(共47张PPT)
限时练24 大单元八查缺补漏保分练
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[刷真题1]
1.(2025·江苏卷)某同学利用红叶李果实制作果醋,图示其操作的简易流程。下列相关叙述正确的是( )
A.果酒、果醋发酵所需菌种的细胞结构相同
B.过程①中添加适量果胶酶,有利于提高出汁率
C.过程②中,为使菌种充分吸收营养物质,需每日多次开盖搅拌
D.过程③发酵时会产生大量气泡,需拧松瓶盖放气
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解析 果酒发酵菌种是酵母菌(真核生物,有细胞核等复杂的细胞结构),果醋发酵菌种是醋酸菌(原核生物,无成形的细胞核),二者细胞结构不同,A项错误。果胶酶能分解果胶,瓦解植物的细胞壁及胞间层,过程①(榨汁)中添加适量果胶酶,有利于提高出汁率,B项正确。过程②是果酒发酵,酵母菌无氧呼吸产生酒精,开盖搅拌会引入氧气,影响酵母菌的无氧呼吸,减缓发酵进程,且易污染杂菌,C项错误。过程③是果醋发酵,发酵时主要是利用酒精产生乙酸,一般不会产生大量气泡,且醋酸菌为好氧细菌,发酵时需要通气,D项错误。
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2.(2025·河南卷)食醋和黄酒是我国传统的日常调味品,均通过发酵技术生产。下列叙述错误的是( )
A.醋酸的发酵是好氧发酵,而酒精的发酵是厌氧发酵
B.以谷物为原料酿造食醋和黄酒时,伴有pH下降和气体产生
C.食醋和黄酒发酵过程中,微生物繁殖越快发酵产物产率越高
D.使用天然混合菌种发酵往往会造成传统发酵食品的品质不一
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解析 参与醋酸发酵的微生物是醋酸菌,其代谢类型是异养需氧型,故醋酸的发酵是好氧发酵;而参与酒精发酵的微生物是酵母菌,需要通过无氧呼吸产生酒精,故是厌氧发酵,A项正确。以谷物为原料酿造食醋和黄酒时,产物中的醋酸、二氧化碳等会使pH下降,B项正确。黄酒发酵过程中,酵母菌在有氧条件下快速繁殖,在无氧条件下产生酒精,其繁殖越快则发酵产物酒精产率越低,C项错误。传统发酵食品所用的是自然菌种,没有进行严格的灭菌,以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主,往往会造成传统发酵食品的品质不一,D项正确。
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3.(2025·河北卷改编)隐甲藻是一种好氧的异养真核微藻,多在海水中腐烂的植物叶片上生长繁殖,是工业生产DHA(一种功能性脂肪酸)的藻类之一。从海洋中筛选获得的高产油脂隐甲藻,可用于DHA的发酵生产。下列叙述错误的是( )
A.隐甲藻可从腐烂的叶片获得生长必需的碳源
B.采集海水中腐烂的叶片,湿热灭菌后接种到固体培养基,以获得隐甲藻
C.选择培养基中可加入抑制细菌生长的抗生素,以减少杂菌生长
D.适当提高发酵时的通气量和搅拌速率均可增加溶氧量,以提高DHA产量
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解析 隐甲藻是异养真核微藻,可从腐烂的叶片(含有机物)获取生长必需的碳源,A项正确。湿热灭菌会杀死隐甲藻,采集腐烂的叶片后,应采用无菌操作分离隐甲藻,而非湿热灭菌后接种,B项错误。隐甲藻是真核生物,抗生素可抑制细菌的生长,故选择培养基中加入抗生素可减少杂菌生长,C项正确。隐甲藻是好氧生物,提高发酵时的通气量和搅拌速率能增加溶氧量,促进其有氧呼吸和生长,利于提高DHA产量,D项正确。
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4.(2025·陕晋宁青卷)我国是世界上最大的柠檬酸生产国。利用黑曲霉通过深层通气液体发酵技术生产柠檬酸,流程如下图。下列叙述错误的是( )
A.淀粉水解糖为发酵提供碳源和能源
B.扩大培养可提供足量的黑曲霉菌种
C.培养基、发酵罐和空气的灭菌方法相同
D.通气、搅拌有利于溶解氧增加和柠檬酸积累
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解析 淀粉不能被黑曲霉直接吸收,但水解成葡萄糖后可被吸收,所以淀粉水解糖能为发酵提供碳源和能源,A项正确。扩大培养可增加黑曲霉的数量,满足发酵的需求,B项正确。培养基、发酵罐的常用灭菌方法是高压蒸汽灭菌法,而空气常用过滤除菌法,C项错误。通气、搅拌既可增加培养液中的溶解氧,又可使菌种与营养物质充分接触,提高黑曲霉的代谢活动,利于柠檬酸的积累,D项正确。
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5.(2025·湖北卷)水母雪莲是我国的一种名贵药材,主要活性成分为次生代谢产物黄酮。水母雪莲生长缓慢,长期的掠夺性采挖导致该药材资源严重匮乏。研究人员开展了悬浮培养水母雪莲细胞合成黄酮的工程技术研究,结果如表所示。下列叙述错误的是( )
转速/(r·min-1) 55 65 75 85
相对生长速率 0.21 0.25 0.26 0.25
细胞干重/(g·L-1) 7.50 9.70 11.4 9.50
黄酮产量/(g·L-1) 0.20 0.27 0.32 0.25
A.黄酮产量与细胞干重呈正相关
B.黄酮是水母雪莲细胞生存和生长所必需的
C.氧气供给对于水母雪莲细胞生长、分裂和代谢是必需的
D.转速为75 r/min时既利于细胞分裂,又利于黄酮的积累
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解析 据表格数据可知,细胞干重越高,黄酮产量越高,推测黄酮产量与细胞干重呈正相关,A项正确。黄酮是水母雪莲的次生代谢产物,不是水母雪莲细胞生存和生长所必需的,B项错误。水母雪莲细胞生长、分裂和代谢需要细胞呼吸提供能量,所以氧气供给对于水母雪莲细胞生长、分裂和代谢是必需的,C项正确。据表格数据可知,转速为75 r/min时,相对生长速率、细胞干重和黄酮产量都是最高的,所以转速为75 r/min时既利于细胞分裂,又利于黄酮的积累,D项正确。
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6.(2025·江苏卷)图示一种植物组织培养周期,①~③表示相应过程。下列相关叙述错误的是( )
A.过程①发生了细胞的脱分化和有丝分裂
B.过程②经细胞的再分化形成不同种类的细胞
C.过程②③所用培养基的成分、浓度相同
D.培养基中糖类既能作为碳源,又与维持渗透压有关
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解析 过程①是由组织块形成愈伤组织,发生了细胞的脱分化,脱分化过程中细胞通过有丝分裂增殖,A项正确。过程②是由愈伤组织形成胚状体,经细胞的再分化形成不同种类的细胞,B项正确。过程②(愈伤组织再分化形成胚状体)和③(胚状体发育为试管苗)所用培养基的成分、浓度不同,如激素配比等有差异,C项错误。培养基中糖类既能作为碳源,为植物组织培养提供能量,又与维持渗透压有关,D项正确。
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7.(2025·河北卷)生物工程在社会生产中的应用日益广泛,下列相关技术和方法错误的是( )
A.利用组织培养技术实现兰花的快速繁殖和优良性状的保持
B.在没有CO2的有氧环境中进行胚胎干细胞培养
C.利用灭活病毒诱导B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合
D.对供体母牛注射促性腺激素使其超数排卵用于胚胎制备
B
解析 植物组织培养可保持母本的优良性状,可用于兰花的快速繁殖,A项正确。胚胎干细胞的培养需要一定浓度CO2,以维持培养液的pH,B项错误。动物细胞融合常用灭活病毒诱导,可使B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,C项正确。对供体母牛注射促性腺激素可促进卵泡发育,使供体母牛超数排卵,用于胚胎制备,D项正确。
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8.(2025·北京卷)动物细胞培养基一般呈淡红色。某次实验时,调控pH的CO2耗尽,培养基转为黄色。由此推断使培养基呈淡红色的是( )
A.必需氨基酸 B.抗生素
C.酸碱指示剂 D.血清
C
解析 在动物细胞培养时,所利用的培养基中需添加血清等天然成分,为防止杂菌污染还可添加抗生素,需在适宜的温度下在含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中培养,其中CO2的主要作用是维持培养液的pH。“某次实验时,调控pH的CO2耗尽,培养基转为黄色”,由此可推断培养基颜色变化是由酸碱指示剂导致的,C项符合题意。
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9.(2025·广东卷)将人眼睑成纤维细胞传代培养后,再培养形成支架,在该支架上接种人口腔黏膜上皮细胞,培养一段时间后分离获得上皮细胞片层,可用于人工角膜的研究。上述过程不涉及( )
A.制备细胞悬液
B.置于5% CO2等适宜条件下培养
C.离心收集细胞
D.用胰蛋白酶消化支架后分离片层
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解析 动物细胞培养时,为增大细胞与培养液的接触面积,需要制备细胞悬液,A项不符合题意。动物细胞需要置于5% CO2等适宜条件下培养,其中CO2的主要作用是维持培养液的pH,B项不符合题意。在成纤维细胞传代培养过程中,需要通过离心收集细胞,C项不符合题意。不能用胰蛋白酶消化支架,避免将上皮细胞片层分散成单个细胞,D项符合题意。
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10.(2024·湖北卷)植物甲抗旱、抗病性强,植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙,过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
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A.过程①中酶处理的时间差异,原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B.过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C.过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D.可通过分析植物丙的染色体,来鉴定其是否为杂种植株
答案 B
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解析 植物体细胞杂交过程包括原生质体的制备(去壁)、原生质体融合、再生细胞壁、植物组织培养等过程。图示过程①需要用纤维素酶和果胶酶处理去除细胞壁,酶处理的时间差异的原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异,A项正确。过程②可采用PEG融合法、高Ca2+—高pH融合法、电融合法和离心法等诱导原生质体融合,不能用灭活的仙台病毒诱导,B项错误。过程④和⑤分别是脱分化和再分化,培养基中均需要加入生长素和细胞分裂素,C项正确。杂种植株细胞中同时含有植物甲和乙的染色体,可通过分析植物丙的染色体,来鉴定其是否为杂种植株,D项正确。
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11.(2025·云南卷)孕酮具有促进子宫内膜增生,为受精卵着床做准备的作用。某奶牛场发现一头高产奶量母牛生产两胎后重复配种均未成功妊娠,该牛可正常排卵但孕酮量低于正常母牛。为获得该母牛的后代,下列说法正确的是( )
A.运用体外受精或人工授精技术可提高该牛的妊娠率
B.使用外源促性腺激素处理该牛获得更多卵子进而可获得多枚胚胎
C.体外受精或人工授精后形成受精卵移植到健康受体可提高存活率
D.使用该牛MⅡ期卵母细胞的细胞核进行核移植可获得可育后代
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解析 该母牛孕酮量低于正常母牛,子宫内膜增生可能不足,不利于受精卵着床,即使运用体外受精或人工授精技术,也难以提高妊娠率,A项错误。使用外源促性腺激素处理该牛,可促使其超数排卵,获得更多卵子,但该母牛孕酮量低于正常母牛,受精卵不能成功着床,不能获得成活胚胎,B项错误。该牛可正常排卵但孕酮量低于正常母牛,可通过体外受精或人工授精后形成受精卵移植到健康受体提高后代存活率,C项正确。核移植通常用体细胞核,而非MⅡ期卵母细胞的细胞核,D项错误。
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12.(2025·山东卷)利用动物体细胞核移植技术培育转基因牛的过程如图所示,下列说法错误的是( )
A.对牛乙注射促性腺激素是为了收集更多的卵母细胞
B.卵母细胞去核应在其减数分裂Ⅰ中期进行
C.培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液
D.可用PCR技术鉴定犊牛丁是否为转基因牛
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解析 通过对牛乙注射促性腺激素进行超数排卵处理,是为了收集更多的卵母细胞,A项正确。卵母细胞应在体外培养到减数分裂Ⅱ中期再进行去核,B项错误。培养牛甲的体细胞时应定期更换培养液,以便清除代谢废物,防止对培养的细胞造成危害,C项正确。可用PCR技术检测犊牛丁的细胞中是否含有目的基因以及目的基因是否进行了转录,从而鉴定犊牛丁是否为转基因牛,D项正确。
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13.(2025·江苏卷)梅花鹿和马鹿杂交后代生命力强、茸质好,但自然杂交很难完成,人工授精能解决此难题。胚胎工程技术的应用,可提高繁殖率,增加鹿场经济效益。下列相关叙述合理的是( )
A.采集的精液无需固定、稀释,即可用血细胞计数板检测精子密度
B.人工授精时,采集的精液经获能处理后才能输入雌性生殖道
C.超数排卵处理时,常用含促性腺激素的促排卵剂
D.母体子宫对胚胎的免疫耐受性低下是胚胎移植的生理学基础
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解析 若血细胞计数板的一个小格内精子数量过多,则计数时会因为重叠而数不清楚,应将采集的精液固定、稀释一定倍数后再进行计数,A项不合理。精子可在雌性动物生殖道内获能,人工授精时,无需提前进行获能处理,B项不合理。促性腺激素能够促进性腺发育和有性生殖细胞的成熟,促进动物超数排卵,C项合理。母体对植入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应,免疫耐受性高,这是胚胎移植的生理学基础,D项不合理。
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14.(2025·黑吉辽蒙卷)下列关于耐高温的DNA聚合酶的叙述,正确的是( )
A.基本单位是脱氧核苷酸
B.在细胞内或细胞外均可发挥作用
C.当模板DNA和脱氧核苷酸存在时即可发生催化反应
D.为维持较高活性,适宜在70~75 ℃下保存
B
解析 耐高温的DNA聚合酶的化学本质是蛋白质,基本单位是氨基酸,A项错误。PCR技术中使用的耐高温的DNA聚合酶是在胞外发挥作用,而这种酶又是从生物体内提取的,所以它又能在细胞内发挥作用,B项正确。当模板DNA和脱氧核苷酸存在时,如果缺少引物可能无法发生催化反应,C项错误。为维持酶的较高活性,适宜在低温下保存,D项错误。
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[刷真题2]
一、选择题
15.(2023·山东卷)以下是以泡菜坛为容器制作泡菜时的4个处理:①沸盐水冷却后再倒入坛中;②盐水需要浸没全部菜料;③盖好坛盖后,向坛盖边沿的水槽中注满水;④检测泡菜中亚硝酸盐的含量。下列说法正确的是( )
A.①主要是为了防止菜料表面的醋酸杆菌被杀死
B.②的主要目的是用盐水杀死菜料表面的杂菌
C.③是为了使气体只能从泡菜坛排出而不能进入
D.④可检测到完整发酵过程中亚硝酸盐含量逐渐降低
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解析 泡菜发酵过程利用的微生物主要是乳酸菌,故①主要是防止菜料表面的乳酸菌被杀死,A项错误。②的主要目的是营造无氧环境,B项错误。乳酸发酵为无氧发酵,向坛盖边沿的水槽中注满水的目的是防止外界空气进入泡菜坛,C项正确。泡菜制作过程中亚硝酸盐含量先升高后降低,D项错误。
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16.(2024·湖南卷)微生物平板划线和培养的具体操作如图所示,下列操作正确的是( )
A.①②⑤⑥
B.③④⑥⑦
C.①②⑦⑧
D.①③④⑤
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解析 由题图可知,②中拔出棉塞后应握住棉塞上部;⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全拿开,应只打开一条缝隙;⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连;⑧中平板应倒置培养。综上所述,D项正确。
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17.(2024·山东卷改编)下列关于植物愈伤组织的说法正确的是( )
A.用果胶酶和胶原蛋白酶去除愈伤组织的细胞壁获得原生质体
