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大专题五
专题15 基因工程
生物技术与工程
知能融通
1．所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提。
( )
2．可以通过PCR以及构建基因文库等方法来获取目的基因。 ( )
提示：获取目的基因的方法有PCR技术扩增、构建基因文库等。
3．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步，目的基因就是编码蛋白质的基因。 ( )
提示：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的序列或非编码RNA基因。
辨 易 错
√
√
×
4．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA。
( )
提示：目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是是否插入到转基因生物(染色体)DNA上，这是检查基因工程是否成功的第一步。
5．基因工程中要培育转基因植物和动物，选用的受体细胞都是受精卵。
( )
提示：培育转基因动物时，所选用的受体细胞一般是受精卵；培育转基因植物时，所选用的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
×
×
6．基因工程中，利用含抗生素的培养基筛选出的受体细胞都含有目的基因。
( )
提示：通过含抗生素的培养基筛选出的受体细胞不一定都含有目的基因(重组质粒)，有可能是只含有(普通)质粒的受体细胞。
7．膀胱生物反应器的优点是提取目的基因产物不受性别和生长期的限制。
( )
8．如果利用蛋白质工程将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，获得新型干扰素，可直接通过改造mRNA实现。 ( )
提示：若直接改造mRNA，可获得改造后的蛋白质，但不能遗传下去。
×
√
×
9．PCR反应体系中加入两种特异性引物以获得引物之间的DNA片段。
( )
提示：利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增；引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，再进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列。
√
1．对限制酶切割位点的三点要求
(1)位置要求：限制酶切割位点所处的位置必须在标记基因外，这样才能保证标记基因的完整性。
(2)数量要求：选择限制酶切割目的基因时，被选择的限制酶在目的基因的两侧都要有识别序列，这样才能切割出完整的目的基因。
(3)对象要求：为使目的基因与载体形成相同的末端从而能够连接，通常使用同一种限制酶将二者切割；如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端存在互补关系，两末端可以连接，则可使用这两种不同限制酶切割载体和目的基因。
破 重 难
突破1 基因工程中三大工具的注意点
归 纳 总 结
与DNA有关的酶
酶 作用及相关键 结果
限制酶 切割DNA分子特定核苷酸序列中的磷酸二酯键 形成黏性末端或平末端
DNA
连接酶 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键(不需要模板) 重组DNA分子
DNA
聚合酶 以DNA一条链为模板，将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键 新的DNA分子
解旋酶 打开DNA分子双链之间的氢键 单链DNA
2．载体必须具备的结构特点和作用
(1)能自我复制：通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入。
(3)有标记基因：有特殊的标记基因，以便于筛选导入目的基因的受体细胞。
(4)无毒害作用：对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
突破2 PCR 技术
易 错 提 醒
(1)PCR反应需在一定的缓冲液中才能进行，且需通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(2)PCR技术中不需要解旋酶，而是利用高温使DNA解链。
(3)关于引物：依据目的基因两端的部分核苷酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对。
考能提升
1．(2025·广东卷)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及_______检测，筛选获得重组菌株W1。
溯 考 情
荧光
注：PGro为大肠杆菌内源启动子，在细胞快速生长期开启基因转录，但进入生长稳定期后即停止基因转录；SsrA基因编码SsrA短肽；C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解。
图a
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有_______________________________________(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是___________________________________。培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是_________________________________ _____________________________。
显微镜直接计数法(或细菌计数板计数法)
作为mKate2蛋白荧光强度检测的对照
PGro转录停止，mKate2蛋白合成停止，但特异性识别和降解仍持续
图b
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为__________________________ _______________________。
快速生长期荧光强度低，进入生长稳定期后快速增强
用酶A基因替换质粒②中mKate2基因，用酶B基因替换质粒①中mKate2基因，构建酶B基因缺失的大肠杆菌突变株并将上述质粒导入
解析：(1)结合图a，含有质粒①的重组菌株W1含有抗性基因1和红色荧光蛋白mKate2基因，因此在添加抗生素的培养基上，可结合PCR和mKate2蛋白或荧光检测筛选菌株。(2)对于培养液中大肠杆菌数量的计数，可采用显微镜直接计数法，对于体积较小的细菌，也可采用细菌计数板进行计数。在大肠杆菌的生长过程中需检测荧光强度，因此接种前需检测液体培养基的荧光强度以形成前后对照，说明荧光强度的差异是大肠杆菌的生长增殖引起的。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。(3)由图题干可推知：快速生长期时，X基因可转录表达，编码的阻遏蛋白 X阻遏红色荧光蛋白mKate2的表达，荧光强度增加缓慢；
生长稳定期，启动子PGro停止转录，X基因停止表达且蛋白 X被降解，因此红色荧光蛋白mKate2表达不受抑制，荧光强度快速增强。(4)根据题意，在快速生长期，酶A、B均需表达生成生长必需物以满足细胞正常生长需求，而在生长稳定期，酶A表达而酶B不表达以积累莽草酸，因此重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；用酶B基因替换质粒①中mKate2基因，导入质粒①，使相关代谢途径关键酶(酶b)在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶因被降解而减少对莽草酸的转化；同时用酶A基因替换质粒②中mKate2基因，导入质粒②，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因(酶A)的稳定表达，从而大量积累莽草酸。
2．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。回答下列问题：
图1
(1)研究者优化了培养基的_____________ (答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
碳源、氮源
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7 RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图2 a，载体的部分结构见图2 b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7 RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为___________ _____，理由是_________________________________________________________。
PT7、PBAD、PBAD
基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_______________________________(答两点)。
a
b
图2
抑制杂菌，去除丢失质粒的菌株
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_____________ ______________________________________。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：_________________________________________________________________ ______。
该处细胞中T7 RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)
解析：(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。(2)由题图2 a分析可知，蓝光照射下，T7 RNAP N端与T7 RNAP C端结合，导致无活性的T7 RNAP变成有活性的T7 RNAP，结合图1及图2 b，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7 RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因，长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。
3．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与_________植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和______________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备_________________。
野生型
农杆菌的Ti质粒
启动子和终止子
(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_____________________________________ ________________________________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约_____%的培养基中的幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株_______(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到______%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
DA1基因和卡那霉素抗性基因(或DA1基因、目的基因、卡那霉素抗性基因)
75
自交
100
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见如图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
核酸电泳图
如图所示：
