高考生物二轮复习 生物技术与工程 专题十四 细胞工程与基因工程 课件(共119张PPT)

(共119张PPT)
专题十四　细胞工程与基因工程
思维导图 体系构建
细胞的全
能性
细胞
增殖
细胞膜
的流动性
细胞核的
全能性
获能
桑葚胚、
囊胚
将内细胞团
均等分割
限制酶
利用PCR获取
和扩增
基因表达载
体的构建
分子
水平
基因
考点1
考点1　植物细胞工程
1．植物细胞工程的两大技术
全能性
2．植物组织培养的条件
(1)植物组织培养的关键
添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
离体
(2)植物激素的使用
生长素与细胞分裂素的比值 作用效果
高 促进根分化、抑制______形成
低 促进芽分化、抑制根形成
适中 促进________________形成
芽
愈伤组织
3.植物体细胞杂交的关键
(1)酶解法——用__________和________去除细胞壁。
(2)融合的方法——聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。
(3)杂种细胞的形成标志——____________的形成。
(4)培养杂种植株的技术——植物组织培养。
(5)杂种植株培育成功的原理——细胞具有全能性。
不能利用病毒融合法
纤维素酶
果胶酶
新细胞壁
【真题研读】
1．(2023·广东选择考)人参皂苷是人参的主要活性成分。科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。下列叙述错误的是(　　)
A．细胞融合前应去除细胞壁
B．高Ca2＋—高pH溶液可促进细胞融合
C．融合的细胞即为杂交细胞
D．杂交细胞可能具有生长快速的优势
√
解析：植物细胞外面有一层细胞壁，这层细胞壁阻碍着细胞间的杂交。因此，在进行体细胞杂交之前，必须先利用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，获得原生质体，A正确。人工诱导原生质体融合的方法基本分为两大类——物理法和化学法，物理法包括电融合法、离心法等；化学法包括聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等，B正确。融合的细胞可能由一种细胞融合而成，也可能由两种细胞融合而成(即杂交细胞)，C错误。杂交细胞可能具有生长快速的优势，D正确。
2．(2025·四川选择考)研究人员用花椰菜(BB，2n＝18)根与黑芥(CC，2n＝16)叶片分别制备原生质体，经PEG诱导融合形成杂种细胞，进一步培养获得再生植株，其中的植株N经鉴定有33条染色体。下列叙述正确的是(　　)
A．两个原生质体融合形成的细胞即为杂种细胞
B．再生植株N的形成证明杂种细胞仍具有全能性
C．花椰菜和黑芥的原生质体能融合，证明两种植物间不存在生殖隔离
D．植株N的B组和C组染色体不能正常联会配对，无法产生可育配子
√
[命题延伸]——判断与填空
(1)植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异。(　　)
(2)植物体细胞杂交过程中，需先脱分化再诱导融合。(　　)
(3)为了获得高产淀粉酶的枯草芽孢杆菌，可利用现有菌种，通过________后再筛选获得，或利用转基因、________________等技术获得。
×
×
人工诱变
原生质体融合
(4)在诱导形成愈伤组织阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是__________________________________________________。
(5)培养胡萝卜根组织可获得试管苗，获得试管苗的过程如图所示。步骤③切取的组织块中要带有形成层，原因是___________________________；从步骤⑤到步骤⑥需要更换新的培养基，其原因是______________________
____________________________________________________________。
步骤⑥要进行照光培养，其作用是__________________________________
__________。
细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织
形成层容易诱导形成愈伤组织
诱导愈伤组织形成和诱导愈伤组织分化形成试管苗所需的生长素和细胞分裂素的比例不同
诱导叶绿素形成，使试管苗能够进行
光合作用
(6)①植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有_______________________________________
(答出两点即可)。
②用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物________进行组织培养。
能保持优良品种的遗传特性、繁殖速度快
茎尖
√
【对点突破】
1．“不是花中偏爱菊，此花开尽更无花”，菊花因高洁的品质备受人们喜爱。为实现菊花的快速繁殖，研究人员利用其外植体培养出大量幼苗，下列属于该培养过程必需条件的是(　　)
A．外植体细胞具有完整的细胞核
B．外植体需经过彻底灭菌处理
C．外植体需用酶分散成单个细胞
D．外植体细胞处于未分化状态
解析：细胞核是遗传和代谢的控制中心，是遗传信息库，含有该种植物完整的遗传信息，故将菊花细胞培养成幼苗过程中外植体细胞必须具有完整的细胞核，A符合题意；植物组织培养过程中，为防止杂菌污染，外植体需进行消毒处理，B不符合题意；植物组织培养过程中外植体无须用酶分散成单个细胞，C不符合题意；植物组织培养的原理是植物细胞具有全能性，其具体过程是外植体脱分化形成愈伤组织，再分化形成新植株，故外植体细胞无须处于未分化状态，D不符合题意。
2．(2025·清远高三质检)科学家为解决马铃薯因感染茄科霍尔氏菌导致产量下降问题，利用植物体细胞杂交技术成功获得了茄子融合亲本的抗青枯病杂种植株。下列相关说法错误的是(　　)
A．混合酶液处理过程需要用纤维素酶和果胶酶混合去除细胞壁
B．过程①可利用聚乙二醇、Ca2＋载体等方法诱导原生质体融合
C.过程②成功的标志是融合的原生质体长出新的细胞壁
D．过程③需对获得的杂种植株进行筛选
√
解析：在进行植物体细胞杂交时，需要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，以获得原生质体，所以混合酶液处理过程需要用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，A正确；过程①是诱导原生质体融合，常用的方法有物理法(离心法、电融合法等)和化学法(聚乙二醇融合法等)，而Ca2＋载体一般用于激活重构胚，B错误；过程②成功的标志是融合的原生质体长出新的细胞壁，这意味着杂种细胞已经形成了完整的细胞结构，C正确；过程③是将愈伤组织培育成杂种植株，由于融合过程可能存在多种情况，所以需对获得的杂种植株进行筛选，以得到抗青枯病的杂种植株，D正确。
考点2
考点2　动物细胞工程与胚胎工程
1.