B.融合的原生质体需再生出细胞壁后才能形成愈伤组织
C.体细胞杂交获得的杂种植株细胞中具有来自亲本的2个细胞核
D.通过愈伤组织再生出多个完整植株的过程属于有性生殖
B
解析 去除植物细胞壁一般用果胶酶和纤维素酶,A项错误。融合的原生质体需再生出细胞壁才能说明植物体细胞融合成功,进而可进行植物组织培养,B项正确。植物体细胞杂交获得的杂种植株细胞为单核细胞(来自杂交亲本的细胞核融合为一个细胞核),C项错误。通过愈伤组织再生出多个完整植株,利用了植物细胞的全能性,属于无性繁殖,D项错误。
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18.(2024·安徽卷)植物细胞悬浮培养技术在生产中已得到应用。某兴趣小组尝试利用该技术培养胡萝卜细胞并获取番茄红素,设计了以下实验流程和培养装置(如图),请同学们进行评议。下列评议不合理的是( )
实验流程
细胞培养装置
A.实验流程中应该用果胶酶等处理愈伤组织,制备悬浮细胞
B.装置中的充气管应置于液面上方,该管可同时作为排气管
C.装置充气口需要增设无菌滤器,用于防止杂菌污染培养液
D.细胞培养需要适宜的温度,装置需增设温度监测和控制设备
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答案 B
解析 植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶,欲利用愈伤组织制备悬浮细胞,可用纤维素酶和果胶酶进行处理,A项合理。为使细胞获得充足的氧气并及时排出多余气体,装置中的充气管应置于液面下方,排气管要置于液面上方,故充气管不能同时作为排气管,B项不合理。为了防止杂菌污染培养液,装置充气口需要增设无菌滤器,C项合理。细胞培养时需要保证适宜的温度,因此装置需增设温度监测和控制设备,D项合理。
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19.(2024·甘肃卷)兰州百合栽培过程中易受病毒侵染,造成品质退化。某研究小组尝试通过组织培养技术获得脱毒苗,操作流程如下图。下列叙述正确的是( )
A.①为脱分化过程,1号培养基中的愈伤组织是排列规则的薄壁组织团块
B.②为再分化过程,愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变或基因重组
C.3号培养基用于诱导生根,其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值大于1
D.百合分生区附近的病毒极少,甚至无病毒,可以作为该研究中的外植体
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解析 ①为脱分化过程,1号培养基中的愈伤组织是排列不规则的薄壁组织团块,A项错误。②为再分化过程,愈伤组织细胞分化时可能会发生基因突变,但基因重组发生在减数分裂过程中,愈伤组织细胞分化时进行有丝分裂,不会发生基因重组,B项错误。3号培养基用于诱导生根,其细胞分裂素浓度与生长素浓度的比值应该小于1,C项错误。百合分生区(一般在茎尖、芽尖、根尖)附近的病毒极少,甚至无病毒,因此可以作为该研究中的外植体,D项正确。
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20.(2024·黑吉辽卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养,在传代后的不同时间点检测细胞数目,结果如下图。下列叙述正确的是( )
A.传代培养时,培养皿需密封防止污染
B.选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C.直接用离心法收集细胞进行传代培养
D.细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
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解析 动物细胞培养需要的条件有无菌、无毒的环境、营养物质、适宜的温度和pH、95%空气和5% CO2的混合气体环境,因此不能将培养皿密封,A项错误。处于指数增长期的细胞形态和生理特性相对稳定,适合进行传代培养。离体培养的细胞生命力比较脆弱,需要适应培养基的环境,原代培养的贴壁细胞最好在达到生长基质的80%表面积后进行传代培养,选取②的细胞进行传代培养比①更合理,B项错误。在进行传代培养时,贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理,使之分散成单个细胞,再用离心法收集,C项错误。细胞增长进入平台期,可能是因为细胞密度过大,有害代谢物积累,培养液中营养物质缺乏,发生接触抑制,D项正确。
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21.(2024·湖北卷)波尔山羊享有“世界山羊之王”的美誉,具有生长速度快、肉质细嫩等优点。生产中常采用胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊。下列叙述错误的是( )
A.选择遗传性状优良的健康波尔母山羊进行超数排卵处理
B.胚胎移植前可采集滋养层细胞进行遗传学检测
C.普通品质的健康杜泊母绵羊不适合作为受体
D.生产中对提供精子的波尔公山羊无需筛选
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解析 通过胚胎工程技术快速繁殖波尔山羊,应选择具有遗传优良性状的公羊和母羊,对母羊进行超数排卵处理后,进行发情配种或人工授精,收集胚胎并检查后,选择同一物种母羊作为受体进行胚胎移植,进行遗传学检测时可采集滋养层细胞,A、B两项正确,D项错误。绵羊和山羊不是同一物种,可能出现免疫排斥反应,C项正确。
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二、非选择题
22.(12分)(2024·黑吉辽卷)将天然Ti质粒改造成含有Vir基因的辅助质粒(辅助T-DNA转移)和不含有Vir基因、含有T-DNA的穿梭质粒,共同转入农杆菌,可提高转化效率。细菌和棉花对密码子偏好不同,为提高翻译效率,增强棉花抗病虫害能力,进行如下操作。回答下列问题。
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注:F1—F3,R1—R3表示引物;T-DNA-LB表示左边界;T-DNA-RB表示右边界;Ori表示复制原点;KanR表示卡那霉素抗性基因;HygBR表示潮霉素B抗性基因。
(1)从苏云金杆菌提取DNA时,需加入蛋白酶,其作用是_______________
_____________________________________________________________。
提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精,其目的是 。
(2)本操作中获取目的基因的方法是 和 。
水解蛋白质,使蛋
白质与DNA分离,便于后续操作中蛋白质的去除和DNA的提取
溶解蛋白质,析出DNA
PCR
人工合成
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(3)穿梭质粒中p35s为启动子,其作用是 ,驱动目的基因转录;插入两个p35s启动子,其目的可能是 。
(4)根据图中穿梭质粒上的KanR和HygBR两个标记基因的位置,用________ 基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
(5)为检测棉花植株是否导入目的基因,提取棉花植株染色体DNA作模板,进行PCR,应选用的引物是 和 。
RNA聚合酶识别和结合的部位
提高基因的表达量,使目的基因高效表达
HygBR
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(6)本研究采用的部分生物技术属于蛋白质工程,理由是 。
A.通过含有双质粒的农杆菌转化棉花细胞
B.将苏云金杆菌Bt基因导入棉花细胞中表达
C.将1—1 362基因序列改变为棉花细胞偏好密码子的基因序列
D.用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白
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解析 (1)从苏云金杆菌提取DNA时,加入蛋白酶的作用是溶解蛋白质,使蛋白质与DNA分离,便于后续操作中蛋白质的去除和DNA的提取,提取过程中加入体积分数为95%的预冷酒精可以溶解蛋白质,析出DNA。(2)由题图可知,获得目的基因的方法是PCR和人工合成。(3)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因转录。插入两个启动子可以转录出更多的mRNA分子,再进一步翻译出更多的蛋白质,提高了基因的表达量。(4)质粒上的基因在T-DNA上可以整合到宿主的核DNA上,从而在宿主细胞内表达,T-DNA外的基因不能在宿主细胞内表达。由题图可知,KanR在T-DNA外,不能在宿主细胞内表达;HygBR在T-DNA上,可以整合到宿主的核DNA上,从而在宿主细胞内表达。故用HygBR基因对应的抗生素初步筛选转化的棉花愈伤组织。
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(5)由题图可知,目的基因左侧为人工合成序列,右侧为1 363—1 848序列,人工合成序列的上链左端有F3引物结合位点且向右延伸,1 363—1 848序列的下链右端有R2引物结合位点且向左延伸,故引物选择F3和R2。(6)蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过改造或合成基因,来改造现有蛋白质,或制造一种新的蛋白质,以满足人类生产和生活的需求。而基因工程原则上只能生产自然界中已有的蛋白质。本研究中,用1—1 362合成基因序列和1 363—1 848天然基因序列获得改造的抗虫蛋白,属于蛋白质工程。(共47张PPT)
层级一:主干知识落实清单
考点1 发酵工程
【串联整合】
1.厘清四种传统发酵食品的制作技术
蛋白质
2.图解发酵工程的基本环节
3.无菌技术常用方法
4.比较两种纯化细菌的方法
接种环
涂布器
5.明确微生物分离与计数的两个实例
灭菌
灼烧灭菌
平板冷却凝固
接种环
酚红
变红
【自主落实】
[练易错]
1.判断下列有关传统发酵技术和发酵工程叙述的正误。
(1)(2023·北京卷)向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境。
( )
(2)(2022·山东卷)啤酒的工业化生产中,大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后,最终过滤、调节、分装。其中焙烤是为了利用高温杀死大麦种子的胚并进行灭菌。( )
(3)(2022·山东卷)选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。
( )
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√
(4)(2021·江苏卷)果醋发酵时,发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时产生的气泡量。( )
(5)(2021·江苏卷)果醋发酵时,用重铬酸钾测定醋酸含量变化时,溶液灰绿色逐日加深。( )
(6)(2021·湖北卷)酸奶制作过程中,后期低温处理可产生大量乳酸杆菌。
( )
√
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2.判断下列有关微生物培养技术叙述的正误。
(1)(2023·山东卷)不含氮源的平板不能用于微生物培养。( )
(2)(2022·湖北卷)微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染。( )
(3)(2022·海南卷)培养细菌时,可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基。( )
(4)(2021·江苏卷)将培养基分装于培养皿中后灭菌,可降低培养基污染的概率。( )
(5)(2021·江苏卷)为提高一株石油降解菌的净化能力,将菌涂布于以石油为唯一碳源的固体培养基上,以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。其中涂布用的菌浓度应控制在30~300个/mL。( )
(6)(2021·浙江卷)涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落,都可用于细胞计数。( )
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√
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[练表达]
3.(选择性必修3 P7正文)醋酸菌是好氧细菌,当O2、糖源都充足时能通过复杂的化学反应 ;当缺少糖源时则 。
4.(选择性必修3 P10正文)获得纯净的微生物培养物的关键是 。
5.(选择性必修3 P16思考·讨论)尿素分解菌之所以能分解尿素,是因为
______________________________________________________________。
将糖分解成乙酸
直接将乙醇转化为乙醛,再将乙醛变为乙酸
防止杂菌污染
它们能合成脲酶,脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3可作为细菌生长的氮源
6.(选择性必修3 P18正文)利用稀释涂布平板法计数,统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,这是因为______________________________________
。
7.平板划线法中第二次及其后的划线操作,总是从上一次划线的末端开始划线的原因是_________________________________________________
_______________________________________________________________
_____________________________________________________________。
8.某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是 。
当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察
到的只是一个菌落
划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次划线从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落
菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌
考点2 细胞工程和胚胎工程
【串联整合】
1.植物组织培养的过程
细胞分裂素
2.植物体细胞杂交技术
3.针对两类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程
(1)植物细胞培养技术是工厂化生产相关代谢产物的一条有效途径,在生产中通常要培养到愈伤组织阶段。因为此时细胞分裂能力旺盛,代谢快,有利于产物生成。
(2)植物组织培养的原理是植物细胞的全能性,植物细胞培养的原理是细胞增殖。
4.动物细胞培养
5.单克隆抗体的制备
B淋巴细胞
骨髓瘤细胞
选择培养基
杂交瘤细胞
克隆化培养
抗体检测
6.动物体细胞核移植
技术和克隆动物
7.胚胎工程
(1)熟知胚胎工程的操作流程
超数排卵
囊胚
内细胞团
(2)归纳胚胎工程中的三个“两”
同期发情
超数排卵
囊胚
8.胚胎分割
【自主落实】
[练易错]
1.判断下列有关植物细胞工程叙述的正误。
(1)(2023·广东卷)科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合,细胞融合前应去除细胞壁。( )
(2)(2023·北京卷)对外植体进行消毒以杜绝接种过程中的微生物污染。
( )
(3)(2023·广东卷)科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合,融合的细胞即为杂交细胞。( )
(4)(2022·上海卷)地钱具有重要的药用价值,若要利用叶片快速人工繁育,可用单倍体育种技术。( )
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2.判断下列有关动物细胞工程叙述的正误。
(1)(2023·北京卷)研究者制备单克隆抗体过程要筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞。( )
(2)(2022·江苏卷)克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植等过程。( )
(3)(2022·湖北卷)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究,结果发现其培养的原代神经元生长缓慢,其原因不可能是血清经过高温处理后加入培养基。( )
(4)(2021·江苏卷)将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。( )
(5)(2021·辽宁卷)用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体。( )
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3.判断下列有关胚胎工程叙述的正误。