解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DA1基因为显性基因，若突变体表型由DA1基因突变造成，则转基因植株的种子大小应与显性性状的野生型植株种子大小相近。(2)DA1基因为目的基因，构建基因表达载体时应用同种限制性内切核酸酶对DA1基因和载体(常用质粒)进行切割，产生相同黏性末端，再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，以确保插入的DA1基因可以正常表达。(3)①根据题干信息和题图分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，
则说明含有目的基因和抗性基因，即表示其基因组中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，T-DNA内部基因在减数分裂时不发生交换，则T1代自交后代应该出现3∶1的性状分离比，DA1为显性基因，因此应该选择阳性率约75%的培养基中的幼苗继续培养。③将T2代阳性植株(有显性纯合子、杂合子)自交，将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，因为杂合子自交会发生性状分离，产生无抗性基因/目的基因的子代，故培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的纯合子植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据序列分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，但野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，再结合图中的数据分析可知，电泳图中野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，据此画出电泳结果。
考向1 (高频点)基因工程的工具和步骤
1．(2025·惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是 ( )
提 考 能
注：箭头表示识别序列中切断部位。
A．KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割位点不同，但形成的黏性末端是相同的
B．与EcoRⅠ相比，HhaⅠ识别序列较短，该序列在DNA中出现的概率高
C．BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的末端拼接
D．限制酶识别序列大多是沿中心轴回转180°相反重合
答案：A
2．(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是 ( )
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
答案：C
解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，吸收的质粒可能是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)，也可能是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，A正确；由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)并成功表达目标蛋白，但也可能是虽然导入了重组质粒但未成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达β-半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色菌落，D正确。
考向2 (难点)PCR技术
3．(2025·肇庆一模)研究者通过利用T-DNA随机插入野生型水稻染色体DNA中，导致被插入的基因功能丧失，以此构建水稻突变体库，从中筛选出一株穗粒数异常的突变体A进行实验探究。请回答下列问题：
(1)用某种限制酶处理水稻突变体A的DNA(如图所示)后，用DNA连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用图中的引物_______(填序号)组合进行PCR扩增，目的是扩增出T-DNA插入位置两端的未知序列，反应过程中引物与模板DNA链碱基互补配对结合的阶段是_______。
①④
复性
(2)将T-DNA两端的未知序列与野生型水稻基因组序列比对，确定T-DNA插入了2号染色体上的B基因中，该突变体A的穗粒数及产量明显_______(填“低于”或“高于”)野生型，据此推测B基因可能促进水稻穗粒的形成，原因是_________________ _______________________________________________________。
(3)考虑转基因技术的安全性，适合选用_______(填“不育”或“可育”)水稻株系作为实验材料，选此株系的原因是_____________________________。
低于
当T-DNA插入2号染色体上的B基因，会破坏B基因，导致突变体产量低于野生型
不育
避免目的基因在自然界中扩散
解析：(1)因为要扩增的是T-DNA插入位置两侧的未知序列，而引物的延伸方向为5′→3′，所以利用图中的引物①④组合进行PCR。PCR过程包括变性、复性、延伸三个阶段，引物与模板结合的阶段是复性阶段。(2)结合题中信息“B基因可能促进水稻穗粒的形成”反推，该突变体产量明显低于野生型，因为当T-DNA插入2号染色体上的B基因，会破坏B基因，导致突变体产量低于野生型。(3)目的基因的扩散可能导致转基因技术存在安全问题，故适合选用不育水稻株系作为实验材料。
考向3 (重点、热点)融合其他知识考查基因工程的应用
4．(2024·河北卷节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为_____________________________启动子。Nos为终止子，其作用为___________。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶_________和_________对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
注：KpnⅠ、HindⅢ、SacⅠ和EcoRⅠ标注的位点为各限制酶的识别位点。
在胚乳中特异性表达的基因的
终止转录
HindⅢ
EcoRⅠ
(2)利用_____________法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测____________，通过_________________技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为_______。选择纯合子进行后续研究的原因是_______________________________。
(4)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是________________________ _______________________(答出两点即可)。
农杆菌转化
r2HN mRNA
抗原—抗体杂交
1/4
纯合子自交后代不发生性状分离
不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高
解析：(1)利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，则启动子应为在胚乳中特异性表达的基因的启动子。Nos为终止子，终止子可以终止转录。KpnⅠ会破坏启动子序列，不能选用；SacⅠ位于终止子序列之外，不能选用。为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。(2)获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录出的r2HN mRNA；也可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
热练
1．(2025·阳江模拟)DNA提取与PCR扩增等操作是基因工程的基础性工作，下列叙述错误的是 ( )
A．从目标生物中提取DNA时，利用了 DNA与其他物质在NaCl溶液和酒精中溶解度的差异
B．PCR扩增中会经30多次变性、退火、延伸的循环，单次循环的DNA产生量没有变化
C．PCR扩增说明一些酶可以在细胞外高于60 ℃条件下发挥作用
D．经琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物条带位置与DNA片段的长度密切相关
B
解析：PCR扩增一般需要30多次循环，每次循环可以分为变性、退火、延伸三步，单次循环的DNA产生量在理论上为模板DNA片段的2倍，因此单次循环的DNA产生量会有变化，B错误。
2．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是
( )
D
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌
落不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定
重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析：若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet(四环素)的培养基中不能形成菌落，D错误。
3．(2025·潮州质检)下列关于“绿叶中色素的提取和分离”(实验Ⅰ)与“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的叙述，正确的是 ( )
A．两个实验都用酒精溶解待提取物质
B．两个实验的物质提取过程均与该物质在相应溶剂中的溶解度有关
C．实验Ⅰ提取的色素滤液呈现绿色，实验Ⅱ粗提取的DNA呈现蓝色
D．实验Ⅱ中鉴定DNA时将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
B
解析：DNA粗提取的实验中使用冷却的体积分数为95%的酒精的目的是溶解蛋白质，并使DNA析出，A错误；“DNA的粗提取与鉴定”利用了蛋白质和DNA溶解度不同的原理，“绿叶中色素的提取和分离”利用了色素在层析液中溶解度不同的原理，B正确；实验Ⅱ粗提取的DNA呈现白色丝状，DNA遇二苯胺试剂(沸水浴)会呈现蓝色，C错误；鉴定DNA时将丝状物先溶解到2 mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴，D错误。
4．在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是 ( )
A．利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B．若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C．如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点
D．表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达
B
解析：同尾酶识别的核苷酸序列不同，但是产生的末端相同，因此用同尾酶切割载体和目的基因，可以产生相同的黏性末端，从而进行互补再次连接，A错误；要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中，转录形成的两种mRNA可碱基互补配对，抑制该基因的翻译过程，从而使该基因表达量下降，B正确；由于DNA子链延伸时总是从5′到3′，如果目的基因没有合适的酶切位点，那么可以在引物5′端末尾设计加入酶切位点，C错误；表达载体中标记基因和目的基因都需要合适的启动子才能表达，D错误。
5．(2024·佛山顺德区二模)近几十年来现代生物技术与工程发展迅速。下列说法错误的是 ( )
A．电泳技术可用于分离和纯化蛋白质、RNA、DNA等生物大分子
B．动物胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移
C．PCR反应体系中需要加入耐高温的解旋酶、DNA聚合酶和DNA连接酶
D．紫草宁的工厂化生产是利用植物细胞培养技术使细胞增殖以获得更多的紫草宁
解析：PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶、DNA连接酶。
C