2.
特定抗原
特定抗体
3．动物体细胞克隆技术(核移植技术)
原理：动物细胞核的全能性
MⅡ期
去核
重构胚
4.
(1)操作流程
超数排卵
妊娠
(2)生理学基础
5．胚胎分割
桑葚胚或囊胚
动物的无性繁殖或克隆
【真题研读】
1．(2025·广东选择考)将人眼睑成纤维细胞传代培养后，再培养形成支架，在该支架上接种人口腔黏膜上皮细胞，培养一段时间后分离获得上皮细胞片层，可用于人工角膜的研究。上述过程不涉及(　　)
A．制备细胞悬液
B．置于5%CO2等适宜条件下培养
C．离心收集细胞
D．用胰蛋白酶消化支架后分离片层
√
解析：动物细胞培养时，需要先用胰蛋白酶处理将组织分散为单个细胞，再用离心法收集，之后将收集的细胞制成细胞悬液，分瓶培养，A、C不符合题意；动物细胞需要置于5%CO2等适宜条件下培养，5%CO2有助于维持培养液的pH值，B 不符合题意；用胰蛋白酶处理消化支架容易导致上皮细胞片层也被分散为单个细胞，无法分离获得上皮细胞片层，D符合题意。
2．(2023·广东选择考)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及的操作是(　　)
A．超数排卵　　　　 B．精子获能处理
C．细胞核移植 D．胚胎培养
解析：试管动物的培育过程主要包括：①精子的采集与体外获能处理，卵子的采集(为获得更多卵子可进行超数排卵处理)与成熟培养；②卵子与精子的体外受精；③胚胎的早期培养；④待胚胎生长到一定阶段后，进行胚胎移植。综上，C符合题意。
√
3．(2025·山东等级考)利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛的过程如下图所示，下列说法错误的是(　　)
A．对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞
B．卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅰ中期进行
C．培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液
D．可用PCR鉴定犊牛丁是否为转基因牛
√
解析：由题图可知，牛乙提供卵母细胞，故对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞，A正确；卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅱ中期进行，B错误；培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，C正确；可用PCR鉴定犊牛丁是否含有目的基因，以鉴定其是否为转基因牛，D正确。
[命题延伸]——判断与填空
(1)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH，无菌、无毒环境以及含95%空气和5%CO2的气体环境等基本条件。
(　　)
(2)研究者制备单克隆抗体用于快速检测甲状旁腺激素(PTH)，制备过程中能筛选分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞。(　　)
(3)胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。(　　)
(4)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是血清经过高温处理后加入培养基。(　　)
√
×
×
×
(5)将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。(　　)
(6)动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。(　　)
(7)①添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是______________________________________________________________
___________________。
②在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对__________________和___________________________________生长具有抑制作用。
×
×
使细胞接触处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组，从而导致细胞膜相互亲和，促进融合
未融合的(亲本)细胞
融合的具有同种核的细胞
③单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是
__________________________________________________。
(8)①为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是________。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是______________________________________________________________________________。
②请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是____________________
__________________________________________________。
通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞
冷冻保存
刚排出的精子不能与卵子受精，只有获能后才具备受精能力(答案合理即可)
同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植
对受体母羊进行
【对点突破】
题点1　动物细胞的培养及核移植
1．骨髓间充质干细胞(BMSC)在某些诱导剂作用下可分化成心肌细胞，在心脏类疾病的治疗中拥有广阔的应用前景。在细胞培养的过程中，通过检测细胞中基因的表达产物可以判断细胞的分化方向。科研人员研究丹酚酸B(丹参提取物)对BMSC分化的影响，从大鼠体内分离BMSC并进行多代培养，用一定浓度的丹酚酸B处理一段时间后，与对照组相比，实验组中与分化为心肌细胞相关的关键基因的mRNA含量明显增加。下列叙述错误的是(　　)
