高考生物二轮复习大概念整合六专题十五基因工程课件(共102张PPT)

(共102张PPT)
专题十五　基因工程
基因工程
1．(2024·湖南卷)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时，发现DNA完全没有被酶切，分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是(　　)
A．限制酶失活，更换新的限制酶
B．酶切条件不合适，调整反应条件如温度和酶的用量等
C．质粒DNA突变导致酶识别位点缺失，更换正常质粒DNA
D．酶切位点被甲基化修饰，换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
B
解析：B　限制酶失活会使DNA完全不被酶切，此时应更换新的限制酶，A正确；酶切条件不合适通常会使切割效果下降，调整反应条件如温度和pH等，调整酶的用量没有作用，B错误；质粒DNA突变会导致限制酶识别位点缺失，进而造成限制酶无法进行切割，此时应更换为正常质粒，C正确；质粒DNA上酶切位点被甲基化修饰，会导致对DNA甲基化敏感的限制酶无法进行酶切，此时应换用对DNA甲基化不敏感的限制酶，D正确。
2．(2024·黑吉辽卷)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒，共同转入农杆菌，可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同，为提高翻译效率，增强棉花抗病虫害能力，进行如下操作。回答下列问题。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时，需加入蛋白酶，其作用是__________。提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精，其目的是________________。
(2)本操作中获取目的基因的方法是_____和____________。
(3)穿梭质粒中p35s为启动子，其作用是__________，驱动目的基因转录；插入两个p35s启动子，其目的可能是_______。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置，用________基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因，提取棉花植株染色体DNA作模板，进行PCR，应选用的引物是________和________。
(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程，理由是________。
A．通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B．将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C．将1-1362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D．用1-1362合成基因序列和1363-1848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
解析：(1)提取DNA时，要加入蛋白酶水解DNA酶以防止提取的DNA被DNA酶水解，同时水解其他的蛋白质以去除杂质；提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精的目的是利用DNA不溶于酒精的特点来析出DNA分子。(2)根据题干信息可知，本操作中获取目的基因的方法有PCR和人工合成。(3)启动子
位于基因的上游，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，可以驱动目的基因转录出mRNA。插入两个启动子有利于目的基因的稳定高效表达，提高转录的效率。(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置分析可知，潮霉素B抗性基因位于T-DNA左右边界之间，可随着T-DNA一同转化进
入受体细胞，故用HygBR基因对应的抗生素可初步筛选转化的棉花愈伤组织。(5)根据图中信息知，目的基因是人工合成的1-1362基因序列与天然的1363-1848基因序列结合体，应该选择引物F3和R2进行PCR检测棉花植株是否导入目的基因。(6)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的
关系作为基础，通过改造或合成基因来改造现有蛋白质，或制造一种新的蛋白质，以满足人类生产和生活的需求。D项所述内容制造了新的蛋白质，属于蛋白质工程。
答案：(1)水解DNA酶以防止提取的DNA被DNA酶水解，同时水解其他的蛋白质以去除杂质　利用DNA不溶于酒精的特点来析出DNA分子　(2)PCR　人工合成　(3)识别和结合RNA聚合酶　保证目的基因的稳定高效表达，提高转录的效率　(4)HygBR　(5)F3　R2　(6)D
(1)(2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒，构建基因表达载体(重组质粒)，并转化到受体菌中。其中若用Hind Ⅲ酶切，目的基因转录的产物可能不同。( )
√
(2)(2022·江苏卷)采用基因工程技术调控植物激素代谢，可实现作物改良。其中在果实中表达acs(乙烯合成关键酶基因)的反义基因可延迟果实成熟。( )
(3)(经典高考题)抗除草剂基因转入某抗盐植物获得2个稳定遗传转基因品系，抗性鉴定为抗除草剂抗盐和抗除草剂不抗盐。表明一定是抗盐性的改变与抗除草剂基因的转入无关。( )
√
×
(4)(2023·全国乙卷，节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料，利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白，丰富了荧光蛋白的颜色种类。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体。
