【备考2027】第二十四章 基因工程--通用版高考生物学第一轮章节练（含答案）
文档属性
| 名称 | 【备考2027】第二十四章 基因工程--通用版高考生物学第一轮章节练（含答案） |
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| 格式 | docx | ||
| 文件大小 | 1.6MB | ||
| 资源类型 | 试卷 | ||
| 版本资源 | 通用版 | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2026-02-22 00:00:00 | ||
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文档简介
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2027通用版高考生物学第一轮
第二十四章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取
五年高考
1.★★(2024安徽,14,3分)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
2.★★★(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
3.★★★(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
4.★★★[2022福建,21节选]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'—OH与加入的脱氧核苷酸的5'—P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是 (填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是 。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
三年模拟
5.★★(2026届广西名校联盟联考)某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验。操作流程如下:①组织捣碎后加入研磨液充分研磨;②过滤取滤液,置于4 ℃冰箱静置分层;③取上清液加入等体积预冷的95%酒精;④离心后收集沉淀物;⑤取部分沉淀加NaCl溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是( )
A.步骤③中因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质可溶,所以冷酒精可使DNA快速析出
B.步骤⑤鉴定时,直接取④离心收集的沉淀物与二苯胺混合,室温下放置观察颜色变化
C.若利用提取物进行PCR后,进行琼脂糖凝胶电泳,迁移距离越大的DNA片段相对分子质量越大
D.步骤②静置后DNA主要存在于沉淀中,需用高浓度NaCl溶液重新溶解
6.★★(2025届河北衡水三模)下列关于基因工程工具酶的叙述,正确的是( )
A.大多限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
B.限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键
C.DNA聚合酶和DNA连接酶都是构建重组DNA的关键酶
D.T4 DNA连接酶只能连接黏性末端,不能连接平末端
7.★★(2025届广东惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点,下列叙述错误的是( )
A.BamHⅠ和BsrGⅠ切割位点不同,但形成的黏性末端是相同的
B.与EcoRⅠ相比,HhaⅠ识别序列较短,该序列在DNA中出现的概率高
C.BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接
D.图中限制酶识别序列旋转180°后与旋转前重合
8.★★★(2025届重庆一中月考)一般情况下,限制酶的识别序列越长,在DNA中出现的概率越低,切割频率越小。限制酶K的识别序列为5'-A↓ATATT-3',限制酶L识别序列为5'-GC↓GC-3'。下列叙述正确的是( )
A.若DNA中碱基随机分布,限制酶L的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K的16倍
B.限制酶K的识别序列更长,故其在不同DNA分子中的切割频率都低于限制酶L
C.限制酶K的识别序列富含A—T碱基对,表明其切割活性依赖于DNA双链的局部解旋能力
D.限制酶K和L切割DNA后产生的片段可被T4 DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段
9.★★(2026届黑龙江哈尔滨六中开学考)用重组DNA技术可以赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有 和T4 DNA连接酶,图中 酶切割后的DNA片段用T4 DNA连接酶比另一类DNA连接酶连接效率更高。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与载体片段之间形成的化学键是 。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中 ;质粒DNA分子上有一至多个 ,供外源DNA片段插入其中;质粒DNA分子上常有特殊的 基因(如某种抗生素抗性基因),便于重组DNA分子的筛选。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段,是 识别和结合的部位,能驱动 过程。
第2节 PCR和电泳
五年高考
1.★(2025广东,7,2分)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的( )
A.1'-碱基 B.2'-氢 C.3'-羟基 D.5'-磷酸基团
2.★★(2024黑吉辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是 ( )
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
3.★★(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
4.★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
5.★★★(2025全国,6,6分)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是( )
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
6.★★★(2025全国,34,12分)为在大肠杆菌中表达酶X,某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0,构建重组质粒PX,并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示,→表示引物5'→3'方向)。回答下列问题:
(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ,而PCR过程中解开双链的方法是 。
(2)PCR过程中,因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
(3)该同学进行PCR实验时,所用模板与引物见表。实验中①和④的作用是 ;
②无扩增产物,原因是 ;③、⑤和⑥有扩增产物,扩增出的DNA产物分别是 。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 PX 无 P0 PX
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性,简要写出实验思路和预期结果 。
三年模拟
7.★★(2026届四川成都七中月考)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确的是( )
A.PCR扩增过程中双链DNA解旋是通过加热实现的
B.用于PCR扩增的Taq DNA聚合酶是一种耐高温的逆转录酶
C.PCR反应体系中需加入适量ATP溶液来驱动子链延伸
D.扩增循环按顺序一般分复性→变性→延伸三步
8.★★(2026届广东部分学校联考)进行PCR时,若设计的引物过短,则会出现对应不良情况。下列不属于对应不良情况的是( )
A.引物与特异性位点结合的正确率降低
B.PCR后出现多条非特异性子链
C.引物与模板链结合的稳定性增强
D.引物之间发生配对的概率增大
9.★★★(2026届湖北华大新高考联盟质量测评)研究者分别选取小麦感病品系和抗病品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR扩增,泳道1、2分别对应染色体1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,图2为感病基因序列示意图。下列分析错误的是( )
A.在PCR扩增时,所用引物越短,引物特异性越低
B.两个PCR产物相对分子质量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变大
C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变
D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果
10.★★★(2026届湖南部分学校联考,改编)果荚开裂并释放种子,是植物繁衍后代的重要途径。拟南芥是自花传粉植物,研究者对拟南芥果荚开裂机理进行了系列研究。
研究者通过筛选拟南芥外源DNA片段插入突变体库,获得果荚不开裂的突变体甲。检测发现突变体甲的M酶活性丧失,推测编码M酶的M基因由于插入X片段,突变为m基因。研究者利用不同的引物对,分别进行PCR,检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型,结果如图1,验证了上述推测。在图2中已标出引物3的位置,选出引物1、2的位置,引物1为 ,引物2为 (从A→E中选)。
微专题 PCR引物设计、选择及应用
五年高考
1.★★★(2025湖南,21,13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题:
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是 (答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有 (答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
2.★★★(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
图2
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
三年模拟
3.★★★(2026届湖北荆州开学考)增强子是可促进基因转录的一小段特殊DNA序列,现用PCR扩增增强子和Bt基因,然后重叠延伸使两片段融合,以实现对Bt基因表达的调控,如图所示。下列叙述正确的是( )
A.增强子中含多个起始密码子以促进基因转录
B.引物B、C的序列需一致以促进两片段融合
C.DNA单链B、C混合后才能延伸出融合片段
D.为获得大量融合片段可用引物A、D扩增融合片段
4.★★★(2025届山西太原二模)反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术,需要先将目标DNA进行环化,再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点,部分过程如图所示,相关叙述正确的是( )
A.过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3
B.过程③中复性是在72 ℃左右使两种引物与模板链结合
C.过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
D.PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列
5.★★★(2026届辽宁七校协作体期初)雌激素类物质污染会通过食物链影响人体健康和生态安全。科研人员欲将斑马鱼的vtg基因(图1)插入Luc基因载体(图2),形成vtg-Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。Luc表示萤火虫荧光素酶基因。(注:Luc基因缺乏启动子序列,vtg基因内部无图2中的任何限制酶识别序列。TetR为四环素抗性基因,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ、BclⅠ为限制酶,→表示转录方向)
(1)基因工程的核心步骤是 。为使vtg基因与Luc基因载体正向连接且降低“空载”概率,可选用限制酶 双酶切Luc基因载体。
(2)通过PCR获取vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息,推测引物1包含的碱基序列为 。
A.5'-GAATTCAACTAT-3'
B.5'-GAATTCTTGATA-3'
C.5'-GATCTTGATA-3'
D.5'-AAGCTTAACTAT-3'
(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养, (选填“能”或“不能”)在含有氨苄青霉素的培养基中生长但 (选填“能”或“不能”)在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
(4)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子,E蛋白与启动子结合后,启动转录过程还需要的酶是 。Luc基因的表达产物萤火虫荧光素酶,可以催化荧光素氧化产生荧光。斑马鱼的vtg基因在正常情况下不表达,当水体中有雌激素存在时,斑马鱼vtg基因的启动子被激活,表达vtg-Luc融合蛋白。在水样中添加荧光素后,Luc催化其产生荧光,荧光越 ,说明水体中 污染越严重。
6.★★★★(2025届江西学业水平选择性考试九)荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,其灵敏度高、特异性好,是目前检测微小残留病变的常用方法。请回答下列有关问题:
(1)TaqMan探针是qPCR中一种常用的探针,其5'端连接荧光基团(F),3'端连接荧光基团(Q),当探针完整时,两个基团距离很近,两个荧光基团相互发生淬灭而不能检测到荧光。在qPCR过程中,当Taq DNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,F和Q两个基团分离,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。具体过程如图1所示。
①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、Taq DNA聚合酶、 和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历 、 、延伸三个阶段,其中延伸阶段是从引物 (填“3'”或“5'”)端开始的。
②在qPCR过程中,Taq DNA聚合酶的两个作用是 。
③在qPCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,保证复性时探针先于引物与模板DNA结合,原因是 。
(2)随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度 (填“增强”或“减弱”)。通过实时检测荧光信号强度,可得Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环次数),该值与待测样本中目的基因的个数呈 (填“正相关”或“负相关”)。
(3)qPCR可用于肿瘤基因的检测,其不但能灵敏地检测到少量突变基因,尽早确诊癌症,还可以准确检测到肿瘤基因的表达量。图2表示三位疑似肿瘤患者中肿瘤基因的检测结果,从Ct值的角度进行分析,患者 (填“A”“B”或“C”)出现肿瘤的概率更大,原因是 。
第3节 基因工程和蛋白质工程
考法1 限制酶的选择:T5、T6、T8、T9、T10
考法2 转基因“受体细胞”的筛选:T2、T3、T4、T6、T8、T9、T10
五年高考
1.★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
2.★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
