在一起来检测目标抗原或抗体的方法。
(2)基本原理：
①先将一种特异性抗体(捕获抗体)固定在固相载体(如微量滴定板、磁珠等)上，形成固相抗体；
②然后加入待测样本，使样本中的目标抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物；
③再加入另一种特异性抗体(检测抗体或酶标抗体)，该抗体与目标抗原的另一个表位结合，形成双抗体夹心结构；
④最后通过加入底物产生颜色反应或触发信号反应(如光信号、电信号)，根据反应的程度进行目标抗原或抗体的定性或定量检测。
1．普通的肿瘤治疗——单克隆抗体(单抗)只能结合单一的抗原，无法有效地聚集于肿瘤组织处。双特异性单克隆抗体(双抗)可以将抗肿瘤的药物直接导至靶细胞，通过靶向多个抗原发挥协同抗肿瘤作用。基因工程制备双抗的原理是对传统单抗进行基因工程方面的改造，从而形成双特异性抗体。利用杂交瘤细胞融合也可以制备双抗，先将每个杂交瘤细胞受抗原刺激产生单克隆抗体，然后将这两个杂交瘤细胞融合在一起，此融合的杂交瘤细胞能够重新随机组合“双亲”单抗肽段，从而产生双抗。下列叙述正确的是( )
√
A．诱导两个杂交瘤细胞融合，一定会产生双抗
B．基因工程改造传统单抗，操作对象是肽链
C．制备杂交瘤细胞的过程中需要将能分泌特定抗体的浆细胞与骨髓瘤细胞融合
D．相比于普通化疗，双抗治疗能减少药物的用量并降低正常组织的不良反应
D [诱导两个杂交瘤细胞融合，结果有不融合的单个杂交瘤细胞、融合成功的双杂交瘤细胞，不一定会产生双抗，即使融合成功的细胞，单抗肽段随机组合，也不一定能产生双抗，A错误；基因工程改造传统单抗，应在基因水平操作，操作对象是DNA分子(或基因)，B错误；制备杂交瘤细胞的过程中是免疫后的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，但是此时的B淋巴细胞包括多种产生不同抗体的浆细胞，C错误；将抗肿瘤的药物直接导至靶细胞，能减少药物的用量，避免了药物作用于正常组织细胞，降低正常组织的不良反应，D正确。]
2．如图表示双抗体夹心法检测抗原的过程，该方法是医学上常用的定量检测抗原的方法，利用细胞工程技术制备的单克隆抗体能增强该过程的有效性。下列叙述错误的是( )
√
A．图示两种抗体与样品中待测抗原的结合位点不同
B．温度、pH等会影响双抗体夹心法检测抗原的结果
C．用双抗体夹心法检测抗原需要制备两种能与抗原结合的单克隆抗体
D．双抗体夹心法与只使用单克隆抗体相比，能增加可识别抗原的种类
D [据图可知，用双抗体夹心法检测抗原时需要用到与抗原不同位点结合的两种抗体，因此用双抗体夹心法检测抗原需要制备两种能与抗原结合的单克隆抗体，A、C正确；据图可知，双抗体夹心法利用酶标抗体中的酶水解相应物质，通过检测水解产物的量来反映样品中抗原的含量，由于酶活性受温度、pH等因素的影响，因此温度、pH等会影响双抗体夹心法检测抗原的结果，B正确；抗原与抗体的结合具有特异性，该技术可用于定量检测抗原，双抗体夹心法与只使用单克隆抗体相比，未增加识别抗原的种类，D错误。]
热点3 同尾酶、启动子与转录调控
1．(2025·河南卷节选)为构建携带cg(高活性卡拉胶酶CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(如图)，对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切，随后用E．coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率，cg转录模板链的5′端最好含有________酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建
BamHⅠ
表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是____________________
______________________________。限制酶的识别序列和切割位点如下：
重组质粒连接处的序
列不再是原来的限制酶识别序列
[解析] E．coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率较低，因此为保证连接的效率，切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶，即不能选择EcoRⅤ酶和SmaⅠ酶，而SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割后的黏性末端相同，若选择SpeⅠ酶与XbaⅠ酶切割，会出现质粒和目的基因的自身环化甚至目的基因倒接，因此切割质粒时SpeⅠ酶与XbaⅠ酶中只能选择一个，而另一个限制酶需要选择BamHⅠ酶，又由于转录的方向是由启动子→终止子，且mRNA形成的方向是5′→3′，且mRNA与DNA的模板链方向相反，因此基因模板链的3′端应靠近启动子，故为保证连接准确性和效率，cg转录
模板链的5′端最好含有BamHⅠ酶切位点。T4 DNA连接酶既可以连接平末端，也可连接黏性末端，不同的平末端均可由T4 DNA连接酶连接，由于限制酶的识别序列具有专一性，若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列，则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验，获得的部分重组质粒分子大小符合预期，但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割，其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
2．(2025·广东卷)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及________检测，筛选获得重组菌株W1。
荧光
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有_____________________________________(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是________________
_____________________。培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是__________________________________
_________________________________________________________。
稀释涂布平板法(或显微镜直接计数法)
排除培养基本身
荧光对实验结果的干扰
PGeo在生长稳定期停止基因转录，且
带有SsrA短肽的mKate2被降解
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为___________________________________________
_______________。
快速生长期无荧光，生长稳定期荧光强度先上
升后保持稳定
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：_________________________
_____________________________________________________________________________________________________________________。
先敲除野生型菌株中的酶B基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶A基因，并将两种质粒导入野生型菌株中
[解析] (1)质粒中存在红色荧光蛋白基因，可根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及荧光检测，筛选获得重组菌株W1。(2)检测培养液中细胞密度常用的方法有稀释涂布平板法(通过统计平板上的菌落数来估算细胞数量，进而得到细胞密度)、显微镜直接计数法(利用细菌计数板在显微镜下直接对细胞进行计数)。接种前检测液体培养基的荧光强度，是为了排除培养基本身荧光对实验结果的干扰。进入生长稳定期后，由于PGeo在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降
解，导致荧光强度快速下降。(3)在重组菌株W2中，