A．在使用丹酚酸B和生理盐水处理细胞前，需对两种试剂进行灭菌处理
B．原代培养的BMSC出现接触抑制时，需要用胃蛋白酶处理并进行分瓶培养
C．BMSC与诱导多能干细胞都是具有分裂能力的细胞，且具有一定的分化潜能
D．推测丹酚酸B是通过促进相关基因的转录来促进BMSC分化为心肌细胞
√
解析：动物细胞工程中，应注意无菌操作，在使用丹酚酸B和生理盐水处理细胞前，需对两种试剂进行灭菌处理，A正确；原代培养的BMSC出现接触抑制时，需要用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理并进行分瓶培养，B错误；BMSC与诱导多能干细胞都是具有分裂能力的细胞，且具有一定的分化潜能，C正确；基因转录是以DNA的一条链为模板合成RNA的过程，分析题意可知，用一定浓度的丹酚酸B处理一段时间后，与对照组相比，实验组中与分化为心肌细胞相关的关键基因的mRNA含量明显增加，故据此推测丹酚酸B是通过促进相关基因的转录来促进BMSC分化为心肌细胞，D正确。
2．为研究治疗性克隆技术能否用于帕金森病的治疗，科研人员利用帕金森病模型鼠进行下图所示实验。下列叙述错误的是(　　)



A．过程①中选择MⅡ期的卵母细胞有利于细胞核全能性恢复
B．过程②中重组细胞培养依次经历了桑葚胚、原肠胚和囊胚等过程
C．过程③的关键是利用特定条件诱导胚胎干细胞相关基因表达
D．过程④无需对受体小鼠注射免疫抑制剂以抑制其细胞免疫功能
√
解析：由于卵母细胞含有激发细胞核全能性的物质，过程①中选择MⅡ期的卵母细胞有利于细胞核全能性的恢复，A正确；过程②中重组细胞培养并获取胚胎干细胞，依次经历了桑葚胚、囊胚过程，B错误；过程③的关键是利用特定条件诱导胚胎干细胞相关基因表达，使之分化形成神经元，C正确；由于移植神经元来自小鼠自身皮肤细胞的诱导分化，不会出现免疫排斥反应，因此过程④中无须对受体小鼠注射免疫抑制剂，D正确。
题点2　动物细胞融合及单克隆抗体
3．(2025·汕头高三三模)非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种具有包膜的双链DNA病毒。科研人员设计如下流程制备ASFV单克隆抗体。下列叙述错误的是
(　　)
A.该流程利用了动物细胞融合和动物细胞培养技术
B．①是从免疫小鼠脾中提取的多种B淋巴细胞
C．②和③所进行的两次筛选过程都不需要用到ASFV
D．该单克隆抗体直接应用于人体可能会引起过敏反应
√
解析：制备单克隆抗体需要将已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，制成杂交瘤细胞，然后进行细胞培养使之产生单克隆抗体，该过程中需要用到动物细胞融合技术和动物细胞培养技术，A正确；由题图可知，在①之前向小鼠体内注射ASFV，引发小鼠特异性免疫，由于在此过程中，小鼠还可能接受其他抗原刺激，因此从其脾中提取的B淋巴细胞有多种，B正确；③代表第二次筛选，即克隆化培养和抗体检测，其中抗体检测需要用到ASFV，C错误；该单克隆抗体是利用小鼠制备的，作为生物制剂应用于人体，因为其属于异源蛋白可能会引起过敏反应，D正确。
4．为减少鼠源单克隆抗体可能引起的副作用，某研究团队对鼠源单克隆抗体F进行改造，制备了人—鼠嵌合抗体F′，具体流程：提取鼠源杂交瘤细胞RNA，逆转录后通过PCR扩增抗体F的基因序列，将其部分序列用人的相应抗体基因序列进行替换，再构建表达载体，在体外制备人—鼠嵌合抗体F′。为检测抗体性质，他们测定了F′单独与抗原作用时对抗原的结合能力以及F′和F同时与抗原作用(F′与F初始浓度相同)时F′对抗原的结合能力，结果如下图所示。下列叙述错误的是(　　)
A．向小鼠体内注入抗原后提取B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞
B．可通过将基因表达载体导入小鼠细胞制备嵌合抗体F′
C．据图推测，抗体基因序列被替换后改变了与抗原的结合位点
D．在共同作用实验中，当F′浓度较高时，抗原更多与F′结合
√
解析：用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从小鼠体内提取能产生特定抗体的B淋巴细胞，与骨髓瘤细胞融合获得杂交瘤细胞，A正确；基因的表达载体可导入小鼠细胞，并在小鼠细胞内表达，产生嵌合抗体F′，B正确；由于抗原、抗体的结合具有特异性，故抗体基因序列被替换后并没有改变与抗原的结合位点，C错误；由题图可知，在共同作用实验中，F′的稀释度小时，F′对抗原的结合能力较强，F′的稀释度增大时，F′对抗原的结合能力减小，即当F′浓度较高时，抗原更多与F′结合，D正确。
题点3　胚胎工程综合应用
5．通过体外受精培育小鼠的过程如下图所示。下列相关叙述正确的是
(　　)
A．①过程是先用雌激素使雌鼠超数排卵，再从输卵管或卵巢中采集卵子
B．②过程发生了有性生殖，此过程中常见的变异类型有基因突变和基因重组
C．③过程是体外胚胎早期发育，④过程是将培养至囊胚或原肠胚阶段的胚胎进行胚胎移植
D．②过程发生受精作用，受精的标志是观察到两个极体或雌、雄原核
√
解析：①过程是卵母细胞的采集，此时可以用促性腺激素使雌鼠超数排卵，A错误；②代表受精过程，此过程中不会发生基因重组，常见的变异类型有基因突变和染色体变异，B错误；④过程是胚胎移植，将培养至桑葚胚或囊胚阶段的胚胎进行胚胎移植，C错误；②过程发生受精作用，受精的标志是观察到两个极体或雌、雄原核，D正确。
6．第三代试管婴儿技术(PGD/PGS)是对早期胚胎细胞进行基因诊断和染色体检测后再进行胚胎移植，流程如下页左上图所示。图中检测包括PGD、PGS(PGD是指胚胎植入前的基因诊断，PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测)。下列叙述正确的是(　　)
A．采集的卵子需培养至MⅠ期才能与获能的精子进行受精
B．PGD和PGS技术可分别用于筛选红绿色盲和唐氏综合征等疾病
C.将成熟的精子放入ATP溶液中进行获能处理
D．“理想胚胎”需培养至桑葚胚或原肠胚阶段才能植入子宫
√
解析：体外受精时，需要将采集到的卵母细胞在体外培养到MⅡ期，才可以与获能的精子完成受精作用，A错误。PGD是指胚胎植入前的基因诊断，PGD可用于筛选红绿色盲；PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测，PGS可用于筛选唐氏综合征，B正确。将精子放在一定浓度的肝素或Ca2＋溶液中，用化学药物诱导精子获能，C错误。“理想胚胎”需培养至桑葚胚或囊胚才能植入子宫，D错误。