3.★★★(2025甘肃,21,11分)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起,严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术,对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”,编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如图)。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后,可通过 (方法)将该质粒转入植物细胞,并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞,需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ,对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素,原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功,首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑;然后,在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过比较 来验证抗病性。
(4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
4.★★★(新思维·重组菌的目的基因产物杀菌活性丧失的原因分析)(2025四川,19,11分)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'→3'方向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带 (填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致 ,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有 (答出1点即可)。
5.★★★★(新考法· 在载体中逐个插入3个基因的分析)(2025河北,22节选)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。
回答下列问题:
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加 (填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成 键。
6.★★★★(2025黑吉辽蒙,25,11分)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用 连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 (从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有 。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
三年模拟
7.★★(2026届湖北宜昌开学考)利用蛋白质工程对干扰素进行改造,可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是( )
A.天然蛋白质合成的过程按照中心法则进行,蛋白质工程与之相反
B.利用蛋白质工程对干扰素进行改造时,操作对象是干扰素
C.经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传
D.对干扰素的改造遇到的难题之一是干扰素的高级结构十分复杂
8.★★(2026届湖南部分学校联考)科学家设想将HIV的壳体蛋白(CA)基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内,利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗,以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如图所示。回答下列问题:
(1)①是 过程,进行①过程操作的目的是 。
(2)选用Ti质粒作为HIV的CA基因的载体,原因是 。
(3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制酶是 ,不选用其他两种限制酶的原因是 。
(4)为了筛选出含重组载体的农杆菌,在选择培养基上添加氨苄青霉素,一段时间后,培养基上形成的菌落 (填“一定”或“不一定”)含有重组载体,原因是 。
9.★★★(2026届河北示范高中联考)如图是构建转基因大肠杆菌生产胰岛素所用的质粒和目的基因的结构。β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在的情况下,使菌落呈现蓝色,否则菌落呈现白色。请结合图示完善下列操作步骤:
(1)目的基因的筛选与获取:可以从 (填“胰岛A细胞”或“胰岛B细胞”)中提取mRNA,逆转录获取cDNA,原因是 。
(2)基因表达载体的构建:为使目的基因与载体正确连接,最好选用限制酶 切割质粒。为保证目的基因能和质粒连接,扩增目的基因时需在引物的 端添加相应序列,左侧引物上连接的序列是
。
(3)将目的基因导入受体细胞:将重组DNA导入大肠杆菌细胞之前,需要用 处理大肠杆菌。有人提出,将受体细胞改为酵母菌更合适,从细胞结构的角度分析,原因 。
(4)目的基因的检测与鉴定:将目的基因导入受体细胞后,用选择培养基进行筛选,培养基中除大肠杆菌必需的营养物质外,还应加入 。后续还需要进行分子水平的检测和个体水平的鉴定,其中检测目的基因是否完成表达的方法是 。
(5)从基因改造角度分析,利用转基因技术生产胰岛素相比传统提取方法有哪些优点: 。
10.★★★(2026届四川部分学校联考)科学家利用基因工程技术将抗虫基因导入棉花细胞,从而获得抗虫棉。该技术涉及的质粒上含氨苄青霉素抗性基因和多个限制酶切割位点,其结构如图1所示。抗虫基因上的限制酶切割位点如图2所示,部分限制酶和其识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列及切割位点
BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3'
XhoⅠ 5'-C↓TCGAG-3'
SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3'
SmaⅠ 5'-CCC↓GGG-3'
(1)质粒通常作为载体,图1上还缺少的结构是 。某同学准备使用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割抗虫基因,与仅用SalⅠ切割抗虫基因相比,其优势是 。
(2)下一步切割质粒时,应选择限制酶 ,理由是 。
(3)将重组质粒导入农杆菌后,需在培养基中添加 以筛选成功转化的农杆菌。通过农杆菌转化法将抗虫基因导入棉花细胞,依据的原理是 。
(4)若已成功导入抗虫基因的植株仍会被害虫啃食,下一步需要进行的研究方向是
。
微专题 基因编辑技术
五年高考
1.★★★★(2024广西,21,14分)M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠,主要制备流程如图所示,实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列,同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因(M-GFP)的表达,恢复小鼠自身被敲除的M基因功能,同时便于示踪。回答下列问题:
注:基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条,即可表示为Aa;两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。
(1)在PCR扩增片段①和②时,通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列,该序列添加的位置位于引物 (选填“3'端”或“5'端”)。在构建载体1时,为了阻断A基因的表达,从转录水平考虑,连接的片段可以是 ;而从翻译水平考虑,连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功,需要限制酶切割载体后,再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液,其目的是
(至少答2方面)。
(3)为了快速高效繁育出含有4对基因(遵循自由组合定律)的实验模型小鼠,应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交,杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M基因的表达可控,在实验模型小鼠喂食时,可添加竞争性结合A蛋白的四环素,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,目的是 。
2.★★★★(2023天津,17,12分)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一,为此设计表达载体,思路如下。
(1)外源基因的选择:纤维素常见生物降解途径如下。
纤维素寡糖纤维二糖葡萄糖
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖,应向酿酒酵母转入图中三种酶的基因,并使其表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法:同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为
(从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择:URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作标记基因。另外,URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以图中方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后,需要将菌株1在 的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
(4)表达载体的构建:综上,为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中,在构建表达载体时,A、B、C、C'、URA3和酶基因应采用图 的排布方式。
三年模拟
3.★★★★(2025届河北衡水中学三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞,包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,技术原理如图甲所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列和切割位点
BglⅡ 5'-A↓GATCT-3'
NheⅠ 5'-G↓CTAGC-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3'
HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3'
某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-Cas9-sgRNA质粒等为材料,进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源黏着斑蛋白(VCL)基因,以研究该基因在细胞中的作用,为乳腺癌的治疗提供理论支持。
(1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙,故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。
(2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙,需要通过 扩增,为了确保酶切后能正确连接到质粒上(相应酶切序列如图乙),需在引物1的5'端加上碱基序列 ,引物2的5'端加上碱基序列 。
(3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含sgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒(空质粒)分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 (填抗生素)筛选成功导入目的基因的细胞。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。
(4)检测与鉴定。获得稳转细胞系,培养3 d后收集细胞全部蛋白检测VCL,结果如图丁,显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。
(5)该技术还可用于通过同源重组修复插入外源目的基因。正确的操作是:导入基因编辑工具表达载体的同时,导入外源目的基因,且在目的基因两端加上与 相同的序列。
4.★★★★(2025届江西部分学校模拟)CRISPR/Cas9系统的gRNA能与目标DNA序列互补,指导Cas9酶精确地定位到基因的特定位置并切割DNA。同源重组是利用具有相同或高度相似序列的DNA分子之间的自然重组机制,将外源基因或DNA片段精确地插入、删除或替换到宿主细胞基因组的特定位置。乙肝e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒源性免疫抑制因子。构建能在肝脏中特异性稳定表达HBeAg的转基因动物对于深入研究HBeAg的作用机制具有重要意义。研究人员克隆乙型肝炎病毒的HBeAg基因,采用CRISPR/Cas9和同源重组技术在Rosa26基因位点定点插入HBeAg,构建转HBeAg基因小鼠,并开展相关研究。构建过程如图1所示(注:虚线交叉部分的序列为同源序列,P1~P4表示特异性扩增基因片段的引物)。回答下列问题:
(1)为获得足够多的小鼠受精卵作为受体细胞,可对雌性小鼠注射 后获得卵细胞。体外受精技术主要包括 等步骤。
(2)可采用 技术将Cas9基因的mRNA、gRNA和重组载体转入小鼠的受精卵中。本实验的gRNA具备的特点是 。Cas9基因的mRNA的作用是
。
(3)成功转基因受精卵发育而成的F0小鼠(小鼠1和小鼠2)的DNA用P1和P2引物、P3和P4引物进行PCR扩增后经电泳得到图2的片段。将F0与野生型小鼠杂交,F1的转基因阳性小鼠相互杂交培育转HBeAg基因纯合子小鼠。在F2得到的14只小鼠中,经P3和P4引物检测结果如图3。则含有HBeAg基因的小鼠是 。请利用PCR技术为选出转HBeAg基因纯合子小鼠,实验的方法和预期结果是 。
第二十四章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取
五年高考
1.★★(2024安徽,14,3分)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
答案 D
2.★★★(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案 B
3.★★★(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
答案 B
4.★★★[2022福建,21节选]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'—OH与加入的脱氧核苷酸的5'—P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是 (填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是 。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
答案 (1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列);而反向连接的重组DNA会形成新的序列,没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)
三年模拟
5.★★(2026届广西名校联盟联考)某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验。操作流程如下:①组织捣碎后加入研磨液充分研磨;②过滤取滤液,置于4 ℃冰箱静置分层;③取上清液加入等体积预冷的95%酒精;④离心后收集沉淀物;⑤取部分沉淀加NaCl溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是( )
A.步骤③中因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质可溶,所以冷酒精可使DNA快速析出
B.步骤⑤鉴定时,直接取④离心收集的沉淀物与二苯胺混合,室温下放置观察颜色变化
C.若利用提取物进行PCR后,进行琼脂糖凝胶电泳,迁移距离越大的DNA片段相对分子质量越大
D.步骤②静置后DNA主要存在于沉淀中,需用高浓度NaCl溶液重新溶解
答案 A
6.★★(2025届河北衡水三模)下列关于基因工程工具酶的叙述,正确的是( )