6．(2024·梅州二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列叙述正确的是 ( )
甲
乙
丙
A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶
B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温
C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
答案：C
解析：由图可知，若用BamHⅠ，则目的基因会因为产生相同的末端而出现自身环化的现象，且两个标记基因均被破坏，再根据目的基因两侧限制酶切割位点知，目的基因(光敏色素基因A)左侧应选择Bcl Ⅰ切割，右侧应选择Hind Ⅲ切割，不选择Sau3A Ⅰ是因为质粒上没有该酶的切割位点，A错误；PCR反应过程中每次循环都要经历两次升温(第一次变性，第二次延伸)和一次降温(复性)，B错误；在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因未被破坏，因此，在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，C正确；光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。
7．(2025·清远二模)新一代人工智能模型ESM3首次实现了对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，并成功“设计”出了一种全新的荧光蛋白，新荧光蛋白的生成相当于模拟了5亿年的进化过程。下列叙述错误的是 ( )
A．人工智能模型ESM3与蛋白质工程一样可以设计自然界没有的蛋白质
B．生物进化中产生的基因突变可为基因工程改造生物提供更多的基因资源
C．基因工程能够阻止生物进化过程中有害基因的出现，因为可以精准编辑基因
D．人工智能模型ESM3可解码生物语言，因为自然界的生物体都有相同的遗传密码
C
解析：基因工程是按照人们的意愿，对生物的基因进行定向改造，但它不能阻止生物进化过程中有害基因的出现。生物进化过程中基因突变具有不定向性，有害基因的产生是随机发生的，C错误。
8．(2024·佛山二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，研究者提出了如下思路：剔除猪的某些基因，用猪的器官作为供体。借助CRISPR/Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因，如图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列叙述错误的是 ( )
B
A．上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因
B．上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与
C．上述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNA
D．可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵
解析：使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，sgRNA分子的碱基序列与基因组DNA中特定碱基序列互补配对，该过程不需要酶催化，然后由Cas9催化磷酸二酯键水解，不需要细胞内限制酶的参与，B错误。
9．(2025·广州越秀区模拟)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是 ( )
A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计
B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同
C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸
D．该不对称PCR过程中需要(26－1)×a个限制性引物
答案：C
解析：PCR扩增时需要根据已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确；由图可知，限制性引物与甲链结合，非限制性引物与乙链结合，则限制性引物耗尽后，产生的单链与甲链的碱基序列相同，B正确；PCR扩增时耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸都连接至引物的3′端，C错误；PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要(26－1)×a个限制性引物，D正确。
10．(2025·广州一模)鹅源星状病毒属于RNA病毒，鹅群感染后死亡率高，对鹅类养殖构成巨大威胁。其全基因组结构模式图如图甲所示，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白。研究人员以疑似感染该病毒死亡鹅的组织为样本，通过研磨提取上清液，进而制备单克隆抗体。回答下列问题：
甲
(1)鹅死亡的原因还可能包括感染鹅细小病毒(一种DNA病毒)或感染致病细菌。为确定感染源，研究人员以样本总DNA为模板，在PCR反应体系中通过加入____________________进行特定片段的扩增并进行相应检测；同时，将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现_______________。
鹅细小病毒DNA引物
致病细菌菌落
(2)成功分离出鹅源星状病毒后，研究人员提取了该病毒的RNA，并通过_____________获得该病毒的cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是____(填编号)。
逆(反)转录
B
乙
注：M表示标准DNA片段，A～C为待测样品，bp指核苷酸对。
(3)从凝胶中分离得到纤突蛋白基因序列并扩增，___________________，导入特定受体细胞，_____________________。进行细胞培养后可从中获得纤突蛋白。
(4)研究人员利用纤突蛋白制备获得了纤突蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于_________________________________________________________(合理即可，答两点)。
构建基因表达载体
检测鉴定转基因成功
快速诊断鹅是否感染鹅源星状病毒；治疗鹅源星状病毒的感染
解析：(1)该实验目的是获得鹅细小病毒的DNA，因此PCR扩增时需要加入鹅细小病毒DNA引物，以保证能扩增出鹅细小病毒的DNA。将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现致病细菌菌落，以确定是否感染致病菌。(2)以该病毒的RNA为模板，在逆转录酶的作用下通过逆转录可形成该病毒的cDNA。根据图甲可知，ORF2区域含有的碱基对数为6 939－4 807＝2 132，因此图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是B。(3)基因工程的操作步骤：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。(4)纤突蛋白单克隆抗体能特异性识别纤突蛋白，可用于检测样本中是否存在鹅源星状病毒；还可应用于疾病治疗，通过与病毒上的纤突蛋白结合，可能阻止病毒侵染细胞等，达到治疗疾病的目的。
11．(2025·佛山二模)逻辑基因线路是借鉴数字电路中逻辑运算的思想，利用基因重组、基因表达调控原理设计、改造生物系统，实现特定功能的合成生物学技术。研究人员设计出“与”门基因线路，将其导入大肠杆菌，实现了当两个输入信号均为“真”时就能发出绿色荧光的“与”门计算逻辑，其真值表和基因线路示意图如图1所示。其中启动子Psal和PBAD分别受水杨酸和阿拉伯糖的诱导激活。supD编码一种特殊tRNA，其可识别终止密码子(UAG)并将其翻译为丝氨酸(Ser)。T7RNAP编码T7噬菌体来源的RNA聚合酶，但其序列中修饰了两个终止密码子对应的序列(T7ptag)。gfp为绿色荧光蛋白基因。回答下列问题：
输入1 输入2 输出
0 0 0
1 0 0
0 1 0
1 1 1
注：0表示“假”，1表示“真”。
图1
(1)在构建该“与”门基因线路过程中，将基因表达载体导入大肠杆菌常用的方法是____________。据图分析，只有PBAD被激活时，T7RNA聚合酶合成过程中的_______过程异常。图中启动子Px可被______________(填“T7RNA聚合酶”或“大肠杆菌RNA聚合酶”)识别。为让大肠杆菌发出绿色荧光，应将其置于含__________ _________的环境中。
Ca2+处理
翻译
T7RNA聚合酶
水杨酸和阿拉伯糖
(2)为测试该“与”门基因线路组分的可替换性，研究人员将Psal和PBAD分别替换成响应细菌群体信号AHL的PluxR和响应外源性镁缺失信号的PmgrB。在不同条件下检测荧光强度，结果如图2所示。替换后的基因线路_____(填“能”或“不能”)体现“与”门计算逻辑，理由是____________________ _______________________________________________。
只有两个输入信号均为“真”，即环境中无Mg2+和有AHL时，才发出荧光
注：“＋”表示有，“－”表示没有。
图2
能
(3)“或”门计算逻辑是输入信号有一个为“真”时，输出即为“真”，真值表如下所示。已知基因RhaS和AraC由启动子PCON启动，两者表达产物能分别抑制启动子PRHAB和PBAD。当鼠李糖和阿拉伯糖均不存在时，RhaS和AraC能发挥抑制作用；当存在鼠李糖或阿拉伯糖时，RhaS或AraC不能发挥抑制作用，启动子PRHAB或PBAD能驱动相关基因转录。请设计“或”门基因线路，使大肠杆菌在有鼠李糖或阿拉伯糖存在时发出绿色荧光，画出基因线路示意图。
输入1 输入2 输出
0 0 0
1 0 0
0 1 1
1 1 1
注：0表示“假”，1表示“真”。
图例：启动子： 基因：
解析：(1)在构建该“与”门基因线路过程中，将基因表达载体导入大肠杆菌常用的方法是Ca2+处理，Ca2+处理后大肠杆菌处子一种易于吸收周围环境中DNA分子的状态，，可以提高转化的效率。只有PBAD被激活时，由于T7RNAP序列中两个终止密码子对应的序列被修饰，因此T7RNA聚合酶合成过程中的翻译过程异常。图中可见，Psal和PBAD均被激活时可表达出T7RNA聚合酶，故启动子Px可被T7RNA聚合酶识别，进而驱动绿色荧光蛋白基因的表达。为让大肠杆菌发出绿色荧光，应将其置于含水杨酸和阿拉伯糖的环境中，因为启动子Psal和PBAD分别受水杨酸和阿拉伯糖的诱导激活。(3)启动子PCON启动基因RhaS和AraC的表达，两者表达产物能分别抑制启动子PRHAB和PBAD，进而表现为无法发出荧光，即鼠李糖和阿拉伯糖均不存在，RhaS和AraC能发挥抑制作用；当鼠李糖或阿拉伯糖存在时，RhaS或AraC不能发挥抑制作用，启动子PRHAB或PBAD能驱动相关基因转录，发出绿色荧光。图见答案，注意符号和前后顺序。
12．(2025·广州二模)不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题：
注：lacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶。EcoRⅠ、SacⅡ、BglⅡ、XbaⅠ、SphⅠ、BamHⅠ为相应限制酶可识别并切割的位点。箭头表示基因转录方向。
甲
(1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶_____________切割质粒p-lacZ，然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。
SacⅡ、BglⅡ
(2)将质粒p01～p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含_________的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28 ℃和37 ℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果如图乙，由图表明，质粒______并在________的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是_________________ ________________________________________________________。