考点3
1．基因工程的操作流程
(1)目的基因的筛选与获取
考点3　基因工程、生物技术的安全性与伦理问题
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
(3)将目的基因导入受体细胞
Ca2＋处理法
(4)目的基因的检测与鉴定
PCR
PCR
抗原—抗体
2．蛋白质工程
基因合成
新的蛋白质
蛋白质结构
脱氧核苷酸序列
3．生物技术的安全性与伦理问题
(1)理性看待转基因技术
①需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
②应认识到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
③要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(2)治疗性克隆与生殖性克隆的关系
项目 类型
治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 用于医学研究和治疗疾病 用于生育，获得人的复制品
水平 细胞、组织或器官水平 个体水平
联系 都属于无性生殖；产生的新个体或新组织遗传信息相同
(3)区分试管婴儿和“设计试管婴儿”
①“设计试管婴儿”比试管婴儿多出的是过程___。　
②试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，“设计试管婴儿”可用于致命血液病等疾病的治疗。
d
【真题研读】
1．(2025·广东选择考)大肠杆菌是重要工业菌株之一，其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量，使细胞适配不同阶段的生产需求，研究者设计了两种质粒，并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白，测试质粒功能。回答下列问题：
(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2，将质粒导入感受态细胞后，在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况，结合PCR及________检测，筛选获得重组菌株W1。
荧光
(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养，定时取样检测培养液中细胞密度，方法有_____________________________________(答1种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度，其作用是_________________________________
_________________________________________________。
培养结果(图b)表明，进入生长稳定期后荧光强度快速下降，原因是
____________________________________________________________________________________________________________。
显微镜直接计数法(或细菌计数板计数法)
与接种后不同生长期的荧光强度形成对照，说明荧光强度的差异是由培养大肠杆菌引起的
C-末端带 SsrA 的红色荧光蛋白可被大肠杆菌蛋白酶系统识别降解，并且进入生长稳定期后，停止合成红色荧光蛋白
(3)研究者选用启动子Px、X基因(编码阻遏蛋白X，阻遏Px开启转录)，重新构建质粒②(图a)，导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养，W2的生长趋势不变，培养期间荧光强度的变化趋势为
__________________________________________________。
快速生长期无荧光，生长稳定期荧光逐渐增强
(4)莽草酸是一种重要工业化学品，其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱，且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物，因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长，并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累，利用上述两种质粒的调控功能，结合野生型菌株遗传物质的改造，提出重组生产菌株构建思路：_________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
图c
先敲除野生型菌株中的酶B 基因，再将质粒①中的mKate2基因替换为酶B 基因，将质粒②中的mKate2基因替换为酶 A 基因， 并将上述质粒导入其中
2．(2024·广东选择考)驹形杆菌可合成细菌纤维素(BC)并将其分泌到胞外组装成膜。作为一种性能优异的生物材料，BC膜应用广泛。研究者设计了酪氨酸酶(可催化酪氨酸形成黑色素)的光控表达载体，将其转入驹形杆菌后构建出一株能合成BC膜并可实现光控染色的工程菌株，为新型纺织原料的绿色制造及印染工艺升级提供了新思路(见图1)。回答下列问题：
(1)研究者优化了培养基的________________(答两点)等营养条件，并控制环境条件，大规模培养工程菌株后可在气液界面处获得BC菌膜(菌体和BC膜的复合物)。
碳源、氮源
(2)研究者利用T7噬菌体来源的RNA聚合酶(T7RNAP)及蓝光光敏蛋白标签，构建了一种可被蓝光调控的基因表达载体[光控原理见图2(a)，载体的部分结构见图2(b)]。构建载体时，选用了通用型启动子PBAD(被工程菌RNA聚合酶识别)和特异型启动子PT7(仅被T7RNAP识别)。为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为______________________________，理由是_______________________________________________________。
PT7、PBAD和PBAD
基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达