A.大多限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
B.限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键
C.DNA聚合酶和DNA连接酶都是构建重组DNA的关键酶
D.T4 DNA连接酶只能连接黏性末端,不能连接平末端
答案 A
7.★★(2025届广东惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点,下列叙述错误的是( )
A.BamHⅠ和BsrGⅠ切割位点不同,但形成的黏性末端是相同的
B.与EcoRⅠ相比,HhaⅠ识别序列较短,该序列在DNA中出现的概率高
C.BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接
D.图中限制酶识别序列旋转180°后与旋转前重合
答案 A
8.★★★(2025届重庆一中月考)一般情况下,限制酶的识别序列越长,在DNA中出现的概率越低,切割频率越小。限制酶K的识别序列为5'-A↓ATATT-3',限制酶L识别序列为5'-GC↓GC-3'。下列叙述正确的是( )
A.若DNA中碱基随机分布,限制酶L的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K的16倍
B.限制酶K的识别序列更长,故其在不同DNA分子中的切割频率都低于限制酶L
C.限制酶K的识别序列富含A—T碱基对,表明其切割活性依赖于DNA双链的局部解旋能力
D.限制酶K和L切割DNA后产生的片段可被T4 DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段
答案 A
9.★★(2026届黑龙江哈尔滨六中开学考)用重组DNA技术可以赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有 和T4 DNA连接酶,图中 酶切割后的DNA片段用T4 DNA连接酶比另一类DNA连接酶连接效率更高。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与载体片段之间形成的化学键是 。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中 ;质粒DNA分子上有一至多个 ,供外源DNA片段插入其中;质粒DNA分子上常有特殊的 基因(如某种抗生素抗性基因),便于重组DNA分子的筛选。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段,是 识别和结合的部位,能驱动 过程。
答案 (1)E.coli DNA连接酶 SmaⅠ和EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)复制 限制酶的切割位点 标记 (4)RNA聚合酶 转录
第2节 PCR和电泳
五年高考
1.★(2025广东,7,2分)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的( )
A.1'-碱基 B.2'-氢 C.3'-羟基 D.5'-磷酸基团
答案 C
2.★★(2024黑吉辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是 ( )
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案 A
3.★★(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案 C
4.★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B
5.★★★(2025全国,6,6分)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是( )
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
答案 D
6.★★★(2025全国,34,12分)为在大肠杆菌中表达酶X,某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0,构建重组质粒PX,并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示,→表示引物5'→3'方向)。回答下列问题:
(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ,而PCR过程中解开双链的方法是 。
(2)PCR过程中,因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
(3)该同学进行PCR实验时,所用模板与引物见表。实验中①和④的作用是 ;
②无扩增产物,原因是 ;③、⑤和⑥有扩增产物,扩增出的DNA产物分别是 。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 PX 无 P0 PX
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性,简要写出实验思路和预期结果 。
答案 (1)解旋酶 高温变性 (2)引物、脱氧核苷三磷酸 (3)作为对照(或答:鉴定反应体系是否有模板污染) P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 (4)提取酶X,催化相应底物(反应物)的反应,检测是否有产物生成。若有产物生成,则证明酶X有活性
三年模拟
7.★★(2026届四川成都七中月考)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确的是( )
A.PCR扩增过程中双链DNA解旋是通过加热实现的
B.用于PCR扩增的Taq DNA聚合酶是一种耐高温的逆转录酶
C.PCR反应体系中需加入适量ATP溶液来驱动子链延伸
D.扩增循环按顺序一般分复性→变性→延伸三步
答案 A
8.★★(2026届广东部分学校联考)进行PCR时,若设计的引物过短,则会出现对应不良情况。下列不属于对应不良情况的是( )
A.引物与特异性位点结合的正确率降低
B.PCR后出现多条非特异性子链
C.引物与模板链结合的稳定性增强
D.引物之间发生配对的概率增大
答案 C
9.★★★(2026届湖北华大新高考联盟质量测评)研究者分别选取小麦感病品系和抗病品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR扩增,泳道1、2分别对应染色体1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,图2为感病基因序列示意图。下列分析错误的是( )
A.在PCR扩增时,所用引物越短,引物特异性越低
B.两个PCR产物相对分子质量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变大
C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变
D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果
答案 D
10.★★★(2026届湖南部分学校联考,改编)果荚开裂并释放种子,是植物繁衍后代的重要途径。拟南芥是自花传粉植物,研究者对拟南芥果荚开裂机理进行了系列研究。
研究者通过筛选拟南芥外源DNA片段插入突变体库,获得果荚不开裂的突变体甲。检测发现突变体甲的M酶活性丧失,推测编码M酶的M基因由于插入X片段,突变为m基因。研究者利用不同的引物对,分别进行PCR,检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型,结果如图1,验证了上述推测。在图2中已标出引物3的位置,选出引物1、2的位置,引物1为 ,引物2为 (从A→E中选)。
答案 B D
微专题 PCR引物设计、选择及应用
五年高考
1.★★★(2025湖南,21,13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题:
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是 (答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有 (答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
答案 (1)①终止子(或复制原点) P1和P3 782 ②基因A未表达(基因A突变/修饰等);蛋白A在大肠杆菌细胞内合成,缺失分泌到细胞外的信号,不能分泌到细胞外 (2)PEG融合法(或电融合法/灭活病毒诱导法) 抗体检测
2.★★★(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
图2
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
答案 (1)模板和引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度,不能呈现碱基序列
三年模拟
3.★★★(2026届湖北荆州开学考)增强子是可促进基因转录的一小段特殊DNA序列,现用PCR扩增增强子和Bt基因,然后重叠延伸使两片段融合,以实现对Bt基因表达的调控,如图所示。下列叙述正确的是( )
A.增强子中含多个起始密码子以促进基因转录
B.引物B、C的序列需一致以促进两片段融合
C.DNA单链B、C混合后才能延伸出融合片段
D.为获得大量融合片段可用引物A、D扩增融合片段
答案 D
4.★★★(2025届山西太原二模)反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术,需要先将目标DNA进行环化,再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点,部分过程如图所示,相关叙述正确的是( )
A.过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3
B.过程③中复性是在72 ℃左右使两种引物与模板链结合
C.过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
D.PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列
答案 C
5.★★★(2026届辽宁七校协作体期初)雌激素类物质污染会通过食物链影响人体健康和生态安全。科研人员欲将斑马鱼的vtg基因(图1)插入Luc基因载体(图2),形成vtg-Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。Luc表示萤火虫荧光素酶基因。(注:Luc基因缺乏启动子序列,vtg基因内部无图2中的任何限制酶识别序列。TetR为四环素抗性基因,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ、BclⅠ为限制酶,→表示转录方向)
(1)基因工程的核心步骤是 。为使vtg基因与Luc基因载体正向连接且降低“空载”概率,可选用限制酶 双酶切Luc基因载体。
(2)通过PCR获取vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息,推测引物1包含的碱基序列为 。
A.5'-GAATTCAACTAT-3'
B.5'-GAATTCTTGATA-3'
C.5'-GATCTTGATA-3'
D.5'-AAGCTTAACTAT-3'
(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养, (选填“能”或“不能”)在含有氨苄青霉素的培养基中生长但 (选填“能”或“不能”)在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
(4)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子,E蛋白与启动子结合后,启动转录过程还需要的酶是 。Luc基因的表达产物萤火虫荧光素酶,可以催化荧光素氧化产生荧光。斑马鱼的vtg基因在正常情况下不表达,当水体中有雌激素存在时,斑马鱼vtg基因的启动子被激活,表达vtg-Luc融合蛋白。在水样中添加荧光素后,Luc催化其产生荧光,荧光越 ,说明水体中 污染越严重。
答案 (1)构建基因表达载体 EcoRⅠ、HindⅢ (2)A (3)能 不能 (4)RNA聚合酶 强 雌激素(类物质)
6.★★★★(2025届江西学业水平选择性考试九)荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,其灵敏度高、特异性好,是目前检测微小残留病变的常用方法。请回答下列有关问题:
(1)TaqMan探针是qPCR中一种常用的探针,其5'端连接荧光基团(F),3'端连接荧光基团(Q),当探针完整时,两个基团距离很近,两个荧光基团相互发生淬灭而不能检测到荧光。在qPCR过程中,当Taq DNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,F和Q两个基团分离,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。具体过程如图1所示。
①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、Taq DNA聚合酶、 和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历 、 、延伸三个阶段,其中延伸阶段是从引物 (填“3'”或“5'”)端开始的。
②在qPCR过程中,Taq DNA聚合酶的两个作用是 。
③在qPCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,保证复性时探针先于引物与模板DNA结合,原因是 。
(2)随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度 (填“增强”或“减弱”)。通过实时检测荧光信号强度,可得Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环次数),该值与待测样本中目的基因的个数呈 (填“正相关”或“负相关”)。
(3)qPCR可用于肿瘤基因的检测,其不但能灵敏地检测到少量突变基因,尽早确诊癌症,还可以准确检测到肿瘤基因的表达量。图2表示三位疑似肿瘤患者中肿瘤基因的检测结果,从Ct值的角度进行分析,患者 (填“A”“B”或“C”)出现肿瘤的概率更大,原因是 。
答案 (1)①引物 变性 复性 3' ②Taq DNA聚合酶能够催化游离脱氧核苷酸连接到核苷酸链上,能水解Taqman探针 ③可确保在随后的延伸阶段,当Taq DNA聚合酶从引物开始合成新链时,就能顺利遇到并水解已结合在模板上的探针,使其发出荧光信号 (2)增强 负相关 (3)A 由于患者A达到荧光阈值时的循环次数比较少,因此其起始模板的肿瘤基因较多
第3节 基因工程和蛋白质工程
考法1 限制酶的选择:T5、T6、T8、T9、T10
考法2 转基因“受体细胞”的筛选:T2、T3、T4、T6、T8、T9、T10
五年高考
1.★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案 B
2.★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D
3.★★★(2025甘肃,21,11分)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起,严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术,对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”,编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如图)。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后,可通过 (方法)将该质粒转入植物细胞,并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞,需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ,对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素,原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功,首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑;然后,在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过比较 来验证抗病性。
(4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