乙
氯霉素
p06
28 ℃
质粒p06 28 ℃条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小
(3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒(记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路：_______________________________________________________ ___________________________________________________________________。
pR空质粒、pR-A、pR-B分别导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落蓝色深浅
解析：(1)切割质粒p-lacZ时，不能破坏复制原点和标记基因(氯霉素抗性基因)，所以不能选择限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，依据基因转录方向，且MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，酶切位点应位于lzcZ基因的上游，且应实行双酶切法，所以应选择限制酶SacⅡ、BglⅡ切割质粒p-lacZ。(2)构建的重组质粒中含有氯霉素抗性基因，所以将质粒p01～p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含氯霉素的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株。LacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶，若β-半乳糖苷酶活性较低，说明其对外源性启动子活性检测干扰较小，则用于插入外源启动子进行活性检测较为灵敏，反之较大，据图，质粒p06在28 ℃的温度条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小，说明用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏。专题15 基因工程
辨 易 错
1．所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提。（）
2．可以通过PCR以及构建基因文库等方法来获取目的基因。（）
3．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步，目的基因就是编码蛋白质的基因。（）
4．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA。（）
5．基因工程中要培育转基因植物和动物，选用的受体细胞都是受精卵。（）
6．基因工程中，利用含抗生素的培养基筛选出的受体细胞都含有目的基因。（）
7．膀胱生物反应器的优点是提取目的基因产物不受性别和生长期的限制。（）
8．如果利用蛋白质工程将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，获得新型干扰素，可直接通过改造mRNA实现。（）
9．PCR反应体系中加入两种特异性引物以获得引物之间的DNA片段。（）
破 重 难
突破1 基因工程中三大工具的注意点
1．对限制酶切割位点的三点要求
(1)位置要求：限制酶切割位点所处的位置必须在标记基因外，这样才能保证标记基因的完整性。
(2)数量要求：选择限制酶切割目的基因时，被选择的限制酶在目的基因的两侧都要有识别序列，这样才能切割出完整的目的基因。
(3)对象要求：为使目的基因与载体形成相同的末端从而能够连接，通常使用同一种限制酶将二者切割；如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端存在互补关系，两末端可以连接，则可使用这两种不同限制酶切割载体和目的基因。
归纳总结
与DNA有关的酶
酶 作用及相关键 结果
限制酶 切割DNA分子特定核苷酸序列中的磷酸二酯键 形成黏性末端或平末端
DNA 连接酶 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键(不需要模板) 重组DNA分子
DNA 聚合酶 以DNA一条链为模板，将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键 新的DNA分子
解旋酶 打开DNA分子双链之间的氢键 单链DNA
2．载体必须具备的结构特点和作用
(1)能自我复制：通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入。
(3)有标记基因：有特殊的标记基因，以便于筛选导入目的基因的受体细胞。
(4)无毒害作用：对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
突破2 PCR 技术
易错提醒
(1)PCR反应需在一定的缓冲液中才能进行，且需通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(2)PCR技术中不需要解旋酶，而是利用高温使DNA解链。
(3)关于引物：依据目的基因两端的部分核苷酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对。
溯 考 情
1．(2025·广东卷)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及__ __检测，筛选获得重组菌株W1。
注：PGro为大肠杆菌内源启动子，在细胞快速生长期开启基因转录，但进入生长稳定期后即停止基因转录；SsrA基因编码SsrA短肽；C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解。
图a
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有__ __(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是__ __。培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是__ __。
图b
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为__ __。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：__ __。
碳源→前体……莽草酸……→细胞生长必需物
图c
2．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素（BC）并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。回答下列问题：
图1
(1)研究者优化了培养基的__ __(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7 RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图2 a，载体的部分结构见图2 b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7 RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为__ _ ___，理由是__ __。
a
b
图2
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为 _(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是__ __。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路： _。
3．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__ __植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和__ __进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备__ __。
(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如下图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了__ __。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约__ __%的培养基中的幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株__ __(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到__ __%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
核酸电泳图
如图所示：
提 考 能
考向1 (高频点)基因工程的工具和步骤
1．(2025·惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是（）
注：箭头表示识别序列中切断部位。
A．KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割位点不同，但形成的黏性末端是相同的
B．与EcoRⅠ相比，HhaⅠ识别序列较短，该序列在DNA中出现的概率高
C．BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的末端拼接
D．限制酶识别序列大多是沿中心轴回转180°相反重合
2．(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如下图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是（）
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
(2)将T-DNA两端的未知序列与野生型水稻基因组序列比对，确定T-DNA插入了2号染色体上的B基因中，该突变体A的穗粒数及产量明显__ __(填“低于”或“高于”)野生型，据此推测B基因可能促进水稻穗粒的形成，原因是__ __。
(3)考虑转基因技术的安全性，适合选用__ __(填“不育”或“可育”)水稻株系作为实验材料，选此株系的原因是__ __。
考向3 (重点、热点)融合其他知识考查基因工程的应用
4．(2024·河北卷节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如下图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为__ __启动子。Nos为终止子，其作用为__ __。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶__ __和__ __对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
注：KpnⅠ、HindⅢ、SacⅠ和EcoRⅠ标注的位点为各限制酶的识别位点。
(2)利用__ __法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测__ __，通过__ __技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为__ __。选择纯合子进行后续研究的原因是__ __。
(4)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是__ __(答出两点即可)。
配 套 热 练
1．(2025·阳江模拟)DNA提取与PCR扩增等操作是基因工程的基础性工作，下列叙述错误的是（）
A．从目标生物中提取DNA时，利用了 DNA与其他物质在NaCl溶液和酒精中溶解度的差异
B．PCR扩增中会经30多次变性、退火、延伸的循环，单次循环的DNA产生量没有变化
C．PCR扩增说明一些酶可以在细胞外高于60 ℃条件下发挥作用
D．经琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物条带位置与DNA片段的长度密切相关