(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，其作用为_________________________________(答两点)。
(4)根据预设的图案用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色，其原因是_________________________________________________________。
(5)有企业希望生产其他颜色图案的BC膜。按照上述菌株的构建模式提出一个简单思路：__________________________________________________
_______________________________。
抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株
该处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素
将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色的蛋白)
解析：(1)培养基的营养物质包括水、无机盐、碳源、氮源等，研究者培养工程菌时，需要优化培养基的碳源、氮源等营养条件，并控制环境条件。(2)由题图2(a)分析可知，蓝光照射下，T7RNAPN端与T7RNAP C端结合，导致无活性的T7RNAP变成有活性的T7RNAP，结合图1，蓝光处理后，RNA聚合酶(T7RNAP)识别启动子①使基因1转录获得相应的mRNA，再以其为模板通过翻译过程获得酪氨酸酶，酪氨酸酶催化染色液中的酪氨酸形成黑色素，可见基因2和3正常表达无活性产物，被蓝光激活后再启动基因1表达，
综合上述分析可知，为实现蓝光控制染色，启动子①②及③依次为PT7、PBAD和PBAD。(3)光控表达载体携带大观霉素(抗生素)抗性基因。长时间培养时在培养液中加入大观霉素，可起抑制杂菌、去除丢失质粒的菌株的作用。(4)由小题2分析可知，蓝光照射处细胞中T7RNAP激活，酪氨酸酶表达并合成黑色素，故用蓝光照射已长出的BC菌膜并继续培养一段时间，随后将其转至染色池处理，发现只有经蓝光照射的区域被染成黑色。(5)由小题2分析可知，题干信息的设计思路最终BC膜被染成黑色，希望生产其他颜色图案的BC膜，可将酪氨酸酶替换成催化其他色素合成的酶(或将酪氨酸酶替换成不同颜色的蛋白)。
3．(2023·广东选择考)种子大小是作物重要的产量性状。研究者对野生型拟南芥(2n＝10)进行诱变，筛选到一株种子增大的突变体。通过遗传分析和测序，发现野生型DA1基因发生一个碱基G到A的替换，突变后的基因为隐性基因，据此推测突变体的表型与其有关，开展相关实验。回答下列问题：
(1)拟采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由该突变造成，则转基因植株的种子大小应与__________植株的种子大小相近。
野生型
(2)用PCR反应扩增DA1基因，用限制性内切核酸酶对PCR产物和________进行切割，用DNA连接酶将两者连接。为确保插入的DA1基因可以正常表达，其上下游序列需具备________________。
Ti质粒
启动子和终止子
(3)转化后，T－DNA(其内部基因在减数分裂时不发生交换)可在基因组单一位点插入也可以同时插入多个位点。在插入片段均遵循基因分离及自由组合定律的前提下，选出单一位点插入的植株，并进一步获得目的基因稳定遗传的植株(如下图)，用于后续验证突变基因与表型的关系。
①农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在选择培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了_________________________
__________。
②T1代阳性植株自交所得的T2代种子按单株收种并播种于选择培养基，选择阳性率约________%的培养基中幼苗继续培养。
③将②中选出的T2代阳性植株____________(填“自交”“与野生型杂交”或“与突变体杂交”)所得的T3代种子按单株收种并播种于选择培养基，阳性率达到________%的培养基中的幼苗即为目标转基因植株。
DA1基因(和卡那霉素抗性
75
自交
100
基因)
为便于在后续研究中检测该突变，研究者利用PCR扩增野生型和突变型基因片段，再使用限制性内切核酸酶X切割产物，通过核酸电泳即可进行突变检测，相关信息见下图，在电泳图中将酶切结果对应位置的条带涂黑。
如下图所示
解析：(1)据题干信息可知，突变体是由野生型DA1基因发生隐性突变形成的，采用农杆菌转化法将野生型DA1基因转入突变体植株，若突变体表型确由隐性突变造成，由于转入的基因为显性基因，则转基因植株的种子大小应与野生型植株的种子大小相近。(2)构建基因表达载体时，需要用限制性内切核酸酶对经过PCR扩增的DA1基因和作为载体的Ti质粒进行切割。为确保插入的DA1基因可以正常表达，DA1基因(目的基因)的上下游需具备启动子和终止子。(3)①卡那霉素抗性基因为标记基因，标记基因的作用是
鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的受体细胞筛选出来。用农杆菌转化T0代植株并自交，将T1代种子播种在含有卡那霉素的培养基上，能够萌发并生长的阳性个体即表示其基因组中插入了DA1基因(和卡那霉素抗性基因)。②假设DA1基因用A表示，结合题中信息知，T1代中能在含有卡那霉素的培养基上生长的植株的基因型为Aa或AA或多位点插入，T1代阳性植株自交所得T2代种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上，T1代阳性植株基因型为Aa时，该植株上所结种子有75%能够萌发并长成幼苗，因此，应选择阳性率约为75%的培养基中幼苗继续培养。
③T2代阳性植株的基因型为1/3AA、2/3Aa，将②中选出的T2代阳性植株自交，所得的T3代种子按单株收种并播种于含有卡那霉素的培养基上，基因型为AA的植株自交，其后代不会发生性状分离，在含有卡那霉素的培养基上，所有种子都能够萌发并生长，而基因型为Aa的植株自交，其后代会发生性状分离，在含有卡那霉素的培养基上部分种子不能萌发，因此阳性率达到100%的培养基中的幼苗为纯合子(AA)，即目标转基因植株。分析题图可知，野生型相关基因中不含限制性内切核酸酶X的识别序列，