①将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达，发现大肠杆菌有的发绿色荧光，有的发黄色荧光，有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析，发绿色荧光的可能原因是________________(答出1点即可)。
密码子具有简并性
②新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后，对其所含的GFP突变基因进行测序，发现其碱基序列与GFP基因的不同，将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达，实验思路是__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
获取YFP基因，运用合适的限制酶和DNA连接酶及载体将YFP基因构建形成基因表达载体，然后将构建好的表达载体（含有目的基因YFP基因）导入酵母菌，检测其是否会发黄色荧光
1．厘清基因工程的三种基本工具
提醒：①若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性；②DNA连接酶无识别的特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。
2．厘清基因工程的操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
①筛选合适的目的基因。
a．从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一。
b．利用序列数据库和序列比对工具进行筛选。
②目的基因的获取。
a．人工合成目的基因。
b．PCR获取和扩增目的基因
c．通过构建基因文库来获取目的基因。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
提醒：①启动子和终止子。
启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)；
终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
(3)将目的基因导入受体细胞
(4)目的基因的检测与鉴定
提醒：PCR不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
3．图解蛋白质工程
命题点
围绕基因工程考查科学思维及科学探究
1．Cre-loxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。把几种荧光蛋白基因和Cre酶能识别并切割的序列(loxP1和loxP2)串在一起，构建表达载体T(如图2)。部分荧光蛋白基因会被Cre酶随机“剪掉”，且两个loxP1之间或两个loxP2之间的基因，最多会被Cre酶敲除一次，剩下的部分得以表达，随机呈现不同的颜色。下列说法错误的是(　　)
A．构建表达载体T时用到的工具包括限制酶、DNA连接酶
B．若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色
C．若小鼠细胞含一个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞只能呈红色或黄色
D．若小鼠细胞含两个表达载体T(含Cre酶)，其脑组织细胞可能出现两种颜色
解析：C　基因表达载体构建过程中需要限制酶和DNA连接酶两种工具酶处理，A正确；据图可知，小鼠有编码红、黄、蓝荧光蛋白的基因，前端有脑组织特异性表达的启动子，肌肉细胞不会表达颜色基因，故若小鼠细胞含一个表达载体T(不含Cre酶)，其肌肉组织细胞呈无色，B正确；
loxP1、loxP2位置如图2黑白三角符号所示，两个loxP1和两个loxP2之间的基因最多会被Cre酶敲除一次，Cre酶表达情况不同，识别的loxP不同，则有可能未敲除荧光蛋白基因，此时为红色(同不含Cre酶时)，也有可能敲除两个loxP1之间的红色荧光蛋白基因，此时为黄色，也有可能敲除两个loxP2之间的红色和黄色荧光蛋白基因，此时为蓝色，因而不同脑细胞会差异表达红色、黄色或蓝色荧光蛋白基因，C错误；小鼠脑组织细胞内有2个相同表达载体T(含Cre酶)，Cre酶对每个DNA片段随机剪切，故其脑组织细胞可能出现两种颜色，D正确。
2．OsGLO1、EcCAT、EcGCL和TSR四个基因分别编码四种不同的酶，研究人员将这些基因分别与叶绿体转运肽(引导合成的蛋白质进入叶绿体)基因连接，构建多基因表达载体(载体中部分序列如图所示)，利用农杆菌转化法转化水稻，在水稻叶绿体内构建了一条新代谢途径，提高了水稻的产量。下列叙述错误的是(　　)
A．四个基因转录时不是都以DNA的同一条单链为模板
B．四个基因都在水稻叶绿体内进行转录翻译
C．用含潮霉素的培养基可筛选被农杆菌转化的水稻细胞
D．可用抗原—抗体杂交技术检测四种酶在转基因水稻中的表达情况
B
解析：B　基因的启动子方向有不同，说明转录时不是都以DNA的同一条单链为模板，A正确；这些基因在叶绿体外合成蛋白质，由叶绿体转运肽引导合成的蛋白质进入叶绿体，B错误；卡那霉素抗性基因不在T-DNA上，应用潮霉素培养基筛选被农杆菌转化的水稻细胞，C正确；可用抗原—抗体杂交技术检测是否有相应的蛋白质产生，从而检测四种酶在转基因水稻中的表达情况，D正确。
命题点
围绕蛋白质工程考查生命观念及社会责任
3．(不定项)科研人员以β-甘露葡萄糖酶为核心研究材料，在其N端找到了两个关键的氨基酸位点，将这两个位点的组氨酸和脯氨酸分别替换为酪氨酸后，其热稳定性得到了显著提高。下列说法正确的是(　　)
A．细胞内合成改造后的高热稳定性蛋白质的过程也遵循中心法则
B．替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现
