(共22张PPT)
[命题最前沿十一] 碳源、碳汇、碳达峰碳中和与水污染治理
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1．碳源和碳汇
碳源是指能够释放CO2或其他温室气体到大气中的地点、过程或系统。碳源是导致大气中温室气体浓度上升的主要原因。碳汇是指通过植树造林、植被恢复等措施，吸收大气中CO2，从而减少温室气体在大气中浓度的过程。这个过程可以减少大气中的温室气体含量，并起减缓全球气候变化的作用。
碳汇和碳源是地球上碳循环的两个重要方面。我们需要通过保护自然碳汇、发展可持续的碳汇项目和减少人为碳源的排放等措施，来共同实现碳平衡和可持续发展的目标。
2．碳达峰碳中和
(1)碳达峰碳中和提出的原因
各国二氧化碳排放→温室气体猛增→威胁生命系统→提出碳达峰碳中和。
(2)碳达峰碳中和的解释
①碳达峰：年度二氧化碳排放量达到历史最高值，之后会经历平台期，进入持续下降的过程，碳达峰是二氧化碳排放量由增转降的历史拐点。
②碳中和：在一定时间内产生的温室气体排放总量，通过植树造林、节能减排等形式，抵消自身产生的二氧化碳排放量，实现二氧化碳“零排放”。
(3)碳中和的措施
①少排放：节能减排、低碳生活。
②不排放：开发利用新能源。
③负排放：植树造林、直接捕获碳等。
3．生态浮床和水污染治理
生态浮岛，又称人工浮床、生态浮床等。它以水生植物为主体，运用无土栽培技术原理，以高分子材料等为载体和基质，应用物种间共生关系，充分利用水体空间生态位和营养生态位，从而建立高效人工生态系统，用以削减水体中的污染负荷。“纳米曝气—生物膜—水生植物”一体化生态修复集成系统是当前城市黑臭河道治理常用技术手段，该系统分别从水体增氧、微生物负载增殖、植物吸收降解等途径对黑臭水体进行全面水质净化，有效地消除水体黑臭，提高水体的自净能力，从而实现对河道的生物修复。图1是河道引清渐推生态修复工程流程图，图2是河道的模拟修复示意图。
图1
图2
突破训练
1．近百年来，随着大气 CO2浓度不断增加，全球变暖加剧。为减缓全球变暖，我国政府提出了“碳达峰”和“碳中和”的 CO2排放目标，彰显了大国责任。下列措施不利于达成此目标的是( )
A．大量燃烧化石燃料 B．积极推进植树造林
C．大力发展风能发电 D．广泛应用节能技术
解析：大量燃烧化石燃料会排放大量CO2，加剧全球变暖，A符合题意。
√
2．2020年9月，我国在联合国大会上向国际社会作出了力争在2060年前实现“碳中和”的庄严承诺。某湖泊早年受周边农业和城镇稠密人口的影响，常年处于CO2过饱和状态。经治理后，该湖泊生态系统每年的有机碳分解量低于生产者有机碳的合成量，实现了碳的零排放。下列叙述错误的是( )
A.低碳生活和绿色农业可以减少生态足迹
B．水生消费者对有机碳的利用，缓解了碳排放
C．湖泊沉积物中有机碳的分解会随着全球气候变暖而加剧
D．在湖泊生态修复过程中，适度提高水生植物的多样性有助于碳的固定
√
解析：生态足迹是指在现有技术条件下，维持某一人口单位(一个人、一个城市、一个国家或全人类)生存所需的生产资源和吸纳废物的土地及水域的面积，低碳生活和绿色农业可以减少生态足迹，A正确；水生消费者利用有机碳的生理过程为呼吸作用，氧化分解有机碳，释放二氧化碳，会加速碳的排放，B错误；湖泊沉积物中的有机碳会被微生物分解，全球气候变暖会导致微生物的分解作用加强，因此湖泊沉积物中有机碳的分解会随着全球气候变暖而加剧，C正确；在湖泊生态修复过程中，适度提高水生植物的多样性可提高生态系统的稳定性，同时有助于光能的充分利用，可使光合作用固定的二氧化碳增加，即有助于碳的固定，D正确。
3．(2025·大湾区高三二模)海洋蓝色碳汇中的“生物泵”是指海洋中有机物生产、消费、传递等一系列生物学过程以及由此导致的颗粒有机碳由海洋表面向海底的转移过程(基本过程见下图)。最新的“海洋微型生物碳泵”理论表明海洋中生物储碳主要由海洋微型生物(包括细菌和原生动物等)贡献，海洋中难以降解的惰性有机碳的储量约为6 500亿吨，与大气CO2量相当。下列叙述错误的是( )
√
A．碳在生物群落和非生物环境之间主要以CO2形式进行传递
B．海洋碳汇的机制之一是碳经食物链与食物网形成颗粒有机碳
C．海洋微型生物碳泵的碳汇效率不受海洋表层光照强度影响
D．海洋微型生物碳泵增强了海洋碳汇能力，缓解了温室效应
4. 结合水域中的生态浮床示意图，分析下列相关叙述，正确的是( )