不能被该酶切割，已知DA1基因的长度为150 bp，因此，野生型相关基因被限制性内切核酸酶X切割并电泳后得到的条带为150 bp。突变型相关基因中含有限制性内切核酸酶X的识别序列，用该酶切割后，突变基因被切割成100 bp、50 bp两种DNA片段，经电泳后得到的条带为100 bp和50 bp。突变型和野生型相关基因经限制性内切核酸酶X切割并电泳后得到的结果如下图所示。
[命题延伸]——判断与填空
(1)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。(　　)
(2)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对。(　　)
(3)通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期。
(　　)
(4)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异性条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异性条带的产生，可以提高复性的温度。(　　)
(5)目的基因是基因工程的关键要素，必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取。(　　)
×
√
√
√
×
(6)乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。
①接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是______________________________________________。
②若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。
__________________________________________________________________________________________________________。
重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法在宿主体内增殖
通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术，检测目的基因是否翻译形成蛋白质
(7)已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________________________________________
__________________________________________________。
(8)制备转基因植物时，用农杆菌侵染植株叶片外植体，其目的是___________________________________________________。
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞
(9)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是_______________________________________________，
终止子的作用是____________________________________。
作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞
终止转录，使转录在需要的地方停下来
【对点突破】
题点1　基因工程的操作步骤及应用
1．他汀类药物是目前应用广泛、效果理想的降脂药物，醇脱氢酶是该药物催化合成过程中的关键酶。研究人员对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR，并将其导入大肠杆菌BL-21中，构建重组醇脱氢酶工程菌，利用LB培养基可大量生产醇脱氢酶。请回答下列问题：
(1)对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR时，需要先设计引物，引物应选择图1中的_____________________________。
引物Ⅱ、引物Ⅲ
(2)PCR反应过程如图2所示，其中50 ℃复性45 s的目的是________________
______。Taq DNA聚合酶在图2中的____________过程中发挥作用。
使引物与模板链
延伸和后延伸
结合
(3)pET-28b质粒(图3)中a区段表示的是___________结构，其作用是______________________________。构建重组质粒时最好选用限制酶_________________________。
将重组质粒导入BL-21中后，培养在含有________的LB固体培养基上，以达到筛选的目的。
启动子
与RNA聚合酶结合，启动转录
NcoⅠ和XhoⅠ
卡那霉素
(4)通常用________________的方法，检测工程菌BL-21是否生产出了醇脱氢酶。
抗原—抗体杂交
解析：(1)PCR过程中，子链延伸方向为5′→3′，因此选用的引物为引物Ⅱ、引物Ⅲ。(2)PCR过程中复性的目的是使引物与模板链通过碱基之间形成的氢键而结合。Taq DNA聚合酶的作用为催化形成磷酸二酯键，延伸子链，因此在延伸和后延伸过程中发挥作用。(3)目的基因要插入启动子和终止子之间，所以a区段为启动子，启动子的作用是与RNA聚合酶结合，启动转录。构建重组质粒时最好选用限制酶NcoⅠ和XhoⅠ以避免破坏标记基因(卡那霉素抗性基因)，若只选其中一个有可能出现目的基因的倒接或目的基因和质粒的自身环化。由于标记基因是卡那霉素，故需要在含有卡那霉素
的LB固体培养基上培养，以达到筛选的目的。(4)通常利用抗原与抗体的结合具有特异性的原理，用相应的抗体检测目的基因是否表达出蛋白质，由于醇脱氢酶的本质是蛋白质，故通常采用抗原—抗体杂交的方法检测是否生产出了醇脱氢酶。
2．甜蛋白是一种高甜度的特殊蛋白质，将甜蛋白基因导入番茄可提高番茄甜味，改善果实品质，获得超甜植株。下图是甜蛋白基因和Ti质粒上限制酶切割位点示意图。回答下列相关问题：
(1)利用转基因技术获得超甜番茄的核心步骤是_____________________，该过程需要选择______________________限制酶切割甜蛋白基因。