C．在分子水平上，可利用PCR等技术检测细胞内是否合成新的目的蛋白质
D．制备过程中应先获得目标蛋白质的三维结构，再预期其生物学功能
AB
解析：AB　细胞内蛋白质的合成过程都遵循中心法则，A正确；蛋白质是DNA经过转录、翻译得到的，所以替换蛋白质中的氨基酸实际可通过改造基因中的碱基序列实现，B正确；PCR等技术能检测目的基因是否导入细胞或是否转录，检测细胞内是否合成新的蛋白质可使用抗原—抗体杂交法，C错误；蛋白质工程的制备过程中要先预期目标蛋白质的生物学功能，再设计获得该蛋白质的三维结构，D错误。
1．(原因分析类)(1)干扰素是一种具有干扰病毒复制作用的糖蛋白，临床上被广泛用于治疗病毒感染性疾病。利用大肠杆菌可构建干扰素工程菌，该工程菌不能生产有活性的干扰素，请解释其原因。____________ __________________________________________________。
(2)生产乳腺生物反应器构建基因表达载体时有什么特别要求？为什么？__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
大肠杆菌为原核生物，无内质网和高尔基体，不具备加工干扰素的能力
必须把药用蛋白基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。因为只有连接了乳腺中特异表达的基因的启动子，才能保证在雌性动物泌乳期相应的目的基因在其乳腺细胞内得以表达。
(3)蛋白质工程是通过对基因的操作来实现对天然蛋白质进行改造，而不直接对蛋白质分子进行操作的原因是什么？_________________________ ___________________________________________________________________________________________________________。
主要原因有：①蛋白质具有十分复杂的空间结构，基因的结构相对简单，容易改造；②改造后的基因可以遗传给下一代，被改造的蛋白质无法遗传
2．(推测依据类)促红细胞生成素(EPO)是一种能刺激骨髓造血的糖蛋白类激素。生产重组人红细胞生成素(rhEPO)时，需构建EPO基因(E基因)表达载体(如图所示)，并将E基因导入受体细胞CHO-DHFR－，通过细胞培养生产rhEPO。
用PBT质粒和E基因构建PBT-E表达载体时所需的酶是__________________________。某同学比较PBT和PBT-E的大小后，推测E基因的碱基长度为100 bp(bp表示碱基对)，该推测是否正确？请说明理由：___________________________________________________________ ______________________________。
Hind Ⅲ、XhoⅠ、DNA连接酶　
不正确，用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ处理质粒时，切除了MCS上两限制酶酶切位点间的DNA序列
微专题2
PCR技术与基因编辑技术
1．(2024·湖南卷，改编)最早的双脱氧测序法是PCR反应体系中，分别再加入一种少量的双脱氧核苷三磷酸(ddATP、ddCTP、ddGTP或ddTTP)，子链延伸时，双脱氧核苷三磷酸也遵循碱基互补配对原则，以加入ddATP的体系为例：若配对的为ddATP，延伸终止；若配对的为脱氧腺苷三磷酸(dATP)，继续延伸；PCR产物变性后电泳检测。通过该方法测序某疾病患者及对照个体的一段序列，结果如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．上述PCR反应体系中要加入两种引物
B．电泳时产物的片段越小，迁移速率越慢
C．5′—CTACCCGTGAT—3′为对照个体的一段序列
D．患者该段序列中某位点的碱基C突变为G
解析：C　利用双脱氧测序法时，PCR反应体系中加入的模板是待测的单链DNA，故只需加入一种引物，A错误。电泳时，产物的片段越大，迁移速率越慢，B错误。依据分析中双脱氧测序法的原理，可以确定每个泳道中的条带(DNA片段)的3′终端的碱基，如＋ddATP的泳道中出现的条带(DNA片段)的3′终端碱基就是A；另外由于每个片段的起始点相同，但终止点不同，因此可以通过比较片段的长度来确定DNA序列中每个位置上的碱基；
图示电泳方向为从上→下，即对应的DNA片段为长→短，则对应的DNA测序结果为3′→5′，如对照个体的电泳结果最短的条带为＋ddCTP泳道组的条带，则说明该DNA片段5′端第一个碱基为C；因此对照个体的测序结果为5′—CTACCCGTGAT—3′，患者的测序结果为5′—CTACCTGTGAT—3′，C正确。对比患者和对照个体的测序结果可知，患者该段序列中某位点的碱基C突变为T，D错误。
2．(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题：
(1)限制酶切割的化学键是_____________________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是_______________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和_______________________________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是__________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是_________________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_______________________(答出2点即可)。
