6 基因工程操作相关新情境
突破1 构建融合基因表达载体
【引言】构建基因表达载体是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，通过复制遗传给下一代，并通过表达发挥作用。因此，基因表达载体除目的基因、复制原点、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。构建正确而高效的表达载体能使基因工程的工作事半功倍。现列举几种，以了解相关情境。
[析 情 境]
1．利用同源重组(无缝克隆技术)构建基因表达载体
无缝克隆技术(In-Fusion技术)，即无缝克隆和组装技术，是一种新型、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。
具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In-Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。
案例1 纤维素是自然界中分布最广、含量最丰富的一种多糖，水解纤维素的酶系包括内切酶（EG）、外切酶（CBH）和B-葡萄糖苷酶（BGL）。已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术依次将EG基因、CBH基因和BGL基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。
(1)科研人员常用PCR技术获取和扩增EG基因、CBH基因和BGL基因，该过程不需要添加解旋酶，但DNA也能解旋的原因是__ __。若PCR产物中出现了部分非目标序列，可能的原因是__ __(答出两点即可)。
(2)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。
①双酶切法：如图甲标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因插入部位及两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的__ __ (填“5′”或“3′”)端添加__ __限制酶的识别序列，设计的引物序列为_ (从5′端书写，写出前12个碱基序列即可)。
甲
②同源重组法：该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在相关酶的作用下即可实现质粒上的同源重组(如图乙所示)。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是__ __。
乙
(3)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在__ __的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测__ __，以确定其发酵效果。
2．利用重组融合PCR法构建基因表达载体。
融合PCR技术在不经过酶切和连接的条件下，采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应，类似于重叠延伸PCR法和一步克隆法：①分别设计5′端带有互补序列的若干条特异性引物，分别进行各个片段的扩增；②随后在同体系加入各片段，以一对外侧引物进行融合片段的全长序列的扩增。
案例2 科研人员将高产基因和抗除草剂草甘膦基因作为目的基因，利用重叠延伸PCR技术构建融合基因，从而培育既高产又抗草甘膦的转基因大豆。融合基因构建过程如图1所示，所用Ti质粒及限制酶识别序列如图2所示。
图1
注：LB、RB分别为T-DNA的左边界、右边界。
图2
(1)图1中，两条杂交链的获得都至少需要经过__ __次扩增循环。PCR1与PCR2的产物能够形成杂交链的条件是__ __。PCR3过程不需要引物，其原因是__ _。
(2)若要将获得的融合基因用于构建基因表达载体，应选用引物__ __对融合基因进行PCR扩增，为了保证扩增后的融合基因能正向插入Ti质粒中，在设计这两种引物时应满足的条件是__ __。
(3)将融合基因导入农杆菌需用Ca2+先处理农杆菌，目的是__ __；利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、大豆细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是__ __。
[悟 典 例]
(2025·佛山顺德二模)抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图1所示。回答下列问题：
图1
(1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第__ __位的碱基替换，碱基具体变化为__ __。基因模板链对应的碱基改变为__ __。
(2)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是__ __。
(3)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择__ __。
A．5′…CCTGTTAT…3′
B．5′…CCTGGTAT…3′
C．5′…ATACCAGG…3′
D．5′…ATAACAGG…3′
(4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR(PCR1和PCR2)，产物1最早出现在PCR1的第__ __轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有__ __；通过PCR3快速扩增时应选用的引物是__ __。
(5)In-Fusion酶能够识别任何具有15 bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。科研人员将载体(320 bp)两端连接上与改良的抗菌肽基因(180 bp)两端相同的序列(15 bp)并利用In-Fusion酶实现两者的连接，如图2所示。最终获得的重组DNA分子长度为__ __。与传统方法相比，这种技术的优点是__ __(至少写两点)。
图2
突破2 基因敲除
【引言】基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。基因敲除是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术。Cre/LoxP重组酶系统是一种新型的基因敲除技术。
[析 情 境]
1．利用“基因敲除”技术，能“敲除”DNA上的特定基因。该技术的主要过程示意图如下：
(1)胚胎干细胞可从小白鼠的__ __中分离得到。
(2)neoR基因插入靶基因使用的工具酶是__ __和__ __，前者识别特定脱氧核苷酸序列并在特定位点切开。“靶基因失活”的含义是__ __。
(3)失活靶基因与正常靶基因交换涉及的变异类型是__ __；经处理后的胚胎干细胞转移到特定培养基中筛选培养，“特定培养基”中需加入__ __以起到筛选培养的目的。
(4)科学家可以通过“基因敲除”来研究基因的功能，培养图示中胚胎干细胞所获得的“基因敲除”小白鼠__ __(填“能”或“不能”)直接用于研究基因功能，原因是__ __。
2．CRISPR/Cas9技术利用人工合成的短链RNA（gRNA）和核酸酶Cas9蛋白共同作用来完成基因的定向编辑。其原理是gRNA作为向导，它的部分序列通过碱基互补配对原则，与希望被编辑的DNA序列结合；Cas9也与gRNA结合，并切割与gRNA结合的DNA序列，使DNA双链断裂；加入含有预期突变的序列，细胞在修复DNA过程中会将其引入基因组，从而实现精准的基因编辑。
(2025·宝安期末节选)下图是与ADE2基因有关的gRNA前面的相关序列及切割位点，切割后用于插入目标序列。则目标序列前方添加的引物序列应含有5′-__ __-3′和5′-__ __-3′。
3．Cre/LoxP重组是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位。Cre/LoxP重组酶系统是由Cre重组酶和LoxP位点组成的基因编辑工具，对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造。
Cre/LoxP重组酶系统的核心元件是Cre重组酶(具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组)和LoxP序列(包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向，LoxP有不同“亚型”，可以嵌套使用)。
同向 反向
同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
(1)LoxP具有方向性，结构如图1所示，其中决定方向的序列是__ __(填序号)。Cre酶能随机识别DNA分子上的两个相同的LoxP序列，并在其中的特定位点切断DNA双链，重新连接切口后，连接时形成的化学键是__ __，两个同向LoxP在发挥作用时，机制如图2，则保留图2中片段__ __(填序号)，就能实现目标基因的敲除。
注：↑代表Cre酶的识别位点。
图1
图2
(2)Cre/LoxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因__ __(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，可以防止Cre基因缺失时的表达。在Cre酶存在的情况下，终止密码子被切除，目的基因__ __(填“表达”或“不表达”)。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是__ __。
[悟 典 例]
(2025·广州白云区模拟)肿瘤细胞表面的PD-L1能与细胞毒性T细胞上的受体PD-1结合，抑制细胞毒性T细胞的活性，实现免疫逃逸。在一项利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗肿瘤的临床试验中，科研团队将携带Cas9蛋白和sgRNA编码信息的质粒导入患者的T细胞内，实现PD-1基因的精准敲除，使患者的病情呈现明显的稳定态势。图1为CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制示意图，图2为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗肿瘤的过程。据图回答问题：
图1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制
图2 CRISPR/Cas9编辑技术治疗肿瘤的过程
(1)构建携带Cas9蛋白和sgRNA编码信息的质粒，需要用到的工具酶有__ __。导入质粒的患者T细胞能够表达出Cas9蛋白，这说明__ __。
(2)由图1可知，胞内基因敲除过程中Cas9蛋白催化目标基因的__ __键断裂，sgRNA的靶向序列与DNA中目标区域的结合遵循__ __原则。
(3)CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶向序列长度一般为20个核苷酸左右。从靶向序列与模板结合的角度分析，靶向序列不可过短的原因是__ __。
(4)综上分析，CRISPR/Cas9编辑技术治疗肿瘤的机理是__ __。
“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。
(1)研究者设计下图所示的DNA片段。已知3种荧光蛋白的氨基酸序列，则可通过__ __法获得相关基因，再利用限制酶和__ __酶将3种荧光蛋白基因和两种LoxP序列、启动子M与载体连接，形成重组质粒，采用__ __法将其导入小鼠的受精卵细胞中，经过筛选、培育，获得转基因小鼠。