A．生态浮床能美化环境，体现生物多样性的间接价值
B．生态浮床通过遮光来抑制藻类的光合作用，避免水华
C．生态浮床进行水体修复与植物根系吸收有机物有关
D．增设生态浮床，改变水体的能量流动方向，提高了能量传递效率
√
解析：增设生态浮床能够降低水体污染改善水质，体现生物多样性的间接价值，美化环境、提高观赏性，体现生物多样性的直接价值，A错误；生态浮床的植物在与藻类竞争阳光中占优势，从而抑制藻类繁殖，避免水华的发生，B正确；植物的根系不能直接吸收有机物，需要分解者将有机物分解为无机物后才能被根系吸收，C错误；增设生态浮床，改变水体的能量流动方向，但并没有提高能量的传递效率，D错误。
5．碳汇是指通过光合作用将CO2转化为有机碳，并储存在植物、土壤等媒介中。研究人员通过探究不同采伐强度下针阔叶混交林生态系统碳储量的动态变化，为合理选择采伐乔木的强度、提升森林碳汇能力提供理论依据。建立轻度采伐(LT)、中度采伐(MT)、重度采伐(HT)样地及对照样地(CK)，10年后统计生态系统生产者及总碳储量(t/hm2)，结果如下表所示。回答下列问题：
层次 采伐强度
CK LT MT HT
乔木层 127.11 138.47 106.65 76.87
灌木层 2.13 6.89 8.81 7.24
草本层 0.38 0.25 0.33 0.17
土壤层 204.89 183.96 238.82 299.15
生态系统 334.51 329.57 354.61 383.43
(1)森林自上而下分别为乔木、灌木和草本植物，形成群落的________________结构。群落的不同层次有各自的优势种，其中优势层的优势种称为建群种。由表可知，该群落的建群种应位于________________，判断依据是___________________________________________________。
(2)在重度采伐样地中，草本层的碳储量仅接近对照样地的一半，结合表中数据，从种间关系的角度分析这种现象形成的可能原因是_____________________________________________________。
垂直
乔木层
乔木层碳储量在各层次中相对最高，是该群落中的优势层
乔木减少使灌木获得更多的资源和空间，抑制草本的生长
(3)腐殖质是土壤中有机物经过微生物的自然分解而形成的一类有机化合物。重度采伐样地的土壤层碳汇能力增强的原因是________________________
______________________________________________________________________。
土壤中有许多细菌、真菌，主要以土壤中的腐殖质为食，这类生物的活动可以促进生态系统的________________。
重度采伐后，大量凋落物进入土壤，且根等遗留在土壤中，经过微生物分解形成腐殖质，提高碳汇能力
物质循环
解析：(1)森林自上而下分别为乔木、灌木和草本植物，具有明显的分层现象，形成群落的垂直结构。群落的不同层次有各自的优势种，其中优势层的优势种称为建群种。依据表格信息可知，乔木层的碳储量在各层次中相对最高，是该群落中的优势层，所以可推知，该群落的建群种位于乔木层。(2)依据题表信息可知，重度采伐样地与对照样地相比，乔木层的碳储量减少明显，乔木的减少使灌木获得了更多的资源和空间，抑制了草本植物的
生长，所以在重度采伐样地中，草本层的碳储量仅接近对照样地的一半。(3)腐殖质是土壤中有机物经过微生物的自然分解而形成的一类有机化合物，重度采伐样地中，采伐后大量凋落物进入土壤，且土壤中遗留了根等，经过微生物的分解形成腐殖质，提高碳汇能力，进而提高了土壤层中的碳储量。土壤中有许多细菌、真菌主要以土壤中的腐殖质为食，这类生物的活动可以促进生态系统的物质循环。(共27张PPT)
[命题最前沿十三] PCR与电泳的原理及应用
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1．PCR
(1)PCR考点总结精华——应对高考至少应该掌握的知识点
①PCR是聚合酶链式反应的缩写，原理是DNA半保留复制。所需条件包括模板、原料(4种脱氧核苷酸)、引物(2种)和耐高温的DNA聚合酶。其实质是在体外对目的基因进行大量复制。