解析：(1)限制酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。在构建片段甲时，将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，可确保后续酶切得到的片段甲中N基因上下游分别具有启动子和终止子，从而使N基因可以正常转录和表达。(2)向导RNA为核糖核苷酸序列，含有碱基A、U、C、G；B1基因组DNA为脱氧核苷酸序列，含有碱基A、T、C、G。故向导RNA与B1基因组DNA互补配对可形成的碱基对有G—C、C—G、U—A、A—T。
(3)由题中信息“利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2”可知，用引物P1和P2进行PCR验证片段甲插入了细菌B1基因组所用的模板为菌株B2的基因组DNA。结合题图分析可知，P4是以细菌B1基因组DNA为模板设计的引物与该引物互补的B1，基因片段未插入片段甲中，故以菌株B2的基因组DNA为模板，以P3和P4为引物进行PCR，不能扩增出目的条带。(4)焚烧秸秆会污染环境，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆可实现废物利用，减少环境污染。
答案：(1)磷酸二酯键　可以确保酶切处理后得到的片段甲中N基因上下游分别具有启动子和终止子，从而使N基因可以正常转录和表达　(2)C—G、U—A、A—T　(3)菌株B2的基因组DNA　无扩增产物　(4)实现废物利用，减少环境污染(合理即可给分)
(1)(2021·福建卷，节选)微生物吸附是重金属废水的处理方法之一。金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在于动植物中的金属结合蛋白，具有吸附重金属的作用。科研人员将枣树的MT基因导入大肠杆菌构建工程菌。
根据枣树的MT cDNA的核苷酸序列设计了相应的引物(如图)，通过PCR扩增MT基因。已知A位点和B位点分别是起始密码子和终止密码子对应的基因位置。选用的引物组合应为____________。
引物1和引物4
(2)(2021·海南卷，节选)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
①过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是________________。随后，Cas9蛋白可切割________________________ _____________序列。
②利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200 bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是_________________。
碱基互补配对原则
目标（目的）DNA（基因）
特定的核苷酸
DNA分子杂交技术
③某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程：_____________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，两者形成复合体，sgRNA识别并结合目标DNA序列，引导Cas9蛋白进行切割，从而把目的基因插入到基因组DNA中
1．PCR技术及应用
(1)PCR技术原理与条件
(2)PCR技术的过程
提醒：可通过引物控制PCR扩增目的基因片段，并在基因两侧引入限制酶识别序列。
2．基因编辑技术
(1)基因组编辑的含义：对基因进行定点修改，以改变目的基因的序列和功能，进行基因治疗和物种改良。
(2)应用最广泛的技术：CRISPR/Cas9。
(3)CRISPR/Cas9组分及功能
短链RNA(sgRNA、
向导RNA) 作为“向导”，部分序列通过碱基互补配对，与目的基因中希望被编辑的DNA序列结合
细菌的核酸酶Cas9 与短链RNA结合，切割与向导RNA结合的DNA，使DNA双链断裂
(4)CRISPR/Cas9技术的主要应用
①基因敲除。
②特异突变引入。
③定点转基因。
(5)CRISPR/Cas9技术的风险
①基因组编辑技术本身存在着识别准确性等方面的问题。
②对人类基因进行“改造”时要严格遵守法律法规，不能违反人类的伦理道德。
命题点
围绕PCR技术考查科学思维及科学探究
1．通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。如图为基因工程中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物2的5′-端分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是(　　)
A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离核苷酸、解旋酶、TaqDNA聚合酶等
B．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA占1/2
C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体
D．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因
解析：C　PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性)，不需要加入解旋酶，A错误；第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，而总DNA分子有8个，所以占1/4，B错误；引物中设计两种限制酶识别位点，可以使目的基因定向插入限制酶切割后的载体，C正确；第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链不等长的突变基因，D错误。
2．反转录PCR又称逆转录PCR(RT-PCR)，是以mRNA为模板进行的特殊PCR，过程如图。下列相关叙述错误的是(　　)
A．图示过程需要控制温度，否则可能得不