注：仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因。
(2)在Cre酶的帮助下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，但两个LoxP1或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，Cre酶基因在环境中存在化学物质Tam时才能激活表达，因此该小鼠“脑彩虹”的出现可受Tam的调控：
①若无Tam作用时，该小鼠脑组织的色彩为__ __色，其他组织细胞颜色为__ __色。
②若有Tam作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：__ __。
配 套 热 练
题组一 构建融合基因表达载体
1．(2025·汕头一模)水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(见图1)，为环境污染治理提供新方法。回答下列问题：
Pc：持续表达启动子，Ps：水杨酸诱导启动子，nahR：调控蛋白基因，mrfp：红色荧光蛋白基因
图1
(1)Pc和Ps启动子可被__ __酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图1可知，当环境中存在水杨酸时，__ __可激活Ps启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。
(2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是__ __。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路：__ __。
(3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是__ __。
图2
(4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入图3中的__ __、__ __位点。
图3
2．某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控制。研究人员通过基因工程构建含质粒-A-B-D的大肠杆菌生产药物P，下图为基因表达载体的构建过程，其中AmpR代表氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。引物1序列为5′-GGTCTAGACCTAGG-3′，引物2序列为5′-GGCCATGGGGTTCC-3′。限制酶的识别序列及切割位点(从左向右均为5′→3′)为KpnⅠ(GGTAC↓C)、XbaⅠ(T↓CTAGA)、BamHⅠ(G↓GATCC)、NcoⅠ(C↓CATGG)。基因B和D转录的模板分别是a链和d链。根据所学知识回答下列问题：
(1)PCR扩增目的基因时，引物的作用是____。常采用____来鉴定PCR的产物。
(2)为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有__ __酶的识别序列，则据图判断，A基因转录的模板链可能是__ __。一个A基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为__ __。
(3)为了实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物__ __的5′端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中__ __(填字母)杂交形成的DNA。
(4)为保证B-D融合基因与质粒-A按图中方式连接，需要在引物3和引物5中分别添加限制酶__ __的识别序列。若筛选导入基因A-B-D的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选__ __的大肠杆菌即为目的菌。
3．(2025·茂名二模)研究表明，长期熬夜将导致肠道活性氧(ROS)积累，从而引起机体代谢紊乱，甚至猝死。补充褪黑素可以清除ROS，但是过量褪黑素会进入血液带来副作用。益生菌EcN可以在肠道内至少生存1周，而其自身无法产生褪黑素。某研究团队在EcN中构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路(如图1)，提出利用工程菌EcN“定点”“持续”“可控”地递送褪黑素以维护熬夜人群肠道健康的新思路。基因工程的关键步骤如图2。请回答下列问题：
图1
图2 无缝克隆pBAD-psmf的流程图
(pBAD-OsCOMT的步骤与该步骤相同)
注：pMV、pBAD为质粒，Apr为AMP抗性基因，araC为调节蛋白，Para为阿拉伯糖启动子，His为标签蛋白。
(1)图2显示了基因工程的核心步骤：__ __。通过无缝克隆的方式，目的基因插入到载体pBAD中__ __的下游，且与His标签相连。
(2)由图2可知，与常规方法相比，无缝克隆法中载体的线性化和插入片段的扩增，均使用__ __法；唯一区别是在设计扩增插入片段的引物时，需保证插入片段末端与线性化载体末端有15～20 bp的同源序列。连接时，利用3′端核酸外切酶水解PCR产物3′端的核苷酸，暴露载体和插入片段同源部分，同源序列即可通过__ __原则实现载体和插入片段的连接。由此归纳无缝克隆的优点有__ __。
(3)分子水平检测表明导入重组质粒的EcN已成功表达目的蛋白。若要从个体生物学水平鉴定导入pBAD-Psmf的EcN或导入pBAD-OsCOMT的EcN所产生的目的蛋白活性，请结合图1简要描述鉴定方法：__ __。
(4)本研究已在EcN中成功构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路。请结合题干信息提出进一步探究思路：__ __。
题组二 基因敲除
4．(2025·惠东模拟)桃源黑猪是我国地方猪种的典型代表，具有瘦肉率低的缺陷。MSNT(肌肉生长抑制素)是控制动物“双肌性状”的基因，其功能为可抑制动物骨骼肌增生，增加脂肪沉积。研究人员利用sgMSNT/Cas9复合物敲除MSNT基因获得了桃源黑猪新品种。图1中的sgMSNT/Cas9复合物中，sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。图2为利用该技术成功敲除MSNT基因后，通过胚胎工程获得桃源黑猪新品种的操作步骤。回答下列问题：
图1
图2
(1)Cas9蛋白相当于__ __酶，可催化__ __键断裂，若图1中复合物所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，则sgMSNT的序列为__ __。
(2)图1所示技术可弥补桃源黑猪瘦肉率低的缺陷的原因是__ __。
(3)图2中形成重构胚后可通过__ __法(写1种)激活，为获得更多胚胎，可在胚胎发育到__ __期时进行__ __。
5．(2025·安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
图1
说明：用图1中的引物1和2进行PCR扩增。
图2
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用__ __(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是__ __。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除，如图1所示。采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的__ __。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落__ __(填序号)，出现菌落④的可能原因是__ __。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：__ __。
6．(2025·潮州质检)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA（sgRNA）引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因(靶基因)或插入新的基因，其工作原理如图1所示。
图1
(1)研究发现，CRISPR/Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说的意义是__ __。
(2)CRISPR/Cas9系统能精准识别目标基因，若目标基因序列为5′-AGCAT……GTACCT-3′。则设计的向导RNA中相应的序列应为__ __。Cas9蛋白相当于__ __酶，可催化__ __键断裂。
(3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现，脱靶概率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越__ __(填“长”或“短”)，基因编辑的脱靶率越高，原因是__ __。
(4)研究发现，恶性肿瘤的发生与TDO2基因有关，图2是科研人员利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠TDO2基因中2、3、4片段的流程图，从而构建TDO2基因敲除(TDO2-KO)模型小鼠(2n)，此过程至少需要根据TDO2基因的碱基序列设计__ __个sgRNA。经基因编辑得到的4只小鼠，标记为1～4号，1、2为雌鼠，3、4为雄鼠，可通过PCR产物进行鉴定，电泳结果如图3所示。选择已有小鼠设计杂交实验，获得TDO2-KO纯合小鼠，请写出实验思路：__ __。
图2
图3
21世纪教育网(www.21cnjy.com)(共60张PPT)
大专题五
生物技术与工程
【引言】构建基因表达载体是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，通过复制遗传给下一代，并通过表达发挥作用。因此，基因表达载体除目的基因、复制原点、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。构建正确而高效的表达载体能使基因工程的工作事半功倍。现列举几种，以了解相关情境。
1．利用同源重组(无缝克隆技术)构建基因表达载体
无缝克隆技术(In-Fusion技术)，即无缝克隆和组装技术，是一种新型、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。
具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In-Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。
[析 情 境]
案例1 纤维素是自然界中分布最广、含量最丰富的一种多糖，水解纤维素的酶系包括内切酶(EG)、外切酶(CBH)和B-葡萄糖苷酶(BGL)。已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术依次将EG基因、CBH基因和BGL基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。
(1)科研人员常用PCR技术获取和扩增EG基因、CBH基因和BGL基因，该过程不需要添加解旋酶，但DNA也能解旋的原因是_______________________________。若PCR产物中出现了部分非目标序列，可能的原因是_____________________________ _____________________________________________________(答出两点即可)。
高温也可使氢键断裂，双链打开
引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性；复性温度过低，DNA聚合酶的质量不好等