(1)(2023·广东卷)科学家采用体外受精技术获得藏羚胚胎,此过程涉及的操作有超数排卵和精子获能处理。( )
(2)(2023·天津卷)培育试管动物需获得MⅡ期的去核卵母细胞。( )
(3)(2022·江苏卷)哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质。( )
(4)(2022·江苏卷)将小鼠桑葚胚分割成2等份获得同卵双胎的过程属于有性生殖。( )
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[练表达]
4.作物脱毒时一般选取根尖或茎尖分生区的组织进行组织培养,原因是
_____________________________________________________________________________________________________________________________。
5.现有甲、乙两种不同的二倍体植物(各含有一种不同的优良性状),自然状态下,甲、乙植物不能进行杂交的原因是__________________________
。运用植物体细胞杂交技术,获得具有优良性状的目的植株,若甲植物的染色体组成为2N=18,乙植物的染色体组成为4N=32,则目的植株 (填“可育”或“不可育”),原因是
______________________________________________________________________________。
植物顶端分生区附近的病毒极少,甚至无病毒,用该处细胞进行组织培养,能得到大量的脱毒苗
甲、乙植物不是同一物种,
二者存在生殖隔离
可育
目的植株含有同源染色体,减数分裂过程中联会正常,能产生正常的生殖细胞
6.利用小鼠生产的曲妥珠单抗是抗Her2的单克隆抗体,用于阻断癌细胞的生长。给小鼠注射Her2蛋白进行免疫,在获取B淋巴细胞前3天需再次注射Her2蛋白,这样做的目的是________________________________________
。诱导融合后,获得的细胞有未融合的亲本细胞、融合的具有同种核的细胞和杂交瘤细胞,原因是 。
7.收集到的运动性能良好的恒河猴精子不能与采集到的卵母细胞直接完成体外受精,原因是 。
通过二次免疫使产生抗Her2抗体的B淋巴细胞
增多
细胞融合是随机的,且融合率达不到100%
只有获能后的精子才能完成受精
8.(选择性必修3 P58相关信息)在实际胚胎工程操作中,常以观察到
作为受精的标志。
9.(选择性必修3 P62思考·讨论)胚胎移植实质上是 。
两个极体或者雌、雄原核
早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移
考点3 基因工程和蛋白质工程
【串联整合】
1.基因工程的基本工具
磷酸二酯键
黏性
磷酸
二酯
2.理解、掌握基因工程的操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
(3)将目的基因导入受体细胞
农杆菌转化法
显微注射法
(4)目的基因的检测与鉴定
3.蛋白质工程
合成
新的蛋白质
蛋白质结构
脱氧核苷酸序列(基因)
4.PCR技术
【自主落实】
[练易错]
1.判断下列有关基因工程叙述的正误。
(1)(2023·广东卷)用PCR反应扩增目的基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割,用DNA连接酶将两者连接。( )
(2)(2023·全国乙卷)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因翻译。
( )
(3)(2023·浙江卷)随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索基因文库获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。( )
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(4)(2023·广东卷)DNA鉴定时加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。( )
(5)(2022·山东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验中,离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。( )
(6)(2022·辽宁卷)为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。( )
(7)(2022·广东卷)基因表达载体中,抗生素抗性基因作为标记基因,可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞,终止子可终止翻译,使翻译在需要的地方停下来。( )
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[练表达]
2.(选择性必修3 P71旁栏思考)限制酶主要来源于原核生物,限制酶不能切割自身所在原核生物的DNA分子的原因是_________________________
。
3.(2023·山东卷)与启动子结合的酶是 ,作为载体,质粒需具备的结构有 (答出2个结构即可)。
4.(选择性必修3 P81资料卡)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将目的基因导入受体细胞并整合到染色体DNA上,原因是
____________________________________________________________________________________________________________________________。
自身所在原核生物DNA分子
中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰
RNA聚合酶
复制原点、标记基因、限制酶识别(或切割)位点
农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA上
5.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物,引物的作用是
。
6.PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+,原因是 。
7.转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物,造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中,就可以有效避免基因污染,原因是 。
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸
真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活
叶绿体基因不会通过花粉传给下一代(共25张PPT)
层级三 素养整合 诠释应用
素养 科学思维与科学探究——PCR技术及应用(选用)
一、重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这项技术目前主要有两个应用方向:基因定点突变、构建融合基因。
【例1】 (2025·山东济宁模拟)融合PCR技术采用具有互补末端的引物,形成具有重叠链的PCR产物,通过PCR产物重叠链的延伸,从而将不同来源的任意DNA片段连接起来。其原理如图所示,据图分析,下列说法错误的是( )
A.上述过程中使用的引物P2和P3的碱基需要完全互补配对
B.设计引物的目的是能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸
C.融合PCR的第一步两条链重叠部位可互为另一条链的引物
D.若融合PCR的第二步获得128个融合基因,理论上该过程消耗了254个引物
A
解析 题述过程中使用的引物P2和P3的碱基不需要完全互补配对,只需要部分碱基互补配对即可,A项错误。引物与DNA模板链结合后,能够从其3'端开始连接脱氧核苷酸,开始子链的合成,B项正确。结合图示可知,融合PCR的第一步两条链重叠部位互补配对,可互为另一条链的引物,C项正确。若融合PCR的第二步获得了128个融合基因,引物数目和新合成的子链数目相同,即该过程消耗了128×2-2=254(个)引物,D项正确。
【例2】 重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术,其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(如图中的引物2和3,突起处代表与模板链不能互补的突变位点),分别进行PCR,获得有重叠链的两种DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。
水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图所示。
(1)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为 才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为 (假设引物为单链DNA)。
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中,引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为
。
(3)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起,设计基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时,特别要注意的问题是
。
T—A或C—G
A或G
3
引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用
M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
【归纳拓展】
(1)基因定点突变,该技术要使用四种引物。考查内容可涉及与突变位点配对的引物设计情况、两个阶段引物的选择、扩增体系及产物等。解答此技术相关问题时可结合题图依据以下原则:引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此,分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
(2)构建融合基因,重叠延伸PCR还可以用于两个或两个以上异源基因DNA片段的拼接。引物上含有末端互补序列,通过PCR产生的两个DNA片段可通过引物延伸进行剪接和扩增,从而获得重组体,与定点突变不同的是待融合基因的PCR产物来自两个不同的基因,通过引物在两种PCR产物中产生互相重叠的链而获得融合基因。
二、反向PCR技术
反向PCR技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
【例3】 (2025·安徽芜湖二模)反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
注:引物分别与邻近的DNA链互补配对。
A.反向PCR应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B.设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降
C.PCR产物是包含已知序列和所有未知序列的环状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶
C
解析 DNA子链合成的方向为5'端到3'端,因此要通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增应选择引物1和引物4进行PCR扩增,A项正确。设计的引物不宜过短,否则扩增的特异性会下降,B项正确。PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的链状DNA分子,扩增产物还需要经过限制酶切割后再用DNA连接酶连接才能形成环状,C项错误。整个过程需用到限制酶、DNA连接酶和耐高温的DNA聚合酶,D项正确。
三、不对称PCR
正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物,那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫作不对称PCR。
【例4】 (2025·江苏扬州模拟)不对称PCR是一种常见的单链DNA探针制备方法,其原理是反应体系中加入一对数量不相等的引物,数量较少的为限制性引物,数量较多的为非限制性引物。假设体系中模板DNA数量为a,在PCR反应的早期10个循环中,扩增产物是双链DNA,限制性引物耗尽,非限制性引物继续引导合成大量目标DNA单链。下列说法正确的是( )
A.若B链为所需的DNA探针,则非限制性引物应选用引物Ⅳ
B.两种引物与模板链结合时,需将温度控制在72 ℃左右
C.如果总共进行25次循环,最终获得的单链DNA探针数为15×210a个
D.因为双链DNA和单链DNA的长度相同,不能通过电泳方法将其分离
C
解析 由于DNA聚合酶只能从3'端延伸DNA链,引物Ⅱ和Ⅲ不能作为扩增探针序列的引物,据题干信息可知,数量较多的非限制性引物将引导合成大量目标DNA单链,若B链为所需的DNA分子探针,即目标DNA单链,则非限制性引物应选用引物Ⅰ,A项错误。两种引物与模板链结合即复性过程,该过程中温度下降到50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合,B项错误。假设B链为目标DNA单链,如果体系中原模板DNA的数量为a,早期10个循环产物双链DNA分子的数量为210×a个,其中有A链210×a个,以A链为模板,利用引物又进行了15次循环,每次循环生成的都是B链,不改变A链的数目,即每次后期循环开始时的模板链A链的数目都是210×a个,15次循环每次生成B链也是210×a个,故最终获得的单链DNA探针数共为15×210×a个,C项正确。单链DNA和双链DNA的相对分子质量不同,电泳可以将其分离,D项错误。
【归纳拓展】
不对称PCR主要只扩增一条模板链,实际操作时,为了增加模板量,也可以加入一对引物,只是两条引物在浓度上应存在差异。如此题经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物。此技术可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。
四、实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,实时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录。在RT-PCR中,通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。
【例5】 (2025·江西模拟预测)实时荧光定量PCR(qPCR)利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,其灵敏度高、特异性好,是目前检测微小残留病变的常用方法。请回答下列有关问题。
图1
(1)Taqman探针是qPCR中一种常用的探针,其5'端连接荧光基团(F),3'端连接淬灭基团(Q)。当探针完整时,两个基团距离很近,F发出的荧光信号被Q吸收而不能被检测到。在qPCR过程中,当Taq DNA聚合酶遇到探针时,探针会水解,F和Q两个基团分离,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,即可对PCR进行实时分析。具体过程如图1所示。
①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、Taq DNA聚合酶、
和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历 、
、延伸三个阶段,其中延伸阶段是从引物的 (填“3'”或“5'”)端开始的。
②在qPCR过程中,Taq DNA聚合酶的两个作用是
。
③在qPCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,原因是
。
引物
变性
复性
3'
催化游离脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上、水解Taqman探针
有利于保证复性时探针先于引物与模板DNA结合
(2)随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度 (填“增强”或“减弱”)。通过实时检测荧光信号强度,可得Ct值(扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环次数),该值与待测样本中目的基因的个数呈
(填“正相关”或“负相关”)。
增强
负相关
(3)qPCR可用于肿瘤基因的检测,其不但能灵敏地检测到少量突变基因,尽早确诊癌症,还可以准确检测到肿瘤基因的表达量。图2表示三位疑似肿瘤患者中肿瘤基因的检测结果,从Ct值的角度进行分析,患者
(填“A”“B”或“C”)出现肿瘤基因的概率更大,原因是
。
图2
A
患者A出现荧光阈值时的循环次数比较小,因此其起始模板的致癌基因较多
解析 (1)①qPCR除需要Taqman探针外,还需要模板DNA、Taq DNA聚合酶、引物和dNTP(N代表A、T、G、C)等,每个循环需要经历变性、复性、延伸三个阶段,延伸是从引物的3'端开始的。
②在qPCR过程中,Taq DNA聚合酶能够催化游离脱氧核苷酸连接到脱氧核苷酸链上,此外还能水解Taqman探针。