答案 (1)农杆菌转化法 Ti质粒上的T-DNA 潮霉素 (2)外植体 次氯酸钠 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 (3)DNA测序(或PCR) 病斑的大小(或病斑面积、发病情况等合理答案) (4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后,白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻
4.★★★(新思维·重组菌的目的基因产物杀菌活性丧失的原因分析)(2025四川,19,11分)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'→3'方向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带 (填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致 ,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有 (答出1点即可)。
答案 (1)F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中正常复制 (2)2 验证重组质粒是否构建成功 (3)苯丙氨酸 翻译受阻
(4)目的基因发生突变(或变异) 发酵条件优化(或产物的分离和纯化方法等)
5.★★★★(新考法· 在载体中逐个插入3个基因的分析)(2025河北,22节选)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。
回答下列问题:
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加 (填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成 键。
答案 (1)引物 脱氧核苷酸(前两空顺序可颠倒) 复性(或“退火”) PCR时不耐高温的DNA聚合酶会失活(或“PCR过程在高温下进行”) (2)SmaⅠ、EcoRⅠ 磷酸二酯
6.★★★★(2025黑吉辽蒙,25,11分)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用 连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 (从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有 。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
答案 (1)序列数据库(如GenBank) XhoⅠ XbaⅠ DNA连接酶/T4 DNA连接酶/E.coli DNA连接酶 (2)外源DNA/外源基因N 1 质粒pYL大小为7.2 kb,重组质粒大小约为9.5 kb,可推断插入的基因N约有2.3 kb(2 300个碱基对),与DNA电泳图中1号样品大小接近,因此判断该组基因N导入成功 (3)GCC (4)香树脂醇
三年模拟
7.★★(2026届湖北宜昌开学考)利用蛋白质工程对干扰素进行改造,可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是( )
A.天然蛋白质合成的过程按照中心法则进行,蛋白质工程与之相反
B.利用蛋白质工程对干扰素进行改造时,操作对象是干扰素
C.经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传
D.对干扰素的改造遇到的难题之一是干扰素的高级结构十分复杂
答案 B
8.★★(2026届湖南部分学校联考)科学家设想将HIV的壳体蛋白(CA)基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内,利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗,以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如图所示。回答下列问题:
(1)①是 过程,进行①过程操作的目的是 。
(2)选用Ti质粒作为HIV的CA基因的载体,原因是 。
(3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制酶是 ,不选用其他两种限制酶的原因是 。
(4)为了筛选出含重组载体的农杆菌,在选择培养基上添加氨苄青霉素,一段时间后,培养基上形成的菌落 (填“一定”或“不一定”)含有重组载体,原因是 。
答案 (1)逆转录 将单链RNA逆转录为双链DNA,获得CA基因的DNA片段以便与Ti质粒连接成重组载体 (2)Ti质粒的T-DNA能将目的基因转移并整合到被侵染植物细胞的染色体DNA上 (3)PatⅠ和BamHⅠ EcoRⅠ会破坏目的基因,NotⅠ的切割位点不在T-DNA中 (4)不一定 (未导入目的基因的)Ti质粒和重组载体均含有氨苄青霉素抗性基因
9.★★★(2026届河北示范高中联考)如图是构建转基因大肠杆菌生产胰岛素所用的质粒和目的基因的结构。β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在的情况下,使菌落呈现蓝色,否则菌落呈现白色。请结合图示完善下列操作步骤:
(1)目的基因的筛选与获取:可以从 (填“胰岛A细胞”或“胰岛B细胞”)中提取mRNA,逆转录获取cDNA,原因是 。
(2)基因表达载体的构建:为使目的基因与载体正确连接,最好选用限制酶 切割质粒。为保证目的基因能和质粒连接,扩增目的基因时需在引物的 端添加相应序列,左侧引物上连接的序列是
。
(3)将目的基因导入受体细胞:将重组DNA导入大肠杆菌细胞之前,需要用 处理大肠杆菌。有人提出,将受体细胞改为酵母菌更合适,从细胞结构的角度分析,原因 。
(4)目的基因的检测与鉴定:将目的基因导入受体细胞后,用选择培养基进行筛选,培养基中除大肠杆菌必需的营养物质外,还应加入 。后续还需要进行分子水平的检测和个体水平的鉴定,其中检测目的基因是否完成表达的方法是 。
(5)从基因改造角度分析,利用转基因技术生产胰岛素相比传统提取方法有哪些优点: 。
答案 (1)胰岛B细胞 因为基因的选择性表达,只有胰岛B细胞中的胰岛素基因才会转录出mRNA (2)XhoⅠ和MunⅠ 5' 5'-CTCGAG-3' (3)Ca2+ 酵母菌为真核生物,有内质网和高尔基体,可以对合成的多肽进行加工处理,合成成熟的胰岛素 (4)X-gal、IPTG、氨苄青霉素 抗原—抗体杂交 (5)能大规模培养,持续、高效地生产胰岛素;可降低生产成本;能保证胰岛素的纯度和质量
10.★★★(2026届四川部分学校联考)科学家利用基因工程技术将抗虫基因导入棉花细胞,从而获得抗虫棉。该技术涉及的质粒上含氨苄青霉素抗性基因和多个限制酶切割位点,其结构如图1所示。抗虫基因上的限制酶切割位点如图2所示,部分限制酶和其识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列及切割位点
BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3'
XhoⅠ 5'-C↓TCGAG-3'
SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3'
SmaⅠ 5'-CCC↓GGG-3'
(1)质粒通常作为载体,图1上还缺少的结构是 。某同学准备使用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割抗虫基因,与仅用SalⅠ切割抗虫基因相比,其优势是 。
(2)下一步切割质粒时,应选择限制酶 ,理由是 。
(3)将重组质粒导入农杆菌后,需在培养基中添加 以筛选成功转化的农杆菌。通过农杆菌转化法将抗虫基因导入棉花细胞,依据的原理是 。
(4)若已成功导入抗虫基因的植株仍会被害虫啃食,下一步需要进行的研究方向是
。
答案 (1)复制原点、终止子 可防止抗虫基因自身环化,可防止抗虫基因反向插入质粒 (2)BamHⅠ和SalⅠ 抗虫基因是使用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割的,限制酶XhoⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因,故不能选择限制酶XhoⅠ,且限制酶SalⅠ与XhoⅠ切割后会形成相同的黏性末端 (3)氨苄青霉素 农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移至被侵染的棉花细胞并整合到该细胞的染色体DNA上 (4)研究抗虫基因在棉花细胞内的表达情况(或检测是否产生相应的抗虫蛋白),抗虫蛋白的抗虫效果
微专题 基因编辑技术
五年高考
1.★★★★(2024广西,21,14分)M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠,主要制备流程如图所示,实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列,同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因(M-GFP)的表达,恢复小鼠自身被敲除的M基因功能,同时便于示踪。回答下列问题:
注:基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条,即可表示为Aa;两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。
(1)在PCR扩增片段①和②时,通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列,该序列添加的位置位于引物 (选填“3'端”或“5'端”)。在构建载体1时,为了阻断A基因的表达,从转录水平考虑,连接的片段可以是 ;而从翻译水平考虑,连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功,需要限制酶切割载体后,再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液,其目的是
(至少答2方面)。
(3)为了快速高效繁育出含有4对基因(遵循自由组合定律)的实验模型小鼠,应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交,杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M基因的表达可控,在实验模型小鼠喂食时,可添加竞争性结合A蛋白的四环素,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,目的是 。
答案 (1)5'端 两端包含LoxP序列的终止子 两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢物、提供营养物质 (3)Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白,无法激活T启动子,导致M-GFP基因不能表达,从而不能恢复被敲除的M基因的功能;不添加四环素,A蛋白基因表达激活T启动子,启动M-GFP基因表达,从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照,增加实验的准确性
2.★★★★(2023天津,17,12分)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一,为此设计表达载体,思路如下。
(1)外源基因的选择:纤维素常见生物降解途径如下。
纤维素寡糖纤维二糖葡萄糖
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖,应向酿酒酵母转入图中三种酶的基因,并使其表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法:同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为
(从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择:URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作标记基因。另外,URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以图中方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后,需要将菌株1在 的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
(4)表达载体的构建:综上,为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中,在构建表达载体时,A、B、C、C'、URA3和酶基因应采用图 的排布方式。
答案 (1)外 (2)P1和P6 (3)①不含尿嘧啶 ②2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶 (4)4
三年模拟
3.★★★★(2025届河北衡水中学三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞,包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,技术原理如图甲所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列和切割位点
BglⅡ 5'-A↓GATCT-3'
NheⅠ 5'-G↓CTAGC-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3'
HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3'
某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-Cas9-sgRNA质粒等为材料,进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源黏着斑蛋白(VCL)基因,以研究该基因在细胞中的作用,为乳腺癌的治疗提供理论支持。
(1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙,故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。
(2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙,需要通过 扩增,为了确保酶切后能正确连接到质粒上(相应酶切序列如图乙),需在引物1的5'端加上碱基序列 ,引物2的5'端加上碱基序列 。
(3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含sgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒(空质粒)分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 (填抗生素)筛选成功导入目的基因的细胞。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。
(4)检测与鉴定。获得稳转细胞系,培养3 d后收集细胞全部蛋白检测VCL,结果如图丁,显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。
(5)该技术还可用于通过同源重组修复插入外源目的基因。正确的操作是:导入基因编辑工具表达载体的同时,导入外源目的基因,且在目的基因两端加上与 相同的序列。
答案 (1)人源黏着斑蛋白(VCL) (2)PCR 5'-AGATCT-3' 5'-GCTAGC-3' (3)卡那霉素和潮霉素 在检测敲除效果时作对照 (4)抗原、抗体特异性结合 (5)Cas9切点两侧碱基序列
4.★★★★(2025届江西部分学校模拟)CRISPR/Cas9系统的gRNA能与目标DNA序列互补,指导Cas9酶精确地定位到基因的特定位置并切割DNA。同源重组是利用具有相同或高度相似序列的DNA分子之间的自然重组机制,将外源基因或DNA片段精确地插入、删除或替换到宿主细胞基因组的特定位置。乙肝e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒源性免疫抑制因子。构建能在肝脏中特异性稳定表达HBeAg的转基因动物对于深入研究HBeAg的作用机制具有重要意义。研究人员克隆乙型肝炎病毒的HBeAg基因,采用CRISPR/Cas9和同源重组技术在Rosa26基因位点定点插入HBeAg,构建转HBeAg基因小鼠,并开展相关研究。构建过程如图1所示(注:虚线交叉部分的序列为同源序列,P1~P4表示特异性扩增基因片段的引物)。回答下列问题:
(1)为获得足够多的小鼠受精卵作为受体细胞,可对雌性小鼠注射 后获得卵细胞。体外受精技术主要包括 等步骤。
(2)可采用 技术将Cas9基因的mRNA、gRNA和重组载体转入小鼠的受精卵中。本实验的gRNA具备的特点是 。Cas9基因的mRNA的作用是
。