(2)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。
①双酶切法：如图甲标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因插入部位及两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的______ (填“5′”或“3′”)端添加________________限制酶的识别序列，设计的引物序列为_____________ _______________________(从5′端书写，写出前12个碱基序列即可)。
甲
5′
BamHⅠ、SacⅠ
GGATCCGAAT
CG、GAGCTCAGCCTA
②同源重组法：该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在相关酶的作用下即可实现质粒上的同源重组(如图乙所示)。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是_________________________________________________________。
乙
(3)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在_____________的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测_____________，以确定其发酵效果。
相关酶的作用下可以实现载体上任一位点与目的基因的重组
不含尿嘧啶
酒精的含量
2．利用重组融合PCR法构建基因表达载体。
融合PCR技术在不经过酶切和连接的条件下，采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应，类似于重叠延伸PCR法和一步克隆法：①分别设计5′端带有互补序列的若干条特异性引物，分别进行各个片段的扩增；②随后在同体系加入各片段，以一对外侧引物进行融合片段的全长序列的扩增。
案例2 科研人员将高产基因和抗除草剂草甘膦基因作为目的基因，利用重叠延伸PCR技术构建融合基因，从而培育既高产又抗草甘膦的转基因大豆。融合基因构建过程如图1所示，所用Ti质粒及限制酶识别序列如图2所示。
图1
注：LB、RB分别为T-DNA的左边界、右边界。
图2
(1)图1中，两条杂交链的获得都至少需要经过____次扩增循环。PCR1与PCR2的产物能够形成杂交链的条件是_______________________________________________。PCR3过程不需要引物，其原因是____________________________________________ ________________________________。
(2)若要将获得的融合基因用于构建基因表达载体，应选用引物_________对融合基因进行PCR扩增，为了保证扩增后的融合基因能正向插入Ti质粒中，在设计这两种引物时应满足的条件是_____________________________________________________ ________________________________。
(3)将融合基因导入农杆菌需用Ca2+先处理农杆菌，目的是__________________ ____________；利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、大豆细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是____________________________________________ _______________________________________________________________________________。
2
两条母链起始段位置的碱基序列可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端
引物P2和引物P3的5′端存在部分互补配对的碱基序列
P1和P4
在引物P1的5′端加上限制酶NheⅠ的识别序列，在引物P4的5′端加上限制酶XmaⅠ的识别序列
使其能够吸收周围环境中的DNA
先筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的大豆细胞
例1 (2025·佛山顺德二模)抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图1所示。回答下列问题：
[悟 典 例]
(1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第______位的碱基替换，碱基具体变化为_________。基因模板链对应的碱基改变为_________。
图1
154
C变为A
G变为T
(2)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是_______________________________________________________________ ___。
(3)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择___。
A．5′…CCTGTTAT…3′
B．5′…CCTGGTAT…3′
C．5′…ATACCAGG…3′
D．5′…ATAACAGG…3′
(4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR(PCR1和PCR2)，产物1最早出现在PCR1的第____轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有_____________________；通过PCR3快速扩增时应选用的引物是_________ ______。
温度偏低时，DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少
A
3
诱变前的抗菌肽基因
引物1和引物2
(5)In-Fusion酶能够识别任何具有15 bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。科研人员将载体(320 bp)两端连接上与改良的抗菌肽基因(180 bp)两端相同的序列(15 bp)并利用In-Fusion酶实现两者的连接，如图2所示。最终获得的重组DNA分子长度为_________。与传统方法相比，这种技术的优点是_________________________________________________________________ _____________________________________________(至少写两点)。
图2
500 bp
插入位点不受限制酶识别序列限制；能够实现目的基因在载体任意位点上的插入；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等
解析：(1)mRNA上3个相邻的碱基决定一个氨基酸为一个密码子，51个氨基酸对应mRNA上的碱基数为51×3＝153，脯氨酸密码子为CCA，苏氨酸密码子为ACA，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，可将mRNA上第154位的碱基替换，碱基具体变化为C变为A。模板链与mRNA碱基互补配对，则基因模板链对应的碱基则由G变为T。(2)变性的目的是使双链DNA打开，若变性时温度偏低，则DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少，导致反应效率降低。(3)由图可知，模板链方向为3′→5′，则诱变引物与转录非模板链碱基互补配对，诱变引物序列与转录模板链相同，且需将模板链上第154位碱基G变为T，则诱变引物序列为5′…CCTGTTAT…3′。(4)结合DNA的半保留复制，第1、2轮循环的产物均为不等长的DNA，产物1最早出现在PCR1的第3轮循环。
DNA的复制方式为半保留复制，因此PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有诱变前的抗菌肽基因。由图可知，经过PCR1和PCR得到的产物2两端包含引物1和引物2序列的，通过PCR3扩增时应选引物1和引物2进行扩增。(5)已知In-Fusion酶能够识别任何具有15 bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。因此最终获得的重组DNA分子长度为载体(320 bp)＋改良的抗菌肽基因(180 bp)＝500 bp。
【引言】基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。基因敲除是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术。Cre/LoxP重组酶系统是一种新型的基因敲除技术。
突破2 基因敲除
1．利用“基因敲除”技术，能“敲除”DNA上的特定基因。该技术的主要过程示意图如下：
[析 情 境]
(1)胚胎干细胞可从小白鼠的_____________________中分离得到。
(2)neoR基因插入靶基因使用的工具酶是___________________和____________，前者识别特定脱氧核苷酸序列并在特定位点切开。“靶基因失活”的含义是_____________________________________________。
(3)失活靶基因与正常靶基因交换涉及的变异类型是___________；经处理后的胚胎干细胞转移到特定培养基中筛选培养，“特定培养基”中需加入_________以起到筛选培养的目的。
(4)科学家可以通过“基因敲除”来研究基因的功能，培养图示中胚胎干细胞所获得的“基因敲除”小白鼠_______(填“能”或“不能”)直接用于研究基因功能，原因是_______________________________________________________。
早期胚胎或原始性腺
限制性内切核酸酶
DNA连接酶
靶基因中的脱氧核苷酸序列发生改变，不能表达
基因重组
新霉素
不能
因为该小白鼠体内仍有一个正常的靶基因，也可能表达性状
2．CRISPR/Cas9技术利用人工合成的短链RNA(gRNA)和核酸酶Cas9蛋白共同作用来完成基因的定向编辑。其原理是gRNA作为向导，它的部分序列通过碱基互补配对原则，与希望被编辑的DNA序列结合；Cas9也与gRNA结合，并切割与gRNA结合的DNA序列，使DNA双链断裂；加入含有预期突变的序列，细胞在修复DNA过程中会将其引入基因组，从而实现精准的基因编辑。
(2025·宝安期末节选)如图是与ADE2基因有关的gRNA前面的相关序列及切割位点，切割后用于插入目标序列。则目标序列前方添加的引物序列应含有5′-______-3′和5′-______-3′。
AAC
ATC
3．Cre/LoxP重组是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位。Cre/LoxP重组酶系统是由Cre重组酶和LoxP位点组成的基因编辑工具，对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造。
Cre/LoxP重组酶系统的核心元件是Cre重组酶(具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组)和LoxP序列(包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向，LoxP有不同“亚型”，可以嵌套使用)。
同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