③在qPCR过程中,Taqman探针的复性温度需比引物的高,这有利于保证复性时探针先于引物与模板DNA结合。
(2)在qPCR中,由于Taq DNA聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的F,F发出的荧光信号被相应仪器检测到,理论上qPCR每扩增一条DNA链,就有1个荧光分子形成,因此随着qPCR循环次数的增加,荧光信号强度会增强。Ct值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则Ct值越小,起始模板量越多,因此该值与待测样本中目的基因的个数呈负相关。
(3)已知Ct值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,Ct值越小,起始模板量越多。由于患者A出现荧光阈值时的循环次数比较小,因此其起始模板的致癌基因较多,出现肿瘤基因的概率更大。
五、巢氏PCR
【例6】 巢式PCR是指先后用外、内引物扩增目的基因的方法。其原理为:先以比目的基因大的DNA片段为模板,用一对外引物进行扩增,获得大量含目的基因的中间产物,再以扩增后的中间产物为模板,用一对内引物扩增目的基因,如图所示。下列说法错误的是( )
巢式PCR工作原理示意图
A.PCR反应缓冲液中Mg2+的作用是激活DNA聚合酶
B.与传统PCR相比,巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例
C.由于和两套引物都互补的靶序列较少,该技术可大大提高扩增的特异性
D.如果两套引物一起加入反应体系中,外引物的复性温度应显著低于内引物
答案 D
【归纳拓展】
巢式PCR共使用了两对引物,进行了两轮PCR,第二次扩增可以减少或排除第一次扩增中出现的非特异性产物,所以该操作可以提高PCR的特异性和灵敏度,可用于极少量DNA模板的扩增。巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的,因此两个阶段反应一般不在同一试管完成,如果两套引物一起加入反应体系中,外引物复性温度要明显高于内引物,使外引物先进行反应。(共23张PPT)
限时练25 发酵工程、细胞工程和胚胎工程
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一、选择题
突破点1 微生物培养与发酵
1.(2025·山西晋中三模)制醋工艺通常包括“酒精发酵”和“乙酸发酵”两个阶段,现代工业制醋采用连续发酵工艺:先密封培养一段时间,随后通入无菌空气并搅拌。下列相关叙述正确的是( )
A.传统制醋“酒精发酵”阶段所用菌种来源于原材料表面附着的多种酵母菌
B.与现代工业制醋相比较,传统制醋工艺不需要考虑消毒、灭菌等繁琐的操作
C.密封阶段中,微生物无氧呼吸产生的酒精可作为底物促进醋酸菌快速繁殖
D.通入无菌空气进行“乙酸发酵”时,需要适当降低发酵罐中的温度
A
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解析 传统制作过程中,所利用的菌种一般来自自然界的天然菌种,传统制醋“酒精发酵”阶段所用菌种来源于原材料表面附着的多种酵母菌,A项正确。传统工艺也需要尽量避免杂菌污染,也有消毒和灭菌的操作,B项错误。醋酸菌是好氧细菌,在有氧条件下才能将酒精转化为乙酸,C项错误。“酒精发酵”温度为18~30 ℃,“乙酸发酵”温度为30~35 ℃,为了保证醋酸菌的活性,在进行“乙酸发酵”时,需要适当升高发酵罐中的温度,D项错误。
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2.(2025·吉林模拟)科研人员通过改良发酵工艺“把玉米变成衣服”,即利用大肠杆菌将玉米淀粉转化为戊二胺,再将戊二胺转化为尼龙布,流程如图所示。其中,戊二胺不能从大肠杆菌体内排出,且对细胞有毒害作用。下列相关分析正确的是( )
A.该工业生产中要使用纤维素酶、胶原蛋白酶、胰蛋白酶等酶制剂
B.发酵过程中,应将培养液置于有氧、中性或近中性的条件下培养
C.发酵时定期更换培养液,能降低戊二胺对大肠杆菌的毒害
D.发酵结束后,可采用离心、过滤和沉淀措施来获得戊二胺
B
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解析 该工业生产是利用玉米淀粉进行生产,需要的是淀粉酶、纤维素酶等,不需要蛋白酶等,A项错误。发酵过程中,应将培养液置于有氧、中性或近中性的条件下培养,有利于生产戊二胺,B项正确。根据题意,戊二胺因不能从大肠杆菌排出而对其有毒害作用,所以可能需要通过基因工程改造大肠杆菌,使其能够耐受或排出戊二胺,仅定期更换培养液不能解决戊二胺对大肠杆菌的毒害作用,C项错误。发酵结束后,可采用提取、分离和纯化措施来获得戊二胺,D项错误。
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3.(2025·湖南卷)采集果园土壤进行微生物分离或计数。下列叙述正确的是( )
A.稀释涂布平板法和平板划线法都能用于尿素分解菌的分离和计数
B.完成平板划线后,培养时需增加一个未接种的平板作为对照
C.土壤中分离得到的醋酸菌能在无氧条件下将葡萄糖分解成乙酸
D.用于筛选尿素分解菌的培养基含有蛋白胨、尿素和无机盐等营养物质
B
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解析 稀释涂布平板法可通过菌落数进行计数,而平板划线法仅用于分离纯化菌种,无法进行计数,A项错误。平板划线法操作后需设置未接种的平板作为空白对照,以验证培养基灭菌是否彻底,B项正确。醋酸菌为好氧细菌,其代谢需氧气,无氧条件下无法将葡萄糖转化为乙酸,C项错误。筛选尿素分解菌的培养基应以尿素为唯一氮源,若含蛋白胨(含其他氮源)则无法筛选目标菌,D项错误。
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4.(2025·河南郑州模拟)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病,其筛选流程及抗性检测如图。下列叙述正确的是( )
A.在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,从感病植株上采集样品
B.将采集的样品充分消毒后,用蒸馏水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测
C.将无菌检测合格的样品研磨,经平板划线法分离得到内生菌的单菌落
D.判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
D
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解析 由题干信息“某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病”可知,在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内,应从未感病植株上采集样品,A项错误。获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染;将采集的样品充分消毒后,用无菌水冲洗,收集冲洗液进行无菌检测,B项错误。由题图可知,样品研磨后进行了稀释涂布,可见将无菌检测合格的样品研磨,经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落,而不是平板划线法,C项错误。由题图抗性检测可知,判断内生菌的抗性效果需设置对照组和实验组,对照组不接种内生菌得到病原菌菌斑,实验组接种内生菌得到病原菌菌斑,然后比较对照组和实验组的菌斑大小,实验组病原菌菌斑越小表明内生菌抗性效果越好,D项正确。
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突破点2 细胞工程和胚胎工程
5.(2025·安徽淮南二模)科学家将人参和胡萝卜细胞的原生质体融合,经培养获得8个杂种愈伤组织,检测发现这8个杂种愈伤组织均含有次生代谢物人参皂苷,其中大多数人参皂苷含量明显高于人参愈伤组织。蛋白质电泳检测中发现一条只在8个杂种愈伤组织中出现的特异条带。下列相关叙述正确的
是( )
A.可使用PEG融合法和灭活病毒诱导法促进两种原生质体融合
B.愈伤组织形成杂种植株是人参和胡萝卜细胞融合完成的标志
C.进行上述杂种愈伤组织培养时用到的培养基中不含有机物
D.大多数杂种愈伤组织的人参皂苷含量较高,可能与特异条带的蛋白质有关
D
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解析 可使用PEG融合法促进两种原生质体融合,不能使用灭活病毒诱导,A项错误。再生细胞壁的形成是人参和胡萝卜细胞融合完成的标志,B项错误。进行题述杂种愈伤组织培养时用到的培养基中需要添加有机物,C项错误。根据题干信息“蛋白质电泳检测中发现一条只在8个杂种愈伤组织中出现的特异条带”,推测大多数杂种愈伤组织的人参皂苷含量较高,可能与特异条带的蛋白质有关,D项正确。
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6.(2025·安徽卷)细胞工程技术已在生物制药和物种繁育等领域得到了广泛应用。下列关于动物细胞工程的叙述,正确的是( )
A.从动物体内取出组织,用胰蛋白酶处理后直接培养的细胞称为传代细胞
B.将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞,可将其诱导形成iPS细胞
C.将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞混合,经诱导融合的细胞即为能分泌所需抗体的细胞
D.采用胚胎分割技术克隆动物常选用桑葚胚或囊胚,因这两个时期的细胞未发生分化
B
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解析 动物细胞培养包括原代培养和传代培养,通常将分瓶前的细胞培养称作原代培养,即动物组织经胰蛋白酶处理后的培养,A项错误。iPS细胞即诱导多能干细胞,将特定基因或特定蛋白导入已分化的T细胞,可将其诱导形成iPS细胞,B项正确。在单克隆抗体的培育过程中,诱导融合是随机和不完全的,可形成骨髓瘤与骨髓瘤融合细胞、B细胞与B细胞融合细胞、杂交瘤细胞,杂交瘤细胞也不一定能分泌所需抗体,需要进行筛选,C项错误。采用胚胎分割技术克隆动物常选用发育良好、形态正常的桑葚胚或囊胚。由桑葚胚发育为囊胚的过程中,细胞开始分化,逐步发育为内细胞团和滋养层细胞,D项错误。
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7.(2025·安徽模拟)我国某科研团队在细胞培养人造肉领域取得了重要成果。该团队成功建立了稳定的猪胚胎干细胞分离培养技术体系,该细胞系可在体外长期稳定传代,维持多能性和基因组稳定性,已传代超过300代。这一技术突破为细胞培养肉的规模化生产提供了重要的种子细胞来源。下列相关叙述错误的是( )
A.培养猪胚胎干细胞时,需用到95%空气和5%CO2的混合气体培养箱
B.进行悬浮培养和贴壁培养时,细胞分裂受阻都可能与有害代谢物积累有关
C.使用猪胚胎干细胞培养人造肉时,优点有增殖能力强、传代次数多等
D.在培养人造肉时,培养液中需添加血清,目的是提供已知的营养成分
D
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解析 培养动物细胞时,通常使用95%空气和5% CO2的混合气体培养箱。其中,空气提供细胞代谢所需的O2,CO2用于维持培养液的pH,A项正确。无论是悬浮培养还是贴壁培养,随着细胞的生长和代谢,有害代谢物会逐渐积累,这些代谢物可能会对细胞产生毒害作用,阻碍细胞分裂,B项正确。胚胎干细胞具有增殖能力强、分化程度低、传代次数多等优点,使用猪胚胎干细胞培养人造肉可以利用这些特性,实现细胞的大量扩增,C项正确。在培养人造肉时,培养液中添加血清的主要目的是提供多种未知的营养成分、生长因子、激素等,以满足细胞生长和增殖的需要,而不是提供已知的营养成分,D项错误。
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8.(2025·黑吉辽蒙卷)研究显示,约70%的小鼠体细胞核移植胚胎未能成功发育至囊胚期,且仅有约2%的胚胎移植到代孕母鼠后可正常发育。下列叙述错误的是( )
A.体细胞核进入去核的MⅡ期卵母细胞形成重构胚
B.移植前胚胎发育率低,可能是植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态
C.胚胎移植到代孕母鼠后成活率低,可能是早期胚胎未能及时从滋养层内孵化
D.为提高胚胎成活率,可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植
C
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解析 去核的MⅡ期卵母细胞存在的一些物质能够促进体细胞核去分化而恢复全能性,进一步发育为完整胚胎,若植入的体细胞核不能完全恢复分化前的功能状态,会导致核移植胚胎不能成功发育,A、B两项正确。孵化是指囊胚进一步扩大,透明带破裂,胚胎从其中伸展出来,C项错误。动物胚胎细胞分化程度低,表现全能性相对容易,因此,为提高胚胎成活率,可用胚胎细胞核移植代替体细胞核移植,D项正确。
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9.(2025·山西临汾三模)羊乳价格比牛乳价格高,为防范市场上以牛乳冒充羊乳销售的行为,研究人员以羊乳酪蛋白为抗原,制备了单克隆抗体。下列相关叙述错误的是( )
A.可以利用动物细胞融合技术和动物细胞培养技术生产单克隆抗体
B.从小鼠脾中得到的B细胞与骨髓瘤细胞融合后产生的杂交瘤细胞有多种
C.用抗羊乳酪蛋白的单克隆抗体可以检测羊乳中是否掺杂了牛乳
D.杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖后,可以在小鼠腹水中获取单克隆抗体
C
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解析 单克隆抗体制备过程中需要利用动物细胞融合技术和动物细胞培养技术,A项正确。从小鼠脾中得到的B细胞不是单一的一种B细胞,而是多种B细胞,将B细胞与骨髓瘤细胞诱导融合会形成多种杂交瘤细胞,B项正确。抗羊乳酪蛋白的单克隆抗体是以羊乳酪蛋白为抗原制得的,不能检测羊乳中是否掺杂了牛乳,C项错误。将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养,或注射到小鼠腹腔内增殖,从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体,D项正确。
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二、非选择题
10.(10分)(2025·云南卷)我国研究人员发明了生产维生素C的两步发酵法,流程如图甲。为了减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖,需要进行灭菌以结束第一步发酵。
甲
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在两步发酵法的基础上,我国研究人员进一步尝试用三菌混菌体系建立一步发酵法。在氧化葡糖杆菌(原始菌MCS)中利用基因工程技术导入大肠杆菌基因ccdB,得到工程菌IR3C。MCS和IR3C单菌培养时,活菌数变化曲线如图乙,MCS、IR3C分别与普通生酮基古龙酸菌和巨大芽孢杆菌进行三菌混菌发酵时,产物含量变化曲线如图丙。
乙
丙
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回答下列问题。
(1)要使基因ccdB在IR3C中稳定遗传、表达并发挥作用,构建的基因表达载体除启动子外,还必须有 。
(2)绘制图乙需统计活菌数,常用方法是 。当活菌达到一定数量时,基因ccdB编码的蛋白质开始发挥作用,推测该蛋白质的作用是 ,开始发挥作用的时间是 ,判断理由是 。
(3)基于图丙,利用IR3C三菌混菌发酵的产量 (填“高于”或“低于”)MCS三菌混菌发酵的产量,其原因是__________________________
_______________________________________________________________
____________________________________。
标记基因、目的基因、终止子、复制原点
稀释涂布平板法
抑制细菌增殖
15 h
在15 h时,IR3C数量下降,而MSC数量上升
高于
IR3C转入了ccdB基因,阻止细胞增殖,减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖,从而使更多山梨糖被用于合成维生素C
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解析 (1)基因工程中构建的基因表达载体,除启动子外,还要有标记基因、目的基因、终止子、复制原点等。
(2)统计活菌数目常用稀释涂布平板法。从图乙看出,随着时间推移,活菌数不断增加,在15 h时,IR3C数量下降,而MSC数量上升,所以推测转入的基因ccdB编码的蛋白质能抑制细菌增殖或诱导细菌凋亡,发挥作用的时间大约在15 h。
(3)从图丙看出,IR3C三菌混菌发酵产生的2-酮-L-古龙酸含量比MSC三菌混菌发酵多,因此可以推测,IR3C三菌混菌发酵维生素C产量更高,可能的原因是IR3C转入了ccdB基因,阻止细胞增殖,减少氧化葡糖杆菌竞争性消耗山梨糖,从而使更多山梨糖被用于合成维生素C。(共39张PPT)
限时练26 基因表达载体的构建及基因工程的技术应用
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一、选择题
