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2027全国版高考生物学一轮复习
课时规范练55 基因工程的基本工具与操作程序
(选择题每小题3分)
必备知识基础练
考点一 重组DNA技术的基本工具
1.(2026·湖南怀化模拟)链状DNA分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是( )
注:N代表任一碱基。
A.限制酶切断的是同一条链上两个特定相邻碱基间的氢键
B.图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖、磷酸基团各2个
C.每条链5'端、3'端的C原子分别与羟基、磷酸基团相连接
D.理论上,图示黏性末端最多可能有256种
2.(2025·山西吕梁模拟)DNA重组技术可以赋予生物以新的遗传特性,创造出更符合人类需要的生物产品。在此过程中需要使用多种工具酶。下列相关叙述正确的是( )
A.所有的限制酶都具有专一性,不同限制酶切割产生的黏性末端都不同
B.限制酶和DNA连接酶分别能催化磷酸二酯键的断裂和形成
C.限制酶识别序列越短,则相应酶切位点在DNA中出现的概率越小
D.DNA连接酶可以将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构
3.(2025·四川绵阳模拟)下图表示pBR322质粒和人生长激素基因所在片段的结构信息,将二者构建的重组质粒导入受体菌并进行筛选。下列叙述错误的是( )
pBR322质粒
人生长激素基因
注:AmpR:氨苄青霉素抗性基因;TetR:四环素抗性基因。
A.用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是含重组质粒的受体菌
B.应选择的限制酶组合是酶F和酶G
C.pBR322质粒含有的AmpR基因和TetR基因都属于标记基因
D.同时用三种限制酶处理图中质粒,完全反应后可得到4种长度DNA
考点二 基因工程的基本操作程序
4.(2026·广东深圳模拟)下图是利用基因工程培育抗虫植物的示意图。下列相关叙述正确的是( )
A.①中Ti质粒应包含启动子、复制原点等元件
B.②的构建需要限制酶和DNA聚合酶等物质的参与
C.③侵染后,重组Ti质粒的全部序列都整合到④的染色体上
D.④的染色体上若含抗虫基因,则⑤就一定表现出抗虫性状
5.(2026·河北邢台模拟)某小组将抗盐基因导入番茄细胞,培育转基因植株。下列操作错误的是( )
A.将胚接种到含生长素和细胞分裂素的培养基上可诱导形成愈伤组织
B.用Ca2+处理番茄细胞后,可将重组质粒直接导入番茄细胞
C.利用PCR技术可检测待测番茄细胞中是否含有抗盐基因
D.将转基因番茄在盐碱地中种植,可检测其是否有抗盐性状
6.(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( )
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
7.(2026·江苏南通模拟)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是( )
A.DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B.PCR过程中需要添加缓冲液,其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C.②链从L到R的方向为3'→5',①②链均可作为子链合成的模板
D.引物③的5'端添加了某序列,至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
8.(2026·内蒙古锡林郭勒盟模拟)某基因表达载体部分结构如图所示,F1、F2、R1、R2表示不同的引物。下列相关叙述错误的是( )
A.启动子是RNA聚合酶识别和结合的位点
B.该基因表达载体至少还包含复制原点和标记基因
C.PCR检测目的基因插入方向是否正确时,引物可选择F2和R2
D.若引物F1与a链相应部位序列相同,则b链为转录的模板链
考点三 实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
9.(2026·福建福州模拟)提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性。在特定的pH条件下拟核DNA分子因无法复性与其他较大的分子沉淀下来,而质粒可复性并与其他小的核酸分子留在上清液中。下列叙述正确的是( )
A.实验中不可将细菌置于无菌水中使其裂解,释放DNA分子
B.也可通过调节温度来替代调节pH使DNA先变性再复性
C.实验中可在上清液中加入2 mol/L的NaCl溶液析出质粒
D.电泳分离质粒时,条带迁移速率不受质粒大小和构象影响
10.(2024·安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是( )
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
关键能力提升练
11.(2025·八省联考云南卷)Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构。为筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链,将编码Hv-Lv肽链的DNA片段与丝状噬菌体固有外壳蛋白pⅧ的基因连接并一起表达,最后用固定化抗原筛选(过程如图)。
下列说法错误的是( )