同向 反向
(1)LoxP具有方向性，结构如图1所示，其中决定方向的序列是_____(填序号)。Cre酶能随机识别DNA分子上的两个相同的LoxP序列，并在其中的特定位点切断DNA双链，重新连接切口后，连接时形成的化学键是_____________，两个同向LoxP在发挥作用时，机制如图2，则保留图2中片段____(填序号)，就能实现目标基因的敲除。
②
磷酸二酯键
2
注：↑代表Cre酶的识别位点。
图1
图2
(2)Cre/LoxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因_______(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，可以防止Cre基因缺失时的表达。在Cre酶存在的情况下，终止密码子被切除，目的基因_______(填“表达”或“不表达”)。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是___________________。
上游
表达
两个LoxP序列相反
例2 (2025·广州白云区模拟)肿瘤细胞表面的PD-L1能与细胞毒性T细胞上的受体PD-1结合，抑制细胞毒性T细胞的活性，实现免疫逃逸。在一项利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗肿瘤的临床试验中，科研团队将携带Cas9蛋白和sgRNA编码信息的质粒导入患者的T细胞内，实现PD-1基因的精准敲除，使患者的病情呈现明显的稳定态势。图1为CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制示意图，图2为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗肿瘤的过程。据图回答问题：
[悟 典 例]
图1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制
图2 CRISPR/Cas9编辑技术治疗肿瘤的过程
(1)构建携带Cas9蛋白和sgRNA编码信息的质粒，需要用到的工具酶有_________ ___________。导入质粒的患者T细胞能够表达出Cas9蛋白，这说明_______________ _______________。
(2)由图1可知，胞内基因敲除过程中Cas9蛋白催化目标基因的___________键断裂，sgRNA的靶向序列与DNA中目标区域的结合遵循_______________原则。
(3)CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶向序列长度一般为20个核苷酸左右。从靶向序列与模板结合的角度分析，靶向序列不可过短的原因是_____________________ ___________________________________________。
(4)综上分析，CRISPR/Cas9编辑技术治疗肿瘤的机理是_____________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________。
限制酶、DNA连接酶
所有生物共用一套遗传密码子
磷酸二酯
碱基互补配对
过短会导致与模板结合的特异性降低，可能会结合到其他非目标区域
通过CRISPR/Cas9编辑技术敲除细胞毒性T细胞的PD-1基因，使细胞毒性T细胞不能表达出受体PD-1，肿瘤细胞无法抑制细胞毒性T细胞的活性，从而被细胞毒性T细胞杀死
例3 “脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。
(1)研究者设计如图所示的DNA片段。已知3种荧光蛋白的氨基酸序列，则可通过_______________法获得相关基因，再利用限制酶和__________酶将3种荧光蛋白基因和两种LoxP序列、启动子M与载体连接，形成重组质粒，采用___________法将其导入小鼠的受精卵细胞中，经过筛选、培育，获得转基因小鼠。
注：仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因。
人工化学合成
DNA连接
显微注射
(2)在Cre酶的帮助下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，但两个LoxP1或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，Cre酶基因在环境中存在化学物质Tam时才能激活表达，因此该小鼠“脑彩虹”的出现可受Tam的调控：
①若无Tam作用时，该小鼠脑组织的色彩为_____色，其他组织细胞颜色为_____色。
②若有Tam作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：__________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
红
无
若有Tam作用时，则启动Cre酶基因的表达，在该酶的作用下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，若随机敲除两个LoxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时细胞为黄色；若敲除两个LoxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时细胞为蓝色；也有可能未成功敲除荧光蛋白基因，此时细胞为红色，这样不同脑细胞就会出现差异，分别表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，进而出现“脑彩虹”
配套热练
题组一 构建融合基因表达载体
1．(2025·汕头一模)水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(见图1)，为环境污染治理提供新方法。回答下列问题：
Pc：持续表达启动子，Ps：水杨酸诱导启动子，nahR：调控蛋白基因，mrfp：红色荧光蛋白基因
图1
(1)Pc和Ps启动子可被__________酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图1可知，当环境中存在水杨酸时，________________________可激活Ps启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。
(2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是____________________。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路：_____________________________________________ _____________________________________________。
RNA聚合
水杨酸—调控蛋白复合物
限制酶和DNA连接酶
选择灵敏度更高的启动子替代PS；在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列(写出其中一种即可)
(3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是___________。
引物1和3
(4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入图3中的_________、_________位点。
E(或F)
B(或C)
图3
解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，所以Pc和Ps启动子可被RNA聚合酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。从图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸—调控蛋白复合物可激活Ps启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。(3)转录是从融合基因模板链的3′→5′，因此水杨酸羟化酶基因需颠倒180°后再与mrfp基因拼接，保证模板链在同一侧，故应选择引物1和引物3进行扩增。(4)ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入在Ps启动子之后、终止子之前，即图中的E(或F)位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动ccdA基因表达抗毒素蛋白；ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，ccdB应插入Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后、终止子之前，即图中的B(或C)位点。
2．某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控制。研究人员通过基因工程构建含质粒-A-B-D的大肠杆菌生产药物P，如图为基因表达载体的构建过程，其中AmpR代表氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。引物1序列为5′-GGTCTAGACCTAGG-3′，引物2序列为5′-GGCCATGGGGTTCC-3′。限制酶的识别序列及切割位点(从左向右均为5′→3′)为KpnⅠ(GGTAC↓C)、XbaⅠ(T↓CTAGA)、BamHⅠ(G↓GATCC)、NcoⅠ(C↓CATGG)。基因B和D转录的模板分别是a链和d链。根据所学知识回答下列问题：
(1)PCR扩增目的基因时，引物的作用是___________________________________ __________。常采用_________________来鉴定PCR的产物。
(2)为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有_______________酶的识别序列，则据图判断，A基因转录的模板链可能是____。一个A基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为_______。
(3)为了实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物_______的5′端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中___________(填字母)杂交形成的DNA。
使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
琼脂糖凝胶电泳
XbaⅠ和NcoⅠ
m
1/8
4和6
b′、d′
(4)为保证B-D融合基因与质粒-A按图中方式连接，需要在引物3和引物5中分别添加限制酶________________的识别序列。若筛选导入基因A-B-D的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选_______________ ____________________________________________________的大肠杆菌即为目的菌。
NcoⅠ、BamHⅠ
能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长