2．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因（AmpR）、四环素抗性基因（TetR）作为标记基因构建的质粒如下图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是（）
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
3．(2025·潮州质检)下列关于“绿叶中色素的提取和分离”(实验Ⅰ)与“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的叙述，正确的是（）
A．两个实验都用酒精溶解待提取物质
B．两个实验的物质提取过程均与该物质在相应溶剂中的溶解度有关
C．实验Ⅰ提取的色素滤液呈现绿色，实验Ⅱ粗提取的DNA呈现蓝色
D．实验Ⅱ中鉴定DNA时将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
4．在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是（）
A．利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B．若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C．如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点
D．表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达
5．(2024·佛山顺德区二模)近几十年来现代生物技术与工程发展迅速。下列说法错误的是（）
A．电泳技术可用于分离和纯化蛋白质、RNA、DNA等生物大分子
B．动物胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移
C．PCR反应体系中需要加入耐高温的解旋酶、DNA聚合酶和DNA连接酶
D．紫草宁的工厂化生产是利用植物细胞培养技术使细胞增殖以获得更多的紫草宁
6．(2024·梅州二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列叙述正确的是（）
甲
乙
丙
A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶
B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温
C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
7．(2025·清远二模)新一代人工智能模型ESM3首次实现了对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，并成功“设计”出了一种全新的荧光蛋白，新荧光蛋白的生成相当于模拟了5亿年的进化过程。下列叙述错误的是（）
A．人工智能模型ESM3与蛋白质工程一样可以设计自然界没有的蛋白质
B．生物进化中产生的基因突变可为基因工程改造生物提供更多的基因资源
C．基因工程能够阻止生物进化过程中有害基因的出现，因为可以精准编辑基因
D．人工智能模型ESM3可解码生物语言，因为自然界的生物体都有相同的遗传密码
8．(2024·佛山二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，研究者提出了如下思路：剔除猪的某些基因，用猪的器官作为供体。借助CRISPR/Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因，下图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列叙述错误的是（）
A．上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因
B．上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与
C．上述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNA
D．可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵
9．(2025·广州越秀区模拟)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA（ssDNA）的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如下图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是（）
A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计
B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同
C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸
D．该不对称PCR过程中需要(26－1)×a个限制性引物
10．(2025·广州一模)鹅源星状病毒属于RNA病毒，鹅群感染后死亡率高，对鹅类养殖构成巨大威胁。其全基因组结构模式图如图甲所示，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白。研究人员以疑似感染该病毒死亡鹅的组织为样本，通过研磨提取上清液，进而制备单克隆抗体。回答下列问题：
甲
(1)鹅死亡的原因还可能包括感染鹅细小病毒(一种DNA病毒)或感染致病细菌。为确定感染源，研究人员以样本总DNA为模板，在PCR反应体系中通过加入__ __进行特定片段的扩增并进行相应检测；同时，将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现__ __。
(2)成功分离出鹅源星状病毒后，研究人员提取了该病毒的RNA，并通过__ __获得该病毒的cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是__ __(填编号)。
乙
注：M表示标准DNA片段，A～C为待测样品，bp指核苷酸对。
(3)从凝胶中分离得到纤突蛋白基因序列并扩增，__ __，导入特定受体细胞，__ __。进行细胞培养后可从中获得纤突蛋白。
(4)研究人员利用纤突蛋白制备获得了纤突蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于 (合理即可，答两点)。
11．(2025·佛山二模)逻辑基因线路是借鉴数字电路中逻辑运算的思想，利用基因重组、基因表达调控原理设计、改造生物系统，实现特定功能的合成生物学技术。研究人员设计出“与”门基因线路，将其导入大肠杆菌，实现了当两个输入信号均为“真”时就能发出绿色荧光的“与”门计算逻辑，其真值表和基因线路示意图如图1所示。其中启动子Psal和PBAD分别受水杨酸和阿拉伯糖的诱导激活。supD编码一种特殊tRNA，其可识别终止密码子（UAG）并将其翻译为丝氨酸（Ser）。T7RNAP编码T7噬菌体来源的RNA聚合酶，但其序列中修饰了两个终止密码子对应的序列(T7ptag)。gfp为绿色荧光蛋白基因。回答下列问题：
输入1 输入2 输出
0 0 0
1 0 0
0 1 0
1 1 1
注：0表示“假”，1表示“真”。
图1
(1)在构建该“与”门基因线路过程中，将基因表达载体导入大肠杆菌常用的方法是__ __。据图分析，只有PBAD被激活时，T7RNA聚合酶合成过程中的__ __过程异常。图中启动子Px可被__ __(填“T7RNA聚合酶”或“大肠杆菌RNA聚合酶”)识别。为让大肠杆菌发出绿色荧光，应将其置于含__ __的环境中。
(2)为测试该“与”门基因线路组分的可替换性，研究人员将Psal和PBAD分别替换成响应细菌群体信号AHL的PluxR和响应外源性镁缺失信号的PmgrB。在不同条件下检测荧光强度，结果如图2所示。替换后的基因线路__ __(填“能”或“不能”)体现“与”门计算逻辑，理由是__ __。
注：“＋”表示有，“－”表示没有。
图2
(3)“或”门计算逻辑是输入信号有一个为“真”时，输出即为“真”，真值表如下所示。已知基因RhaS和AraC由启动子PCON启动，两者表达产物能分别抑制启动子PRHAB和PBAD。当鼠李糖和阿拉伯糖均不存在时，RhaS和AraC能发挥抑制作用；当存在鼠李糖或阿拉伯糖时，RhaS或AraC不能发挥抑制作用，启动子PRHAB或PBAD能驱动相关基因转录。请设计“或”门基因线路，使大肠杆菌在有鼠李糖或阿拉伯糖存在时发出绿色荧光，画出基因线路示意图。
输入1 输入2 输出
0 0 0
1 0 0
0 1 1
1 1 1
注：0表示“假”，1表示“真”。
图例：启动子： 基因：
12．(2025·广州二模)不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题：
注：lacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶。EcoRⅠ、SacⅡ、BglⅡ、XbaⅠ、SphⅠ、BamHⅠ为相应限制酶可识别并切割的位点。箭头表示基因转录方向。
甲
(1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶__ __切割质粒p-lacZ，然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。
(2)将质粒p01～p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含__ __的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28 ℃和37 ℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果如图乙，由图表明，质粒__ __并在__ __的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是__ _ __。
乙
(3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒(记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路： _。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)专题15 基因工程
辨 易 错
1．所有生物共用一套遗传密码是基因工程能够最终成功的重要前提。( √ )
2．可以通过PCR以及构建基因文库等方法来获取目的基因。( √ )
提示：获取目的基因的方法有PCR技术扩增、构建基因文库等。
3．筛选和获取目的基因是基因工程的第一步，目的基因就是编码蛋白质的基因。( × )
提示：目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的序列或非编码RNA基因。
4．目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是能否转录出mRNA。( × )
提示：目的基因能否在受体细胞中稳定遗传的关键是是否插入到转基因生物(染色体)DNA上，这是检查基因工程是否成功的第一步。
5．基因工程中要培育转基因植物和动物，选用的受体细胞都是受精卵。( × )
提示：培育转基因动物时，所选用的受体细胞一般是受精卵；培育转基因植物时，所选用的受体细胞可以是受精卵，也可以是体细胞。
6．基因工程中，利用含抗生素的培养基筛选出的受体细胞都含有目的基因。( × )
提示：通过含抗生素的培养基筛选出的受体细胞不一定都含有目的基因(重组质粒)，有可能是只含有(普通)质粒的受体细胞。
7．膀胱生物反应器的优点是提取目的基因产物不受性别和生长期的限制。( √ )
8．如果利用蛋白质工程将干扰素分子上的一个半胱氨酸变成丝氨酸，获得新型干扰素，可直接通过改造mRNA实现。( × )
提示：若直接改造mRNA，可获得改造后的蛋白质，但不能遗传下去。
9．PCR反应体系中加入两种特异性引物以获得引物之间的DNA片段。( √ )
提示：利用PCR技术扩增目的基因时，由于DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，因此要用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增；引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，再进行DNA的延伸，这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列。