A.Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子
B.Hv-LvDNA片段上无需连接标记基因
C.目标是获得能耐受多次冲洗的噬菌体
D.实验过程须严格遵循生物防护措施
12.(12分)(2026·河南开封模拟)紫番茄经基因编辑后可产生比普通番茄多9倍的花青素,花青素能降低人类患心脏病、糖尿病的风险。如图是花青素合成酶基因(S)的cDNA(由某种生物发育某个时期的mRNA经逆转录产生的互补DNA)和Ti质粒的结构示意图。请结合基因工程相关知识,回答下列问题。
Ti质粒
(1)构建基因表达载体时,需用限制酶切割花青素合成酶基因的cDNA和Ti质粒。若要保证目的基因完整插入Ti质粒的T-DNA区域,且后续能正常表达,应选择的限制酶组合是 ,选择依据是 。
(2)基因表达载体中,启动子的作用是 ;
标记基因(某抗生素抗性基因)的作用是 。
(3)若要检测花青素合成酶基因是否成功导入受体细胞,常用的技术是 ;若要检测花青素合成酶基因是否在受体细胞中成功表达,可采用的方法有 (答出1种即可)。
13.(10分)(2025·陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的 步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的 (填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'- -3',切割载体时应选用的两种限制酶是 。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到 上,抗性基因 可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经 形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
14.(11分)(2025·四川卷)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'-3'方向。②密码子对应的氨基酸为AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用 引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带 (填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致 ,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是 。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有 (答出1点即可)。
15.(8分)(2024·全国新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是 。
(2)CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA 互补配对可以形成的碱基对有G—C和 。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组,所用的模板是 ;若用该模板与引物P3和P4进行PCR,实验结果是 。
(4)与秸秆焚烧相比,利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是 (答出2点即可)。
参考答案
必备知识基础练
1.D 解析 限制酶切断的是DNA分子两条链上两个特定相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,A项错误。图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖2个、磷酸基团1个,B项错误。图中每条链5'端、3'端的C原子分别与磷酸基团、羟基相连接,C项错误。图中黏性末端含有4个碱基,因此,理论上,图示黏性末端最多可能有44=256(种),D项正确。
2.B 解析 不同限制酶切割产生的黏性末端可能相同,A项错误。限制酶能够识别特定的DNA序列并催化磷酸二酯键的断裂,而DNA连接酶能够催化磷酸二酯键的形成,将DNA片段连接起来,B项正确。限制酶识别序列越短,则相应酶切位点在DNA中出现的概率越大,因为短序列在DNA中出现的频率较高,C项错误。DNA连接酶的功能是将DNA片段连接起来,而不是将游离的单个脱氧核苷酸连接成双链结构,D项错误。
3.A 解析 酶E会破坏两种标记基因,为避免切割后DNA片段的自身环化,又保留质粒上的标记基因,切割时应选择的限制酶组合是酶F和酶G,由于酶F会破坏四环素抗性基因,故使用含氨苄青霉素的培养基筛选出的是导入重组质粒的受体菌和导入原质粒的受体菌,A项错误,B项正确。pBR322质粒含有的AmpR基因和TetR基因都属于标记基因,以便于对含有目的基因的受体菌进行选择,C项正确。据图可知,同时用三种限制酶处理图中质粒,因酶E有两个作用位点,故同时用三种限制酶处理图中质粒,完全反应后可得到4种长度DNA,D项正确。
4.A 解析 基因工程的关键步骤是构建基因表达载体,基因表达载体主要由启动子、目的基因、标记基因、终止子、复制原点组成,即①中Ti质粒应包含启动子、终止子、标记基因和复制原点等元件,A项正确。②是目的基因表达载体,其构建过程需要限制酶和DNA连接酶等物质的参与,B项错误。③侵染植物细胞后,重组Ti质粒上的T-DNA整合到受体细胞的染色体上,C项错误。④的染色体上若含抗虫基因,但目的基因也可能不能转录或者不能翻译,或者表达的蛋白质不具有生物活性,即⑤不一定表现出抗虫性状,D项错误。