到产物
B．RT-PCR技术中，不需已知mRNA的全部
序列
C．过程③中子链沿着模板链的5′→3′方向延伸
D．RT-PCR技术可应用于是否被RNA病毒感染的检测
C
解析：C　图示过程需要控制温度，如变性解旋时温度需要控制在90 ℃左右，A正确；PCR技术中，不需要已知mRNA的全部序列，只需一段已知mRNA的部分序列即可，B正确；过程③中，在引物作用下，DNA聚合酶从引物3′端开始延伸DNA链，即子链沿着模板链的3′→5′方向延伸，C错误；RT-PCR是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增相结合的技术，可应用于是否被RNA病毒感染的检测，
D正确。
命题点
围绕基因编辑考查科学思维及社会责任
3．(2023·山东青岛二模)CRISPR/Cas9系统由单链的向导RNA(sgRNA)和限制性内切核酸酶Cas9构成，为高效获得特定基因敲除的斑马鱼系，科研人员利用基因编辑技术(原理如图所示)，用化学方法合成特定的sgRNA，与Cas9 mRNA一起注射到斑马鱼细胞，筛选出特定基因敲除的斑马鱼。下列说法正确的是(　　)
A．两种RNA可通过显微注射法导入斑马鱼的肌肉细胞
B．图中sgRNA通过碱基互补配对实现其引导功能
C．Cas9 mRNA能对斑马鱼特定基因位点进行切割
D．基因敲除后的斑马鱼的发育一定会发生异常
B
解析：B　用化学方法合成特定的sgRNA，与Cas9 mRNA一起注射到斑马鱼细胞，两种RNA通过显微注射法导入斑马鱼的受精卵，不是肌肉细胞，A错误；sgRNA通过与DNA的碱基互补配对完成对目标DNA的识别，从而实现Cas9蛋白对DNA分子的定位，引导Cas9蛋白到DNA的特定基因位点进行切割，B正确；Cas9蛋白能对基因位点进行切割，而不是Cas9 mRNA，C错误；如果敲除的基因是无编码作用的基因片段，则不会导致斑马鱼发育异常，D错误。
4．(不定项)(2023·山东济南二模)猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B．Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C．改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
D．通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
解析：ACD　培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，sgRNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；改造后的受体细胞经培养发育到囊胚或桑葚胚时，可将其进行胚胎移植或冷冻保存，C正确；改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，两者是等位基因，D正确。
1．(概念表述类)(1)引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的__________。用于PCR的引物长度通常为______个核苷酸。
(2)引物在DNA复制中的作用是_____________________________________ _____________。
2．(批判性思维类)(1)PCR中的复性一定均为引物与DNA模板结合吗？为什么？_________________________________________________________ ___________________。
短单链核酸
20～30
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接
不一定。复性时，引物与DNA模板的结合是随机的，也存在DNA解开的两条链的结合
脱氧核苷酸
(2)PCR反应的结果都是所需的DNA片段吗？为什么？________________ _____________________________________________________________________________________________________________________。
不都是。因为第一次循环得到的DNA片段只有一种引物，比所需的DNA片段要长，从第三次循环才出现所需的DNA片段，这样的片段存在两种引物
3．(价值应用类)基于CRISPR/Cas9系统强大的精确编辑植物基因组的能力，CRISPR/Cas9基因编辑技术已经成为农业中的一个强有力的工具，科研人员在CRISPR/Cas9的基础上进行改造，开发出了可以精准实现多种碱基替换和大片段插入和删除的基因编辑工具。请写出CRISPR/Cas9及其改造的产品在科学研究中的应用：__________________________________ _____________________________________________________________________________________________________________________________________________ (答出一点即可)。
对基因进行定点突变，抑制有害基因或致病基因的表达；利用基因编辑技术对作物的淀粉含量、香味、营养价值和贮藏品质等品质性状进行改良或精确地去除生产上无用或不理想的性状
3
4
5
6
7
8
9
1
2
(限时：45分钟)
一、单项选择题
1．如图表示改造哺乳动物遗传特性的三种途径，相关叙述错误的是
(　　)
A．上述动物的获得过程中均运用显微注射法
B．动物2含有目的基因的体细胞与其他
体细胞的基因种类不同
C．获得动物3的重组细胞具有全能性
D．获得动物1的受体细胞通常是MⅡ期卵母细胞
课时作业
训练(十五)　基因工程
D
3
4
5
6
7
8
9
1
2
解析：D　获得动物1转基因动物，需将目的基因导入受精卵，因为受精卵的全能性高，D错误。
2
1
3
4
5
6
7
8
9