破 重 难
突破1 基因工程中三大工具的注意点
1．对限制酶切割位点的三点要求
(1)位置要求：限制酶切割位点所处的位置必须在标记基因外，这样才能保证标记基因的完整性。
(2)数量要求：选择限制酶切割目的基因时，被选择的限制酶在目的基因的两侧都要有识别序列，这样才能切割出完整的目的基因。
(3)对象要求：为使目的基因与载体形成相同的末端从而能够连接，通常使用同一种限制酶将二者切割；如果不同的限制酶切割DNA分子所产生的末端存在互补关系，两末端可以连接，则可使用这两种不同限制酶切割载体和目的基因。
归纳总结
与DNA有关的酶
酶 作用及相关键 结果
限制酶 切割DNA分子特定核苷酸序列中的磷酸二酯键 形成黏性末端或平末端
DNA 连接酶 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键(不需要模板) 重组DNA分子
DNA 聚合酶 以DNA一条链为模板，将单个脱氧核苷酸加到已有的DNA片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键 新的DNA分子
解旋酶 打开DNA分子双链之间的氢键 单链DNA
2．载体必须具备的结构特点和作用
(1)能自我复制：通过复制进行基因扩增，否则可能会使重组DNA丢失。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点，以便于目的基因的插入。
(3)有标记基因：有特殊的标记基因，以便于筛选导入目的基因的受体细胞。
(4)无毒害作用：对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
突破2 PCR 技术
易错提醒
(1)PCR反应需在一定的缓冲液中才能进行，且需通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
(2)PCR技术中不需要解旋酶，而是利用高温使DNA解链。
(3)关于引物：依据目的基因两端的部分核苷酸序列设计。两种引物之间以及每种引物内部不能发生碱基互补配对。
溯 考 情
1．(2025·广东卷)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白。测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及__荧光__检测，筛选获得重组菌株W1。
注：PGro为大肠杆菌内源启动子，在细胞快速生长期开启基因转录，但进入生长稳定期后即停止基因转录；SsrA基因编码SsrA短肽；C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解。
图a
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有__显微镜直接计数法(或细菌计数板计数法)__(答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是__作为mKate2蛋白荧光强度检测的对照__。培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是__PGro转录停止，mKate2蛋白合成停止，但特异性识别和降解仍持续__。
图b
(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏PX开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为__快速生长期荧光强度低，进入生长稳定期后快速增强__。
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：__用酶A基因替换质粒②中mKate2基因，用酶B基因替换质粒①中mKate2基因，构建酶B基因缺失的大肠杆菌突变株并将上述质粒导入__。
碳源→前体……莽草酸……→细胞生长必需物
图c
解析：(1)结合图a，含有质粒①的重组菌株W1含有抗性基因1和红色荧光蛋白mKate2基因，因此在添加抗生素的培养基上，可结合PCR和mKate2蛋白或荧光检测筛选菌株。(2)对于培养液中大肠杆菌数量的计数，可采用显微镜直接计数法，对于体积较小的细菌，也可采用细菌计数板进行计数。在大肠杆菌的生长过程中需检测荧光强度，因此接种前需检测液体培养基的荧光强度以形成前后对照，说明荧光强度的差异是大肠杆菌的生长增殖引起的。进入生长稳定期后，由于PGro在生长稳定期停止基因转录，所以不再合成带有SsrA短肽的mKate2，同时C-末端带有SsrA短肽的蛋白质可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并以一定速率降解，导致荧光强度快速下降。(3)由图题干可推知：快速生长期时，X基因可转录表达，编码的阻遏蛋白 X阻遏红色荧光蛋白mKate2的表达，荧光强度增加缓慢；生长稳定期，启动子PGro停止转录，X基因停止表达且蛋白 X被降解，因此红色荧光蛋白mKate2表达不受抑制，荧光强度快速增强。(4)根据题意，在快速生长期，酶A、B均需表达生成生长必需物以满足细胞正常生长需求，而在生长稳定期，酶A表达而酶B不表达以积累莽草酸，因此重组生产菌株构建思路是：首先对野生型大肠杆菌进行改造，敲除酶B基因；用酶B基因替换质粒①中mKate2基因，导入质粒①，使相关代谢途径关键酶(酶b)在快速生长期正常表达以保证细胞正常生长，进入生长稳定期后该酶因被降解而减少对莽草酸的转化；同时用酶A基因替换质粒②中mKate2基因，导入质粒②，利用其调控机制在生长稳定期实现莽草酸合成相关基因(酶A)的稳定表达，从而大量积累莽草酸。
2．(2024·广东卷)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(图1)。回答下列问题：
图1
(1)研究者优化了培养基的__碳源、氮源__(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和 BC膜的复合物)。
(2)研究者利用T7 噬菌体来源的RNA聚合酶(T7 RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体(光控原理见图2 a，载体的部分结构见图2 b)。构建载体时，选用了通用型启动子 PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7 RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为__PT7、PBAD、_PBAD___，理由是__基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达__。
a
b
图2
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为__抑制杂菌，去除丢失质粒的菌株__(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是__该处细胞中T7 RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素__。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：__将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色蛋白)__。
解析：(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。(2)由题图2 a分析可知，蓝光照射下，T7 RNAP N端与T7 RNAP C端结合，导致无活性的T7 RNAP变成有活性的T7 RNAP，结合图1及图2 b，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7 RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶从而催化染色液中酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD 和PBAD。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因，长时间培养时在培养液中加入大观霉素，抗生素具有抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。
3．(2023·广东卷)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__野生型__植株的种子大小相近。
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和__农杆菌的Ti质粒__进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备__启动子和终止子__。
(3)转化后，T-DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入，也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如下图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了__DA1基因和卡那霉素抗性基因(或DA1基因、目的基因、卡那霉素抗性基因)__。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约__75__%的培养基中的幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株__自交__(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到__100__%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
核酸电泳图
如图所示：
解析：(1)根据题干信息可知，突变后的基因为隐性基因，则野生型DA1基因为显性基因，若突变体表型由DA1基因突变造成，则转基因植株的种子大小应与显性性状的野生型植株种子大小相近。(2)DA1基因为目的基因，构建基因表达载体时应用同种限制性内切核酸酶对DA1基因和载体(常用质粒)进行切割，产生相同黏性末端，再用DNA连接酶将两者连接起来。在基因表达载体中，启动子位于目的基因的首端，终止子位于目的基因的尾端，以确保插入的DA1基因可以正常表达。(3)①根据题干信息和题图分析，将T0代植株的花序浸没在农杆菌(T-DNA上含有DA1基因和卡那霉素抗性基因)菌液中转化，再将获得的T1代种子播种在选择培养基(含有卡那霉素)上，若在选择培养基上有能够萌发并生长的阳性个体，则说明含有目的基因和抗性基因，即表示其基因组中插入DA1基因和卡那霉素抗性基因。②T1代阳性植株都含有DA1基因，若是单一位点插入，相当于一对等位基因的杂合子，T-DNA内部基因在减数分裂时不发生交换，则T1代自交后代应该出现3∶1的性状分离比，DA1为显性基因，因此应该选择阳性率约75%的培养基中的幼苗继续培养。③将T2代阳性植株(有显性纯合子、杂合子)自交，将得到的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基上，因为杂合子自交会发生性状分离，产生无抗性基因/目的基因的子代，故培养基上全部为具有卡那霉素抗性的植株即为需要选择的纯合子植株，即阳性率达到100%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。根据序列分析，野生型和突变型基因片段的长度都是150 bp，但野生型的基因没有限制酶X的切割位点，而突变型的基因有限制酶X的切割位点，再结合图中的数据分析可知，电泳图中野生型只有150 bp，突变型有50 bp和100 bp，据此画出电泳结果。
提 考 能
考向1 (高频点)基因工程的工具和步骤
1．(2025·惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点，下列叙述错误的是( A )
注：箭头表示识别序列中切断部位。
A．KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割位点不同，但形成的黏性末端是相同的
B．与EcoRⅠ相比，HhaⅠ识别序列较短，该序列在DNA中出现的概率高
C．BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的末端拼接
D．限制酶识别序列大多是沿中心轴回转180°相反重合