5.B 解析 植物组织培养中,外植体(如胚)在含有生长素和细胞分裂素的培养基中可脱分化形成愈伤组织,A项正确。Ca2+处理常用于细菌(如大肠杆菌)感受态细胞的制备,而将重组质粒导入植物细胞需通过农杆菌转化法或显微注射法,B项错误。PCR技术通过特异性引物扩增目的基因片段,可检测抗盐基因的存在,C项正确。在盐碱地种植转基因番茄,通过观察其抗盐性状可直接验证目的基因的表达效果,D项正确。
6.C 解析 氯化钙处理大肠杆菌可使其处于感受态,提高转化效率,更多质粒(含目的基因或不含)被导入,会增加蓝色(未插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因完整)和白色(插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因被破坏)菌落数,A项正确。仅含卡那霉素时,导入普通质粒和含目的基因质粒的大肠杆菌均会形成白色菌落,无法判定菌株是否含目的基因,B项正确。白色菌落仅说明β-半乳糖苷酶基因被破坏(可能插入目的基因),但目的基因不一定表达,不能直接判定为表达目标蛋白的菌株,C项错误。质粒K经酶切后自身环化,导入大肠杆菌后β-半乳糖苷酶基因完整,可分解X-gal产生蓝色菌落,从而导致蓝色菌落偏多,D项正确。
7.B 解析 体内DNA复制由ATP、dNTP提供能量,体外DNA复制(PCR)由dNTP和加热提供能量,A项错误。真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2+激活,因此PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+,B项正确。根据DNA分子中两条链的反向平行关系可判断,②链从L到R的方向为5'→3',C项错误。引物③的5'端添加了某序列,经过第1次循环,得到的1个DNA分子中有1条链含有该序列;经过第2次循环,得到的1个DNA分子的两条链均含有该序列,所以至少需经2次循环就可获得该序列的双链产物,D项错误。
8.C 解析 启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,A项正确。图中有启动子和终止子等,因此该基因表达载体还需具备的结构有标记基因、复制原点等,B项正确。引物F2与R1或F1与R2结合部位包含目的基因的碱基序列,因此推测为了确定目的基因连接到质粒中且插入方向正确,进行PCR检测时,若仅用一对引物,应选择图中的引物F2和R1或F1和R2,C项错误。若引物F1与a链相应部位序列相同,根据转录时碱基互补配对原则,那么b链为转录的模板链,D项正确。
9.A 解析 细菌具有细胞壁,置于无菌水中,由于细胞壁的支持和保护作用,细菌不会吸水涨破,无法释放DNA分子,所以实验中不可将细菌置于无菌水中使其裂解来释放DNA分子,A项正确。调节温度也可使DNA先变性再复性,但无法将拟核DNA分子和质粒(DNA分子)分开,B项错误。DNA能溶于2 mol/L的NaCl溶液,在上清液中加入2 mol/L的NaCl溶液不能析出质粒(DNA),C项错误。电泳分离质粒时,条带迁移速率受质粒大小和构象影响,一般来说,质粒越小、构象越有利于迁移,迁移速率越快,D项错误。
10.D 解析 研磨液有利于DNA的溶解,更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A项正确。DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA,B项正确。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液,可利用该原理对DNA进行粗提取,C项正确。在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,故二苯胺试剂可用于鉴定DNA,但不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质,D项错误。
关键能力提升练
11.C 解析 启动子位于基因的上游,是RNA聚合酶识别与结合的位点,可用于驱动基因的转录,故Hv-LvDNA片段上游需要设计并连接启动子,A项正确。Hv-Lv肽链是抗体与抗原识别并结合的关键结构,而Hv-LvDNA可表达出Hv-Lv肽链,该技术中Hv-LvDNA属于目的基因,无需连接标记基因,B项正确。结合题意可知,该过程的目的是筛选特异性高、结合能力强的Hv-Lv肽链,C项错误。实验过程须严格遵循生物防护措施,尽可能避免可能会带来的安全问题,D项正确。
12.答案 (1)XbaⅠ和HindⅢ 切割后可产生互补黏性末端,便于目的基因定向插入,保证目的基因正常表达
(2)RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动目的基因转录 筛选出含有目的基因的受体细胞
(3)PCR技术 抗原—抗体杂交
解析 (1)构建基因表达载体时,需用限制酶切割花青素合成酶基因的cDNA和Ti质粒,由图可知,可选择XbaⅠ和HindⅢ,理由是切割后可产生互补黏性末端,便于目的基因定向插入,保证目的基因正常表达。
(2)基因表达载体中,启动子的作用是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动目的基因转录;标记基因(抗生素抗性基因)可通过在含对应抗生素的培养基中培养,筛选出含有目的基因的受体细胞。
(3)PCR技术可通过检测受体细胞DNA中是否有花青素合成酶基因,用于检测导入是否成功;检测目的基因是否表达可通过抗原—抗体杂交(检测花青素合成酶)的方法。
13.答案 (1)(4种)脱氧核苷酸 延伸
(2)5'端 AGATCT BamHⅠ与EcoRⅠ