②用PCR仪控制温度：加热变性破坏氢键(超过 90 ℃)→复性(50 ℃左右)→延伸(72 ℃左右)，需在耐高温的DNA聚合酶(不需要解旋酶、限制酶、DNA连接酶)的作用下进行。三步反应完成后，两引物间固定长度的DNA序列在PCR扩增3次后首先出现，随着重复次数的增多，DNA分子数目就以2n的形式增加。
③利用PCR扩增目的基因(如干扰素基因)时，设计引物序列的主要依据是有一段已知目的基因(干扰素基因)的核苷酸序列。所以引物是一小段单链DNA。复制方向是沿子链5′→3′，当扩增4次，共产生16个DNA时，消耗30个引物。
(2)PCR中“引物”归类分析
①引物的作用：Taq DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，Taq DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。不同引物可结合不同的目的基因并进行扩增。
②设计引物应遵循的主要原则
a．引物长度应大于16个核苷酸，可防止随机结合。
b．引物与靶序列间的Tm(指当50%的引物和靶序列表现为双链DNA分子时的温度)不应过低。
c．引物不应有发夹结构，即不能有4 bp以上的回文序列。
d．2个引物间不应有4 bp以上的互补序列或同源序列。
e．引物中碱基的分布应尽可能均匀，G＋C含量接近50%。
③引物的处理
由于引物延伸从3′端开始，3′端不能进行任何修饰，引物5′端对扩增特异性影响不大，因此，可给予修饰而不影响扩增特异性。引物5′端修饰包括加酶切位点、标记生物素、荧光等。为了使经PCR扩增的目的基因能与载体正常结合，需要在2种引物的5′端添加不同的限制酶的识别序列。其目的是保证目的基因定向插入载体并避免目的基因自身环化。
(3)PCR循环时与引物相关的计算
PCR经过n次循环产生的DNA数为2n，一共有2n＋1条链，其中有2条链是DNA母链，不含引物，其他的每1条链均含1个引物，并且2种引物的数量相等，故PCR过程经过n次循环，需要的引物总个数是(2n＋1－2)，需要某一种引物的总个数是(2n＋1－2)×(1/2)＝2n－1。一个DNA由1条母链和第1种引物延伸的子链组成，另一个DNA由另1条母链和第2种引物延伸的子链组成，其他的DNA均由2种引物延伸的2条子链组成。
2．电泳的原理及应用
DNA电泳是基因工程中最基本的技术。近年来基于DNA电泳图谱分析与比较，结合高中所学的基因诊断、DNA指纹技术以及基因克隆等相关内容的遗传学试题较为常见。以遗传学基本知识为背景，以DNA电泳图谱为情境，强调情境与立意相结合，体现高考能力考核目标和要求，很好地考查学生的获取、处理、表达信息能力和应用分析能力。
(1)DNA电泳原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300 nm的紫外灯下被检测出来。
(2)蛋白质电泳原理
蛋白质电泳常用方法是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N，N′-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
(3)电泳的应用
电泳技术已广泛用于核酸等成分的分离和鉴定。核酸的电泳条带只表示它们的种类，不表示数量，不同条带代表分子量不同的片段。
突破训练
√
1．某二倍体动物种群有100个个体，其常染色体上某基因有A1、A2、A3三个等位基因。对这些个体的基因A1、A2、A3进行PCR扩增，凝胶电泳及统计结果如下图所示。该种群中A3的基因频率是( )
A．52% B. 27% C. 26% D. 2%
解析：分析题图可知，该动物种群个体数为100个，其中有2个个体的基因型为A3A3，15个个体的基因型为A1A3，35个个体的基因型为A2A3，则A3的基因频率＝(2×2＋15＋35)÷(100×2)×100%＝27%，B符合题意。
2．亚洲棉的突变型光籽和野生型毛籽是一对相对性状，研究发现，亚洲棉某突变体的光籽表型与8号染色体的～880 kb至～903 kb区间相关，研究人员根据野生型毛籽棉的该区间设计连续的重叠引物进行PCR，产物扩增结果如下图所示，下列说法错误的是( )
A．应提取该突变体和野生型亚洲棉的全部染色体DNA进行PCR
B．上图中PCR产物的鉴定是通过琼脂糖凝胶电泳来进行的
C．据图分析可知，分子量较大的扩增产物与点样处的距离较小
D．该突变体出现的根本原因是第6对引物对应区间发生了基因突变
√