(3)成功转基因受精卵发育而成的F0小鼠(小鼠1和小鼠2)的DNA用P1和P2引物、P3和P4引物进行PCR扩增后经电泳得到图2的片段。将F0与野生型小鼠杂交,F1的转基因阳性小鼠相互杂交培育转HBeAg基因纯合子小鼠。在F2得到的14只小鼠中,经P3和P4引物检测结果如图3。则含有HBeAg基因的小鼠是 。请利用PCR技术为选出转HBeAg基因纯合子小鼠,实验的方法和预期结果是 。
答案 (1)促性腺激素 卵母细胞的采集、精子的获取和受精 (2)显微注射 与Rosa26基因的特定位点的碱基互补配对 在细胞内翻译生成Cas9酶,完成目标序列的定点切割 (3)1、2、6、10、11、14 将含有HBeAg基因的小鼠的DNA用P1和P2引物进行PCR扩增后电泳;预期结果为:只能扩增出7.8 kb条带的小鼠为纯合子(合理即可)
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2027通用版高考生物学第一轮
第二十四章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取
五年高考
1.★★(2024安徽,14,3分)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
2.★★★(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
3.★★★(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
4.★★★[2022福建,21节选]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'—OH与加入的脱氧核苷酸的5'—P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是 (填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是 。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
三年模拟
5.★★(2026届广西名校联盟联考)某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验。操作流程如下:①组织捣碎后加入研磨液充分研磨;②过滤取滤液,置于4 ℃冰箱静置分层;③取上清液加入等体积预冷的95%酒精;④离心后收集沉淀物;⑤取部分沉淀加NaCl溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是( )
A.步骤③中因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质可溶,所以冷酒精可使DNA快速析出
B.步骤⑤鉴定时,直接取④离心收集的沉淀物与二苯胺混合,室温下放置观察颜色变化
C.若利用提取物进行PCR后,进行琼脂糖凝胶电泳,迁移距离越大的DNA片段相对分子质量越大
D.步骤②静置后DNA主要存在于沉淀中,需用高浓度NaCl溶液重新溶解
6.★★(2025届河北衡水三模)下列关于基因工程工具酶的叙述,正确的是( )
A.大多限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
B.限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键
C.DNA聚合酶和DNA连接酶都是构建重组DNA的关键酶
D.T4 DNA连接酶只能连接黏性末端,不能连接平末端
7.★★(2025届广东惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点,下列叙述错误的是( )
A.BamHⅠ和BsrGⅠ切割位点不同,但形成的黏性末端是相同的
B.与EcoRⅠ相比,HhaⅠ识别序列较短,该序列在DNA中出现的概率高
C.BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接
D.图中限制酶识别序列旋转180°后与旋转前重合
8.★★★(2025届重庆一中月考)一般情况下,限制酶的识别序列越长,在DNA中出现的概率越低,切割频率越小。限制酶K的识别序列为5'-A↓ATATT-3',限制酶L识别序列为5'-GC↓GC-3'。下列叙述正确的是( )
A.若DNA中碱基随机分布,限制酶L的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K的16倍
B.限制酶K的识别序列更长,故其在不同DNA分子中的切割频率都低于限制酶L
C.限制酶K的识别序列富含A—T碱基对,表明其切割活性依赖于DNA双链的局部解旋能力
D.限制酶K和L切割DNA后产生的片段可被T4 DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段
9.★★(2026届黑龙江哈尔滨六中开学考)用重组DNA技术可以赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有 和T4 DNA连接酶,图中 酶切割后的DNA片段用T4 DNA连接酶比另一类DNA连接酶连接效率更高。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与载体片段之间形成的化学键是 。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中 ;质粒DNA分子上有一至多个 ,供外源DNA片段插入其中;质粒DNA分子上常有特殊的 基因(如某种抗生素抗性基因),便于重组DNA分子的筛选。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段,是 识别和结合的部位,能驱动 过程。
第2节 PCR和电泳
五年高考
1.★(2025广东,7,2分)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的( )
A.1'-碱基 B.2'-氢 C.3'-羟基 D.5'-磷酸基团
2.★★(2024黑吉辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是 ( )
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
3.★★(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
4.★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
5.★★★(2025全国,6,6分)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是( )
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
6.★★★(2025全国,34,12分)为在大肠杆菌中表达酶X,某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0,构建重组质粒PX,并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示,→表示引物5'→3'方向)。回答下列问题:
(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ,而PCR过程中解开双链的方法是 。
(2)PCR过程中,因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
(3)该同学进行PCR实验时,所用模板与引物见表。实验中①和④的作用是 ;
②无扩增产物,原因是 ;③、⑤和⑥有扩增产物,扩增出的DNA产物分别是 。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 PX 无 P0 PX
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性,简要写出实验思路和预期结果 。
三年模拟
7.★★(2026届四川成都七中月考)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确的是( )
A.PCR扩增过程中双链DNA解旋是通过加热实现的
B.用于PCR扩增的Taq DNA聚合酶是一种耐高温的逆转录酶
C.PCR反应体系中需加入适量ATP溶液来驱动子链延伸
D.扩增循环按顺序一般分复性→变性→延伸三步
8.★★(2026届广东部分学校联考)进行PCR时,若设计的引物过短,则会出现对应不良情况。下列不属于对应不良情况的是( )
A.引物与特异性位点结合的正确率降低
B.PCR后出现多条非特异性子链
C.引物与模板链结合的稳定性增强
D.引物之间发生配对的概率增大
9.★★★(2026届湖北华大新高考联盟质量测评)研究者分别选取小麦感病品系和抗病品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR扩增,泳道1、2分别对应染色体1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,图2为感病基因序列示意图。下列分析错误的是( )
A.在PCR扩增时,所用引物越短,引物特异性越低
B.两个PCR产物相对分子质量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变大
C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变
D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果
10.★★★(2026届湖南部分学校联考,改编)果荚开裂并释放种子,是植物繁衍后代的重要途径。拟南芥是自花传粉植物,研究者对拟南芥果荚开裂机理进行了系列研究。
研究者通过筛选拟南芥外源DNA片段插入突变体库,获得果荚不开裂的突变体甲。检测发现突变体甲的M酶活性丧失,推测编码M酶的M基因由于插入X片段,突变为m基因。研究者利用不同的引物对,分别进行PCR,检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型,结果如图1,验证了上述推测。在图2中已标出引物3的位置,选出引物1、2的位置,引物1为 ,引物2为 (从A→E中选)。
微专题 PCR引物设计、选择及应用
五年高考
1.★★★(2025湖南,21,13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题:
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是 (答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有 (答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
2.★★★(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
图2
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
三年模拟
3.★★★(2026届湖北荆州开学考)增强子是可促进基因转录的一小段特殊DNA序列,现用PCR扩增增强子和Bt基因,然后重叠延伸使两片段融合,以实现对Bt基因表达的调控,如图所示。下列叙述正确的是( )
A.增强子中含多个起始密码子以促进基因转录
B.引物B、C的序列需一致以促进两片段融合
C.DNA单链B、C混合后才能延伸出融合片段
D.为获得大量融合片段可用引物A、D扩增融合片段
4.★★★(2025届山西太原二模)反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术,需要先将目标DNA进行环化,再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点,部分过程如图所示,相关叙述正确的是( )
A.过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3
B.过程③中复性是在72 ℃左右使两种引物与模板链结合
C.过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
D.PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列
5.★★★(2026届辽宁七校协作体期初)雌激素类物质污染会通过食物链影响人体健康和生态安全。科研人员欲将斑马鱼的vtg基因(图1)插入Luc基因载体(图2),形成vtg-Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。Luc表示萤火虫荧光素酶基因。(注:Luc基因缺乏启动子序列,vtg基因内部无图2中的任何限制酶识别序列。TetR为四环素抗性基因,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ、BclⅠ为限制酶,→表示转录方向)
(1)基因工程的核心步骤是 。为使vtg基因与Luc基因载体正向连接且降低“空载”概率,可选用限制酶 双酶切Luc基因载体。
(2)通过PCR获取vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息,推测引物1包含的碱基序列为 。
A.5'-GAATTCAACTAT-3'
B.5'-GAATTCTTGATA-3'
C.5'-GATCTTGATA-3'
D.5'-AAGCTTAACTAT-3'
(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养, (选填“能”或“不能”)在含有氨苄青霉素的培养基中生长但 (选填“能”或“不能”)在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
(4)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子,E蛋白与启动子结合后,启动转录过程还需要的酶是 。Luc基因的表达产物萤火虫荧光素酶,可以催化荧光素氧化产生荧光。斑马鱼的vtg基因在正常情况下不表达,当水体中有雌激素存在时,斑马鱼vtg基因的启动子被激活,表达vtg-Luc融合蛋白。在水样中添加荧光素后,Luc催化其产生荧光,荧光越 ,说明水体中 污染越严重。
6.★★★★(2025届江西学业水平选择性考试九)荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,其灵敏度高、特异性好,是目前检测微小残留病变的常用方法。请回答下列有关问题:
(1)TaqMan探针是qPCR中一种常用的探针,其5'端连接荧光基团(F),3'端连接荧光基团(Q),当探针完整时,两个基团距离很近,两个荧光基团相互发生淬灭而不能检测到荧光。在qPCR过程中,当Taq DNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,F和Q两个基团分离,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。具体过程如图1所示。
①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、Taq DNA聚合酶、 和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历 、 、延伸三个阶段,其中延伸阶段是从引物 (填“3'”或“5'”)端开始的。
②在qPCR过程中,Taq DNA聚合酶的两个作用是 。
③在qPCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,保证复性时探针先于引物与模板DNA结合,原因是 。
(2)随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度 (填“增强”或“减弱”)。通过实时检测荧光信号强度,可得Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环次数),该值与待测样本中目的基因的个数呈 (填“正相关”或“负相关”)。
(3)qPCR可用于肿瘤基因的检测,其不但能灵敏地检测到少量突变基因,尽早确诊癌症,还可以准确检测到肿瘤基因的表达量。图2表示三位疑似肿瘤患者中肿瘤基因的检测结果,从Ct值的角度进行分析,患者 (填“A”“B”或“C”)出现肿瘤的概率更大,原因是 。
第3节 基因工程和蛋白质工程
考法1 限制酶的选择:T5、T6、T8、T9、T10
考法2 转基因“受体细胞”的筛选:T2、T3、T4、T6、T8、T9、T10
五年高考
1.★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
2.★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