解析：KpnⅠ的切割位点在CC之间，Acc65Ⅰ切割位点在GG之间，KpnⅠ和Acc65Ⅰ切割位点不同，二者产生的末端分别为和、和，可见形成的黏性末端是不同的，A错误；通常识别序列越短，其在DNA中出现的概率越高，B正确；BamH Ⅰ切割产生的黏性末端与Mbo Ⅰ切割成的末端相同，都有序列，故BamHⅠ切割产生的末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接，C正确；分析6种限制酶的识别序列可发现，均是沿中心对称，即回转180°相反重合，D正确。
2．(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因，将该质粒导入大肠杆菌细胞后，其编码的酶可分解X-gal，产生蓝色物质，进而形成蓝色菌落，如下图所示。科研小组以该质粒作为载体，采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( C )
A．使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率，可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B．如果筛选平板中仅含卡那霉素，生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C．因质粒K中含两个标记基因，筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D．若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
解析：使用氯化钙处理大肠杆菌，可使其处于感受态，提高转化效率，即更多的大肠杆菌能吸收质粒，吸收的质粒可能是含目的基因的重组质粒(可能形成白色菌落)，也可能是未重组的质粒K(形成蓝色菌落)，A正确；由于仅含卡那霉素，未添加X-gal，无论导入的是重组质粒还是空白质粒，因不含X-gal，无法产生蓝色物质，故生长出的菌落均为白色，B正确；平板中长出的白色菌落，可能是导入了重组质粒(含目的基因)并成功表达目标蛋白，但也可能是虽然导入了重组质粒但未成功表达目标蛋白，不能仅仅因为是白色菌落就判定为表达目标蛋白的菌株，C错误；若筛选平板中蓝色菌落偏多，原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌，因为自身环化的质粒K中β-半乳糖苷酶基因完整，能表达β-半乳糖苷酶，分解X-gal形成蓝色菌落，D正确。
考向2 (难点)PCR技术
3．(2025·肇庆一模)研究者通过利用T-DNA随机插入野生型水稻染色体DNA中，导致被插入的基因功能丧失，以此构建水稻突变体库，从中筛选出一株穗粒数异常的突变体A进行实验探究。请回答下列问题：
(1)用某种限制酶处理水稻突变体A的DNA(如下图所示)后，用DNA连接酶将两端的黏性末端连接成环，以此为模板，利用图中的引物__①④__(填序号)组合进行PCR扩增，目的是扩增出T-DNA插入位置两端的未知序列，反应过程中引物与模板DNA链碱基互补配对结合的阶段是__复性__。
(2)将T-DNA两端的未知序列与野生型水稻基因组序列比对，确定T-DNA插入了2号染色体上的B基因中，该突变体A的穗粒数及产量明显__低于__(填“低于”或“高于”)野生型，据此推测B基因可能促进水稻穗粒的形成，原因是__当T-DNA插入2号染色体上的B基因，会破坏B基因，导致突变体产量低于野生型__。
(3)考虑转基因技术的安全性，适合选用__不育__(填“不育”或“可育”)水稻株系作为实验材料，选此株系的原因是__避免目的基因在自然界中扩散__。
解析：(1)因为要扩增的是T-DNA插入位置两侧的未知序列，而引物的延伸方向为5′→3′，所以利用图中的引物①④组合进行PCR。PCR过程包括变性、复性、延伸三个阶段，引物与模板结合的阶段是复性阶段。(2)结合题中信息“B基因可能促进水稻穗粒的形成”反推，该突变体产量明显低于野生型，因为当T-DNA插入2号染色体上的B基因，会破坏B基因，导致突变体产量低于野生型。(3)目的基因的扩散可能导致转基因技术存在安全问题，故适合选用不育水稻株系作为实验材料。
考向3 (重点、热点)融合其他知识考查基因工程的应用
4．(2024·河北卷节选)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为r2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得r2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如下图所示。其中GtP为启动子，若使r2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为__在胚乳中特异性表达的基因的__启动子。Nos为终止子，其作用为__终止转录__。r2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶__HindⅢ__和__EcoRⅠ__对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
注：KpnⅠ、HindⅢ、SacⅠ和EcoRⅠ标注的位点为各限制酶的识别位点。
(2)利用__农杆菌转化__法将r2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测__r2HN mRNA__，通过__抗原—抗体杂交__技术检测是否翻译出r2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，r2HN纯合子植株的占比为__1/4__。选择纯合子进行后续研究的原因是__纯合子自交后代不发生性状分离__。
(4)利用水稻作为生物反应器生产r2HN疫苗的优点是__不受性别的限制、可大量种植、成本低、安全性高__(答出两点即可)。
解析：(1)利用水稻细胞培育能表达r2HN的水稻胚乳细胞生物反应器，则启动子应为在胚乳中特异性表达的基因的启动子。Nos为终止子，终止子可以终止转录。KpnⅠ会破坏启动子序列，不能选用；SacⅠ位于终止子序列之外，不能选用。为了将目的基因插入载体的启动子和终止子之间，则需要用限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对r2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。(2)获得水稻愈伤组织后，通过农杆菌的侵染，使目的基因进入水稻细胞并完成转化。为检测r2HN表达情况，可通过PCR技术检测转录出的r2HN mRNA；也可从转基因水稻中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原—抗体杂交检测是否翻译出r2HN蛋白。
配 套 热 练
1．(2025·阳江模拟)DNA提取与PCR扩增等操作是基因工程的基础性工作，下列叙述错误的是( B )
A．从目标生物中提取DNA时，利用了 DNA与其他物质在NaCl溶液和酒精中溶解度的差异
B．PCR扩增中会经30多次变性、退火、延伸的循环，单次循环的DNA产生量没有变化
C．PCR扩增说明一些酶可以在细胞外高于60 ℃条件下发挥作用
D．经琼脂糖凝胶电泳后的PCR产物条带位置与DNA片段的长度密切相关
解析：PCR扩增一般需要30多次循环，每次循环可以分为变性、退火、延伸三步，单次循环的DNA产生量在理论上为模板DNA片段的2倍，因此单次循环的DNA产生量会有变化，B错误。
2．(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如下图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( D )
A．若用HindⅢ酶切，目的基因转录的产物可能不同
B．若用PvuⅠ酶切，在含Tet(四环素)培养基中的菌落不一定含有目的基因
C．若用SphⅠ酶切，可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D．若用SphⅠ酶切，携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
解析：若用SphⅠ酶切，会破坏四环素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因不受影响，因此携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)的培养基中能形成菌落，在含Tet(四环素)的培养基中不能形成菌落，D错误。
3．(2025·潮州质检)下列关于“绿叶中色素的提取和分离”(实验Ⅰ)与“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的叙述，正确的是( B )
A．两个实验都用酒精溶解待提取物质
B．两个实验的物质提取过程均与该物质在相应溶剂中的溶解度有关
C．实验Ⅰ提取的色素滤液呈现绿色，实验Ⅱ粗提取的DNA呈现蓝色
D．实验Ⅱ中鉴定DNA时将丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴
解析：DNA粗提取的实验中使用冷却的体积分数为95%的酒精的目的是溶解蛋白质，并使DNA析出，A错误；“DNA的粗提取与鉴定”利用了蛋白质和DNA溶解度不同的原理，“绿叶中色素的提取和分离”利用了色素在层析液中溶解度不同的原理，B正确；实验Ⅱ粗提取的DNA呈现白色丝状，DNA遇二苯胺试剂(沸水浴)会呈现蓝色，C错误；鉴定DNA时将丝状物先溶解到2 mol·L-1的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂并进行沸水浴，D错误。
4．在构建基因表达载体时，需要遵循一定的规则。同时面对实际问题，可利用分子生物学原理加以解决。下列说法正确的是( B )
A．利用不同的限制酶对载体和目的基因进行剪切而形成的黏性末端无法再次连接
B．若要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中
C．如果目的基因没有合适的酶切位点，可以在引物3′端末尾设计加入酶切位点
D．表达载体中标记基因不需要启动子，可以在受体细胞中持续表达
解析：同尾酶识别的核苷酸序列不同，但是产生的末端相同，因此用同尾酶切割载体和目的基因，可以产生相同的黏性末端，从而进行互补再次连接，A错误；要降低细胞中某基因的表达，可将该基因的编码序列反向连接到基因表达载体中，转录形成的两种mRNA可碱基互补配对，抑制该基因的翻译过程，从而使该基因表达量下降，B正确；由于DNA子链延伸时总是从5′到3′，如果目的基因没有合适的酶切位点，那么可以在引物5′端末尾设计加入酶切位点，C错误；表达载体中标记基因和目的基因都需要合适的启动子才能表达，D错误。
5．(2024·佛山顺德区二模)近几十年来现代生物技术与工程发展迅速。下列说法错误的是( C )
A．电泳技术可用于分离和纯化蛋白质、RNA、DNA等生物大分子
B．动物胚胎移植实质上是早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移
C．PCR反应体系中需要加入耐高温的解旋酶、DNA聚合酶和DNA连接酶
D．紫草宁的工厂化生产是利用植物细胞培养技术使细胞增殖以获得更多的紫草宁
解析：PCR反应体系中需要添加耐高温的DNA聚合酶，不需要解旋酶、DNA连接酶。
6．(2024·梅州二模)光敏色素基因在调节作物生长发育中具有重要作用。为探讨玉米中光敏色素基因A(含大约256个碱基对)在棉花种质资源创制中的利用价值，研究人员将A基因转入棉花中，对棉花受体细胞进行检测，并通过电泳技术分析结果。该过程所用质粒与含光敏色素基因的DNA上相关限制酶的酶切位点分别如图甲、乙所示，电泳检测结果如图丙。下列叙述正确的是( C )
甲
乙
丙
A．为构建正确连接的表达载体，应选用BamHⅠ和HindⅢ这两种限制酶
B．PCR扩增目的基因过程中每次循环都要经历一次升温和两次降温
C．表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选
D．由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号转基因棉花均培育成功
解析：由图可知，若用BamHⅠ，则目的基因会因为产生相同的末端而出现自身环化的现象，且两个标记基因均被破坏，再根据目的基因两侧限制酶切割位点知，目的基因(光敏色素基因A)左侧应选择Bcl Ⅰ切割，右侧应选择Hind Ⅲ切割，不选择Sau3A Ⅰ是因为质粒上没有该酶的切割位点，A错误；PCR反应过程中每次循环都要经历两次升温(第一次变性，第二次延伸)和一次降温(复性)，B错误；在构建基因表达载体的过程中，卡那霉素抗性基因被破坏，而四环素抗性基因未被破坏，因此，在表达载体导入受体细胞后，可用含四环素的选择培养基进行初步筛选，C正确；光敏色素基因A含大约256个碱基对，由图丙电泳结果可知，1、2、3、4号均成功导入光敏色素基因A，但转基因棉花是否培育成功还需要进行生物个体水平上的鉴定，D错误。