3．某研究小组利用转基因技术，将绿色荧光蛋白基因(GFP)整合到野生型小鼠Gata3基因一端，如图甲所示。实验得到能正常表达两种蛋白质的杂合子雌雄小鼠各1只，交配以期获得Gata3-GFP基因纯合子小鼠。为了鉴定交配获得的4只新生小鼠的基因型，设计了引物1和引物2用于PCR扩增，PCR产物电泳结果如图乙所示。
下列叙述正确的是( )
A．Gata3基因的启动子无法控制GFP基因表达
B．翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白
C．2号条带的小鼠是野生型，4号条带的小鼠是Gata3-GFP基因纯合子
D．若用引物1和引物3进行PCR，能更好地区分杂合子和纯合子
√
解析：由图甲可知，Gata3基因与GFP基因共用一个启动子，且由题干可知两基因能正常表达出相关蛋白质，A错误；由于启动子在左侧，基因在右侧，转录基因时，先转录Gata3基因，再转录GFP基因，由于翻译的方向是沿mRNA的5′→3′，因此翻译时先合成Gata3蛋白，再合成GFP蛋白，B正确；由图乙可知，大片段包含GFP基因编码区片段，小片段不包含GFP基因编码区片段，则2号小鼠是Gata3—GFP基因纯合子，4号小鼠是野生型，C错误；若用引物1和引物3进行PCR，杂合子和Gata3—GFP基因纯合子均能扩出条带，仅有Gata3基因时无法扩出条带，不利于区分杂合子和纯合子，D错误。
4．构筑病毒防线需要两种措施：一种是病毒检测，以阻断传播途径；另一种是疫苗研制，以增强人体免疫力。常采用RT-PCR技术(逆转录荧光PCR技术)检测多种病毒感染。该技术的原理是在PCR反应体系中加入引物的同时，加入与某条模板链互补的荧光探针，当DNA聚合酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，使荧光监测系统记录到荧光信号，即每个荧光探针被水解就有一个荧光信号生成并被准确记录(见下图)。回答下列问题：
(1)PCR反应体系中需要添加模板、原料、酶、引物等，其中引物的作用是使Taq DNA聚合酶能够从引物的________端开始连接脱氧核苷酸。从理论上推测，PCR扩增1个目的基因至第六轮循环结束，共记录到________个荧光信号，第六轮循环将消耗________个引物1。
(2)根据某病毒核酸序列设计的引物1为GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT，______(填“能”或“不能”)依据此序列设计出引物2的序列。如果待测样本中没有检测到荧光信号，初步推测样本中________(填“含有”或“不含有”)相应病毒。
3′
63
32
不能
不含有
5．苯丙酮尿症是由PKU基因突变引起的，基因定点整合可以将正常PKU基因定点整合到PKU基因突变的小鼠胚胎干细胞的染色体DNA上，替换突变基因，用于研究该病的治疗。基因定点整合的过程是从染色体DNA的突变PKU基因两侧各选择一段DNA序列HB1和HB2，根据其碱基序列分别合成HB1和HB2，再将两者分别与基因K1、K2连接，中间插入正常PKU基因和标记基因neor，构建出如下图所示的重组载体。重组载体和染色体DNA中的HB1和HB2序列发生交换，导致两者之间区域发生互换(见下图)。回答下列问题：
(1)构建重组载体时，需采用PCR对PKU基因进行扩增，扩增时，需要先加热超过90℃使DNA解聚为单链，后冷却至50 ℃左右的目的是____________________________。
(2)重组载体中的HB1和HB2之间除了插入正常的PKU基因和neor基因以外，还必须含有_____________。neor基因的作用是_____________________
______________________。
使引物结合到互补的DNA链上
启动子、终止子
鉴定与筛选含有正常
PKU基因的胚胎干细胞
(3)用图中重组载体转化时，会出现一些PKU基因错误整合的胚胎干细胞。错误整合时，载体的两个K基因中至少会有一个与neor基因一起整合到染色体DNA上，已知含有neor基因的细胞具有G418的抗性。K1、K2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。根据上述信息，设计简要的实验方案从转化的胚胎干细胞中筛选出正确整合的胚胎干细胞。