3.★★★(2025甘肃,21,11分)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起,严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术,对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”,编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如图)。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后,可通过 (方法)将该质粒转入植物细胞,并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞,需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ,对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素,原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功,首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑;然后,在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过比较 来验证抗病性。
(4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
4.★★★(新思维·重组菌的目的基因产物杀菌活性丧失的原因分析)(2025四川,19,11分)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'→3'方向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带 (填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致 ,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有 (答出1点即可)。
5.★★★★(新考法· 在载体中逐个插入3个基因的分析)(2025河北,22节选)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。
回答下列问题:
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加 (填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成 键。
6.★★★★(2025黑吉辽蒙,25,11分)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用 连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 (从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有 。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
三年模拟
7.★★(2026届湖北宜昌开学考)利用蛋白质工程对干扰素进行改造,可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是( )
A.天然蛋白质合成的过程按照中心法则进行,蛋白质工程与之相反
B.利用蛋白质工程对干扰素进行改造时,操作对象是干扰素
C.经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传
D.对干扰素的改造遇到的难题之一是干扰素的高级结构十分复杂
8.★★(2026届湖南部分学校联考)科学家设想将HIV的壳体蛋白(CA)基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内,利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗,以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如图所示。回答下列问题:
(1)①是 过程,进行①过程操作的目的是 。
(2)选用Ti质粒作为HIV的CA基因的载体,原因是 。
(3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制酶是 ,不选用其他两种限制酶的原因是 。
(4)为了筛选出含重组载体的农杆菌,在选择培养基上添加氨苄青霉素,一段时间后,培养基上形成的菌落 (填“一定”或“不一定”)含有重组载体,原因是 。
9.★★★(2026届河北示范高中联考)如图是构建转基因大肠杆菌生产胰岛素所用的质粒和目的基因的结构。β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在的情况下,使菌落呈现蓝色,否则菌落呈现白色。请结合图示完善下列操作步骤:
(1)目的基因的筛选与获取:可以从 (填“胰岛A细胞”或“胰岛B细胞”)中提取mRNA,逆转录获取cDNA,原因是 。
(2)基因表达载体的构建:为使目的基因与载体正确连接,最好选用限制酶 切割质粒。为保证目的基因能和质粒连接,扩增目的基因时需在引物的 端添加相应序列,左侧引物上连接的序列是
。
(3)将目的基因导入受体细胞:将重组DNA导入大肠杆菌细胞之前,需要用 处理大肠杆菌。有人提出,将受体细胞改为酵母菌更合适,从细胞结构的角度分析,原因 。
(4)目的基因的检测与鉴定:将目的基因导入受体细胞后,用选择培养基进行筛选,培养基中除大肠杆菌必需的营养物质外,还应加入 。后续还需要进行分子水平的检测和个体水平的鉴定,其中检测目的基因是否完成表达的方法是 。
(5)从基因改造角度分析,利用转基因技术生产胰岛素相比传统提取方法有哪些优点: 。
10.★★★(2026届四川部分学校联考)科学家利用基因工程技术将抗虫基因导入棉花细胞,从而获得抗虫棉。该技术涉及的质粒上含氨苄青霉素抗性基因和多个限制酶切割位点,其结构如图1所示。抗虫基因上的限制酶切割位点如图2所示,部分限制酶和其识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列及切割位点
BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3'
XhoⅠ 5'-C↓TCGAG-3'
SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3'
SmaⅠ 5'-CCC↓GGG-3'
(1)质粒通常作为载体,图1上还缺少的结构是 。某同学准备使用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割抗虫基因,与仅用SalⅠ切割抗虫基因相比,其优势是 。
(2)下一步切割质粒时,应选择限制酶 ,理由是 。
(3)将重组质粒导入农杆菌后,需在培养基中添加 以筛选成功转化的农杆菌。通过农杆菌转化法将抗虫基因导入棉花细胞,依据的原理是 。
(4)若已成功导入抗虫基因的植株仍会被害虫啃食,下一步需要进行的研究方向是
。
微专题 基因编辑技术
五年高考
1.★★★★(2024广西,21,14分)M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠,主要制备流程如图所示,实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列,同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因(M-GFP)的表达,恢复小鼠自身被敲除的M基因功能,同时便于示踪。回答下列问题:
注:基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条,即可表示为Aa;两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。
(1)在PCR扩增片段①和②时,通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列,该序列添加的位置位于引物 (选填“3'端”或“5'端”)。在构建载体1时,为了阻断A基因的表达,从转录水平考虑,连接的片段可以是 ;而从翻译水平考虑,连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功,需要限制酶切割载体后,再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液,其目的是
(至少答2方面)。
(3)为了快速高效繁育出含有4对基因(遵循自由组合定律)的实验模型小鼠,应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交,杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M基因的表达可控,在实验模型小鼠喂食时,可添加竞争性结合A蛋白的四环素,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,目的是 。
2.★★★★(2023天津,17,12分)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一,为此设计表达载体,思路如下。
(1)外源基因的选择:纤维素常见生物降解途径如下。
纤维素寡糖纤维二糖葡萄糖
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖,应向酿酒酵母转入图中三种酶的基因,并使其表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法:同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为
(从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择:URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作标记基因。另外,URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以图中方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后,需要将菌株1在 的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
(4)表达载体的构建:综上,为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中,在构建表达载体时,A、B、C、C'、URA3和酶基因应采用图 的排布方式。
三年模拟
3.★★★★(2025届河北衡水中学三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞,包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,技术原理如图甲所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列和切割位点
BglⅡ 5'-A↓GATCT-3'
NheⅠ 5'-G↓CTAGC-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3'
HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3'
某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-Cas9-sgRNA质粒等为材料,进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源黏着斑蛋白(VCL)基因,以研究该基因在细胞中的作用,为乳腺癌的治疗提供理论支持。
(1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙,故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。
(2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙,需要通过 扩增,为了确保酶切后能正确连接到质粒上(相应酶切序列如图乙),需在引物1的5'端加上碱基序列 ,引物2的5'端加上碱基序列 。
(3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含sgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒(空质粒)分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 (填抗生素)筛选成功导入目的基因的细胞。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。
(4)检测与鉴定。获得稳转细胞系,培养3 d后收集细胞全部蛋白检测VCL,结果如图丁,显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。
(5)该技术还可用于通过同源重组修复插入外源目的基因。正确的操作是:导入基因编辑工具表达载体的同时,导入外源目的基因,且在目的基因两端加上与 相同的序列。
4.★★★★(2025届江西部分学校模拟)CRISPR/Cas9系统的gRNA能与目标DNA序列互补,指导Cas9酶精确地定位到基因的特定位置并切割DNA。同源重组是利用具有相同或高度相似序列的DNA分子之间的自然重组机制,将外源基因或DNA片段精确地插入、删除或替换到宿主细胞基因组的特定位置。乙肝e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒源性免疫抑制因子。构建能在肝脏中特异性稳定表达HBeAg的转基因动物对于深入研究HBeAg的作用机制具有重要意义。研究人员克隆乙型肝炎病毒的HBeAg基因,采用CRISPR/Cas9和同源重组技术在Rosa26基因位点定点插入HBeAg,构建转HBeAg基因小鼠,并开展相关研究。构建过程如图1所示(注:虚线交叉部分的序列为同源序列,P1~P4表示特异性扩增基因片段的引物)。回答下列问题:
(1)为获得足够多的小鼠受精卵作为受体细胞,可对雌性小鼠注射 后获得卵细胞。体外受精技术主要包括 等步骤。
(2)可采用 技术将Cas9基因的mRNA、gRNA和重组载体转入小鼠的受精卵中。本实验的gRNA具备的特点是 。Cas9基因的mRNA的作用是
。
(3)成功转基因受精卵发育而成的F0小鼠(小鼠1和小鼠2)的DNA用P1和P2引物、P3和P4引物进行PCR扩增后经电泳得到图2的片段。将F0与野生型小鼠杂交,F1的转基因阳性小鼠相互杂交培育转HBeAg基因纯合子小鼠。在F2得到的14只小鼠中,经P3和P4引物检测结果如图3。则含有HBeAg基因的小鼠是 。请利用PCR技术为选出转HBeAg基因纯合子小鼠,实验的方法和预期结果是 。
第二十四章 基因工程
第1节 重组DNA技术的基本工具和DNA的粗提取
五年高考
1.★★(2024安徽,14,3分)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
答案 D
2.★★★(2024湖南,5,2分)某同学将质粒DNA进行限制酶酶切时,发现DNA完全没有被酶切,分析可能的原因并提出解决方法。下列叙述错误的是( )
A.限制酶失活,更换新的限制酶
B.酶切条件不合适,调整反应条件如温度和酶的用量等
C.质粒DNA突变导致酶识别位点缺失,更换正常质粒DNA
D.酶切位点被甲基化修饰,换用对DNA甲基化不敏感的限制酶
答案 B
3.★★★(2023重庆,12,3分)某小组通过PCR[假设引物长度为8个碱基(短于实际长度)]获得了含有目的基因的DNA片段,并用限制酶进行酶切(如图),再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是( )
A.其中一个引物序列为5'-TGCGCAGT-3'
B.步骤①所用的酶是SpeⅠ和CfoⅠ
C.用步骤①的酶对载体进行酶切,至少获得了2个片段
D.酶切片段和载体连接时,可使用E.coli连接酶或T4连接酶
答案 B
4.★★★[2022福建,21节选]美西螈具有很强的再生能力。研究表明,美西螈的巨噬细胞在断肢再生的早期起重要作用。为研究巨噬细胞的作用机制,科研人员制备了抗巨噬细胞表面标志蛋白CD14的单克隆抗体,具体方法如下。回答下列问题:
(一)基因工程抗原的制备
(1)根据美西螈CD14基因的核苷酸序列,合成引物,利用PCR扩增CD14片段。已知DNA聚合酶催化引物的3'—OH与加入的脱氧核苷酸的5'—P形成磷酸二酯键,则新合成链的延伸方向是 (填“5'→3'”或“3'→5'”)。
(2)载体和CD14片段的酶切位点及相应的酶切序列如图所示。用XhoⅠ和SalⅠ分别酶切CD14和载体后连接,CD14接入载体时会形成正向连接和反向连接的两种重组DNA。可进一步用这两种限制酶对CD14的连接方向进行鉴定,理由是 。
(3)培养能表达CD14蛋白的大肠杆菌,分离纯化目的蛋白。
答案 (1)5'→3' (2)正向连接的重组DNA有这两种酶切位点(限制酶的识别序列);而反向连接的重组DNA会形成新的序列,没有这两种酶的酶切位点(没有限制酶的识别序列)
三年模拟
5.★★(2026届广西名校联盟联考)某研究小组以新鲜洋葱为材料进行“DNA粗提取与鉴定”实验。操作流程如下:①组织捣碎后加入研磨液充分研磨;②过滤取滤液,置于4 ℃冰箱静置分层;③取上清液加入等体积预冷的95%酒精;④离心后收集沉淀物;⑤取部分沉淀加NaCl溶解后进行二苯胺鉴定。下列叙述正确的是( )