7．(2025·清远二模)新一代人工智能模型ESM3首次实现了对蛋白质序列、结构和功能的统一推理，并成功“设计”出了一种全新的荧光蛋白，新荧光蛋白的生成相当于模拟了5亿年的进化过程。下列叙述错误的是( C )
A．人工智能模型ESM3与蛋白质工程一样可以设计自然界没有的蛋白质
B．生物进化中产生的基因突变可为基因工程改造生物提供更多的基因资源
C．基因工程能够阻止生物进化过程中有害基因的出现，因为可以精准编辑基因
D．人工智能模型ESM3可解码生物语言，因为自然界的生物体都有相同的遗传密码
解析：基因工程是按照人们的意愿，对生物的基因进行定向改造，但它不能阻止生物进化过程中有害基因的出现。生物进化过程中基因突变具有不定向性，有害基因的产生是随机发生的，C错误。
8．(2024·佛山二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，研究者提出了如下思路：剔除猪的某些基因，用猪的器官作为供体。借助CRISPR/Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因，下图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。下列叙述错误的是( B )
A．上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因
B．上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与
C．上述基因编辑技术能定点切除的目标基因取决于sgRNA
D．可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵
解析：使用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时，sgRNA分子的碱基序列与基因组DNA中特定碱基序列互补配对，该过程不需要酶催化，然后由Cas9催化磷酸二酯键水解，不需要细胞内限制酶的参与，B错误。
9．(2025·广州越秀区模拟)不对称PCR是利用不等量的一对引物来产生大量单链DNA(ssDNA)的方法。加入的一对引物中含量较少的被称为限制性引物，含量较多的被称为非限制性引物。PCR的最初的若干次循环中，其扩增产物主要是双链DNA(dsDNA)，但当限制性引物消耗完后，就会产生大量的ssDNA。不对称PCR的简单过程如下图所示。假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后开始扩增产生ssDNA。下列叙述错误的是( C )
A．限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计
B．据图可知，最后大量获得的ssDNA与图中甲链的碱基序列相同
C．上述过程中子链分别沿限制性引物的5′端、非限制性引物的3′端延伸
D．该不对称PCR过程中需要(26－1)×a个限制性引物
解析：PCR扩增时需要根据已知目的基因两侧的碱基序列来设计引物，因此限制性引物和非限制性引物均需要依据模板DNA的碱基序列来设计，A正确；由图可知，限制性引物与甲链结合，非限制性引物与乙链结合，则限制性引物耗尽后，产生的单链与甲链的碱基序列相同，B正确；PCR扩增时耐高温的DNA聚合酶将4种脱氧核苷酸都连接至引物的3′端，C错误；PCR扩增时引物是新子链的一部分，假设模板DNA分子初始数量为a个，6次循环后产生26个DNA分子，因此该不对称PCR过程中需要(26－1)×a个限制性引物，D正确。
10．(2025·广州一模)鹅源星状病毒属于RNA病毒，鹅群感染后死亡率高，对鹅类养殖构成巨大威胁。其全基因组结构模式图如图甲所示，ORF2区域编码的纤突蛋白是该病毒的主要抗原性蛋白。研究人员以疑似感染该病毒死亡鹅的组织为样本，通过研磨提取上清液，进而制备单克隆抗体。回答下列问题：
甲
(1)鹅死亡的原因还可能包括感染鹅细小病毒(一种DNA病毒)或感染致病细菌。为确定感染源，研究人员以样本总DNA为模板，在PCR反应体系中通过加入__鹅细小病毒DNA引物__进行特定片段的扩增并进行相应检测；同时，将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现__致病细菌菌落__。
(2)成功分离出鹅源星状病毒后，研究人员提取了该病毒的RNA，并通过__逆(反)转录__获得该病毒的cDNA作为纤突蛋白基因序列的扩增模板。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是__B__(填编号)。
乙
注：M表示标准DNA片段，A～C为待测样品，bp指核苷酸对。
(3)从凝胶中分离得到纤突蛋白基因序列并扩增，__构建基因表达载体__，导入特定受体细胞，__检测鉴定转基因成功__。进行细胞培养后可从中获得纤突蛋白。
(4)研究人员利用纤突蛋白制备获得了纤突蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体可应用于__快速诊断鹅是否感染鹅源星状病毒；治疗鹅源星状病毒的感染__(合理即可，答两点)。
解析：(1)该实验目的是获得鹅细小病毒的DNA，因此PCR扩增时需要加入鹅细小病毒DNA引物，以保证能扩增出鹅细小病毒的DNA。将样本上清液接种于固体培养基上，在适宜的条件下培养一段时间后，观察并鉴定培养基上是否出现致病细菌菌落，以确定是否感染致病菌。(2)以该病毒的RNA为模板，在逆转录酶的作用下通过逆转录可形成该病毒的cDNA。根据图甲可知，ORF2区域含有的碱基对数为6 939－4 807＝2 132，因此图乙电泳结果中最有可能代表纤突蛋白基因序列的是B。(3)基因工程的操作步骤：目的基因的筛选与获取→基因表达载体的构建→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定。(4)纤突蛋白单克隆抗体能特异性识别纤突蛋白，可用于检测样本中是否存在鹅源星状病毒；还可应用于疾病治疗，通过与病毒上的纤突蛋白结合，可能阻止病毒侵染细胞等，达到治疗疾病的目的。
11．(2025·佛山二模)逻辑基因线路是借鉴数字电路中逻辑运算的思想，利用基因重组、基因表达调控原理设计、改造生物系统，实现特定功能的合成生物学技术。研究人员设计出“与”门基因线路，将其导入大肠杆菌，实现了当两个输入信号均为“真”时就能发出绿色荧光的“与”门计算逻辑，其真值表和基因线路示意图如图1所示。其中启动子Psal和PBAD分别受水杨酸和阿拉伯糖的诱导激活。supD编码一种特殊tRNA，其可识别终止密码子(UAG)并将其翻译为丝氨酸(Ser)。T7RNAP编码T7噬菌体来源的RNA聚合酶，但其序列中修饰了两个终止密码子对应的序列(T7ptag)。gfp为绿色荧光蛋白基因。回答下列问题：
输入1 输入2 输出
0 0 0
1 0 0
0 1 0
1 1 1
注：0表示“假”，1表示“真”。
图1
(1)在构建该“与”门基因线路过程中，将基因表达载体导入大肠杆菌常用的方法是__Ca2+处理__。据图分析，只有PBAD被激活时，T7RNA聚合酶合成过程中的__翻译__过程异常。图中启动子Px可被__T7RNA聚合酶__(填“T7RNA聚合酶”或“大肠杆菌RNA聚合酶”)识别。为让大肠杆菌发出绿色荧光，应将其置于含__水杨酸和阿拉伯糖__的环境中。
(2)为测试该“与”门基因线路组分的可替换性，研究人员将Psal和PBAD分别替换成响应细菌群体信号AHL的PluxR和响应外源性镁缺失信号的PmgrB。在不同条件下检测荧光强度，结果如图2所示。替换后的基因线路__能__(填“能”或“不能”)体现“与”门计算逻辑，理由是__只有两个输入信号均为“真”，即环境中无Mg2+和有AHL时，才发出荧光__。
注：“＋”表示有，“－”表示没有。
图2
(3)“或”门计算逻辑是输入信号有一个为“真”时，输出即为“真”，真值表如下所示。已知基因RhaS和AraC由启动子PCON启动，两者表达产物能分别抑制启动子PRHAB和PBAD。当鼠李糖和阿拉伯糖均不存在时，RhaS和AraC能发挥抑制作用；当存在鼠李糖或阿拉伯糖时，RhaS或AraC不能发挥抑制作用，启动子PRHAB或PBAD能驱动相关基因转录。请设计“或”门基因线路，使大肠杆菌在有鼠李糖或阿拉伯糖存在时发出绿色荧光，画出基因线路示意图。
输入1 输入2 输出
0 0 0
1 0 0
0 1 1
1 1 1
注：0表示“假”，1表示“真”。
图例：启动子： 基因：
解析：(1)在构建该“与”门基因线路过程中，将基因表达载体导入大肠杆菌常用的方法是Ca2+处理，Ca2+处理后大肠杆菌处子一种易于吸收周围环境中DNA分子的状态，可以提高转化的效率。只有PBAD被激活时，由于T7RNAP序列中两个终止密码子对应的序列被修饰，因此T7RNA聚合酶合成过程中的翻译过程异常。图中可见，Psal和PBAD均被激活时可表达出T7RNA聚合酶，故启动子Px可被T7RNA聚合酶识别，进而驱动绿色荧光蛋白基因的表达。为让大肠杆菌发出绿色荧光，应将其置于含水杨酸和阿拉伯糖的环境中，因为启动子Psal和PBAD分别受水杨酸和阿拉伯糖的诱导激活。(3)启动子PCON启动基因RhaS和AraC的表达，两者表达产物能分别抑制启动子PRHAB和PBAD，进而表现为无法发出荧光，即鼠李糖和阿拉伯糖均不存在，RhaS和AraC能发挥抑制作用；当鼠李糖或阿拉伯糖存在时，RhaS或AraC不能发挥抑制作用，启动子PRHAB或PBAD能驱动相关基因转录，发出绿色荧光。图见答案，注意符号和前后顺序。
12．(2025·广州二模)不同的启动子活性不同，可引起基因表达强度的差异。MCS是一段含多种限制酶切割位点的DNA序列，广泛用于插入不同外源启动子，但MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，对外源启动子活性检测造成干扰。为了构建能灵敏检测外源启动子活性的质粒，科研人员利用无启动子的lacZ基因和质粒p构建出质粒p-lacZ(如图甲)，并以此进行进一步研究。回答下列问题：
注：lacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶。EcoRⅠ、SacⅡ、BglⅡ、XbaⅠ、SphⅠ、BamHⅠ为相应限制酶可识别并切割的位点。箭头表示基因转录方向。
甲
(1)为构建更为灵敏的外源启动子活性检测质粒，最好选择限制酶__SacⅡ、BglⅡ__切割质粒p-lacZ，然后将MCS与p-lacZ连接构建成质粒p01。在此基础上对MCS进行不同改造分别得到质粒p02、p03、p04、p05、p06。
(2)将质粒p01～p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含__氯霉素__的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株，然后分别于28 ℃和37 ℃条件下培养后进行β-半乳糖苷酶活性测定，结果如图乙，由图表明，质粒__p06__并在__28 ℃__的温度下用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏，理由是__质粒p06 28_℃条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小__。
乙
(3)β-半乳糖苷酶可以分解X-gal产生蓝色物质，使菌落呈现蓝色。请利用(2)筛选得到的质粒(记为pR)为工具，用固体培养基初步比较外源启动子A和B的活性，试写出简要的实验思路：__pR空质粒、pR-A、pR-B分别导入LacZ基因缺失菌种中，并接种到含有X-gal平板上，在适宜条件下培养，检测不同组平板上菌落蓝色深浅__。
解析：(1)切割质粒p-lacZ时，不能破坏复制原点和标记基因(氯霉素抗性基因)，所以不能选择限制酶EcoRⅠ和BamHⅠ，依据基因转录方向，且MCS自身序列也可能会启动下游基因的表达，酶切位点应位于lzcZ基因的上游，且应实行双酶切法，所以应选择限制酶SacⅡ、BglⅡ切割质粒p-lacZ。(2)构建的重组质粒中含有氯霉素抗性基因，所以将质粒p01～p06分别与lacZ基因缺失菌株混合后接种至含氯霉素的液体培养基中培养并筛选出成功转入质粒的菌株。LacZ基因编码产物为β-半乳糖苷酶，若β-半乳糖苷酶活性较低，说明其对外源性启动子活性检测干扰较小，则用于插入外源启动子进行活性检测较为灵敏，反之较大，据图，质粒p06在28 ℃的温度条件下，β-半乳糖苷酶活性最低，对外源性启动子活性检测干扰最小，说明用于插入外源启动子进行活性检测最灵敏。
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