1.(2025·福建漳州模拟)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图1所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体,并转化到受体菌中。利用影印法(用无菌绒布轻盖在已长好菌落的原培养基上,然后不转动任何角度,“复印”至新的培养基上)筛选菌株,过程如图2所示。下列叙述正确的是( )
图1
图2
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A.为防止目的基因与质粒的反向连接,可用HindⅢ和ScaⅠ酶切
B.将质粒用ScaⅠ酶切后,所得产物经琼脂糖凝胶电泳可出现3个条带
C.目的基因插入TetR中,筛选时A培养基含四环素,B培养基含氨苄青霉素
D.利用影印法筛选时,能在B培养基中生长的是转化成功的菌落
答案 B
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解析 若用HindⅢ和ScaⅠ酶切质粒,由于质粒中有两个ScaⅠ的酶切位点,因而不一定能防止目的基因与质粒的反向连接,A项错误。由于图示质粒中有两个ScaⅠ的酶切位点,所以用ScaⅠ酶切质粒,能得到三种DNA片段,即完整的片段和两个短片段,所得产物经凝胶电泳可形成3个条带,B项正确。目的基因插入TetR中,则含有重组质粒的细菌对四环素不具有抗性,对氨苄青霉素有抗性,所以A培养基含有氨苄青霉素,B培养基含有四环素,C项错误。转化成功的菌落对氨苄青霉素有抗性,对四环素没有抗性,所以能够在A培养基中生长,不能在B培养基中生长的菌落是转化成功的菌落,D项错误。
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2.(2025·江西模拟)受到外源DNA入侵时,细菌能将外源DNA中特异性序列整合到CRISPR基因上。当再受到同样外源DNA入侵时,细菌可从CRISPR基因上提取特异性片段,转录出sgRNA;Cas基因则表达产生Cas酶,对外源DNA进行分解,两者共同作用完成对细菌自身的保护,过程如图所示。下列说法错误的是( )
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A.细菌将外源DNA整合到CRISPR基因上属于基因重组
B.sgRNA能对外源DNA进行定位且序列越短定位越准确
C.Cas酶能切割磷酸二酯键催化外源DNA分解
D.通过设计sgRNA可对动物细胞实现特定基因的定位
答案 B
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解析 细菌将外源DNA整合到CRISPR基因上属于基因重组,A项正确。sgRNA通过与外源DNA分子一条单链互补配对引导Cas酶到特定基因位点进行切割,序列越短,定位越容易发生脱靶现象,越不准确,B项错误。Cas酶切割特定基因位点,相当于限制酶作用于脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键,催化外源DNA分解,C项正确。sgRNA可以与外源DNA分子一条单链进行碱基互补配对,通过设计sgRNA可对动物细胞实现特定基因的定位,D项正确。
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二、非选择题
3.(11分)(2025·四川卷)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'-3'方向。②密码子对应的氨基酸为AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
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(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用
引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是 。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生 条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是 。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带 (填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致________________________________
,最终引起细菌死亡。
F2、F4
保证目的基因能在链霉菌细胞中复制
2
检测重组质粒是否构建成功
苯丙氨酸
翻译过程无法正常进行,细菌无法
合成蛋白质
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(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是
_____________________________________________________________。
若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有_____________________________________________________
_____________________________________________________________。
(答出1点即可)。
目的基因发生突变(或目的基因表达受到抑制等合理答案)
发酵的最佳条件(或提高发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等合理答案)
1
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解析 (1)引物需要结合到模板的3'端,且与目的基因的部分碱基序列互补配对,子链延伸方向为5'端→3'端,因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点,是为了保证目的基因能在链霉菌细胞中复制,使目的基因能够在链霉菌中稳定存在并遗传给后代。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,会得到载体片段和目的基因片段,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功,若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带,说明酶切成功,重组质粒构建可能成功。但是还需要进一步的鉴定。
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(3)观察拉索西丁的作用机制图,结合所给密码子信息,可知拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC,编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点,会导致翻译过程无法正常进行,进而使细菌无法合成蛋白质,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是目的基因发生突变,导致其表达的产物结构改变,从而失去杀菌活性;也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有:发酵的最佳条件,如温度、pH、溶氧量等;如何提高发酵产物的产量;产物的分离和纯化方法等。
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4.(11分)(2025·黑吉辽蒙卷)香树脂醇具有抗炎等功效,从植物中提取难度大、产率低。通过在酵母菌中表达外源香树脂醇合酶基因N,可高效生产香树脂醇。回答下列问题。
1
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图1
(1)可从 中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,为保证基因N与质粒pYL正确连接,需在引物1和引物2的5'端分别引入_________ 和 限制酶识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用
连接DNA片段,构建重组质粒,大小约9.5 kb(kb为千碱基对),假设构建重组质粒前后,质粒pYL对应部分大小基本不变。
序列数据库
XhoⅠ
XbaⅠ
DNA连接酶
1
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注:M为指示分子大小的标准
参照物,1~4为菌株号。
图2
(2)进一步筛选构建的质粒,以1~4号菌株中提取的质粒为模板,使用引物1和引物2进行PCR扩增,电泳PCR产物,结果如图2。在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有 的污染。初步判断实验组 (从“1~4”中选填)的质粒中成功插入了基因N,理由是
。
其他模板
1
实验组1的电泳条带大小与基因N的大小接近
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(3)为提高香树脂醇合酶催化效率,将编码第240位脯氨酸或第243位苯丙氨酸的碱基序列替换为编码丙氨酸的碱基序列,丙氨酸的密码子有GCA等。a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有 。
a:5'…GCA/CCC/GAG/TTC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC…3'
b:5'…GAA/CTG/TGG/GAC/ACC/CTG/AAC/TAC/TTC/TCT/GAG…3'
c:5'…GCC/TGG/CTG/TTT/CCC/TCT/TTC/TTC/CCC/TAC/CAC…3'
d:5'…GAT/AAT/AAG/ATC/CGA/GAG/AAG/GCC/ATG/CGA/AAG…3'
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的 含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
GCC
香树脂醇
1
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解析 (1)可从序列数据库中查询基因N的编码序列,设计特定引物。如图1所示,a链为转录模板链,所以右端为启动子端,为保证基因N与质粒pYL正确连接,右端要与质粒pYL中用限制酶SpeⅠ切出的末端(5'-A
3'-TGATC)相连,而限制酶SpeⅠ会将基因N切断,所以引物2的5'端应引入限制酶XbaⅠ的识别序列,以便切出与SpeⅠ相同的末端进行连接;引物1的5'端则引入限制酶XhoⅠ的识别序列。PCR扩增基因N,特异性酶切后,利用DNA连接酶连接DNA片段。
(2)在第5组的PCR反应中,使用无菌水代替实验组的模板DNA,目的是检验PCR反应中是否有其他模板的污染。初步判断实验组1的质粒中成功插入了基因N,理由是重组质粒的大小约9.5 kb,质粒pYL的大小约7.2 kb,所以基因N的大小约为2.3 kb,使用引物1和引物2进行PCR扩增的是基因N,实验组1的电泳条带大小约为2.3 kb,与基因N的大小接近。
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(3)a是诱变第240位脯氨酸编码序列的引物(GCA为诱变序列),据图可知,a的5'端显示的前三个碱基GCA即为第240位脯氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列;又因为 b、c、d其中一条是诱变第243位苯丙氨酸的引物,其配对模板与a的配对模板相同,据图可知,只有c的序列与a的序列(244位~250位)相同,故c链为诱变第243位苯丙氨酸的引物,5'端显示的前三个碱基为第243位苯丙氨酸替换为丙氨酸后对应的密码子序列GCC。据此分析,丙氨酸的密码子除GCA外,还有GCC。
(4)进一步检测转基因酵母菌发酵得到的香树脂醇含量并进行比较,可以选出最优的香树脂醇合酶基因的改造方案。
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5.(11分)(2025·广东卷)大肠杆菌是重要工业菌株之一,其培养过程可分为快速生长期和生长稳定期两个阶段。为了通过调节蛋白质合成与降解速率来动态调控代谢途径关键酶的蛋白量,使细胞适配不同阶段的生产需求,研究者设计了两种质粒,并以稳定性好的红色荧光蛋白mKate2为模式蛋白,测试质粒功能。回答下列问题。
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(1)研究者首先构建质粒①(图a)用于在细胞内表达C-末端带SsrA短肽的mKate2,将质粒导入感受态细胞后,在添加抗生素的选择培养基上培养。根据培养基上菌落的生长状况,结合PCR及 检测,筛选获得重组菌株W1。
图a
荧光(或mKate2蛋白)
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(2)将W1在适宜条件下进行摇瓶培养,定时取样检测培养液中细胞密度,方法有 (答一种)。接种前需检测液体培养基的荧光强度,其作用是_______________________________________________________
。培养结果(图b)表明,进入生长稳定期后荧光强度快速下降,原因是__________________________
________________________________
________________________________
_____________________________。
图b
显微镜直接计数法
排除培养液本身的荧光强度对实验结果的干扰,保证实验结果
的准确性
PGro在生长稳定期停止基因转录,且C-末端带有SsrA短肽的mKate2被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解
1
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(3)研究者选用启动子PX、X基因(编码阻遏蛋白X,阻遏PX开启转录),重新构建质粒②(图a),导入野生型大肠杆菌中获得重组菌株W2。在适宜条件下摇瓶培养,W2的生长趋势不变,培养期间荧光强度的变化趋势为 。
快速生长期荧光强度弱,生长稳定期荧光强度迅速上升
1
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(4)莽草酸是一种重要工业化学品,其胞内合成代谢途径见图c。由于野生型大肠杆菌胞内酶A活性弱,且莽草酸会被快速转化为细胞生长必需物,因此细胞中无法大量积累莽草酸。为了保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,利用上述两种质粒的调控功能,结合野生型菌株遗传物质的改造,提出重组生产菌株构建思路:
_______________________________________________________________
_____________________________________________________________。
图c
用酶A基因替换质粒②中mKate2基因,用酶B基因替换质粒①中mKate2基因,构建酶B基因缺失的大肠杆菌突变菌株,并导入上述质粒
1
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解析 (1)在基因工程中,结合PCR 技术扩增目的基因片段,可检测目的基因是否成功导入,依据荧光(mKate2蛋白)检测筛选出含有目的基因的重组菌株W1。
(2)检测培养液中细胞密度时,由于大肠杆菌细胞是肉眼无法直接观察到的,因此常用的方法有显微镜直接计数法,显微镜直接计数法可通过细菌计数板在显微镜下直接数出细胞数量。接种前需要检测液体培养基的荧光强度,其目的是排除培养液本身的荧光强度对实验结果的干扰。根据图a中的注释可知,PGro在生长稳定期停止基因转录,且C-末端带有SsrA短肽的mKate2可被大肠杆菌内源蛋白酶系统特异性识别并降解,由于红色荧光蛋白mKate2减少,因此进入生长稳定期后荧光强度快速下降。
1
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(3)图a中的质粒②,由于启动子PGro在细胞快速生长期开启转录,会使X基因编码的阻遏蛋白X阻遏PX开启转录,致使mKate2荧光蛋白表达受阻,同时X上带有SsrA短肽,又会被大肠杆菌不断降解,因此快速生长期荧光强度弱;而到了生长稳定期PGro停止基因转录,阻遏蛋白X又被不断降解而含量下降,PX开始大量转录,荧光蛋白不断积累,荧光强度不断上升。
(4)根据(2)(3)知,用酶A基因替换质粒②中mKate2基因,使其在生长稳定期能持续合成酶A,从而促进莽草酸的合成,用酶B基因替换质粒①中mKate2基因,构建酶B基因缺失的大肠杆菌突变菌株,并导入上述质粒,使其在生长稳定期时酶B合成大量减少,从而实现莽草酸的大量积累。因此,为保证细胞正常生长,并在生长稳定期实现莽草酸的大量积累,重组生产菌株构建思路见答案。
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6.(11分)(2025·河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题。
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是
。将培养后的菌液混匀并充分 ,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