解析：(2)据图可知，A基因扩增选择引物1和引物2，结合引物和限制酶识别序列可知，引物1序列为： 5′-GGTCTAGACCTAGG-3′，含限制酶XbaⅠ识别序列，引物2序列为5′-GGCCATGGGTTCC-3′，含限制酶NcoⅠ识别序列。基因转录的起点是启动子，XbaⅠ识别序列靠近启动子，而NcoⅠ识别序列靠近终止子，转录的方向是从模板链的3′端开始，结合引物的序列方向，说明A基因转录的模板链可能是m。A基因经过4轮循环，共产生16个DNA分子，因DNA的半保留复制，
16个DNA分子中有14个含有两种引物、2个含有一种引物，故只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8 。(3)基因B和D转录的模板分别是a链和d链，要将B基因和D基因重叠延伸，且保证B、D基因的正常表达，需要模板链在DNA的同一条链上，结合图示B基因和D基因的引物可知，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物4和6的5′端添加互补序列。引物6与d互补配对，引物4和b互补配对，引物4和引物6的末端互补配对形成杂交双链，因此能延伸得到B-D融合基因的为图中b′、 d′杂交形成的DNA。(4) 利用XbaⅠ和NcoⅠ限制酶获得质粒-A ，为了使B、D基因表达，B、D基因也必须连接在启动子和终止子之间，若选择XbaⅠ，则基因A会被切割破坏，因此只能选择NcoⅠ、BamHⅠ的识别序列。由于含基因A-B-D的大肠杆菌四环素抗性基因被破坏，但含有氨苄青霉素抗性基因，因此能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
3．(2025·茂名二模)研究表明，长期熬夜将导致肠道活性氧(ROS)积累，从而引起机体代谢紊乱，甚至猝死。补充褪黑素可以清除ROS，但是过量褪黑素会进入血液带来副作用。益生菌EcN可以在肠道内至少生存1周，而其自身无法产生褪黑素。某研究团队在EcN中构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路(如图1)，提出利用工程菌EcN“定点”“持续”“可控”地递送褪黑素以维护熬夜人群肠道健康的新思路。基因工程的关键步骤如图2。请回答下列问题：
图1
图2 无缝克隆pBAD-psmf的流程图
(pBAD-OsCOMT的步骤与该步骤相同)
注：pMV、pBAD为质粒，Apr为AMP抗性基因，araC为调节蛋白，Para为阿拉伯糖启动子，His为标签蛋白。
(1)图2显示了基因工程的核心步骤：_____________________。通过无缝克隆的方式，目的基因插入到载体pBAD中____________________的下游，且与His标签相连。
(2)由图2可知，与常规方法相比，无缝克隆法中载体的线性化和插入片段的扩增，均使用______法；唯一区别是在设计扩增插入片段的引物时，需保证插入片段末端与线性化载体末端有15～20 bp的同源序列。连接时，利用3′端核酸外切酶水解PCR产物3′端的核苷酸，暴露载体和插入片段同源部分，同源序列即可通过_______________原则实现载体和插入片段的连接。由此归纳无缝克隆的优点有____ ____________________________________________________________。
基因表达载体的构建
阿拉伯糖启动子/Para
可进行一个或者多个目的基因的插入，且不依赖限制酶和DNA连接酶
PCR
碱基互补配对
(3)分子水平检测表明导入重组质粒的EcN已成功表达目的蛋白。若要从个体生物学水平鉴定导入pBAD-Psmf的EcN或导入pBAD-OsCOMT的EcN所产生的目的蛋白活性，请结合图1简要描述鉴定方法：________________________________________ _______________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(4)本研究已在EcN中成功构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路。请结合题干信息提出进一步探究思路：___________________________________________ __________________________________________________________________________________________________________。
以适量血清素为底物，检测导入pBAD-Psmf的EcN产生N-乙酰血清素的浓度在单位时间内的变化情况/以适量N-乙酰血清素为底物，检测导入pBAD-OsCOMT的EcN产生褪黑素的浓度在单位时间内的变化情况
探讨外源蛋白表达量(Psmf或OsCOMT)对EcN生存率的影响/探究如何改造当前的基因工程菌EcN，才能最终实现在肠道内“定点”“持续”“可控”地清除活性氧
题组二 基因敲除
4．(2025·惠东模拟)桃源黑猪是我国地方猪种的典型代表，具有瘦肉率低的缺陷。MSNT(肌肉生长抑制素)是控制动物“双肌性状”的基因，其功能为可抑制动物骨骼肌增生，增加脂肪沉积。研究人员利用sgMSNT/Cas9复合物敲除MSNT基因获得了桃源黑猪新品种。图1中的sgMSNT/Cas9复合物中，sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。图2为利用该技术成功敲除MSNT基因后，通过胚胎工程获得桃源黑猪新品种的操作步骤。回答下列问题：
(1)Cas9蛋白相当于_____________________酶，可催化___________键断裂，若图1中复合物所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，则sgMSNT的序列为_________________。
图1
图2
限制性内切核酸限制
磷酸二酯
5′-GAUGG-3′
(2)图1所示技术可弥补桃源黑猪瘦肉率低的缺陷的原因是___________________ ________________________________________________________________________________________________________。
(3)图2中形成重构胚后可通过____________________________________________ _____________________法(写1种)激活，为获得更多胚胎，可在胚胎发育到________ _________期时进行___________。
sgMSNT/Cas9复合物使MSNT基因被切割破坏，抑制MSNT基因表达，从而达到促进桃源黑猪骨骼肌增生，减少脂肪沉积，瘦肉率增加的效果
电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂(写出其中一种即可)
囊胚或桑葚胚
胚胎分割
解析：据题干信息“Cas9蛋白对DNA进行切割”可知，Cas9蛋白相当于限制酶，故其可催化磷酸二酯键的断裂。sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，据图可知，sgMSNT可与靶核酸分子(需要切割的DNA片段)部分互补配对，若所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，结合碱基互补配对和双链反向平行关系，则sgMSNT的序列为5′-GAUGG-3′。
5．(2025·安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
图1
说明：用图1中的引物1和2进行PCR扩增。
图2
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用_________________(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是_________________________________。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除，如图1所示。采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的_____________。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落_____(填序号)，出现菌落④的可能原因是___________________ ________________________________________。
稀释涂布平板法
分离不同条件下生长的内生放线菌
指数级扩增
②
重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：_______________________________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测
解析：(1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500 bp)＋R基因 (2 000 bp) ＋ R-D (500 bp)＝3 000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，
R基因(2 000 bp)被敲除，引物1和引物2之间的DNA片段长度约为 R-U(500 bp)＋R-D(500 bp)＝ 1 000 bp，对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。出现菌落④的可能原因是整个重组质粒(大小为3 000 bp的质粒＋500 bp R-U＋500 bp R-D＝4 000 bp)整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个质粒的长度(4 000 bp)，即3 000＋4 000＝7 000 bp。这是单交换同源重组整合的结果。
6．(2025·潮州质检)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因(靶基因)或插入新的基因，其工作原理如图1所示。
(1)研究发现，CRISPR/Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说的意义是_______________________________________________________________________ _________________。
图1
防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状(遗传信息)的稳定(或抵御病毒、外源DNA的入侵)
(2)CRISPR/Cas9系统能精准识别目标基因，若目标基因序列为5′-AGCAT……GTACCT-3′。则设计的向导RNA中相应的序列应为______________________________。Cas9蛋白相当于_______________________酶，可催化___________键断裂。
(3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现，脱靶概率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越_____(填“长”或“短”)，基因编辑的脱靶率越高，原因是_________________ ______________________________________________。
3′-UCGUA…… CAUGGA-5′
限制/限制性内切核酸
磷酸二酯
短
sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错