(3)染色体DNA 2 再分化
解析 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用,将单个脱氧核苷酸加到引物的3'端进行子链的延伸。
(2)为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。根据S基因的转录方向可知,使用双酶切法保证目的基因插入方向正确,载体中含有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ三个酶切位点,而S基因上含有XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的酶切位点,首先要保证S基因结构的完整性,不能在S基因两端添加XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的限制酶识别序列,由表格信息可选择能与载体中限制酶切出相同黏性末端的限制酶,BglⅡ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同,结合S基因的转录方向可知S基因的左端为上游启动子一端,应在S基因上游添加BglⅡ的识别序列,即5'-AGATCT-3',下游直接添加EcoRⅠ的识别序列。因此,切割载体时应选用的两种限制酶为BamHⅠ和EcoRⅠ。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中的T-DNA会转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上。据图可知,载体的T-DNA片段中抗性基因2含有启动子和终止子,可正常表达,若T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上,则该细胞就可具有抗性基因2对应的抗性,因此,抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
14.答案 (1)F2、F4 保证目的基因能在链霉菌细胞中复制
(2)2 检测重组质粒是否构建成功
(3)苯丙氨酸 翻译过程无法正常进行,细菌无法合成蛋白质
(4)目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等合理答案) 发酵的最佳条件(或提高发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等合理答案)
解析 (1)引物需要结合到模板的3'端,且与目的基因的部分碱基序列互补配对,子链延伸方向为5'端→3'端,因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点,是为了保证目的基因能在链霉菌细胞中复制,使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,会得到载体片段和目的基因片段,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功,若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带,说明酶切成功,重组质粒构建可能成功。但是还需要进一步的鉴定。
(3)观察拉索西丁的作用机制图,结合所给密码子信息,可知拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC,编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点,会导致翻译过程无法正常进行,进而使细菌无法合成蛋白质,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是目的基因发生突变,导致其表达的产物结构改变,从而失去杀菌活性;也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有:发酵的最佳条件,如温度、pH、溶氧量等;如何提高发酵产物的产量;产物的分离和纯化方法等。
15.答案 (1)磷酸二酯键 片段甲含有启动子和终止子 (2)U—A、A—T (3)菌株B2的基因组DNA 无扩增产物 (4)实现废物利用,减少环境污染
解析 该工程菌的制备流程可概括为:①获得含有“M1+启动子+N基因+终止子+M2”序列的片段甲。②利用CRISPR/Cas9 技术将片段甲与细菌B1基因组中的“替换区”交换,从而将N基因插入细菌B1基因组,获得菌株B2。
(1)限制酶切割的化学键是磷酸二酯键。片段甲含有启动子和终止子,需把M1插入启动子之前,M2插入终止子之后。
(2)考查RNA与DNA的碱基配对情况。向导RNA与细菌B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C、U—A、A—T。
(3)片段甲若成功插入细菌B1基因组,则成为菌株B2,因此欲验证片段甲插入了细菌B1基因组,应该利用引物P1和P2对菌株B2基因组DNA进行PCR。如果有扩增产物,说明成功获得了菌株B2;如果没有扩增产物,说明片段甲没有插入细菌B1基因组。若以菌株B2基因组为模板与引物P3和P4进行PCR,因B2基因组中无引物P4结合序列,故无扩增产物。
(4)秸秆焚烧会产生大量有害气体,严重污染环境,且有很大的火灾隐患,焚烧对于有机物中的能量也是极大的浪费。利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点:实现废物利用,减少环境污染。
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