在富含卡拉胶的环境中,存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大
稀释
1
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(2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有 酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是_____________________________________
。
BamHⅠ
重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶
识别序列
1
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限制酶的识别序列和切割位点如下:
图1
1
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(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是 ,随后在含 和 的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态
卡拉胶
四环素
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第 位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是
_______________________________________________________________
________________________。
图2
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44
该位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小
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解析 (1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在富含卡拉胶的环境中,存在能够分解卡拉胶的微生物的可能性较大,因此可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2)E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶,因此为保证连接准确性和效率,切割质粒和目的基因时不能选择切成平末端的限制酶,即不能选择EcoRⅤ和SmaⅠ。而SpeⅠ与XbaⅠ切割后形成的黏性末端相同,若选择SpeⅠ与XbaⅠ切割,会出现质粒和目的基因的自连甚至目的基因倒接,因此切割质粒时SpeⅠ与XbaⅠ中只能选择一个,而另一个限制酶需要选择BamHⅠ。
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又由于转录的方向是由启动子→终止子,且mRNA形成的方向是5'→3',且mRNA与DNA的模板链方向相反,因此基因模板链的3'端应靠近启动子,故为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有BamHⅠ酶切位点。由于限制酶的识别序列具有专一性,若连接后的序列不存在最初限制酶的识别序列,则可能导致重组质粒无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割。故另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是重组质粒连接处的序列不再是原来的限制酶识别序列。
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(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶,使其菌落周围形成透明圈,且重组质粒上含有四环素抗性基因,因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含卡拉胶和四环素的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)据图可知,虚线长度代表氨基酸间的空间距离,由于第44位点的氨基酸空间上离半胱氨酸更近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小,因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
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7.(12分)(2025·山东卷)种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造,利用农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中,筛选到2个种子休眠相关基因的插入失活纯合突变体。与野生型相比,突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息已知。
注:LB/RB为T-DNA的边界序列;Kanr为卡那霉素抗性基因;bp为碱基对。
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7
(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为 。选用图甲中的SmaⅠ对抗除草剂基因X进行完全酶切,再选择SmaⅠ和 对Ti质粒进行完全酶切,将产生的黏性末端补平,补平时使用的酶是 。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接,构建重组载体,转化大肠杆菌;经卡那霉素筛选并提取质粒后再选用限制酶 进行完全酶切并电泳检测,若电泳结果呈现一长一短2条带,较短的条带长度近似为
bp,则一定为正向重组质粒。
甲 Ti质粒与抗除草剂基因信息
复制原点
Xba Ⅰ
DNA聚合酶
Spe Ⅰ、Sma Ⅰ
550
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7
(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入小麦基因组中同一基因导致的,提取基因组DNA,经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段(图乙)。在此酶切过程中,限于后续PCR难以扩增大片段DNA,最好使用识别序列为_____ (填“4”“6”或“8”)个碱基对的限制酶,且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段 ,才能利用引物P1和P2成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后,进行了一系列操作,其中可以判断出2条片段的未知序列是否属于同一个基因的操作为___________________ (填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比对”)。
注:P1、P2表示引物。
乙 基因组DNA酶切后含T-DNA的片段
4
连接成环(或环化)
测序和序列比对
1
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7
(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株,如果检测到野生型基因, (填“能”或“不能”)确定该植株的表型为野生型。
不能
1
2
3
4
5
6
7
解析 (1)与复制有关的结构是复制原点。根据后面的信息“用限制酶切后补平”,即在DNA聚合酶的作用下游离的脱氧核苷酸连到脱氧核苷酸链的3'端,故需要用XbaⅠ对质粒进行切割,而不能用PstⅠ;提取质粒,切割后得到两条条带,需要两个切点,题干中给出长度的只有目的基因,故需要选择SpeⅠ和SmaⅠ两种限制酶进行切割,切割后会出现两种长度的片段,短的长度大约为550 bp,说明基因前端被补平,大肠杆菌中导入了正向重组质粒。
1
2
3
4
5
6
7
(2)限制酶识别序列越短,在识别序列出现的概率越高,切割得到的序列越短,根据题意选用识别序列为4个碱基对的限制酶。目的是通过PCR扩增出图乙中的未知序列,两种引物延伸方向相反,故需要把图乙中序列环化,或者首尾连接,再进行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳仅能判断DNA片段长度,要判断是否为同一个基因需要进行测序或序列比对。
(3)野生型基因导入突变植株后无法确定其能否正常表达,故检测到野生型基因无法确定植株的表型。(共112张PPT)
层级二 二轮核心 精研专攻
【单元网络构建】
醋酸菌
巴氏消毒法
湿热灭菌法
碳源、氮源、水、无机盐等
稀释涂布平板法
植物细胞的全能性
细胞增殖
细胞膜的流动性
动物细胞核的全能性
获能
桑葚胚期、囊胚期
将内细胞团均等分割
DNA连接酶
基因表达载体的构建
基因
突破点1 微生物培养与发酵
【高考命题预测】
本部分试题情境大多来自生产生活实践,一般题目难度不大,可能的命题方向有:①果酒、果醋、泡菜、酸奶、腐乳等传统发酵产物的制作原理及制作过程,可能结合中国古代农副业等传统制作方法。②发酵工程通常通过流程图的形式考查啤酒、酱油、醋、柠檬酸等的工业化生产、乙醇燃料制备等,多考查流程中各环节的原理以及影响发酵的因素等内容。③微生物培养主要以微生物的筛选为主要考查方向,主要内容有微生物的实验室培养技术,分解淀粉、纤维素或石油的细菌的分离,耐盐、耐高温、耐酸碱等特殊环境条件的细菌的分离,以及细菌的纯化及计数等。题目的情境来源多样,部分来自大学教材,部分来自当前科学热点的相关论文。
聚焦1传统发酵技术与发酵工程
【练真题 明方向】
1.(2025·云南卷)黄酒是我国古老的发酵酒之一,传统酿制中,先用蒸煮过的小麦或麸皮为原料,对之前发酵留存的少量酒曲(曲种)进行扩大制曲;再将酒曲和蒸煮后的糯米、大米混合处理一段时间后,添加足量酒母(含酵母菌)完成发酵,压榨成品。下列说法错误的是( )
A.小麦、麸皮等原料为酒曲中微生物的生长繁殖提供了碳源和氮源等营养物质
B.为避免制曲过程被杂菌污染影响黄酒品质,扩大制曲前需对留存的酒曲灭菌
C.糯米、大米蒸煮后立即与酒曲混合会导致酶空间结构改变而降低其催化效率
D.将酒曲混合糯米、大米处理一段时间,是为了获得酒母发酵时的底物葡萄糖
B
解析 小麦、麸皮等原料含有蛋白质、糖类等多种营养成分,蛋白质可以为微生物提供氮源,糖类等可以为微生物提供碳源,所以小麦、麸皮等能为酒曲中微生物的生长繁殖提供碳源和氮源等营养物质,A项正确。扩大制曲前对留存的酒曲不能灭菌,因为酒曲本身含有发酵所需的菌种,若灭菌会杀死这些菌种,导致无法进行正常的发酵过程,B项错误。糯米、大米蒸煮后温度较高,立即与酒曲混合,高温会使酶的空间结构改变,导致酶活性降低,从而降低其催化效率,C项正确。酒曲中含有淀粉酶等酶类,将酒曲混合糯米、大米处理一段时间,淀粉酶可将糯米、大米中的淀粉分解为葡萄糖,从而为后续酒母(含酵母菌)发酵提供底物葡萄糖,D项正确。
2.(2025·山东卷改编)酿造某大曲白酒的过程中,微生物的主要来源有大曲和窖泥。大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物,制曲过程需经堆积培养,培养时温度可达60 ℃左右;将大曲和酿酒原料混合,初步发酵后放入窖池;窖池发酵是白酒酿造过程中微生物发酵的最后阶段。下列说法错误的是( )
A.堆积培养过程中的高温有利于筛选酿酒酵母
B.大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物
C.窖池发酵过程中,酵母菌以无氧呼吸为主
D.窖池密封不严使酒变酸是因为乙酸含量增加
A
解析 堆积培养可使白酒酿造过程中糖化所需微生物增多,但不能筛选出耐高温的酿酒酵母,大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物,是能合成淀粉酶的微生物,所以堆积培养过程中的高温有利于筛选产淀粉酶的微生物,A项错误,B项正确。窖池发酵过程是在缺氧的环境中进行,酵母菌以无氧呼吸为主,C项正确。窖池密封不严使酒变酸是因为乙酸含量增加,D项正确。
3.(2024·山东卷)在发酵过程中,多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体,菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是( )
A.相同菌体密度下,菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D.发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
D
解析 相同菌体密度下,菌球体越大,其中的菌体得到的氧越少,柠檬酸的产生速率越慢,A项正确。发酵中期添加一定量的硫酸铵,可使菌体内铵离子浓度升高,进而解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制,有利于提高柠檬酸的产量,B项正确。发酵过程中pH下降使不耐酸的细菌(适合中性或弱碱性)难以生存,可抑制大部分细菌的生长,C项正确。柠檬酸属于代谢物,不能用过滤法获取,D项错误。
【归纳拓展】
1.发酵过程中控制杂菌的措施
(1)通过发酵条件控制杂菌:①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧细菌;②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境抑制杂菌繁殖。
(2)利用盐控制杂菌:如腐乳的制作。
(3)利用酒精控制杂菌:如果酒、腐乳的制作。
2.发酵工程与传统发酵技术的区别
与传统发酵技术相比,大规模工业发酵能够通过选育菌种、控制发酵过程和分离、提纯产品等过程批量生产发酵产品。其操作流程如下:
【练模拟 拓角度】
4.(2025·广西北海模拟)广西传统酸笋制作依赖自然发酵。某工厂尝试将竹笋高温灭菌后,接种纯培养的植物乳杆菌(异养厌氧型乳酸菌),但发酵产物酸味远弱于自然发酵,且风味远不如传统发酵。下列叙述正确的是( )
A.高温灭菌破坏了竹笋中的纤维素,导致乳酸菌无法获取碳源
B.自然发酵酸味较强,是因为醋酸菌是发酵液中的优势菌种,产醋酸
C.接种植物乳杆菌的主要目的是产生乳酸为酵母菌提供原料
D.相较于传统酸笋发酵,纯种发酵液中乳酸菌的数量更多
D
解析 纤维素经高温灭菌后结构未改变,且乳酸菌无法直接分解纤维素,A项错误。自然发酵酸味较强,是因为乳酸菌是发酵液中的优势菌种,产乳酸,传统发酵风味较好,主要是因为乳酸菌、酵母菌、曲霉等多种微生物共同作用,产生丰富的代谢物,形成有机酸、醇、酯等复合型风味,B项错误。接种植物乳杆菌的主要目的是产生乳酸,酵母菌发酵的主要原料是葡萄糖,C项错误。相较于传统发酵,纯种发酵液中乳酸菌的数量更多,因为乳酸菌纯度更高,D项正确。
5.(2025·湖南二模)我国每年产生的农业秸秆数量巨大,秸秆直接焚烧会造成大气污染、土壤损伤,绿色处理秸秆能有效减少农业废弃物,促进可持续发展。下图为发酵工程中利用水稻、玉米等农业秸秆生产柠檬酸的简要流程图。下列相关叙述正确的是( )
A.生产柠檬酸的黑曲霉是异养厌氧型,其优良菌种只能从自然界中筛选出来
B.发酵罐内发酵是工厂化生产柠檬酸的中心环节,还可利用黑曲霉发酵生产酱油
C.发酵结束后,对罐内发酵液可采取适当的过滤、沉淀措施获得柠檬酸
D.黑曲霉还可以在工业生产中用来生产淀粉酶这种利用价值更高的单细胞蛋白
答案 B
解析 由图中“振荡培养”可知,在发酵过程中需要氧气参与,黑曲霉是好氧菌。优良菌种不仅可以从自然界中筛选,还可以通过诱变育种、基因工程等现代生物技术进行培育,A项错误。发酵罐内发酵是工厂化生产柠檬酸的中心环节,且黑曲霉可用于酱油生产,B项正确。发酵结束后,发酵液中除了柠檬酸外还含有黑曲霉菌体及其他杂质。仅采取过滤、沉淀措施无法获得纯净的柠檬酸,还需要进行进一步的分离和提纯等操作,C项错误。单细胞蛋白指的是微生物菌体,不是淀粉酶,D项错误。
聚焦2微生物的选择培养、鉴定和计数
【练真题 明方向】
6.(2025·黑吉辽蒙卷)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株,旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是( )
A.以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B.逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C.配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求
D.用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
D
解析 要筛选降解金霉素能力强的菌株,以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基,只有能利用金霉素的菌株才能在选择培养基上生长,A项正确。逐步提高培养基中金霉素的浓度,可对菌株进行选择,有助于获得高耐受的菌株,B项正确。微生物的生长需要适宜的pH,配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求,C项正确。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,接种环用于平板划线法,D项错误。