2．白细胞介素-2(IL-2)参与移植排斥反应，是免疫调节因子，对机体的免疫应答和抗病毒感染等有重要作用。科研人员将含IL-2基因的DNA片段和质粒pPIC9K(部分结构如图所示)构建成重组质粒，并导入酵母菌GS115(组氨酸缺陷菌株)中，筛选到了能分泌IL-2的工程菌株。下列叙述错误的是(　　)
2
1
3
4
5
6
7
8
9
A．组氨酸合成基因可作为标记基因筛选导入重组质粒的酵母菌细胞
B．构建重组质粒时可选用Avr Ⅱ和Not Ⅰ切割目的基因和pPIC9K质粒
C．重组质粒导入酵母菌GS115前，需要先用Ca2＋处理酵母菌GS115细胞
D．抑制IL-2基因的表达可在一定程度上减轻机体器官移植后的免疫排斥反应
2
1
3
4
5
6
7
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解析：B　据图可知，为保证目的基因(Avr Ⅱ会破坏目的基因)和启动子(Sac Ⅰ会破坏启动子)的完整性，可用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ分别切割含有IL-2基因的DNA片段和pPIC9K质粒，B错误。
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3．研究人员通过RNA沉默技术，特异性降低苹果细胞内多酚氧化酶基因的表达水平，使苹果被切开后即使长时间暴露在空气中也不会被氧化褐变。如图是该过程原理的示意图，下列有关叙述不正确的是(　　)
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A．构建基因表达载体需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶和RNA聚合酶
B．可采用农杆菌转化法将目的基因成功导入苹果细胞
C．目的基因与多酚氧化酶
基因的表达序列互补，且同时在同一细胞内表达
D．“RNA沉默”的含义是mRNA不能翻译产生多酚氧化酶
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解析：A　构建基因表达载体需要的工具酶有限制酶、DNA连接酶，不需要RNA聚合酶，A错误。
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4．基因工程中需使用特定的限制酶切割基因载体，以便其与目的基因连接形成基因表达载体。研究人员将相同的基因载体分组并进行相应酶切处理(如表所示)，其中限制酶H1和H2识别序列不同。各组基因载体经酶切处理后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图所示。下列说法错误的是(　　)
分组 相应酶切处理
甲 限制酶H1
乙 限制酶H2
丙 限制酶
H1＋H2
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A．该基因载体最有可能为环状DNA分子
B．限制酶H1与H2在该载体上都有识别和切割位点
C．限制酶H1与H2在该载体上的酶切位点最短相距0.2 kb
D．限制酶作用于该载体时会直接导致氢键和磷酸二酯键的断裂
解析：D　限制酶切割载体时直接破坏的是作用位点上两个脱氧核糖核苷酸之间的磷酸二酯键，D错误。
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5．在某些生化反应中，积累的产物浓度达到一定程度时，产物会与酶结合，从而抑制酶促反应的进行。如图是苏氨酸脱氢酶催化苏氨酸形成异亮氨酸的过程。下列相关叙述错误的是(　　)
A．苏氨酸脱氢酶和苏氨酸中可能都含有氨基和羧基
B．图示存在反馈调节，有助于维持异亮氨酸含量的相对稳定
C．增加苏氨酸含量可以解除异亮氨酸对苏氨酸脱氢酶的抑制
D．可通过蛋白质工程改造苏氨酸
脱氢酶的结构来提高异亮氨酸的产
量
C
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解析：C　据图可知，当异亮氨酸浓度达到一定程度时，会与苏氨酸脱氢酶结合，从而使得苏氨酸不能与苏氨酸脱氢酶结合，则苏氨酸也不能转化为异亮氨酸，即使苏氨酸浓度增大，苏氨酸也不能与苏氨酸脱氢酶结合，所以增加苏氨酸含量不能解除异亮氨酸对苏氨酸脱氢酶的抑制，C错误。
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二、不定项选择题
6．环境DNA(eDNA)是“在环境样品中所有被发现的不同生物的基因组DNA的混合”，它涵盖的范围非常广泛，无论是土壤、空气、液体，甚至是排泄物，都可以从中找到可作为样品的eDNA。对所得的样品，可使用普通的聚合酶链式反应(PCR)或直接霰弹枪法(shotgun strategy)测序，能够方便获得多个DNA序列。下列有关说法不正确的是(　　)
A．可分析环境样品中的eDNA分别是属于哪些物种，这与传统的动植物分类调查是不一致的
B．eDNA技术可寻找环境中是否有单一物种的DNA，用于研究和追踪珍稀物种的分布
C．使用PCR测序，能够方便获得DNA序列
D．每个eDNA中都有一个游离的磷酸基团
AD
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解析：AD　由于DNA分子具有特异性，所以可分析环境样品中的eDNA分别是属于哪些物种，这与传统的动植物分类调查其实是一致的，A错误；环境DNA(eDNA)技术是一种新型生物资源调查手段，是指从环境中提取DNA片段，根据DNA分子的特异性，结合PCR和DNA测序等分子生物学技术来定性或定量检测目标生物，从而确定其分布状况等，B正确；PCR是一项体外扩增DNA的技术，其原理是DNA的复制，故扩增微量的样品eDNA，可获得大量的DNA序列，C正确；DNA分子是双螺旋结构，有两条脱氧核苷酸链，若是链状DNA分子，则每个eDNA中都有两个游离的磷酸基团，若是环状DNA分子，则没有游离的磷酸基团，D错误。