(4)研究发现，恶性肿瘤的发生与TDO2基因有关，图2是科研人员利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠TDO2基因中2、3、4片段的流程图，从而构建TDO2基因敲除(TDO2-KO)模型小鼠(2n)，此过程至少需要根据TDO2基因的碱基序列设计____个sgRNA。经基因编辑得到的4只小鼠，标记为1～4号，1、2为雌鼠，3、4为雄鼠，可通过PCR产物进行鉴定，电泳结果如图3所示。选择已有小鼠设计杂交实验，获得TDO2-KO纯合小鼠，请写出实验思路：_______________________________________ _______________________________________。
2
将1号和4号小鼠杂交得子代，通过PCR及电泳对子代进行鉴定，选出只含条带②的小鼠
图2
图3
解析：(1)Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因(靶基因)，推测细菌细胞内存在的CRISPR-Cas9系统可通过切割外源DNA使之失效，防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状，以保证自身的安全。(2)向导RNA与目标基因的碱基序列应互补，且两条链方向相反，因此若目标基因序列为5′-AGCAT……GTACCT-3′，则设计的向导RNA中相应的序列应为3′-UCGUA……CAUGGA-5′。Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因(靶基因)，因此Cas9蛋白相当于限制酶，可催化磷酸二酯键的断裂。(3)由于其他DNA序列可能也含有与向导RNA互补配对的序列，
sgRNA的识别序列越短，特异性越差，越容易与其他片段结合造成编辑出错，造成脱靶。(4)据图2分析，需要将野生型基因2、3、4三个片段切除，由图中两处剪刀符号可知，只需根据2的左侧和4的右侧部分序列，设计两个sgRNA。据图3可知，1号和4号均有一个TDO2基因被敲除，一个TDO2基因未被敲除，可认为是杂合子，据题意可知，1号为雌鼠，4号为雄鼠，故可选择1号和4号进行杂交，再通过PCR及电泳对子代进行鉴定，选出仅含图3中条带②的小鼠，即TDO2-KO纯合小鼠。6 基因工程操作相关新情境
突破1 构建融合基因表达载体
【引言】构建基因表达载体是基因工程的核心，其目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，通过复制遗传给下一代，并通过表达发挥作用。因此，基因表达载体除目的基因、复制原点、标记基因外，还必须有启动子、终止子等。构建正确而高效的表达载体能使基因工程的工作事半功倍。现列举几种，以了解相关情境。
[析 情 境]
1．利用同源重组(无缝克隆技术)构建基因表达载体
无缝克隆技术(In-Fusion技术)，即无缝克隆和组装技术，是一种新型、快速、简洁的克隆方法，可以在质粒的任何位点进行一个或多个目标DNA片段的插入。
具体原理：在载体末端和目的基因两端应具有15～25个同源碱基，而目的基因两端的同源序列往往是通过引物设计实现的，In-Fusion酶能够识别具有相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，DNA连接酶再将两条DNA单链黏合起来。
(1)质粒构建过程：①采用酶切或者PCR扩增方法将载体线性化；②使用设计好的引物进行目的DNA片段的PCR扩增；③反应体系内形成重组质粒。
(2)与传统酶切、酶连相比的优势：①位点选择灵活，在载体任意位置进行基因克隆；②快速简便；③克隆效率高，阳性克隆高达90%以上；④可同时克隆两个或多个DNA片段。
案例1 纤维素是自然界中分布最广、含量最丰富的一种多糖，水解纤维素的酶系包括内切酶(EG)、外切酶(CBH)和B-葡萄糖苷酶(BGL)。已知酿酒酵母菌不能吸收纤维素，科研人员利用基因工程技术依次将EG基因、CBH基因和BGL基因分多步导入酿酒酵母菌，获取可以直接利用纤维素发酵的酿酒酵母工程菌。
(1)科研人员常用PCR技术获取和扩增EG基因、CBH基因和BGL基因，该过程不需要添加解旋酶，但DNA也能解旋的原因是__高温也可使氢键断裂，双链打开__。若PCR产物中出现了部分非目标序列，可能的原因是__引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性；复性温度过低，DNA聚合酶的质量不好等__(答出两点即可)。
(2)构建基因表达载体是基因工程的核心步骤，科研人员采用以下两种方法构建含有EG基因的表达载体。
①双酶切法：如图甲标注了载体、EG基因的限制酶切点、EG基因插入部位及两端的部分序列，已知酿酒酵母菌不能合成尿嘧啶，图中的标记基因为尿嘧啶合成基因。结合图中信息分析，在扩增EG基因时应在引物的__5′__ (填“5′”或“3′”)端添加__BamHⅠ、SacⅠ__限制酶的识别序列，设计的引物序列为__GGATCCGAATCG、GAGCTCAGCCTA(从5′端书写，写出前12个碱基序列即可)。
甲
②同源重组法：该操作可通过PCR技术在任一位点实现质粒的线性化，只要将目的基因两端带有与线性化质粒两端同源的DNA序列，在相关酶的作用下即可实现质粒上的同源重组(如图乙所示)。与双酶切法相比，同源重组法构建基因表达载体的突出优点是__在相关酶的作用下可以实现载体上任一位点与目的基因的重组__。
乙
(3)导入上述重组质粒的酿酒酵母菌应在__不含尿嘧啶__的培养基上筛选培养。将筛选得到的菌株接种到液体培养基中培养一段时间，通过检测__酒精的含量__，以确定其发酵效果。
2．利用重组融合PCR法构建基因表达载体。
融合PCR技术在不经过酶切和连接的条件下，采用具有互补末端的引物将不同来源的扩增片段连接起来。现有的融合PCR技术一般包括两步PCR反应，类似于重叠延伸PCR法和一步克隆法：①分别设计5′端带有互补序列的若干条特异性引物，分别进行各个片段的扩增；②随后在同体系加入各片段，以一对外侧引物进行融合片段的全长序列的扩增。
案例2 科研人员将高产基因和抗除草剂草甘膦基因作为目的基因，利用重叠延伸PCR技术构建融合基因，从而培育既高产又抗草甘膦的转基因大豆。融合基因构建过程如图1所示，所用Ti质粒及限制酶识别序列如图2所示。
图1
注：LB、RB分别为T-DNA的左边界、右边界。
图2
(1)图1中，两条杂交链的获得都至少需要经过__2__次扩增循环。PCR1与PCR2的产物能够形成杂交链的条件是__引物P2和引物P3的5′端存在部分互补配对的碱基序列__。PCR3过程不需要引物，其原因是__两条母链起始段位置的碱基序列可以作为子链合成的引物，为DNA聚合酶提供3′端__。
(2)若要将获得的融合基因用于构建基因表达载体，应选用引物__P1和P4__对融合基因进行PCR扩增，为了保证扩增后的融合基因能正向插入Ti质粒中，在设计这两种引物时应满足的条件是__在引物P1的5′端加上限制酶NheⅠ的识别序列，在引物P4的5′端加上限制酶XmaⅠ的识别序列__。
(3)将融合基因导入农杆菌需用Ca2+先处理农杆菌，目的是__使其能够吸收周围环境中的DNA__；利用农杆菌转化法将融合基因导入农杆菌、大豆细胞的过程中，需要筛选两次，这两次筛选分别是__先筛选出能在含潮霉素培养基上生长而不能在含卡那霉素培养基上生长的农杆菌，再用含草甘膦的培养基筛选出导入融合基因的大豆细胞__。
[悟 典 例]
(2025·佛山顺德二模)抗生素的长期使用易导致病菌产生严重的耐药性。抗菌肽以其快速杀菌活性、低耐药可能性、免疫调节特性和促进伤口愈合的潜力成为最有前景的抗菌药物。研究发现，将抗菌肽第52位的脯氨酸(密码子为CCA)替换成苏氨酸(密码子为ACA)可增强抗菌肽的杀菌活性。科研人员利用大引物PCR定点诱变技术对抗菌肽基因进行改造的过程如图1所示。回答下列问题：
图1
(1)将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，需要将mRNA的对应碱基序列中第__154__位的碱基替换，碱基具体变化为__C变为A__。基因模板链对应的碱基改变为__G变为T__。
(2)PCR过程中温度的控制至关重要，若变性时温度偏低，则会导致反应效率降低，原因是__温度偏低时，DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少__。
(3)据图分析，“大引物PCR定点诱变”技术中设计的“诱变引物”应选择__A__。
A．5′…CCTGTTAT…3′
B．5′…CCTGGTAT…3′
C．5′…ATACCAGG…3′
D．5′…ATAACAGG…3′
(4)进行大引物PCR定点诱变获得改良的抗菌肽基因需要进行两次PCR(PCR1和PCR2)，产物1最早出现在PCR1的第__3__轮循环；PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有__诱变前的抗菌肽基因__；通过PCR3快速扩增时应选用的引物是__引物1和引物2__。
(5)In-Fusion酶能够识别任何具有15 bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。科研人员将载体(320 bp)两端连接上与改良的抗菌肽基因(180 bp)两端相同的序列(15 bp)并利用In-Fusion酶实现两者的连接，如图2所示。最终获得的重组DNA分子长度为__500 bp__。与传统方法相比，这种技术的优点是__插入位点不受限制酶识别序列限制；能够实现目的基因在载体任意位点上的插入；避免限制酶切割对质粒功能区的破坏等__(至少写两点)。
图2
解析：(1)mRNA上3个相邻的碱基决定一个氨基酸为一个密码子，51个氨基酸对应mRNA上的碱基数为51×3＝153，脯氨酸密码子为CCA，苏氨酸密码子为ACA，若想将抗菌肽第52位的脯氨酸换成苏氨酸，可将mRNA上第154位的碱基替换，碱基具体变化为C变为A。模板链与mRNA碱基互补配对，则基因模板链对应的碱基则由G变为T。(2)变性的目的是使双链DNA打开，若变性时温度偏低，则DNA双链解旋不充分，延伸时模板减少，产生的产物量偏少，导致反应效率降低。(3)由图可知，模板链方向为3′→5′，则诱变引物与转录非模板链碱基互补配对，诱变引物序列与转录模板链相同，且需将模板链上第154位碱基G变为T，则诱变引物序列为5′…CCTGTTAT…3′。(4)结合DNA的半保留复制，第1、2轮循环的产物均为不等长的DNA，产物1最早出现在PCR1的第3轮循环。DNA的复制方式为半保留复制，因此PCR2的产物除改良的抗菌肽基因外，还有诱变前的抗菌肽基因。由图可知，经过PCR1和PCR得到的产物2两端包含引物1和引物2序列的，通过PCR3扩增时应选引物1和引物2进行扩增。(5)已知In-Fusion酶能够识别任何具有15 bp相同末端序列的线性DNA分子并使其形成黏性末端，实现目的基因和载体的连接。因此最终获得的重组DNA分子长度为载体(320 bp)＋改良的抗菌肽基因(180 bp)＝500 bp。
巩固提示：趁热打铁，请完成“配套热练”中对应练习。
突破2 基因敲除
【引言】基因敲除是自20世纪80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。基因敲除是针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏蔽，并可进一步对生物体造成影响。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术。Cre/LoxP重组酶系统是一种新型的基因敲除技术。
[析 情 境]
1．利用“基因敲除”技术，能“敲除”DNA上的特定基因。该技术的主要过程示意图如下：
(1)胚胎干细胞可从小白鼠的__早期胚胎或原始性腺__中分离得到。
(2)neoR基因插入靶基因使用的工具酶是__限制性内切核酸酶__和__DNA连接酶__，前者识别特定脱氧核苷酸序列并在特定位点切开。“靶基因失活”的含义是__靶基因中的脱氧核苷酸序列发生改变，不能表达__。
(3)失活靶基因与正常靶基因交换涉及的变异类型是__基因重组__；经处理后的胚胎干细胞转移到特定培养基中筛选培养，“特定培养基”中需加入__新霉素__以起到筛选培养的目的。