7.(2025·四川卷)微塑料由塑料废弃物风化形成,难以降解,会危害生态环境和人体健康。有人分离到X和Y两种微塑料降解菌,将总菌量相同的X、Y、X+Y(X∶Y=1∶1)分别接种于含有等量微塑料的蛋白胨液体培养基中,培养一段时间后测定微塑料的残留率(残留率=剩余量/添加量×100%),结果如下图。下列叙述正确的是( )
A.用平板划线法能测定X菌组中的活菌数
B.Y菌组微塑料残留率较高,故菌浓度也高
C.混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种
D.能在该培养基中生长繁殖的微生物都能降解微塑料
C
解析 平板划线法主要用于微生物的分离和纯化,不能用于测定活菌数,测定活菌数常用稀释涂布平板法,A项错误。Y菌组微塑料残留率较高,说明Y菌对微塑料的降解能力相对较弱,而不是菌浓度高,微塑料残留率与菌对微塑料的降解能力有关,而非直接与菌浓度相关,B项错误。由图可知,X+Y混合菌种组的微塑料残留率低于X菌组和Y菌组,说明混合菌种对微塑料的降解能力高于单一菌种,C项正确。该培养基中含有蛋白胨,能在该培养基中生长繁殖的微生物可能利用蛋白胨作为碳源和氮源等,但不一定都能降解微塑料,D项错误。
8.(2025·山东卷)深海淤泥中含有某种能降解纤维素的细菌。探究不同压强下,该细菌在以纤维素或淀粉为唯一碳源的培养基上的生长情况。其他条件相同且适宜,实验处理及结果如表所示。下列说法正确的是( )
组别 压强 纤维素 淀粉 菌落
① 常压 - + -
② 常压 + - -
③ 高压 - + -
④ 高压 + - +
注: “+”表示有;“-”表示无。
A.可用平板划线法对该菌计数
B.制备培养基的过程中,应先倒平板再进行高压蒸汽灭菌
C.由②④组可知,在以纤维素为唯一碳源的培养基上,该菌可在常压下生长
D.由③④组可知,高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长
D
解析 平板划线法用于分离单菌落,不能准确计数,计数常用稀释涂布平板法,A项错误。制备培养基应先高压蒸汽灭菌,再倒平板,避免杂菌污染,B项错误。②组在常压下、以纤维素为唯一碳源时无菌落,说明常压下该菌无法生长,C项错误。③组在高压下、以淀粉为唯一碳源时无菌落,④组在高压下、以纤维素为唯一碳源时有菌落,表明高压下该菌不能在以淀粉为唯一碳源的培养基上生长,D项正确。
【归纳拓展】
1.选择培养基四种常见的制备方法
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
2.辨析两种微生物计数方法
比较 项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
公式 每克样品中的菌数=C/V×M。C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数:每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
比较 项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分活菌和死菌
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
【练模拟 拓角度】
9.(2025·福建漳州模拟)从马盲肠中分离出能够降解纤维素的厌氧细菌并对其进行鉴定,实验流程和结果如下图。下列叙述正确的是( )
注:刚果红可与纤维素形成红色复合物,当纤维素被分解后,复合物就无法形成,会出现透明圈。
A.可以用接种环把菌液接种到培养基上
B.①~③应在无氧条件下倒置培养
C.菌落甲降解纤维素的能力低于菌落乙
D.菌株乙更适合用于研发反刍动物的饲料添加剂
B
解析 根据图示信息可知,接种方法为稀释涂布平板法,用的接种工具为涂布器,接种环是平板划线法中的接种工具,A项错误。该培养基培养的是厌氧细菌,因此①~③应在无氧条件下倒置培养,B项正确。菌落甲的透明圈与菌落直径比值大于乙,因此分泌的纤维素分解酶的降解能力高于乙,C项错误。根据C项分析可知,菌落甲降解纤维素的能力更强,因此菌株甲更适合研发为反刍动物的饲料添加剂,D项错误。
10.(2025·安徽芜湖二模)T2噬菌体能专一侵染大肠杆菌,进入宿主细胞的噬菌体不会被杀病毒剂灭活,在裂解宿主细胞后能继续感染并裂解周围的大肠杆菌。在培养基平板上,一个被感染的细菌最终会形成一个噬菌斑。利用这一原理可以检测受污染水样中大肠杆菌的数量,具体操作步骤如图所示。下列叙述错误的是( )
A.T2噬菌体需利用大肠杆菌的核糖体合成子代病毒的蛋白质
B.噬菌体感染并裂解细菌的特性有利于减少污水中细菌的数量
C.若平均噬菌斑数为48个,则待检测水样中目标菌的浓度为960个/mL
D.保温时间过长或稀释倍数不足均可造成噬菌斑的统计值较目标菌实际值偏低
答案 C
解析 噬菌体是病毒,没有细胞结构,只能利用大肠杆菌的核糖体合成子代病毒的蛋白质,A项正确。由题意可知,噬菌体感染并裂解细菌的特性,有利于减少污水中细菌的数量,B项正确。培养皿中接种的待测水样体积为0.1 mL,若平均噬菌斑数为48个,则待检测水样中目标菌的浓度为480个/mL,C项错误。若保温时间过长,部分被感染的细菌可能已裂解并释放出子代噬菌体,加入杀病毒剂后会灭活这些游离噬菌体,导致部分初始感染细菌无法形成独立的菌斑,从而使统计值低于实际目标菌数量。稀释倍数不足会使接种到平板上的混合液浓度过高,导致多个噬菌斑重叠或融合,也会造成噬菌斑的统计值较目标菌实际值偏低,D项正确。
突破点2 细胞工程和胚胎工程
【高考命题预测】
细胞工程和胚胎工程的题目情境的呈现形式多样,简单情境大部分以教材中出现的相关技术为背景,题目以文字描述为主。复杂情境大多以不同技术的综合应用为情境,呈现形式除文字信息外,也常通过流程图、表格、概念图等形式呈现。一般以选择题的形式呈现,考查某一技术过程所需的条件、原理或产生的结果。一般情境来自教材或与教材情境类似,难度不大;复杂情境涉及多种技术的综合应用,需全面掌握相关的生物学知识,才能准确梳理题目所涉及流程的原理、控制条件、影响因素以及最终达成的目标,并能用所学的相关知识分析解决问题。
聚焦1植物细胞工程
【练真题 明方向】
1.(2025·黑吉辽蒙卷)利用植物组织培养技术获得红豆杉试管苗,有助于解决紫杉醇药源短缺问题。下列叙述正确的是( )
A.细胞分裂素和生长素的比例会影响愈伤组织的形成
B.培养基先分装到锥形瓶,封口后用干热灭菌法灭菌
C.芽原基细胞由于基因选择性表达,不能用作外植体
D.紫杉醇不能通过细胞产物的工厂化生产来获取,植物组织培养优势明显
A
解析 植物组织培养中,细胞分裂素和生长素的比例会影响植物细胞的发育方向,包括脱分化形成愈伤组织的过程,A项正确。培养基分装封口后常用高压蒸汽灭菌法灭菌,干热灭菌法适用于耐高温和需要保持干燥的物品,B项错误。芽原基细胞具有全能性,可作为外植体,C项错误。紫杉醇可通过培养红豆杉细胞进行细胞产物的工厂化生产来获取,D项错误。
2.(2025·四川卷)研究人员用花椰菜(BB,2n=18)根与黑芥(CC,2n=16)叶片分别制备原生质体,经PEG诱导融合形成杂种细胞,进一步培养获得再生植株,其中的植株N经鉴定有33条染色体。下列叙述正确的是( )
A.两个原生质体融合形成的细胞即为杂种细胞
B.再生植株N的形成证明杂种细胞仍具有全能性
C.花椰菜和黑芥的原生质体能融合,证明两种植物间不存在生殖隔离
D.植株N的B组和C组染色体不能正常联会配对,无法产生可育配子
B
解析 两个原生质体融合形成的细胞不一定是杂种细胞,有可能是两个花椰菜原生质体融合或两个黑芥原生质体融合等,A项错误。细胞的全能性是指细胞经分裂和分化后,仍具有产生完整有机体或分化成其他各种细胞的潜能和特性,杂种细胞经过培养形成再生植株N,这证明了杂种细胞仍具有全能性,B项正确。花椰菜和黑芥是不同物种,它们之间存在生殖隔离。原生质体能融合并不能证明不存在生殖隔离,因为生殖隔离是指不同物种之间一般是不能相互交配的,即使交配成功,也不能产生可育的后代,C项错误。植株N是花椰菜(BB,2n=18)根和黑芥(CC,2n=16)叶片的原生质体经PEG诱导融合形成杂种细胞后培养获得的再生植株,染色体组成是BBCC,存在同源染色体,在减数分裂时能正常联会配对,能产生可育配子,D项错误。
【练模拟 拓角度】
3.(2025·黑龙江哈尔滨二模)菊花“紫凤牡丹”可药食两用,其细胞内黄酮类次生代谢物具有抗癌功效。为探索该品种的有效脱毒手段,研究人员进行了茎尖组织培养实验,结果如下表,有关叙述错误的是( )
紫凤牡丹在不同处理方式下的脱毒对比
不同处理方式 接种数/个 成活数/个 成活率/% 病毒脱除数/个 病毒脱除率/%
甲:一次茎尖脱毒处理 15 4 26.67 1 25.00
乙:利巴韦林+4 ℃处理 15 5 33.33 1 40.00
丙:一次茎尖脱毒处理+ABA 15 5 33.33 3 60.00
A.可利用植物细胞培养技术以获得大量黄酮类物质
B.获得脱毒苗的过程中需加入生长素和细胞分裂素
C.据表分析可知,采用丙处理方式时脱毒效果最好
D.经三种处理方式获得的脱毒苗均具有抗病毒特性
答案 D
解析 菊花“紫凤牡丹”细胞内黄酮类次生代谢物具有抗癌功效,为了提高产量可利用植物细胞培养技术以获得大量黄酮类物质,A项正确。获得脱毒苗的过程中需加入生长素和细胞分裂素,这两种激素的比值会影响植物组织培养的方向,B项正确。据表数据分析可知,采用丙处理方式时脱毒效果最好,同时成活率也较高,C项正确。经三种处理方式获得的脱毒苗均具有带毒少的特征,但并不具有抗病毒特性,D项错误。
4.(2025·陕西咸阳三模)下图是利用甲、乙两种植物的各自优势,通过植物细胞工程技术培育高产、耐盐的杂种植株的实验流程图。下列相关叙述错误的是( )
A.科研人员用蜗牛消化道提取液进行a处理来制备原生质体,说明该提取液中含有胰蛋白酶
B.b是诱导融合后的杂种细胞,其细胞内的染色体数目比任何一方亲本细胞中染色体数目多
C.具有耐盐性状的c需要先移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中,待其长壮后再移栽入土
D.在高盐环境中进行d选择获得的目的植株,其形态特征、生理特性等表型与双亲存在差异
答案 A
解析 利用蜗牛消化酶制备植物原生质体时,主要利用其所含纤维素酶和果胶酶来降解细胞壁,并非利用胰蛋白酶,A项错误。b是诱导融合后的杂种细胞,其细胞内的染色体数目应该是两种亲本细胞染色体数目的总和,因此比任何一方亲本细胞中染色体数目多,B项正确。具有耐盐性状的c需要先移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境中,待其长壮后再移栽入土,这是为了确保植株在移植过程中能够适应环境并健康成长,C项正确。在高盐环境中进行d选择获得的目的植株,其形态特征、生理特性等表型与双亲存在差异,这是因为杂种植株结合了两种亲本的特性,并且在高盐环境中进行了选择,D项正确。
聚焦2动物细胞工程和胚胎工程
【练真题 明方向】
5.(2025·湖北卷)利用犬肾细胞MDCK扩增流感病毒,生产流感疫苗,具有标准化、产量高等优点。但MDCK细胞贴壁生长的特性不利于生产规模的扩大,严重制约疫苗的生产效率。研究人员通过筛选,成功获得一种无成瘤性的(多代培养不会癌变)、可悬浮培养的MDCK细胞——XF06。下列叙述错误的是( )
A.XF06悬浮培养可提高细胞密度,进而提升生产效率
B.细胞贴壁生长特性的改变是由于流感病毒感染所导致
C.可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒
D.采用无成瘤性细胞生产疫苗,是为了避免疫苗中有致瘤DNA的污染
B
解析 悬浮培养允许细胞在生物反应器中自由生长,无需贴附表面,可显著提高XF06的密度,从而提高疫苗生产效率,A项正确。根据题干信息可知,XF06的悬浮培养特性是通过筛选获得的遗传改变,而非流感病毒感染所致,B项错误。在疫苗生产中,感染病毒的细胞需裂解释放病毒,离心技术(如差速离心或密度梯度离心)是标准方法,用于分离和纯化流感病毒颗粒,去除细胞碎片等杂质,C项正确。成瘤性细胞可能含有致癌基因或病毒DNA,若污染疫苗,存在潜在安全风险,XF06无成瘤性(多代培养不癌变),可减少疫苗中致瘤DNA污染的可能性,D项正确。
6.(2025·黑吉辽蒙卷改编)下图是制备抗白细胞介素-6(IL-6)单克隆抗体的示意图。下列叙述正确的是( )
A.步骤①给小鼠注射IL-6后,应从脾中分离筛选T淋巴细胞
B.步骤②在脾组织中加入胃蛋白酶,制成单细胞悬液
C.步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合,体现了细胞膜的流动性
D.步骤④经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞
C
解析 步骤①给小鼠注射IL-6后,应从脾中分离筛选B淋巴细胞,A项错误。步骤②在脾组织中加入胰蛋白酶或胶原蛋白酶,制成单细胞悬液,B项错误。步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合,体现了细胞膜的流动性,C项正确。步骤④用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞,步骤⑤经过克隆化培养和抗体检测筛选出了能产生特定抗体的杂交瘤细胞,D项错误。
7.(2025·陕晋宁青卷)科研人员通过对绵羊受精卵进行基因编辑和胚胎移植等操作,获得了羊毛长度显著长于对照组的优良品系。下列叙述错误的是( )
A.为获取足够的卵子,需对供体绵羊注射促性腺激素进行超数排卵处理
B.为确保受体绵羊与供体绵羊生理状态一致,需进行同期发情处理
C.受精卵发育至桑葚胚阶段,细胞数量和胚胎总体积均增加
D.对照组绵羊的选择需考虑年龄、性别等无关变量的影响
C
解析 胚胎移植过程中通过对优良供体母畜注射促性腺激素,使其超数排卵,从而获取足够的卵子,A项正确。为确保早期胚胎移植后供体和受体处于相同的生理状态,需要对供体和受体进行同期发情处理,B项正确。受精卵发育至桑葚胚阶段,细胞数量增加,但胚胎总体积并不增加,C项错误。对照实验中无关变量应保持相同且适宜,所以对照组绵羊的选择应考虑年龄、性别等的影响,D项正确。
【练模拟 拓角度】
8.(2025·陕西咸阳模拟)源自犬肾细胞的细胞系,具有上皮细胞特征,因其易于在实验室条件下培养,已成为流感疫苗开发中的关键工具。在传统的细胞培养技术中,通常采用含有血清成分的培养基来促进细胞贴壁生长,待细胞达到一定密度后,通过消化处理将它们分离,以便进行后续的传代操作。下列叙述正确的是( )
A.血清中的营养物质可以促进动物细胞的生长
B.胰蛋白酶主要用于消化血清中的蛋白质成分
C.悬浮培养的细胞完全不受细胞密度和有害代谢物的影响
D.10%CO2在细胞培养中主要用于维持培养液的pH稳定
A
解析 血清含有细胞生长所需的多种营养物质,还包括促生长因子、激素等调节物质,能够促进动物细胞的生长,A项正确。胰蛋白酶主要用于消化细胞间的蛋白质,使细胞分散,B项错误。悬浮培养的细胞仍会受到细胞密度、有害代谢物积累和培养液中营养物质缺乏等因素的影响,C项错误。5%CO2在细胞培养中主要用于维持培养液的pH稳定,D项错误。
9.(2025·安徽淮北模拟)非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种具有包膜的双链DNA病毒,病毒蛋白p30位于病毒的包膜上,在病毒进入宿主细胞时期具有重要作用。科研人员设计如下流程制备ASFV单克隆抗体。下列叙述错误的是( )
A.该流程利用了动物细胞融合和动物细胞培养技术
B.该单克隆抗体直接应用于人体可能会引起过敏反应
C.①是从免疫小鼠脾中提取的多种B淋巴细胞
D.②和③所进行的两次筛选过程都不需要用到ASFV
D
解析 制备单克隆抗体需要将已免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,制成杂交瘤细胞,然后进行细胞培养使之产生单克隆抗体,该过程中需要用到动物细胞融合和动物细胞培养技术,A项正确。由图可知,该单克隆抗体是利用小鼠制备的,直接应用于人体,因其属于异源蛋白可能会引起过敏反应甚至危及生命,B项正确。由图可知,在获得①之前向小鼠体内注射ASFV(作为抗原),引发小鼠特异性免疫,获得已免疫的B淋巴细胞,由于在此过程中,小鼠还可能接受其他抗原物质刺激,因此从其脾中提取的B淋巴细胞有多种,C项正确。②代表利用选择培养基进行的第一次筛选,该过程不需要用到ASFV;③代表第二次筛选,即克隆化培养和抗体检测,其中抗体检测需要用到ASFV与克隆化培养的杂交瘤细胞产生的抗体进行抗原—抗体杂交,D项错误。
突破点3 基因表达载体的构建及基因工程的技术应用
【高考命题预测】
在高考命题中,该突破点主要考查在特定情境下,通过设计合适的引物、利用特定限制酶剪切,进行基因编辑或基因拼接,达到改变特定基因、实现基因重组、获得融合蛋白等目的,操作过程复杂,所涉及内容为当前最前沿的技术成果等。多以最新基因工程研究成果为载体,通过模式图的形式呈现,部分辅以电泳图进行结果检测,设问部分的主要形式有引物的设计或选择、限制酶的选择、基因结构分析、预期基因编辑后的功能等。
聚焦1限制酶的选取与基因表达载体的构建
【练真题 明方向】
1.(2025·江苏卷改编)图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 ,下列相关叙述正确的是( )
A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型相同
C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致
D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
答案 D
解析 基因A突变为致病基因a是由碱基对T—A被G—C替换造成的,A项错误。用Hind Ⅲ限制酶酶切A基因后会形成黏性末端,用AluⅠ限制酶酶切A基因后,形成的是平末端,B项错误。用AluⅠ限制酶切割a基因有3个酶切位点,而Hind Ⅲ酶切位点只有2个,所以两种限制酶分别酶切a基因产生的片段大小不同,C项错误。用Hind Ⅲ限制酶对基因a进行酶切,产生的片段与对基因A的酶切结果不同,通过电泳显示可以进行鉴定诊断,D项正确。