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7．研究人员将雪花莲凝集素(GNA)基因和尾穗苋凝集素(ACA)基因连接成融合基因后再与pBI121质粒载体结合并导入玉米细胞，最终获得了抗蚜虫玉米新品种，部分操作过程如图所示。下列叙述正确的是(　　)
A．过程①和过程②分别需要使用DNA聚合酶和DNA连接酶
B．可将含有重组载体的溶液滴加到玉米受粉后形成的花粉管通道内，获得抗蚜虫玉米新品种
C．在加入了卡那霉素的培
养基上存活下来的玉米细胞
均成功导入了重组载体
D．若用PCR技术检测出玉
米细胞含有融合基因，则该
玉米为抗蚜虫玉米
B
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解析：B　过程①为获得融合基因，过程②为构建基因表达载体，两过程均需要使用DNA连接酶，A错误；将含有重组载体的溶液滴加到玉米受粉后形成的花粉管通道内，重组载体可通过花粉管通道进入卵细胞、合子或早期胚胎细胞中，这是将目的基因导入植物细胞的方法之一，B正确；
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在加入了卡那霉素的培养基上存活下来的玉米细胞，可能是成功导入重组载体的细胞，也可能是导入含有卡那霉素抗性基因的非重组载体的细胞，C错误；用PCR技术检测出玉米细胞含有融合基因，不能说明该玉米为抗蚜虫玉米，因为融合基因可能不能正常表达，D错误。
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三、非选择题
8．党的二十大对保障粮食安全提出了更高要求，马铃薯是我国重要的粮食作物之一。致病疫霉导致的晚疫病及干旱、高低温和盐胁迫等是导致马铃薯减产的重要原因。研究人员为探究StNPR4和StproNPR4基因在马铃薯应对致病疫霉和高盐胁迫中的功能进行了相关实验，基因表达载体构建示意图如图。
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(1)用Sac Ⅱ等限制酶切割含目的基因的DNA片段，与经相同酶切割后的pENTR-L16质粒用________________酶连接，构建重组pENTR-L16。
(2)经________________酶将含目的基因的片段切出并连接到载体pORE04上构建重组pORE04。
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(3)将重组pORE04导入马铃薯细胞常用的方法是____________法，它利用了T-DNA的________________特性，最终使目的基因整合到马铃薯细胞__________________上。经转化后得到5个品系，命名为1、2、3、4和5。如图A表示马铃薯基因相对表达量分析，B表示马铃薯接种致病疫霉后病原菌相对生物量分析，C表示150 mmol·L－1的NaCl处理对马铃薯快繁生根率的影响，**表示组别间差异达到极显著水平。
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①据图A分析，只有转基因品系__________的表达量显著低于野生型(WT)和其余4个转化品系，因此后续试验不再检测此品系。
②据图B和图C分析，与野生型马铃薯比较，转基因马铃薯品系的优势是具有________，致病疫霉相对生物量低；生根率高，______________。
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(4)为研究转基因马铃薯植株的分子机理，研究人员利用TaqMan探针和反转录PCR技术，对转基因马铃薯StproNPR4和StNPR4基因的表达进行检测：
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①StproNPR495基因的两端碱基序列如下：
采用PCR技术获取和扩增StproNPR4基因，需要使用的引物2序列为5′－CTTGGATGAT－3′，则引物1的序列为______(标出5′和3′端，写出前6个碱基即可)。
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②TaqMan探针的结构如图所示，由于探针有________________的片段，导致游离探针上的荧光素会与淬灭剂结合无法发出荧光。
③经检测，转基因马铃薯水杨酸(SA)信号通路相关蛋白基因表达量显著上升，SA是一种植物抗病有关的调节物质。研究人员推测L仪器检测通过激活SA途径提升抗病能力，欲验证这一假设，需要进行的实验是_______________。
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解析：(1)用Sac Ⅱ等限制酶切割含目的基因的DNA片段，与经相同酶切割后的pENTR-L16质粒具有相同的黏性末端，再用DNA连接酶连接，构建重组pENTR-L16。
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(2)分析题图可知，两个质粒都有Sac Ⅱ和Kpn Ⅰ的酶切位点，故经Sac Ⅱ和Kpn Ⅰ酶将含目的基因的片段切出并连接到载体pORE04上构建重组pORE04。
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(3)将重组pORE04导入马铃薯细胞常用的方法是农杆菌转化法，T-DNA是可转移DNA，能够最终使目的基因整合到马铃薯细胞染色体的DNA上。经转化后得到5个品系，命名为1、2、3、4和5。①A表示马铃薯基因相对表达量分析，据图A分析，只有转基因品系5的表达量显著低于野生型(WT)和其余4个转化品系，因此后续试验不再检测此品系。
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②B表示马铃薯接种致病疫霉后病原菌相对生物量分析，C表示150 mmol·L－1的NaCl处理对马铃薯快繁生根率的影响，图中的**表示组别间差异达到极显著水平。据图B和图C分析，与野生型马铃薯比较，转基因马铃薯品系的致病疫霉相对生物量低，说明具有抗病性；而生根率高，故存活能力强。