A.步骤③中因为DNA不溶于酒精而某些蛋白质可溶,所以冷酒精可使DNA快速析出
B.步骤⑤鉴定时,直接取④离心收集的沉淀物与二苯胺混合,室温下放置观察颜色变化
C.若利用提取物进行PCR后,进行琼脂糖凝胶电泳,迁移距离越大的DNA片段相对分子质量越大
D.步骤②静置后DNA主要存在于沉淀中,需用高浓度NaCl溶液重新溶解
答案 A
6.★★(2025届河北衡水三模)下列关于基因工程工具酶的叙述,正确的是( )
A.大多限制酶的识别序列由6个核苷酸组成
B.限制酶可切割特定核苷酸序列之间的氢键
C.DNA聚合酶和DNA连接酶都是构建重组DNA的关键酶
D.T4 DNA连接酶只能连接黏性末端,不能连接平末端
答案 A
7.★★(2025届广东惠州一模)限制性内切核酸酶是基因工程中常用的一种酶。以下是6种不同限制酶的识别序列和切割位点,下列叙述错误的是( )
A.BamHⅠ和BsrGⅠ切割位点不同,但形成的黏性末端是相同的
B.与EcoRⅠ相比,HhaⅠ识别序列较短,该序列在DNA中出现的概率高
C.BamHⅠ切割产生的黏性末端能够与MboⅠ切割成的黏性末端拼接
D.图中限制酶识别序列旋转180°后与旋转前重合
答案 A
8.★★★(2025届重庆一中月考)一般情况下,限制酶的识别序列越长,在DNA中出现的概率越低,切割频率越小。限制酶K的识别序列为5'-A↓ATATT-3',限制酶L识别序列为5'-GC↓GC-3'。下列叙述正确的是( )
A.若DNA中碱基随机分布,限制酶L的识别序列在DNA中出现的理论概率是限制酶K的16倍
B.限制酶K的识别序列更长,故其在不同DNA分子中的切割频率都低于限制酶L
C.限制酶K的识别序列富含A—T碱基对,表明其切割活性依赖于DNA双链的局部解旋能力
D.限制酶K和L切割DNA后产生的片段可被T4 DNA连接酶“缝合”成一个新的DNA片段
答案 A
9.★★(2026届黑龙江哈尔滨六中开学考)用重组DNA技术可以赋予生物新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中要使用多种工具酶,其中4种限制酶的切割位点如图所示。
回答下列问题:
(1)常用的DNA连接酶有 和T4 DNA连接酶,图中 酶切割后的DNA片段用T4 DNA连接酶比另一类DNA连接酶连接效率更高。
(2)DNA连接酶催化目的基因片段与载体片段之间形成的化学键是 。
(3)重组DNA技术中所用的质粒载体具有一些特征,如质粒DNA分子上有复制原点,可以保证质粒在受体细胞中 ;质粒DNA分子上有一至多个 ,供外源DNA片段插入其中;质粒DNA分子上常有特殊的 基因(如某种抗生素抗性基因),便于重组DNA分子的筛选。
(4)表达载体含有启动子,启动子是指位于基因上游的一段有特殊序列结构的DNA片段,是 识别和结合的部位,能驱动 过程。
答案 (1)E.coli DNA连接酶 SmaⅠ和EcoRⅤ (2)磷酸二酯键 (3)复制 限制酶的切割位点 标记 (4)RNA聚合酶 转录
第2节 PCR和电泳
五年高考
1.★(2025广东,7,2分)Solexa测序是一种将PCR与荧光检测相结合的高通量测序技术。为了确保该PCR过程中,DNA聚合酶催化一个脱氧核苷酸单位完成聚合反应后,DNA链不继续延伸,应保护底物中脱氧核糖结构上的( )
A.1'-碱基 B.2'-氢 C.3'-羟基 D.5'-磷酸基团
答案 C
2.★★(2024黑吉辽,7,2分)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验,下列叙述正确的是 ( )
A.琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小
B.凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置
C.在同一电场作用下,DNA片段越长,向负极迁移速率越快
D.琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来
答案 A
3.★★(2023福建,4,2分)关于“DNA片段的扩增及电泳鉴定”(实验Ⅰ)和“DNA的粗提取与鉴定”(实验Ⅱ)的实验操作,下列相关叙述正确的是( )
A.实验Ⅰ中,PCR实验所需的移液器、枪头、蒸馏水等必须进行高压蒸汽灭菌处理
B.实验Ⅰ中,将扩增得到的PCR产物进行凝胶电泳,加样前应先接通电源
C.实验Ⅱ中,取洋葱研磨液的上清液,加入等体积冷酒精后析出粗提取的DNA
D.实验Ⅱ中,将白色丝状物直接加入二苯胺试剂中并进行沸水浴,用于鉴定DNA
答案 C
4.★★(2022辽宁,12,2分)抗虫和耐除草剂玉米双抗12-5是我国自主研发的转基因品种。为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,反应程序如图所示。下列叙述正确的是( )
A.预变性过程可促进模板DNA边解旋边复制
B.后延伸过程可使目的基因的扩增更加充分
C.延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制
D.转基因品种经检测含有目的基因后即可上市
答案 B
5.★★★(2025全国,6,6分)琼脂糖凝胶电泳常用于核酸样品的分析,样品1~4的电泳结果如图所示(“+”“-”分别代表电泳槽的阳极和阴极)。已知样品1和2中的DNA分子分别是甲和乙,甲只有限制酶R的一个酶切位点,样品3和4中有一个样品是甲的酶切产物。下列叙述错误的是( )
A.配制琼脂糖凝胶时需选用适当的缓冲溶液
B.该实验条件下甲、乙两种DNA分子均带负电荷
C.甲、乙两种DNA分子所含碱基对的数量可能不同
D.据图推测样品3可能是甲被酶R完全酶切后的产物
答案 D
6.★★★(2025全国,34,12分)为在大肠杆菌中表达酶X,某同学将编码酶X的基因(目的基因)插入质粒P0,构建重组质粒PX,并转入大肠杆菌。该同学设计引物用PCR方法验证重组质粒构建成功(引物1~4结合位置如图所示,→表示引物5'→3'方向)。回答下列问题:
(1)PCR是根据DNA复制原理在体外扩增DNA的技术。在细胞中DNA复制时解开双链的酶是 ,而PCR过程中解开双链的方法是 。
(2)PCR过程中,因参与合成反应、不断消耗而浓度下降的组分有 。
(3)该同学进行PCR实验时,所用模板与引物见表。实验中①和④的作用是 ;
②无扩增产物,原因是 ;③、⑤和⑥有扩增产物,扩增出的DNA产物分别是 。
管号 ① ② ③ ④ ⑤ ⑥
模板 无 P0 PX 无 P0 PX
引物对 引物1和引物2 引物3和引物4
(4)设计实验验证大肠杆菌表达的酶X有活性,简要写出实验思路和预期结果 。
答案 (1)解旋酶 高温变性 (2)引物、脱氧核苷三磷酸 (3)作为对照(或答:鉴定反应体系是否有模板污染) P0不含与引物1和引物2互补的碱基序列 目的基因、质粒片段、含目的基因和部分质粒序列的片段 (4)提取酶X,催化相应底物(反应物)的反应,检测是否有产物生成。若有产物生成,则证明酶X有活性
三年模拟
7.★★(2026届四川成都七中月考)下列关于PCR扩增DNA片段及电泳鉴定的叙述,正确的是( )
A.PCR扩增过程中双链DNA解旋是通过加热实现的
B.用于PCR扩增的Taq DNA聚合酶是一种耐高温的逆转录酶
C.PCR反应体系中需加入适量ATP溶液来驱动子链延伸
D.扩增循环按顺序一般分复性→变性→延伸三步
答案 A
8.★★(2026届广东部分学校联考)进行PCR时,若设计的引物过短,则会出现对应不良情况。下列不属于对应不良情况的是( )
A.引物与特异性位点结合的正确率降低
B.PCR后出现多条非特异性子链
C.引物与模板链结合的稳定性增强
D.引物之间发生配对的概率增大
答案 C
9.★★★(2026届湖北华大新高考联盟质量测评)研究者分别选取小麦感病品系和抗病品系的叶片,对候选染色体1和2上的相关基因进行PCR扩增,泳道1、2分别对应染色体1、2相关基因PCR产物,结果如图1所示。DNA序列分析发现抗病基因的出现是感病基因缺失一部分碱基序列造成的,图2为感病基因序列示意图。下列分析错误的是( )
A.在PCR扩增时,所用引物越短,引物特异性越低
B.两个PCR产物相对分子质量接近时适当延长电泳时间,凝胶中这两个条带距离会变大
C.推测抗病品系抗病性状出现的根本原因是染色体2上感病基因发生突变
D.推测图1中泳道2的条带是选用引物1和引物2进行PCR扩增后的电泳结果
答案 D
10.★★★(2026届湖南部分学校联考,改编)果荚开裂并释放种子,是植物繁衍后代的重要途径。拟南芥是自花传粉植物,研究者对拟南芥果荚开裂机理进行了系列研究。
研究者通过筛选拟南芥外源DNA片段插入突变体库,获得果荚不开裂的突变体甲。检测发现突变体甲的M酶活性丧失,推测编码M酶的M基因由于插入X片段,突变为m基因。研究者利用不同的引物对,分别进行PCR,检测野生型拟南芥及突变体甲的基因型,结果如图1,验证了上述推测。在图2中已标出引物3的位置,选出引物1、2的位置,引物1为 ,引物2为 (从A→E中选)。
答案 B D
微专题 PCR引物设计、选择及应用
五年高考
1.★★★(2025湖南,21,13分)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题:
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为 bp。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是 (答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有 (答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
答案 (1)①终止子(或复制原点) P1和P3 782 ②基因A未表达(基因A突变/修饰等);蛋白A在大肠杆菌细胞内合成,缺失分泌到细胞外的信号,不能分泌到细胞外 (2)PEG融合法(或电融合法/灭活病毒诱导法) 抗体检测
2.★★★(2023江苏,22,12分)为了将某纳米抗体和绿色荧光蛋白基因融合表达,运用重组酶技术构建质粒,如图1所示。请回答下列问题:
图1
(1)分别进行PCR扩增片段F1与片段F2时,配制的两个反应体系中不同的有 ,扩增程序中最主要的不同是 。
(2)有关基因序列如图2。引物F2-F、F1-R应在下列选项中选用 。
图2
A.ATGGTG------CAACCA C.GACGAG------CTGCAG
B.TGGTTG------CACCAT D.CTGCAG------CTCGTC
(3)将PCR产物片段与线性质粒载体混合后,在重组酶作用下可形成环化质粒,直接用于转化细菌。这一过程与传统重组质粒构建过程相比,无需使用的酶主要有 。
(4)转化后的大肠杆菌需采用含有抗生素的培养基筛选,下列叙述错误的有 。
A.稀释涂布平板需控制每个平板30~300个菌落
B.抗性平板上未长出菌落的原因一般是培养基温度太高
C.抗性平板上常常会出现大量杂菌形成的菌落
D.抗性平板上长出的单菌落无需进一步划线纯化
(5)为了验证平板上菌落中的质粒是否符合设计,用不同菌落的质粒为模板,用引物F1-F和F2-R进行了PCR扩增,质粒P1~P4的扩增产物电泳结果如图3。根据图中结果判断,可以舍弃的质粒有 。
(6)对于PCR产物电泳结果符合预期的质粒,通常需进一步通过基因测序确认,原因是 。
答案 (1)模板和引物 退火温度 (2)CD (3)限制性内切核酸酶、DNA连接酶 (4)ABC (5)P3、P4 (6)电泳条带仅能显示扩增片段的大致长度,不能呈现碱基序列
三年模拟
3.★★★(2026届湖北荆州开学考)增强子是可促进基因转录的一小段特殊DNA序列,现用PCR扩增增强子和Bt基因,然后重叠延伸使两片段融合,以实现对Bt基因表达的调控,如图所示。下列叙述正确的是( )
A.增强子中含多个起始密码子以促进基因转录
B.引物B、C的序列需一致以促进两片段融合
C.DNA单链B、C混合后才能延伸出融合片段
D.为获得大量融合片段可用引物A、D扩增融合片段
答案 D
4.★★★(2025届山西太原二模)反向PCR是一种用于扩增已知序列两侧的未知序列的技术,需要先将目标DNA进行环化,再以环化的DNA为模板进行扩增。现利用反向PCR技术来确定目的基因的插入位点,部分过程如图所示,相关叙述正确的是( )
A.过程②中根据目的基因两端的部分核苷酸序列设计引物2和3
B.过程③中复性是在72 ℃左右使两种引物与模板链结合
C.过程③所用的酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
D.PCR第二轮循环即可获得两条链等长的未知序列
答案 C
5.★★★(2026届辽宁七校协作体期初)雌激素类物质污染会通过食物链影响人体健康和生态安全。科研人员欲将斑马鱼的vtg基因(图1)插入Luc基因载体(图2),形成vtg-Luc融合基因重组载体并培育转基因斑马鱼。Luc表示萤火虫荧光素酶基因。(注:Luc基因缺乏启动子序列,vtg基因内部无图2中的任何限制酶识别序列。TetR为四环素抗性基因,AmpR为氨苄青霉素抗性基因,Sau3AⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、BsrGⅠ、BclⅠ为限制酶,→表示转录方向)
(1)基因工程的核心步骤是 。为使vtg基因与Luc基因载体正向连接且降低“空载”概率,可选用限制酶 双酶切Luc基因载体。
(2)通过PCR获取vtg基因时,需设计合适的引物。依据图1、图2信息,推测引物1包含的碱基序列为 。
A.5'-GAATTCAACTAT-3'
B.5'-GAATTCTTGATA-3'
C.5'-GATCTTGATA-3'
D.5'-AAGCTTAACTAT-3'
(3)筛选导入vtg-Luc基因重组载体的大肠杆菌,可将大肠杆菌依次放在含有氨苄青霉素、四环素的培养基中培养, (选填“能”或“不能”)在含有氨苄青霉素的培养基中生长但 (选填“能”或“不能”)在含有四环素的培养基中生长的大肠杆菌即为目的菌。
(4)水体中的雌激素能使斑马鱼细胞产生E蛋白,E蛋白可以激活vtg基因上游的启动子,E蛋白与启动子结合后,启动转录过程还需要的酶是 。Luc基因的表达产物萤火虫荧光素酶,可以催化荧光素氧化产生荧光。斑马鱼的vtg基因在正常情况下不表达,当水体中有雌激素存在时,斑马鱼vtg基因的启动子被激活,表达vtg-Luc融合蛋白。在水样中添加荧光素后,Luc催化其产生荧光,荧光越 ,说明水体中 污染越严重。
答案 (1)构建基因表达载体 EcoRⅠ、HindⅢ (2)A (3)能 不能 (4)RNA聚合酶 强 雌激素(类物质)
6.★★★★(2025届江西学业水平选择性考试九)荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,其灵敏度高、特异性好,是目前检测微小残留病变的常用方法。请回答下列有关问题:
(1)TaqMan探针是qPCR中一种常用的探针,其5'端连接荧光基团(F),3'端连接荧光基团(Q),当探针完整时,两个基团距离很近,两个荧光基团相互发生淬灭而不能检测到荧光。在qPCR过程中,当Taq DNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,F和Q两个基团分离,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。具体过程如图1所示。
①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、Taq DNA聚合酶、 和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历 、 、延伸三个阶段,其中延伸阶段是从引物 (填“3'”或“5'”)端开始的。
②在qPCR过程中,Taq DNA聚合酶的两个作用是 。
③在qPCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,保证复性时探针先于引物与模板DNA结合,原因是 。
(2)随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度 (填“增强”或“减弱”)。通过实时检测荧光信号强度,可得Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环次数),该值与待测样本中目的基因的个数呈 (填“正相关”或“负相关”)。
(3)qPCR可用于肿瘤基因的检测,其不但能灵敏地检测到少量突变基因,尽早确诊癌症,还可以准确检测到肿瘤基因的表达量。图2表示三位疑似肿瘤患者中肿瘤基因的检测结果,从Ct值的角度进行分析,患者 (填“A”“B”或“C”)出现肿瘤的概率更大,原因是 。
答案 (1)①引物 变性 复性 3' ②Taq DNA聚合酶能够催化游离脱氧核苷酸连接到核苷酸链上,能水解Taqman探针 ③可确保在随后的延伸阶段,当Taq DNA聚合酶从引物开始合成新链时,就能顺利遇到并水解已结合在模板上的探针,使其发出荧光信号 (2)增强 负相关 (3)A 由于患者A达到荧光阈值时的循环次数比较少,因此其起始模板的肿瘤基因较多
第3节 基因工程和蛋白质工程
考法1 限制酶的选择:T5、T6、T8、T9、T10
考法2 转基因“受体细胞”的筛选:T2、T3、T4、T6、T8、T9、T10
五年高考
1.★★(2023辽宁,8,2分)CD163蛋白是PRRSV(病毒)感染家畜的受体。为实时监控CD163蛋白的表达和转运过程,将红色荧光蛋白RFP基因与CD163基因拼接在一起(如图),使其表达成一条多肽。该拼接过程的关键步骤是除去( )
A.CD163基因中编码起始密码子的序列
B.CD163基因中编码终止密码子的序列
C.RFP基因中编码起始密码子的序列