________________________________________________________________
__________________________________________________。
在含G418和DHPG的培养液中培养转化的胚胎干细胞，能够存活的即为正确整合的胚胎干细胞
6．定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲所示。研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙所示。回答下列问题：
(1)利用大引物PCR进行定点诱变需要进行两轮PCR(PCR1和PCR2)，在PCR1中，至少需要________个循环才能获得相应的大引物模板。在PCR2中，要获得带有诱变点的改良基因，引物应选用大引物两条链中的________(填“①”或“②”)。
(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶Xma Ⅰ而不选用限制酶Sma Ⅰ的原因是__________________________________________________
__________。为将改良基因构建在质粒上，还需要_________________等酶。
2
②
Sma Ⅰ的酶切末端为平末端，无法与改良基因上的黏性
末端连接
Bgl Ⅱ、DNA连接酶
(3)在构建改良基因表达载体时，有的质粒含有改良基因，有的质粒为空白质粒，将含上述元件的溶液加入大肠杆菌菌液中，在适宜温度下培养一段时间后，再将菌液涂布在含氨苄青霉素和______________的平板上。一段时间后，在培养基上出现白色和蓝色两种菌落，其中白色菌落含有重组质粒，判断的依据是_______________________________________________
______________________________________________________。
β-半乳糖苷
构建改良基因重组质粒时破坏了LacZ基因，含该质粒的大肠杆菌不能分解β-半乳糖苷产生蓝色物质，菌落为白色(共20张PPT)
[命题最前沿十二] 基因编辑技术及其应用
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CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合， 并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
突破训练
1．(2025·汕头高三一模)Cas13是一种能结合活细胞内RNA并对其进行切割的核酸酶。科研人员改造Cas13获得失去切割能力的dCas13，将其与sgRNA(向导RNA)、荧光RNA适体(能结合并激活荧光染料)结合形成结构a，以实现对目标RNA的靶向结合、可视化检测和成像(如下图所示)。下列叙述正确的是( )
A．dCas13失去的是断裂核糖和碱基间氢键的能力
B．sgRNA序列越短则与目标RNA的结合越精准
C．用不同的sgRNA制备a可同时检测不同RNA
D．细胞成像情况可评估目标RNA的位置和含量
√
解析：Cas13是能结合活细胞内RNA并对其进行切割的核酸酶，dCas13失去的是断裂核糖核苷酸之间的磷酸二酯键的能力，A错误；sgRNA序列越短，特异性越差，脱靶率越高，B错误；由题意可知，对RNA的位置和含量的检测是通过荧光呈现的，因此用不同的sgRNA制备a不能同时检测不同RNA，可分别检测，C错误；由题图可知，细胞成像情况可评估目标RNA的位置和含量，D正确。
2．CRISPR/Cas9基因编辑技术机理如下图所示，利用Cas9蛋白(一种核酸内切酶)在向导RNA(sgRNA)的引导下，切割特定DNA序列，以实现基因的定点敲除、单碱基编辑和基因片段的精准替换。下列叙述正确的是( )
A．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的sgRNA
B．sgRNA与目标DNA结合的碱基互补配对方式是A－U、U－A、G－C、C－G
C．基因片段的精准替换属于染色体结构变异
D．Cas9蛋白断裂DNA分子中的磷酸二酯键
√