(4)科学家可以通过“基因敲除”来研究基因的功能，培养图示中胚胎干细胞所获得的“基因敲除”小白鼠__不能__(填“能”或“不能”)直接用于研究基因功能，原因是__因为该小白鼠体内仍有一个正常的靶基因，也可能表达性状__。
2．CRISPR/Cas9技术利用人工合成的短链RNA(gRNA)和核酸酶Cas9蛋白共同作用来完成基因的定向编辑。其原理是gRNA作为向导，它的部分序列通过碱基互补配对原则，与希望被编辑的DNA序列结合；Cas9也与gRNA结合，并切割与gRNA结合的DNA序列，使DNA双链断裂；加入含有预期突变的序列，细胞在修复DNA过程中会将其引入基因组，从而实现精准的基因编辑。
(2025·宝安期末节选)下图是与ADE2基因有关的gRNA前面的相关序列及切割位点，切割后用于插入目标序列。则目标序列前方添加的引物序列应含有5′-__AAC__-3′和5′-__ATC__-3′。
3．Cre/LoxP重组是一种特定位点的重组酶技术，可在DNA的特定位点上执行删除、插入、易位及倒位。Cre/LoxP重组酶系统是由Cre重组酶和LoxP位点组成的基因编辑工具，对转基因受体细胞DNA上的特定序列进行定点切割和重新连接，从而在基因或染色体水平上对生物基因进行遗传改造。
Cre/LoxP重组酶系统的核心元件是Cre重组酶(具有限制酶特性，能够特异性识别LoxP位点。能介导两个LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点间的基因序列被删除或重组)和LoxP序列(包括两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的间隔区域，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了LoxP位点的方向，LoxP有不同“亚型”，可以嵌套使用)。
同向 反向
同向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列，仅保留一个LoxP。
反向LoxP：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位。
(1)LoxP具有方向性，结构如图1所示，其中决定方向的序列是__②__(填序号)。Cre酶能随机识别DNA分子上的两个相同的LoxP序列，并在其中的特定位点切断DNA双链，重新连接切口后，连接时形成的化学键是__磷酸二酯键__，两个同向LoxP在发挥作用时，机制如图2，则保留图2中片段__2__(填序号)，就能实现目标基因的敲除。
注：↑代表Cre酶的识别位点。
图1
图2
(2)Cre/LoxP重组酶系统可以调控基因的表达，在目的基因__上游__(填“上游”或“下游”)插入一个带有LoxP位点的编码终止密码子的序列，可以防止Cre基因缺失时的表达。在Cre酶存在的情况下，终止密码子被切除，目的基因__表达__(填“表达”或“不表达”)。若经Cre酶作用使得2个LoxP位点间的序列发生反转，其原因可能是__两个LoxP序列相反__。
[悟 典 例]
(2025·广州白云区模拟)肿瘤细胞表面的PD-L1能与细胞毒性T细胞上的受体PD-1结合，抑制细胞毒性T细胞的活性，实现免疫逃逸。在一项利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗肿瘤的临床试验中，科研团队将携带Cas9蛋白和sgRNA编码信息的质粒导入患者的T细胞内，实现PD-1基因的精准敲除，使患者的病情呈现明显的稳定态势。图1为CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制示意图，图2为利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗肿瘤的过程。据图回答问题：
图1 CRISPR/Cas9基因编辑技术的机制
图2 CRISPR/Cas9编辑技术治疗肿瘤的过程
(1)构建携带Cas9蛋白和sgRNA编码信息的质粒，需要用到的工具酶有__限制酶、DNA连接酶__。导入质粒的患者T细胞能够表达出Cas9蛋白，这说明__所有生物共用一套遗传密码子__。
(2)由图1可知，胞内基因敲除过程中Cas9蛋白催化目标基因的__磷酸二酯__键断裂，sgRNA的靶向序列与DNA中目标区域的结合遵循__碱基互补配对__原则。
(3)CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶向序列长度一般为20个核苷酸左右。从靶向序列与模板结合的角度分析，靶向序列不可过短的原因是__过短会导致与模板结合的特异性降低，可能会结合到其他非目标区域__。
(4)综上分析，CRISPR/Cas9编辑技术治疗肿瘤的机理是__通过CRISPR/Cas9编辑技术敲除细胞毒性T细胞的PD-1基因，使细胞毒性T细胞不能表达出受体PD-1，肿瘤细胞无法抑制细胞毒性T细胞的活性，从而被细胞毒性T细胞杀死__。
“脑彩虹”是一项最新的大脑成像技术，通过荧光蛋白“点亮”大脑内的神经元，帮助科学家了解大脑。
(1)研究者设计下图所示的DNA片段。已知3种荧光蛋白的氨基酸序列，则可通过__人工化学合成__法获得相关基因，再利用限制酶和__DNA连接__酶将3种荧光蛋白基因和两种LoxP序列、启动子M与载体连接，形成重组质粒，采用__显微注射__法将其导入小鼠的受精卵细胞中，经过筛选、培育，获得转基因小鼠。
注：仅表达与启动子相邻的荧光蛋白基因。
(2)在Cre酶的帮助下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，但两个LoxP1或两个LoxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，Cre酶基因在环境中存在化学物质Tam时才能激活表达，因此该小鼠“脑彩虹”的出现可受Tam的调控：
①若无Tam作用时，该小鼠脑组织的色彩为__红__色，其他组织细胞颜色为__无__色。
②若有Tam作用时，该小鼠脑组织会出现“脑彩虹”，请阐述机理：__若有Tam作用时，则启动Cre酶基因的表达，在该酶的作用下，一些荧光蛋白基因可能会被随机“剪掉”，若随机敲除两个LoxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时细胞为黄色；若敲除两个LoxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时细胞为蓝色；也有可能未成功敲除荧光蛋白基因，此时细胞为红色，这样不同脑细胞就会出现差异，分别表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，进而出现“脑彩虹”__。
巩固提示：趁热打铁，请完成“配套热练”中对应练习。
配 套 热 练
题组一 构建融合基因表达载体
1．(2025·汕头一模)水杨酸是常见的水体污染物，科学家利用基因工程构建智能工程菌，通过向大肠杆菌体内导入含特殊DNA序列的重组质粒，制备水杨酸生物传感器(见图1)，为环境污染治理提供新方法。回答下列问题：
Pc：持续表达启动子，Ps：水杨酸诱导启动子，nahR：调控蛋白基因，mrfp：红色荧光蛋白基因
图1
(1)Pc和Ps启动子可被__RNA聚合__酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。分析图1可知，当环境中存在水杨酸时，__水杨酸—调控蛋白复合物__可激活Ps启动子，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。
(2)研究人员改造重组质粒，选择激活能力更强的蛋白的基因nahR1替代nahR，实现在相同浓度的水杨酸条件下荧光强度扩大为原来的2倍，提高传感器的灵敏度。该改造过程需要用到的工具酶是__限制酶和DNA连接酶__。请提出另一种改造重组质粒以提高传感器灵敏度的思路：__选择灵敏度更高的启动子替代PS；在mrfp基因前插入提高表达效率的DNA序列(写出其中一种即可)__。
(3)水杨酸羟化酶可催化水杨酸转化为龙胆酸，龙胆酸可被细胞利用。若将水杨酸羟化酶基因与mrfp基因连接成融合基因，则工程菌可同时实现对水杨酸的动态检测和清除。现欲通过PCR判定融合基因已准确连接，应选择图2中的引物组合是__引物1和3__。
图2
(4)工程菌治理环境污染具有成本低、动态治理等优点，但菌株本身会造成水源安全隐患。科学家将ccdA、ccdB两个基因插入原有序列中，使水杨酸被耗尽时菌株即启动“自毁”。已知ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，则ccdA、ccdB分别插入图3中的__E(或F)__、__B(或C)__位点。
图3
解析：(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，所以Pc和Ps启动子可被RNA聚合酶识别并结合后驱动基因的模板链沿3′→5′方向转录出mRNA。从图中可知，当环境中存在水杨酸时，水杨酸—调控蛋白复合物可激活Ps启动子，启动基因表达红色荧光蛋白，最终使菌体发出红色荧光，据此可判定环境中的水杨酸浓度。(3)转录是从融合基因模板链的3′→5′，因此水杨酸羟化酶基因需颠倒180°后再与mrfp基因拼接，保证模板链在同一侧，故应选择引物1和引物3进行扩增。(4)ccdA基因表达抗毒素蛋白导致毒蛋白失效，为了保证在水杨酸存在时工程菌正常生存，ccdA应插入在Ps启动子之后、终止子之前，即图中的E(或F)位点，这样在水杨酸存在时，Ps启动子启动ccdA基因表达抗毒素蛋白；ccdB基因表达毒蛋白可使工程菌致死，当水杨酸被耗尽时，Ps启动子不再启动，此时要让工程菌启动“自毁”，ccdB应插入Pc启动子控制的区域，所以应插入Pc启动子之后、终止子之前，即图中的B(或C)位点。
2．某自花传粉植物的药物P的合成依次受染色体上显性基因A、B、D控制。研究人员通过基因工程构建含质粒-A-B-D的大肠杆菌生产药物P，下图为基因表达载体的构建过程，其中AmpR代表氨苄青霉素抗性基因，TetR表示四环素抗性基因。引物1序列为5′-GGTCTAGACCTAGG-3′，引物2序列为5′-GGCCATGGGGTTCC-3′。限制酶的识别序列及切割位点(从左向右均为5′→3′)为KpnⅠ(GGTAC↓C)、XbaⅠ(T↓CTAGA)、BamHⅠ(G↓GATCC)、NcoⅠ(C↓CATGG)。基因B和D转录的模板分别是a链和d链。根据所学知识回答下列问题：
(1)PCR扩增目的基因时，引物的作用是__使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸__。常采用__琼脂糖凝胶电泳__来鉴定PCR的产物。
(2)为保证A基因正确连接到质粒上，需利用PCR1对A基因进行改造，所用引物1和引物2上分别含有__XbaⅠ和NcoⅠ__酶的识别序列，则据图判断，A基因转录的模板链可能是__m__。一个A基因经过4轮循环后，得到的子代DNA分子中，只含有1种引物的DNA分子所占的比例为__1/8__。
(3)为了实现图中B基因和D基因的重叠延伸，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物__4和6__的5′端添加互补序列。过程②复性过程中会形成多种杂交双链，其中能延伸得到B-D融合基因的为图中__b′、d′__(填字母)杂交形成的DNA。
(4)为保证B-D融合基因与质粒-A按图中方式连接，需要在引物3和引物5中分别添加限制酶__NcoⅠ、BamHⅠ__的识别序列。若筛选导入基因A-B-D的大肠杆菌，可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养，筛选__能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长__的大肠杆菌即为目的菌。