(2)Ti质粒上的启动子是____________识别和结合的位点，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为__________________________________。
(3)农杆菌侵染番茄细胞时，T-DNA的作用是________________________
______________________________________，该过程发生的变异类型为______________。然后在添加____________的培养基中培养番茄细胞，筛选转化成功的愈伤组织。
基因表达载体的构建
XbaⅠ和Hind Ⅲ
RNA聚合酶
番茄细胞中能表达的基因的启动子
携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上
基因重组
卡那霉素
(4)若得到的超甜番茄体细胞中导入的是2个甜蛋白基因，则让其自交，若子代表型及比例为_____________________________，说明2个甜蛋白基因插到了两对同源染色体上(含有1个和2个甜蛋白基因的番茄甜味相同)。
超甜番茄∶普通番茄＝15∶1
解析：(1)基因工程的核心步骤是基因表达载体的构建。切割目的基因时，不能选择限制酶BamH Ⅰ，因为其会破坏目的基因，左侧应选择用限制酶XbaⅠ切割，目的基因应插入质粒的启动子和终止子之间，故不能选择限制酶SalⅠ，综合考虑，切割目的基因右侧应选择用限制酶Hind Ⅲ(Hind Ⅲ靠近终止子，而EcoRⅠ靠近启动子)。(2)Ti质粒上的启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点，为了保证甜蛋白基因能够在番茄细胞中表达，应将Ti质粒上的启动子替换为番茄细胞中能表达的基因的启动子。
(3)农杆菌侵染番茄细胞时，T-DNA的作用是携带目的基因进入受体细胞并将其整合到受体细胞的染色体DNA上，该过程使受体细胞发生了基因重组。由于重组质粒中含有卡那霉素的抗性基因，因此在添加卡那霉素的培养基中培养番茄细胞，筛选出导入甜蛋白基因的细胞，进而可获得转化成功的愈伤组织。(4)若2个甜蛋白基因插到了两对同源染色体上，即相当于双杂合类型，遗传上遵循基因的自由组合定律，则其自交，后代中只要含有甜蛋白基因，性状就表现为超甜，则其自交产生的后代的表型及比例为超甜番茄∶普通番茄＝15∶1。
题点2　蛋白质工程基本原理及应用
3．水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是__________，物质b是__________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是____________________。
多肽链
mRNA
密码子具有简并性
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有_____________________、__________________________________________和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是_______________。
通过构建基因文库获取
通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成
DNA半保留复制
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的____________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是_________________________________________________
____________________________________________。
种类
提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。
_________________________________________________。
取3支试管，编号为1、2、3，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、题述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间
解析：(1)蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由此可知，物质a是多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可能有几个密码子。(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有通过构建基因文库获取、通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成和利用 PCR 技术扩增。PCR 技术遵循的基本原理是 DNA半保留复制。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据题图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且两种酶差别不大；而水解产物中抗凝血活性差异较大，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、题述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路：取3支试管，编号为1、2、3，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、题述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素；用酒精消毒，用注射器取同一种动物(如家兔)血液，立即将等量的血液加入1、2、3号3支试管中，静置相同时间，统计3支试管中血液凝固时间。
题点3　生物技术的安全性与伦理问题
4．以哺乳动物为研究对象的生物技术已获得了长足的进步。对生物技术应用于人类，在安全与伦理方面有不同的观点，下列叙述正确的是(　　)
A．试管婴儿技术应全面禁止
B．治疗性克隆不需要监控和审查
C．生殖性克隆不存在伦理道德方面的风险