解析：向导RNA(sgRNA)只需要与靶基因的部分序列配对结合，从而引导Cas9蛋白到一个特定的基因位点并剪切DNA，实现精准靶向编辑，A错误；sgRNA与目标DNA结合的碱基互补配对方式是A－T、U－A、G－C、C－G，B错误；基因片段的精准替换属于基因突变，C错误；通常通过CRISPR/Cas9基因编辑技术断裂DNA分子中的磷酸二酯键，D正确。
3．Cre/loxP酶系统可以在DNA的特定位点上执行碱基序列的删除、插入以及重组等，从而实现基因的定点编辑。Cre/loxP酶系统由Cre酶和loxP序列两部分组成，loxP序列是一段长为34 bp的DNA序列，具有方向性，Cre酶能有效识别loxP序列并从特定位置切割(如下图所示)。下列说法正确的是( )
A．Cre酶能将两个核糖核苷酸之间的磷酸二酯键断开
B．如果两个loxP序列位于一个DNA分子上，且方向相同，那么Cre酶作用于loxP序列不可形成环状片段1和片段2
C．如果两个loxP序列位于一个DNA分子上，且方向相反，那么Cre酶作用于loxP序列可形成环状片段1和片段2
D．如果两个loxP序列分别位于两个不同的DNA分子上，那么Cre酶能介导两个DNA分子的片段交换
√
解析：Cre酶与限制酶的功能类似，能将特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开，A错误；如果两个loxP序列位于一个DNA分子上，并且方向相同，那么Cre酶作用于两个loxP序列后形成的黏性末端相同，故两个loxP序列外的序列连接形成片段2，两个loxP序列间的序列首尾相连形成环状片段1，B错误；如果两个loxP序列位于一个DNA分子上，且方向相反，那么Cre酶仅能导致两个loxP序列间的序列反转连接，不能形成环状片段1和片段2，C错误；如果两个loxP序列分别位于不同的DNA分子上，那么Cre酶能介导两个DNA分子的片段交换，D正确。
4．CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如下图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是______________。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是__________________。
DNA连接酶
Ca2＋处理法
(3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________________。随后，Cas9蛋白可切割_______________________
序列。
碱基互补配对原则
目标DNA特定的核苷酸
(4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：
_________________________________________________________________
__________________________________________________。
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中
解析：(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的 DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞之前需要用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(3)根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，准确引导Cas9蛋白切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。
Cas9蛋白能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则，实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；由此可见，Cas9蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。(4)根据图示可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中。