解析：(2)据图可知，A基因扩增选择引物1和引物2，结合引物和限制酶识别序列可知，引物1序列为： 5′-GGTCTAGACCTAGG-3′，含限制酶XbaⅠ识别序列，引物2序列为5′-GGCCATGGGTTCC-3′，含限制酶NcoⅠ识别序列。基因转录的起点是启动子，XbaⅠ识别序列靠近启动子，而NcoⅠ识别序列靠近终止子，转录的方向是从模板链的3′端开始，结合引物的序列方向，说明A基因转录的模板链可能是m。A基因经过4轮循环，共产生16个DNA分子，因DNA的半保留复制，16个DNA分子中有14个含有两种引物、2个含有一种引物，故只含有1种引物的DNA分子所占的比例为1/8 。(3)基因B和D转录的模板分别是a链和d链，要将B基因和D基因重叠延伸，且保证B、D基因的正常表达，需要模板链在DNA的同一条链上，结合图示B基因和D基因的引物可知，PCR2和PCR3过程中需要分别在引物4和6的5′端添加互补序列。引物6与d互补配对，引物4和b互补配对，引物4和引物6的末端互补配对形成杂交双链，因此能延伸得到B-D融合基因的为图中b′、 d′杂交形成的DNA。(4) 利用XbaⅠ和NcoⅠ限制酶获得质粒-A ，为了使B、D基因表达，B、D基因也必须连接在启动子和终止子之间，若选择XbaⅠ，则基因A会被切割破坏，因此只能选择NcoⅠ、BamHⅠ的识别序列。由于含基因A-B-D的大肠杆菌四环素抗性基因被破坏，但含有氨苄青霉素抗性基因，因此能在含有氨苄青霉素的培养基中生长但不能在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
3．(2025·茂名二模)研究表明，长期熬夜将导致肠道活性氧(ROS)积累，从而引起机体代谢紊乱，甚至猝死。补充褪黑素可以清除ROS，但是过量褪黑素会进入血液带来副作用。益生菌EcN可以在肠道内至少生存1周，而其自身无法产生褪黑素。某研究团队在EcN中构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路(如图1)，提出利用工程菌EcN“定点”“持续”“可控”地递送褪黑素以维护熬夜人群肠道健康的新思路。基因工程的关键步骤如图2。请回答下列问题：
图1
图2 无缝克隆pBAD-psmf的流程图
(pBAD-OsCOMT的步骤与该步骤相同)
注：pMV、pBAD为质粒，Apr为AMP抗性基因，araC为调节蛋白，Para为阿拉伯糖启动子，His为标签蛋白。
(1)图2显示了基因工程的核心步骤：__基因表达载体的构建__。通过无缝克隆的方式，目的基因插入到载体pBAD中__阿拉伯糖启动子/Para__的下游，且与His标签相连。
(2)由图2可知，与常规方法相比，无缝克隆法中载体的线性化和插入片段的扩增，均使用__PCR__法；唯一区别是在设计扩增插入片段的引物时，需保证插入片段末端与线性化载体末端有15～20 bp的同源序列。连接时，利用3′端核酸外切酶水解PCR产物3′端的核苷酸，暴露载体和插入片段同源部分，同源序列即可通过__碱基互补配对__原则实现载体和插入片段的连接。由此归纳无缝克隆的优点有__可进行一个或者多个目的基因的插入，且不依赖限制酶和DNA连接酶__。
(3)分子水平检测表明导入重组质粒的EcN已成功表达目的蛋白。若要从个体生物学水平鉴定导入pBAD-Psmf的EcN或导入pBAD-OsCOMT的EcN所产生的目的蛋白活性，请结合图1简要描述鉴定方法：__以适量血清素为底物，检测导入pBAD-Psmf的EcN产生N-乙酰血清素的浓度在单位时间内的变化情况/以适量N-乙酰血清素为底物，检测导入pBAD-OsCOMT的EcN产生褪黑素的浓度在单位时间内的变化情况__。
(4)本研究已在EcN中成功构建了以血清素为底物合成褪黑素的代谢通路。请结合题干信息提出进一步探究思路：__探讨外源蛋白表达量(Psmf或OsCOMT)对EcN生存率的影响/探究如何改造当前的基因工程菌EcN，才能最终实现在肠道内“定点”“持续”“可控”地清除活性氧__。
题组二 基因敲除
4．(2025·惠东模拟)桃源黑猪是我国地方猪种的典型代表，具有瘦肉率低的缺陷。MSNT(肌肉生长抑制素)是控制动物“双肌性状”的基因，其功能为可抑制动物骨骼肌增生，增加脂肪沉积。研究人员利用sgMSNT/Cas9复合物敲除MSNT基因获得了桃源黑猪新品种。图1中的sgMSNT/Cas9复合物中，sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，并引导Cas9蛋白对DNA进行切割。图2为利用该技术成功敲除MSNT基因后，通过胚胎工程获得桃源黑猪新品种的操作步骤。回答下列问题：
图1
图2
(1)Cas9蛋白相当于__限制性内切核酸限制__酶，可催化__磷酸二酯__键断裂，若图1中复合物所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，则sgMSNT的序列为__5′-GAUGG-3′__。
(2)图1所示技术可弥补桃源黑猪瘦肉率低的缺陷的原因是__sgMSNT/Cas9复合物使MSNT基因被切割破坏，抑制MSNT基因表达，从而达到促进桃源黑猪骨骼肌增生，减少脂肪沉积，瘦肉率增加的效果__。
(3)图2中形成重构胚后可通过__电刺激、Ca2+载体、乙醇、蛋白酶合成抑制剂(写出其中一种即可)__法(写1种)激活，为获得更多胚胎，可在胚胎发育到__囊胚或桑葚胚__期时进行__胚胎分割__。
解析：据题干信息“Cas9蛋白对DNA进行切割”可知，Cas9蛋白相当于限制酶，故其可催化磷酸二酯键的断裂。sgMSNT是能准确识别MSNT基因序列的RNA，据图可知，sgMSNT可与靶核酸分子(需要切割的DNA片段)部分互补配对，若所识别的DNA序列为5′-CCATC-3′，结合碱基互补配对和双链反向平行关系，则sgMSNT的序列为5′-GAUGG-3′。
5．(2025·安徽卷)稻瘟病是一种真菌病害，水稻叶片某些内生放线菌对该致病菌有抑制作用。科研小组分离筛选出内生放线菌，并开展了相关研究。回答下列问题：
图1
说明：用图1中的引物1和2进行PCR扩增。
图2
(1)采集有病斑的水稻叶片，经表面消毒、研磨处理，制备研磨液。此后，采用__稀释涂布平板法__(填方法)将研磨液接种于不同的选择培养基，分别置于不同温度下培养，目的是__分离不同条件下生长的内生放线菌__。
(2)经筛选获得一株内生放线菌，该菌株高效合成铁载体小分子，能辅助内生放线菌吸收铁离子。R基因是合成铁载体的关键基因之一。科研小组构建R基因敲除株，探究铁载体的功能。主要步骤如下：首先克隆R基因的上游片段R-U和下游片段R-D；然后构建重组质粒；最后利用重组质粒和内生放线菌DNA片段中同源区段可发生交换的原理，对目标基因进行敲除，如图1所示。采用PCR技术鉴定R基因的敲除结果。PCR通过变性、复性和延伸三步，反复循环，可实现基因片段的__指数级扩增__。R基因敲除过程中，可发生多种形式的同源区段交换，PCR检测结果如图2所示，其中R基因敲除株为菌落__②__(填序号)，出现菌落④的可能原因是__重组质粒通过(单交换)同源重组整合到了内生放线菌的基因组中__。
(3)内生放线菌和稻瘟病致病菌的生长均需要铁元素。科研小组推测该内生放线菌通过对铁离子的竞争性利用，从而抑制稻瘟病致病菌生长。设计实验验证该推测，简要写出实验思路：__设置两组培养实验：对照组在低(或常规)铁浓度的培养基上进行，实验组在高铁浓度的培养基上进行。在两组培养基的相同位置分别接种内生放线菌和稻瘟病致病菌。在相同且适宜的条件下培养一段时间后，观察并比较两组中稻瘟病致病菌菌落的生长情况(如菌落大小或抑制圈大小)。若高铁组的抑制效果明显弱于低铁组，则支持该推测__。
解析：(1)从含有多种微生物的研磨液中分离出单一菌落，并接种到选择培养基中常用的接种方法是稀释涂布平板法。使用选择培养基和不同的温度条件，目的是抑制其他杂菌的生长，分离不同条件下生长的内生放线菌。(2)PCR技术的核心原理是通过多次循环(变性、复性、延伸)，使目标DNA片段的数量以指数形式快速增加，实现体外扩增。PCR鉴定是利用引物1和引物2进行的。 在野生型菌株中，引物1和引物2之间的DNA片段长度为 R-U (500 bp)＋R基因 (2 000 bp) ＋ R-D (500 bp)＝3 000 bp。对应图2中的菌落①和③。 在成功发生双交换的R基因敲除株中，R基因(2 000 bp)被敲除，引物1和引物2之间的DNA片段长度约为 R-U(500 bp)＋R-D(500 bp)＝ 1 000 bp，对应图2中的菌落②。 菌落④的PCR产物大小约为7 000 bp。出现菌落④的可能原因是整个重组质粒(大小为3 000 bp的质粒＋500 bp R-U＋500 bp R-D＝4 000 bp)整合到了基因组中。整合后，引物1和引物2之间的区域长度变为原来的长度(3 000 bp)加上整个质粒的长度(4 000 bp)，即3 000＋4 000＝7 000 bp。这是单交换同源重组整合的结果。
6．(2025·潮州质检)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因(靶基因)或插入新的基因，其工作原理如图1所示。
图1
(1)研究发现，CRISPR/Cas9系统广泛存在于细菌细胞内，这对细菌来说的意义是__防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状(遗传信息)的稳定(或抵御病毒、外源DNA的入侵)__。
(2)CRISPR/Cas9系统能精准识别目标基因，若目标基因序列为5′-AGCAT……GTACCT-3′。则设计的向导RNA中相应的序列应为__3′-UCGUA……CAUGGA-5′__。Cas9蛋白相当于__限制/限制性内切核酸__酶，可催化__磷酸二酯__键断裂。
(3)sgRNA切割非特异性DNA导致CRISPR/Cas9编辑系统对非目的基因进行编辑的现象称为“脱靶”。研究发现，脱靶概率与sgRNA的长度相关，sgRNA的识别序列越__短__(填“长”或“短”)，基因编辑的脱靶率越高，原因是__sgRNA的识别序列短，特异性差，容易与其他片段结合造成编辑出错__。
(4)研究发现，恶性肿瘤的发生与TDO2基因有关，图2是科研人员利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠TDO2基因中2、3、4片段的流程图，从而构建TDO2基因敲除(TDO2-KO)模型小鼠(2n)，此过程至少需要根据TDO2基因的碱基序列设计__2__个sgRNA。经基因编辑得到的4只小鼠，标记为1～4号，1、2为雌鼠，3、4为雄鼠，可通过PCR产物进行鉴定，电泳结果如图3所示。选择已有小鼠设计杂交实验，获得TDO2-KO纯合小鼠，请写出实验思路：__将1号和4号小鼠杂交得子代，通过PCR及电泳对子代进行鉴定，选出只含条带②的小鼠__。
图2
图3
解析：(1)Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因(靶基因)，推测细菌细胞内存在的CRISPR-Cas9系统可通过切割外源DNA使之失效，防止外源基因插入并表达，保持了细菌遗传性状，以保证自身的安全。(2)向导RNA与目标基因的碱基序列应互补，且两条链方向相反，因此若目标基因序列为5′-AGCAT……GTACCT-3′，则设计的向导RNA中相应的序列应为3′-UCGUA……CAUGGA-5′。Cas9基因表达产生的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，切割DNA双链以敲除目标基因(靶基因)，因此Cas9蛋白相当于限制酶，可催化磷酸二酯键的断裂。(3)由于其他DNA序列可能也含有与向导RNA互补配对的序列，sgRNA的识别序列越短，特异性越差，越容易与其他片段结合造成编辑出错，造成脱靶。(4)据图2分析，需要将野生型基因2、3、4三个片段切除，由图中两处剪刀符号可知，只需根据2的左侧和4的右侧部分序列，设计两个sgRNA。据图3可知，1号和4号均有一个TDO2基因被敲除，一个TDO2基因未被敲除，可认为是杂合子，据题意可知，1号为雌鼠，4号为雄鼠，故可选择1号和4号进行杂交，再通过PCR及电泳对子代进行鉴定，选出仅含图3中条带②的小鼠，即TDO2-KO纯合小鼠。
21世纪教育网(www.21cnjy.com)