D.RFP基因中编码终止密码子的序列
答案 B
2.★★(2023湖北,4,2分)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用Hind Ⅲ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
答案 D
3.★★★(2025甘肃,21,11分)水稻白叶枯病(植株的叶片上会出现逐渐扩大的黄白色至枯白色病斑)由白叶枯病菌引起,严重威胁水稻生产和粮食安全。科学家利用CRISPR-Cas9基因组编辑技术,对水稻白叶枯病的感病基因SWEET(该基因被白叶枯病菌利用以侵染水稻)的启动子区进行了定点“修改”,编辑后的水稻幼胚通过植物组织培养技术获得抗病植株(如图)。回答下列问题。
(1)CRISPR-Cas9重组Ti质粒构建完成后,可通过 (方法)将该质粒转入植物细胞,并将 整合到该细胞的染色体上。为了能够筛选出转化成功的细胞,需要在植物组织培养基中添加 。
(2)实验中用到的水稻幼胚在植物组织培养中被称为 ,对其消毒时需依次使用酒精和 处理。诱导形成再生植株的过程中需使用生长素和细胞分裂素,原因是 。
(3)为了检测基因编辑水稻是否成功,首先需采用 技术检测目标基因的启动子区是否被成功编辑;然后,在个体水平需将基因编辑后的水稻与野生型水稻分别接种白叶枯病菌,通过比较 来验证抗病性。
(4)在该研究中,基因编辑成功后的水稻可以抗白叶枯病的原因为 。
答案 (1)农杆菌转化法 Ti质粒上的T-DNA 潮霉素 (2)外植体 次氯酸钠 生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键激素 (3)DNA测序(或PCR) 病斑的大小(或病斑面积、发病情况等合理答案) (4)对感病基因SWEET的启动子区进行定点修改后,白叶枯病菌无法利用该基因侵染水稻
4.★★★(新思维·重组菌的目的基因产物杀菌活性丧失的原因分析)(2025四川,19,11分)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'→3'方向。②密码子对应的氨基酸:AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带 (填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致 ,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有 (答出1点即可)。
答案 (1)F2、F4 保证载体能在链霉菌细胞中正常复制 (2)2 验证重组质粒是否构建成功 (3)苯丙氨酸 翻译受阻
(4)目的基因发生突变(或变异) 发酵条件优化(或产物的分离和纯化方法等)
5.★★★★(新考法· 在载体中逐个插入3个基因的分析)(2025河北,22节选)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。
回答下列问题:
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为 。
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加 (填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成 键。
答案 (1)引物 脱氧核苷酸(前两空顺序可颠倒) 复性(或“退火”) PCR时不耐高温的DNA聚合酶会失活(或“PCR过程在高温下进行”) (2)SmaⅠ、EcoRⅠ 磷酸二酯
6.★★★★(2025黑吉辽蒙,25,11分)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
(1)可从 中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用 连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 (从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是 。
(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有 。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
答案 (1)序列数据库(如GenBank) XhoⅠ XbaⅠ DNA连接酶/T4 DNA连接酶/E.coli DNA连接酶 (2)外源DNA/外源基因N 1 质粒pYL大小为7.2 kb,重组质粒大小约为9.5 kb,可推断插入的基因N约有2.3 kb(2 300个碱基对),与DNA电泳图中1号样品大小接近,因此判断该组基因N导入成功 (3)GCC (4)香树脂醇
三年模拟
7.★★(2026届湖北宜昌开学考)利用蛋白质工程对干扰素进行改造,可在一定条件下延长其保存时间。下列叙述错误的是( )
A.天然蛋白质合成的过程按照中心法则进行,蛋白质工程与之相反
B.利用蛋白质工程对干扰素进行改造时,操作对象是干扰素
C.经改造后的干扰素基因能通过工程菌的繁殖实现遗传
D.对干扰素的改造遇到的难题之一是干扰素的高级结构十分复杂
答案 B
8.★★(2026届湖南部分学校联考)科学家设想将HIV的壳体蛋白(CA)基因与Ti质粒连接构建重组载体转染到枸杞细胞内,利用愈伤组织作为反应器生产HIV的壳体蛋白作为疫苗,以研究CA疫苗对人体的免疫应答。建立愈伤组织反应器的主要过程如图所示。回答下列问题:
(1)①是 过程,进行①过程操作的目的是 。
(2)选用Ti质粒作为HIV的CA基因的载体,原因是 。
(3)切割CA-DNA和Ti质粒所用的限制酶是 ,不选用其他两种限制酶的原因是 。
(4)为了筛选出含重组载体的农杆菌,在选择培养基上添加氨苄青霉素,一段时间后,培养基上形成的菌落 (填“一定”或“不一定”)含有重组载体,原因是 。
答案 (1)逆转录 将单链RNA逆转录为双链DNA,获得CA基因的DNA片段以便与Ti质粒连接成重组载体 (2)Ti质粒的T-DNA能将目的基因转移并整合到被侵染植物细胞的染色体DNA上 (3)PatⅠ和BamHⅠ EcoRⅠ会破坏目的基因,NotⅠ的切割位点不在T-DNA中 (4)不一定 (未导入目的基因的)Ti质粒和重组载体均含有氨苄青霉素抗性基因
9.★★★(2026届河北示范高中联考)如图是构建转基因大肠杆菌生产胰岛素所用的质粒和目的基因的结构。β-半乳糖苷酶在X-gal和IPTG存在的情况下,使菌落呈现蓝色,否则菌落呈现白色。请结合图示完善下列操作步骤:
(1)目的基因的筛选与获取:可以从 (填“胰岛A细胞”或“胰岛B细胞”)中提取mRNA,逆转录获取cDNA,原因是 。
(2)基因表达载体的构建:为使目的基因与载体正确连接,最好选用限制酶 切割质粒。为保证目的基因能和质粒连接,扩增目的基因时需在引物的 端添加相应序列,左侧引物上连接的序列是
。
(3)将目的基因导入受体细胞:将重组DNA导入大肠杆菌细胞之前,需要用 处理大肠杆菌。有人提出,将受体细胞改为酵母菌更合适,从细胞结构的角度分析,原因 。
(4)目的基因的检测与鉴定:将目的基因导入受体细胞后,用选择培养基进行筛选,培养基中除大肠杆菌必需的营养物质外,还应加入 。后续还需要进行分子水平的检测和个体水平的鉴定,其中检测目的基因是否完成表达的方法是 。
(5)从基因改造角度分析,利用转基因技术生产胰岛素相比传统提取方法有哪些优点: 。
答案 (1)胰岛B细胞 因为基因的选择性表达,只有胰岛B细胞中的胰岛素基因才会转录出mRNA (2)XhoⅠ和MunⅠ 5' 5'-CTCGAG-3' (3)Ca2+ 酵母菌为真核生物,有内质网和高尔基体,可以对合成的多肽进行加工处理,合成成熟的胰岛素 (4)X-gal、IPTG、氨苄青霉素 抗原—抗体杂交 (5)能大规模培养,持续、高效地生产胰岛素;可降低生产成本;能保证胰岛素的纯度和质量
10.★★★(2026届四川部分学校联考)科学家利用基因工程技术将抗虫基因导入棉花细胞,从而获得抗虫棉。该技术涉及的质粒上含氨苄青霉素抗性基因和多个限制酶切割位点,其结构如图1所示。抗虫基因上的限制酶切割位点如图2所示,部分限制酶和其识别序列及切割位点如表所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列及切割位点
BamHⅠ 5'-G↓GATCC-3'
XhoⅠ 5'-C↓TCGAG-3'
SalⅠ 5'-G↓TCGAC-3'
SmaⅠ 5'-CCC↓GGG-3'
(1)质粒通常作为载体,图1上还缺少的结构是 。某同学准备使用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割抗虫基因,与仅用SalⅠ切割抗虫基因相比,其优势是 。
(2)下一步切割质粒时,应选择限制酶 ,理由是 。
(3)将重组质粒导入农杆菌后,需在培养基中添加 以筛选成功转化的农杆菌。通过农杆菌转化法将抗虫基因导入棉花细胞,依据的原理是 。
(4)若已成功导入抗虫基因的植株仍会被害虫啃食,下一步需要进行的研究方向是
。
答案 (1)复制原点、终止子 可防止抗虫基因自身环化,可防止抗虫基因反向插入质粒 (2)BamHⅠ和SalⅠ 抗虫基因是使用限制酶BamHⅠ和XhoⅠ切割的,限制酶XhoⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因,故不能选择限制酶XhoⅠ,且限制酶SalⅠ与XhoⅠ切割后会形成相同的黏性末端 (3)氨苄青霉素 农杆菌Ti质粒上的T-DNA可转移至被侵染的棉花细胞并整合到该细胞的染色体DNA上 (4)研究抗虫基因在棉花细胞内的表达情况(或检测是否产生相应的抗虫蛋白),抗虫蛋白的抗虫效果
微专题 基因编辑技术
五年高考
1.★★★★(2024广西,21,14分)M蛋白与“记忆”的形成密切相关。科研人员制备了M基因表达可控的实验模型小鼠,主要制备流程如图所示,实验模型小鼠通过特异性表达Cre重组酶来敲除两个LoxP位点间的序列,同时利用体内表达的蛋白A激活诱导型T启动子。利用融合绿色荧光蛋白基因的M基因(M-GFP)的表达,恢复小鼠自身被敲除的M基因功能,同时便于示踪。回答下列问题:
注:基因型A/+指的是A基因被嵌合在细胞同源染色体中的一条,即可表示为Aa;两端添加上LoxP位点的M基因称为floxM。
(1)在PCR扩增片段①和②时,通常会在所用引物的一端添加被限制酶识别的序列,该序列添加的位置位于引物 (选填“3'端”或“5'端”)。在构建载体1时,为了阻断A基因的表达,从转录水平考虑,连接的片段可以是 ;而从翻译水平考虑,连接的片段可以是 。为了鉴定载体2是否构建成功,需要限制酶切割载体后,再进行 。
(2)培养小鼠胚胎干细胞需定时更换培养液,其目的是
(至少答2方面)。
(3)为了快速高效繁育出含有4对基因(遵循自由组合定律)的实验模型小鼠,应将培育出的基因型Cre/+A/+小鼠和M-GFP/+floxM/+小鼠分别与基因型floxM/floxM小鼠杂交,杂交获得的子代,再进行一代杂交后最终获得基因型为 实验模型小鼠。
(4)为了实现M基因的表达可控,在实验模型小鼠喂食时,可添加竞争性结合A蛋白的四环素,抑制T启动子的活性。添加四环素与未添加相比,目的是 。
答案 (1)5'端 两端包含LoxP序列的终止子 两端包含LoxP序列的可转录出终止密码子相应的DNA序列 电泳 (2)清除代谢物、提供营养物质 (3)Cre/+A/+M-GFP/+floxM/floxM (4)添加四环素会竞争性结合A蛋白,无法激活T启动子,导致M-GFP基因不能表达,从而不能恢复被敲除的M基因的功能;不添加四环素,A蛋白基因表达激活T启动子,启动M-GFP基因表达,从而恢复被敲除的M基因的功能。通过添加和不添加四环素的自身对照,增加实验的准确性
2.★★★★(2023天津,17,12分)构建可利用纤维素产乙醇的转基因酿酒酵母菌株是解决能源危机的手段之一,为此设计表达载体,思路如下。
(1)外源基因的选择:纤维素常见生物降解途径如下。
纤维素寡糖纤维二糖葡萄糖
酿酒酵母通常无法吸收纤维素、寡糖和纤维二糖,应向酿酒酵母转入图中三种酶的基因,并使其表达产物在细胞 (内/外)发挥作用。
(2)外源基因的插入方法:同源重组是碱基序列基本相同的DNA区段通过配对、链断裂和再连接而产生片段交换的过程。通过同源重组将外源基因插入染色体的特定位点可获得遗传稳定的工程菌株,如甲图所示。
酿酒酵母基因组有多个AB短序列。为通过同源重组将外源基因插入AB之间,在设计表达载体时,可采用PCR技术在外源基因两端分别引入A和B,获得乙图所示长片段。PCR时应选用的一对引物为
(从P1~P6中选)。
(3)标记基因的选择:URA3是尿嘧啶合成关键酶基因,常被用作标记基因。另外,URA3编码的蛋白可将外源5-氟乳清酸转化为有毒物质,导致细胞死亡。
①为得到成功插入酶Ⅰ基因的菌株1,需将酶Ⅰ基因同URA3一起插入URA3缺陷型酿酒酵母基因组AB之间,并利用 的培养基筛选存活菌株。
②在后续插入酶Ⅱ基因时,为继续利用URA3作为筛选标记,需切除菌株1的URA3。为此设计表达载体时,还应向URA3两端引入酿酒酵母基因组中不存在的同源区段C和C',并以图中方式 排列才能通过同源重组达到上述目的。
此后,需要将菌株1在 的培养基上培养,存活菌株即为URA3被成功切除的菌株1'。
(4)表达载体的构建:综上,为将三种酶基因依次插入酿酒酵母基因组中,在构建表达载体时,A、B、C、C'、URA3和酶基因应采用图 的排布方式。
答案 (1)外 (2)P1和P6 (3)①不含尿嘧啶 ②2 含有5-氟乳清酸和尿嘧啶 (4)4
三年模拟
3.★★★★(2025届河北衡水中学三模)CRISPR/Cas9基因编辑技术已被广泛应用于基因治疗等领域。其基本工具sgRNA/Cas9来源于原核细胞,包括具有导向功能的sgRNA和行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白,技术原理如图甲所示。回答下列问题:
限制酶 识别序列和切割位点
BglⅡ 5'-A↓GATCT-3'
NheⅠ 5'-G↓CTAGC-3'
EcoRⅠ 5'-G↓AATTC-3'
HindⅢ 5'-A↓AGCTT-3'
某研究团队以人乳腺癌MDA-MB-231细胞、Lenti-Cas9-sgRNA质粒等为材料,进行原位定点敲除乳腺癌细胞中的人源黏着斑蛋白(VCL)基因,以研究该基因在细胞中的作用,为乳腺癌的治疗提供理论支持。
(1)获取目的基因。经过改造的质粒已经插入了Cas9蛋白基因如图乙,故只需要根据 基因的部分序列人工合成sgRNA基因即可。
(2)构建表达载体。人工合成的sgRNA基因如图丙,需要通过 扩增,为了确保酶切后能正确连接到质粒上(相应酶切序列如图乙),需在引物1的5'端加上碱基序列 ,引物2的5'端加上碱基序列 。
(3)导入受体细胞。利用慢病毒将包含sgRNA基因的重组质粒及相应对照质粒(空质粒)分别转入不同的乳腺癌MDA-MB-231细胞。感染后用 (填抗生素)筛选成功导入目的基因的细胞。设计转入空质粒的乳腺癌细胞的目的是 。
(4)检测与鉴定。获得稳转细胞系,培养3 d后收集细胞全部蛋白检测VCL,结果如图丁,显示敲除成功。检测特定蛋白质的原理是 。
(5)该技术还可用于通过同源重组修复插入外源目的基因。正确的操作是:导入基因编辑工具表达载体的同时,导入外源目的基因,且在目的基因两端加上与 相同的序列。
答案 (1)人源黏着斑蛋白(VCL) (2)PCR 5'-AGATCT-3' 5'-GCTAGC-3' (3)卡那霉素和潮霉素 在检测敲除效果时作对照 (4)抗原、抗体特异性结合 (5)Cas9切点两侧碱基序列
4.★★★★(2025届江西部分学校模拟)CRISPR/Cas9系统的gRNA能与目标DNA序列互补,指导Cas9酶精确地定位到基因的特定位置并切割DNA。同源重组是利用具有相同或高度相似序列的DNA分子之间的自然重组机制,将外源基因或DNA片段精确地插入、删除或替换到宿主细胞基因组的特定位置。乙肝e抗原(HBeAg)是乙型肝炎病毒源性免疫抑制因子。构建能在肝脏中特异性稳定表达HBeAg的转基因动物对于深入研究HBeAg的作用机制具有重要意义。研究人员克隆乙型肝炎病毒的HBeAg基因,采用CRISPR/Cas9和同源重组技术在Rosa26基因位点定点插入HBeAg,构建转HBeAg基因小鼠,并开展相关研究。构建过程如图1所示(注:虚线交叉部分的序列为同源序列,P1~P4表示特异性扩增基因片段的引物)。回答下列问题:
(1)为获得足够多的小鼠受精卵作为受体细胞,可对雌性小鼠注射 后获得卵细胞。体外受精技术主要包括 等步骤。
(2)可采用 技术将Cas9基因的mRNA、gRNA和重组载体转入小鼠的受精卵中。本实验的gRNA具备的特点是 。Cas9基因的mRNA的作用是
。
(3)成功转基因受精卵发育而成的F0小鼠(小鼠1和小鼠2)的DNA用P1和P2引物、P3和P4引物进行PCR扩增后经电泳得到图2的片段。将F0与野生型小鼠杂交,F1的转基因阳性小鼠相互杂交培育转HBeAg基因纯合子小鼠。在F2得到的14只小鼠中,经P3和P4引物检测结果如图3。则含有HBeAg基因的小鼠是 。请利用PCR技术为选出转HBeAg基因纯合子小鼠,实验的方法和预期结果是 。
答案 (1)促性腺激素 卵母细胞的采集、精子的获取和受精 (2)显微注射 与Rosa26基因的特定位点的碱基互补配对 在细胞内翻译生成Cas9酶,完成目标序列的定点切割 (3)1、2、6、10、11、14 将含有HBeAg基因的小鼠的DNA用P1和P2引物进行PCR扩增后电泳;预期结果为:只能扩增出7.8 kb条带的小鼠为纯合子(合理即可)
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