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(4)引物需要与模板链的3′端互补配对，即—OH端，故根据StproNPR4基因两端碱基序列可知，采用PCR技术获取和扩增StproNPR4基因，需要使用的引物2序列为5′－CTTGGATGAT－3′，则引物1的序列为5′－TCTGTT－3′。
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②依据TaqMan探针的结构图可知，由于探针有碱基互补配对的片段，导致游离探针上的荧光素会与淬灭剂结合无法发出荧光。③分析题意，实验目的为验证L仪器检测通过激活SA途径提升抗病能力，自变量为有无SA途径，故欲验证这一假设，需要进行的实验是敲除SA受体基因或抑制SA信号途径，检测马铃薯的抗病情况。
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答案：(1)DNA连接　(2)Sac Ⅱ和Kpn Ⅰ　(3)农杆菌转化　可转移　染色体的DNA　①5　②抗病性　存活能力强　(4)①5′－TCTGTT－3′　②碱基互补配对　③敲除SA受体基因或抑制SA信号途径，检测马铃薯的抗病情况
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9．人体细胞中的ICF45蛋白与细胞周期调控、肿瘤发生过程有关。为探究ICF45蛋白的相关作用机制，某研究人员进行了如下实验。回答下列问题：
(1)研究人员先通过基因工程技术构建了可表达ICF45蛋白的工程菌大肠杆菌，再通过培养大肠杆菌获得ICF45蛋白。在构建过程中，研究人员从宫颈癌细胞系细胞中提取mRNA，然后以mRNA为模板，在__________酶的作用下合成cDNA。再依据一段__________的核苷酸序列设计引物，进行PCR扩增。PCR技术的一个循环包括的环节是________________。将含有目的基因的表达载体导入大肠杆菌前，一般先用____________处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。
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(2)研究人员将获得的ICF45蛋白注射到若干只健康小鼠体内，一段适宜时间后从小鼠的脾脏中提取出小鼠B淋巴细胞，将其与________________细胞诱导融合。然后经特定的选择性培养基筛选，对筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，最终选择出________________细胞在体外条件下进行大规模培养，这样就可以从培养液中获得大量的ICF45单克隆抗体。
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(3)该研究人员利用获得的ICF45单克隆抗体，通过免疫共沉淀技术进一步筛选出与ICF45蛋白相互作用的蛋白质，实验结果如下表。已知免疫共沉淀技术是在体外进行的研究蛋白质相互作用的一种技术。其原理是抗体A可与蛋白质A特异性结合，因此使用抗体A可将蛋白质A“沉淀”。如果蛋白质B与蛋白质A相互结合形成复合体，那么抗体A在将蛋白质A“沉淀”的同时，也会把蛋白质B“沉淀”下来。
各蛋白质提取结果 ICF45单克隆抗体免疫共沉淀结果
ICF45 是 ＋
HSPA9 是 ＋
Annexin—A2 是 ＋
Myosin9 是 ＋
COMT 是 －
注：“＋”表示出现“沉淀”条带；“－”表示未出现“沉淀”条带。
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实验过程中，研究人员对健康人体细胞蛋白提取物中5种蛋白质进行检测，目的是________________________________。请结合实验原理及表中结果推测，________________________最可能是与ICF45蛋白相互作用的蛋白质。
解析：(1)研究人员从宫颈癌细胞系细胞中提取mRNA，然后以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA。再依据一段ICF45基因的核苷酸序列设计引物，进行PCR扩增。PCR技术的一个循环包括的环节是变性、复性、延伸。一般先用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，然后再将含有目的基因的表达载体导入其中。
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(2)制备单克隆抗体时需将小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合。然后经特定的选择培养基筛选，对筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，最终选择出抗体检测呈阳性的杂交瘤(能产生抗ICF45蛋白抗体的杂交瘤)细胞在体外条件下进行大规模培养，这样就可以从培养液中获得大量的ICF45单克隆抗体。(3)实验过程中，研究人员对人体细胞蛋白提取物中5种蛋白质进行检测，目的是保证人细胞提取物中存在待检测的蛋白质，如果待测蛋白质不存在，那么免疫共沉淀结果就没有意义。结合免疫共沉淀技术的原理及表中结果可知，HSPA9、Annexin—A2、Myosin9最可能是与ICF45蛋白相互作用的蛋白质。
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答案：(1)逆转录　ICF45基因　变性、复性、延伸　Ca2＋　(2)骨髓瘤　抗体检测呈阳性的杂交瘤(能产生抗ICF45蛋白抗体的杂交瘤)　(3)保证人细胞提取物中存在待检测的蛋白质　HSPA9、Annexin—A2、Myosin9