D．我国不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验
√
解析：试管婴儿属于有性生殖，合理范围内，试管婴儿技术是可以使用的，A错误；治疗性克隆要在严格监管下进行，B错误；生殖性克隆会引起严重的道德伦理、社会和法律问题，C错误。
5．治疗性克隆有望解决供体器官短缺和免疫排斥等问题。下图表示治疗性克隆的过程，下列说法错误的是(　　)
A.细胞A常采用去核卵母细胞作为移植的受体细胞
B．该治疗性过程应用了核移植、动物细胞培养和胚胎移植等技术
C．胚胎干细胞分化为多种体细胞是基因选择性表达的结果
D．动物细胞的培养需提供95%空气和5%CO2的混合气体
√
解析：细胞A常采用去核卵母细胞作为移植的受体细胞，因为去核卵母细胞有激活动物细胞全能性的物质，且细胞体积大，易操作，所含营养物质丰富，A正确；①表示核移植，②表示胚胎干细胞的增殖分化，该治疗性过程应用了核移植、动物细胞培养技术，并未涉及胚胎移植技术，B错误；细胞分化的实质是基因的选择性表达，C正确；动物细胞的培养需提供95%空气(有利于细胞呼吸，进行正常代谢活动)和5%CO2(维持培养液的pH)的混合气体，D正确。
创设情境 长句特训
事实概述类
1．植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是_____________________
_______________(用流程图表示)。
2．在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，其目的分别是
__________________________________________________
__________________________________________________。
答案：第一次是筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基)；第二次是进一步筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞(用抗原—抗体结合法)
3．质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是________________________。
答案：切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的DNA片段末端相同
4．为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的________________作探针进行分子杂交检测，又要在个体生物学水平上进行鉴定，后者的具体过程是___________________________________
__________________________________________________。
答案：抗盐基因(或目的基因)　将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
5．用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是__________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是_______________________________。
抗体
抗原与抗体特异性结合
原因分析类
6．若想利用植物体细胞杂交技术培养出马铃薯—草莓杂种植物，以提高土地的利用率，____________(填“能”或“不能”)把两物种细胞直接融合，理由是________________________________________________________。
植物细胞外面有一层细胞壁，阻碍了细胞间的杂交(融合)
不能
7．动物体细胞进行体外培养时，______________(填“需要”或“不需要”)脱分化过程，原因是__________________________________________
_____________________________。
高度分化的动物细胞分化的潜能变窄，失去
不需要
发育成完整个体的能力
8．若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_________________________________。
答案：未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
实验探究类
9．蛋白质NLP是拟南芥细胞内的硝酸盐受体，与硝酸盐结合后会激活硝酸盐响应基因的启动子。科研人员通过构建多种转基因拟南芥研究NLP的功能，在NLP研究中利用硝酸盐响应基因的启动子与荧光素酶基因组成报告基因。
(1)报告基因中添加荧光素酶基因的优点是____________________________
________________________________。
报告基因的受体拟南芥须为NLP合成缺陷型，以避免_______________对实验的干扰。
荧光素酶基因表达产物可催化荧光素氧化发出荧光，易于检测
细胞内NLP
(2)为获得NLP的氨基端和羧基端以分别研究其功能，科研人员构建了包含NLP片段的重组基因，如下页左上图所示，其中需要人为添加起始密码子编码序列的是___________________________________。若通过引物同时为NLP基因片段添加限制酶识别序列和起始密码子编码序列，起始密码子编码序列需添加在限制酶识别序列的__________(填“3′端”“5′端”或“3′端、5′端均可以”)。
编码羧基端的NLP基因片段
3′端
(3)利用报告基因与上述三种重组NLP基因分别制备转基因拟南芥，并编号为1组、2组、3组，与对照组分别置于含KCl或KNO3的培养基中培养，实验结果如右图。对照组拟南芥的实验处理是_________________________
_______________。
根据实验结果可知，激活硝酸盐响应基因表达的是________(填“氨基端”“羧基端”或“氨基端、羧基端均可以”)；硝酸盐存在时，NLP激活硝酸盐响应基因表达的机制是_____________________
______________________________________________。
导入报告基因，不导入
重组NLP基因
羧基端
NLP的氨基端会
抑制羧基端的激活作用，硝酸盐能够解除抑制作用