2.(2025·安徽卷)质粒K中含有β-半乳糖苷酶基因,将该质粒导入大肠杆菌细胞后,其编码的酶可分解X-gal,产生蓝色物质,进而形成蓝色菌落,如图所示。科研小组以该质粒作为载体,采用基因工程技术实现人源干扰素基因在大肠杆菌中的高效表达。下列叙述错误的是( )
A.使用氯化钙处理大肠杆菌以提高转化效率,可增加筛选平板上白色和蓝色菌落数
B.如果筛选平板中仅含卡那霉素,生长出的白色菌落不可判定为含目的基因的菌株
C.因质粒K中含两个标记基因,筛选平板中长出的白色菌落即为表达目标蛋白的菌株
D.若筛选平板中蓝色菌落偏多,原因可能是质粒K经酶切后自身环化并导入了大肠杆菌
答案 C
解析 氯化钙处理大肠杆菌可使其处于感受态,提高转化效率,更多质粒(含目的基因或不含)导入,会增加蓝色(未插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因完整)和白色(插入目的基因,β-半乳糖苷酶基因被破坏)菌落数,A项正确。仅含卡那霉素时,导入普通质粒和含目的基因质粒的大肠杆菌均会形成白色菌落,无法判定菌株是否含目的基因,B项正确。白色菌落仅说明β-半乳糖苷酶基因被破坏(可能插入目的基因),但目的基因不一定表达,不能直接判定为表达目标蛋白的菌株,C项错误。质粒K酶切后自身环化,导入大肠杆菌后β-半乳糖苷酶基因完整,可分解X-gal产生蓝色菌落,会使蓝色菌落偏多,D项正确。
3.(2025·陕晋宁青卷)马铃薯作为重要农作物,提高其冷耐受性可拓展优质马铃薯的种植区域。我国科研人员发现,野生马铃薯中S基因的表达与其冷耐受性调控有关,将该基因导入栽培马铃薯中可显著增强其抗寒能力。回答下列问题。
(1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、 、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的
步骤中起作用。
(2)图中标识了载体和S基因中限制酶的切割位点。为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的 (填“5'端”或“3'端”)添加限制酶识别序列,结合上表分析,上游引物应添加的碱基序列是5'- -3',切割载体时应选用的两种限制酶是 。PCR扩增产物和载体分别被限制酶切割后,经纯化和连接,获得含S基因的表达载体并导入农杆菌。
(4种)脱氧核苷酸
延伸
5'端
AGATCT
BamHⅠ与EcoRⅠ
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中T-DNA进入愈伤组织细胞,将S基因整合到 上,抗性基因
可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经
形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
染色体DNA
2
再分化
解析 (1)PCR扩增目的基因时,需要模板DNA、引物、4种脱氧核苷酸、含Mg2+的缓冲液和耐高温的DNA聚合酶。DNA聚合酶在PCR的延伸步骤中起作用,将单个脱氧核苷酸加到引物的3'端进行子链的延伸。
(2)为将S基因正确插入载体,PCR扩增S基因时需在引物的5'端添加相应的限制酶识别序列。根据S基因的转录方向可知,使用双酶切法保证目的基因插入方向正确,载体中含有BamHⅠ、EcoRⅠ和XbaⅠ三个酶切位点,而S基因上含有XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的酶切位点,首先要保证S基因结构的完整性,不能在S基因两端添加XbaⅠ、NdeⅠ、BamHⅠ的限制酶识别序列,由表格信息可选择能与载体中限制酶切出相同黏性末端的限制酶,BglⅡ和BamHⅠ切割产生的黏性末端相同,结合S基因的转录方向可知S基因的左端为上游启动子一端,应在S基因上游添加BglⅡ的识别序列,即5'-AGATCT-3',下游直接添加EcoRⅠ的识别序列。因此,切割载体应选用的两种限制酶为BamHⅠ和EcoRⅠ。
(3)用携带S基因的农杆菌侵染栽培马铃薯愈伤组织时,基因表达载体中的T-DNA会转移并整合到愈伤组织细胞的染色体DNA上。据图可知,载体的T-DNA片段中抗性基因2含有启动子和终止子,可正常表达,若T-DNA成功整合到被侵染细胞的染色体DNA上,则该细胞就可具有抗性基因2对应的抗性,因此,抗性基因2可用于筛选成功转化的愈伤组织。该愈伤组织经再分化形成芽、根,继续培育可获得抗寒能力显著增强的马铃薯植株。
4.(2025·河北卷)为治理水体中对生物有毒害的镉污染,研究者构建了分泌信号肽SP7、镉离子结合蛋白CADR、定位于细胞壁的蛋白GP1和黄色荧光蛋白YFP编码序列融合表达的载体,转入单细胞衣藻,实现CADR大量合成、分泌并定位于细胞壁,以吸附水体中的镉离子。回答下列问题。
(1)在DNA聚合酶、引物、模板DNA和脱氧核苷酸中,随着PCR反应进行,分子数量逐渐减少的是 和 。模板与引物在PCR反应的 阶段开始结合。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,其原因为
。
引物
脱氧核苷酸
复性
PCR反应中DNA变性需高温,耐高温的DNA聚合酶能在高温下催化子链合成
(2)载体中可用的酶切位点信息和拟构建载体的部分结构如图1所示。在将CADR、GP1和YFP基因逐个构建到载体时,为避免错误连接,需向以上三个基因的两端分别添加限制酶识别序列,其中GP1两端应添加 (填两种限制酶)的识别序列。用DNA连接酶连接时,可催化载体和目的基因之间形成 键。
图1
SmaⅠ和EcoRⅠ
磷酸二酯
(3)若在荧光显微镜下观察到转基因衣藻表现为 ,初步表明融合蛋白表达成功。将转基因衣藻和野生型衣藻置于含镉离子的培养液中培养一段时间后,若转基因衣藻细胞壁比野生型衣藻细胞壁的镉离子含量 ,则表明融合蛋白能结合镉离子。
发黄色荧光且荧光定位于细胞壁
高
(4)将转基因衣藻和野生型衣藻在不同镉离子浓度的培养液中培养6 d后,检测细胞密度,结果见图2。转基因衣藻在含有不同浓度镉离子的培养液中生长均优于野生型衣藻的原因可能是____________________________
。
240 μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻生长均被明显抑制的原因可能是
。
注:镉离子对渗透压的影响忽略不计。
图2
转基因衣藻可通过细胞壁上的
融合蛋白吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害
培养液中的镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害
(5)转基因衣藻可用于水体镉污染治理,与施加化学药物法相比,能体现出其环境治理优势的两个特性是 和 。(填标号)
①衣藻作为生物材料在水体中可自我繁殖
②衣藻生长速率受镉离子浓度影响
③衣藻可吸收水体中能引起富营养化的物质
④衣藻吸附的镉可沿食物链传递
①
③
解析 (1)PCR反应中,脱氧核苷酸(原料,随循环进行被消耗)和引物(与模板结合后被延伸,消耗减少)的分子数量逐渐降低。模板与引物在PCR反应的复性阶段结合(温度降低,引物与模板互补配对)。PCR中使用的DNA聚合酶需耐高温,因为PCR反应要经高温变性(使DNA解旋),普通酶会失活,耐高温的DNA聚合酶才能在高温环境下催化子链合成。
(2)观察载体上的酶切位点,结合基因连接顺序(SP7→CADR→GP1→YFP),根据限制酶识别序列及切割位点可知,载体中前两个酶切位点经NheⅠ和XbaⅠ酶切后形成的黏性末端一致,如果第一个基因CADR添加这两个限制酶的识别序列,与切割后的载体连接时会形成倒位连接,因此CADR两端添加NheⅠ(或XbaⅠ)和SmaⅠ两种限制酶的识别序列,先与载体连接。第二个基因GP1两端添加SmaⅠ和EcoRⅠ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR基因的载体上。最后YFP基因两端添加EcoRⅠ和EcoRⅤ两种限制酶的识别序列,连接到已重组了CADR和GP1两个基因的载体上,从而完成基因表达载体的构建。DNA连接酶催化载体和目的基因之间形成磷酸二酯键。
(3)融合蛋白含黄色荧光蛋白YFP,若表达成功,转基因衣藻在荧光显微镜下会发出黄色荧光且荧光定位于细胞壁(GP1使融合蛋白定位于细胞壁)。若融合蛋白能结合镉离子,转基因衣藻细胞壁的镉离子含量会高于野生型(野生型无CADR高效吸附作用)。
(4)转基因衣藻的生长优于野生型,原因是细胞壁上的融合蛋白能吸附培养液中的镉离子,减轻了镉离子对细胞的毒害(转基因衣藻通过细胞壁上的CADR减少镉进入细胞)。240 μmol/L镉离子浓度下,转基因衣藻和野生型衣藻的生长均受到抑制,是因为镉离子浓度过高,超出融合蛋白的吸附能力,细胞内镉离子积累过多产生强毒害。
(5)与化学药物法相比,转基因衣藻的优势:①可自我繁殖,无需持续投放,能长期发挥作用;③吸收富营养化物质:治理镉污染的同时,改善水体富营养化(如吸收N、P)。衣藻生长受镉离子浓度影响,非优势,②不符合题意;镉沿食物链传递,有风险,非优势,④不符合题意,故填①和③。
【归纳拓展】
1.限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)。
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
2.基因表达载体的构建过程
【练模拟 拓角度】
5.(2025·安徽合肥三模)低温是早春和晚秋作物生长的重要环境胁迫因子,可导致植物的叶出现脱水萎蔫。科研人员以一种农杆菌Ti质粒为载体,将由低温诱导启动子RD29A控制的拟南芥耐寒基因AtCOR15a导入番茄基因组,以期改良番茄的耐寒性,为培育耐寒性番茄新品种奠定基础。回答下列问题。
(1)低温诱导启动子RD29A的作用是
。请在图中标明重组后拟南芥耐寒基因AtCOR15a和低温诱导启动子RD29A的位置。
低温条件下,被RNA聚合酶识别和结合,驱动AtCOR15a基因的转录
(2)将含有基因AtCOR15a的重组Ti质粒转入农杆菌,再用农杆菌侵染番茄无菌苗子叶,使用抗生素 筛选出具有该抗生素抗性的幼苗后,还需提取抗性幼苗的染色体DNA进行PCR鉴定,目的是 。
(3)通过对番茄幼苗的总RNA进行测定,获得基因AtCOR15a相对表达量最高的3个株系A1、A33、A37。为进一步从个体水平对这些株系幼苗的耐寒性进行评估,简要写出实验设计思路:
。
卡那霉素
检测番茄的染色体DNA上是否插入了AtCOR15a基因
以野生型番茄和A1、A33和A37株系番茄为材料,低温处理相同时间后,观察低温条件下番茄叶的脱水萎蔫程度,比较各材料间耐寒性的差异
解析 (1)启动子的作用是提供RNA聚合酶识别和结合的位点,驱动基因转录出mRNA,所以低温诱导启动子RD29A的作用是低温条件下,被RNA聚合酶识别和结合,驱动AtCOR15a基因的转录。因为Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞的染色体DNA上,所以重组后拟南芥耐寒基因AtCOR15a和低温诱导启动子RD29A应位于T-DNA内。
(2)由图可知,T-DNA中含卡那霉素抗性基因,所以使用抗生素卡那霉素筛选出具有该抗生素抗性的幼苗,提取抗性幼苗的染色体DNA进行PCR鉴定,目的是检测番茄的染色体DNA上是否插入了AtCOR15a基因。
(3)本实验的目的是为进一步从个体水平对获得基因AtCOR15a相对表达量最高的3个株系A1、A33、A37的耐寒性进行评估,自变量为番茄幼苗的种类,因变量为番茄叶的脱水萎蔫程度,实验设计思路为以野生型番茄和A1、A33和A37株系番茄为材料,低温处理相同时间后,观察低温条件下番茄叶的脱水萎蔫程度,比较各材料间耐寒性的差异。
聚焦2基因工程技术的应用
【练真题 明方向】
6.(2024·新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中,构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段;再经限制酶切割获得含N基因的片段甲,片段甲两端分别为M1与M2;利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组,得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ~Ⅳ)、引物(P1~P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示,→表示引物5'→3'方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是 。为保证N基因能在菌株B2中表达,在构建片段甲时,应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间,原因是______________________________________________
。
磷酸二酯键
不破坏N基因,使M1与M2之间有启动子、N基因、
终止子,能保证N基因正常表达
(2)CRISPR/Cas9 技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA 互补配对可以形成的碱基对有G—C和 。
C—G、A—T、U—A
【情境链接】
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补,从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合,并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物,与传统的基因工程相比,其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
[命题设计]
(1)从功能上来看,CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制性内切核酸酶,该系统广泛存在于细菌中,其在细菌中的作用是
。
(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而“脱靶”的现象,sgRNA的识别序列越短,基因编辑的脱靶率就越高。请分析原因。
。
切割外源DNA,使之失效,起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵,保护自身或清除入侵病毒DNA)
sgRNA的识别序列短,特异性差,容易与其他DNA片段结合造成编辑出错
【练模拟 拓角度】
7.(2025·四川内江三模)2-苯乙醇(2-PE)具有令人愉悦的玫瑰香气,常作为添加剂而广泛地应用于食品、化妆品和医药领域。酿酒酵母生产2-PE过程中,支路基因ARO8的表达会损耗中间代谢物而导致2-PE产量不高。科研人员欲使用CRISPR/Cas9基因编辑技术(CRISPR/Cas9系统编码的sgRNA可引导Cas9蛋白切割目的基因)对尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母进行编辑处理,以降低由ARO8基因导致的中间产物损耗来提高2-PE产量。生产过程如图1。
图1
注:BclⅠ识别序列为5'-TGATCA-3', SmiⅠ识别序列为5'-TTTAAA-3', EcoRⅠ识别序列为5'-GAATTC-3'; URA3基因表达产物可指导合成尿嘧啶,但当培养基中含有5-氟乳清酸(5-FOA)时,尿嘧啶可将5-FOA转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。
回答下列问题。
(1)构建基因表达载体。人工合成sgRNA对应的DNA片段时,应根据
基因的部分已知碱基序列等设计。据图分析可知,为保证sgRNA对应的DNA片段正确插入质粒1中,在进行PCR扩增时需在该DNA片段上下游分别添加 限制酶的识别序列,再用
连接。基因表达载体除了图示组成外,还需要有 。
(2)基因表达载体的扩增。在含有 的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌,提取质粒。
ARO8
BclⅠ、SmiⅠ
DNA连接酶
复制原点
氨苄青霉素
(3)导入受体细胞。用质粒2转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母,在
的平板上筛选成功导入质粒的酿酒酵母。Cas9蛋白在sgRNA引导下切割ARO8基因实现对ARO8基因的敲除。实现敲除后,为避免质粒残留带来后续影响,研究人员将获得的单菌落多次传代,随后稀释涂布在含有 的平板上,筛选并获得不再含有质粒2的菌落。
缺乏尿嘧啶
5-氟乳清酸(5-FOA)
(4)表达水平检测。为验证ARO8基因的缺失对2-PE合成的影响,研究人员对2-PE发酵产量进行了检测,结果如图2。实验结果说明
。
图2
ARO8基因的缺失能提高2-PE产量(或ARO8的表达会导致2-PE产量较低)
解析 (1)图1中显示,CRISPR/Cas9系统编码的sgRNA可通过碱基互补配对与ARO8基因进行结合,引导Cas9蛋白切割ARO8基因,所以,人工合成sgRNA对应的DNA片段时,应根据ARO8基因的部分已知碱基序列等设计。图中质粒1中,启动子与终止子之间依次有BclⅠ、SmiⅠ、EcoRⅠ的酶切位点,而EcoRⅠ会破坏氨苄青霉素抗性基因,所以,在进行PCR扩增时需在sgRNA对应的DNA片段上下游分别添加BclⅠ、SmiⅠ限制酶的识别序列,再用DNA连接酶进行连接。基因表达载体的组成包括目的基因、复制原点、启动子、终止子和标记基因。图1中的质粒2即基因表达载体,其中显示了启动子、终止子、Cas9基因、sgRNA对应的DNA片段(目的基因)、URA3基因和氨苄青霉素抗性基因(标记基因,它们的表达产物便于目的基因的检测与受体细胞的筛选)。所以基因表达载体除了图示组成外,还需要有复制原点。
(2)因为基因表达载体含氨苄青霉素抗性基因,所以进行基因表达载体的扩增时,可以在含有氨苄青霉素的培养基上筛选培养导入重组质粒的大肠杆菌,提取质粒。
(3)同理,用质粒2转化尿嘧啶营养缺陷型酿酒酵母,在不含尿嘧啶的平板上筛选成功导入质粒的酿酒酵母。基因表达载体上的URA3基因的表达产物可指导合成尿嘧啶,但当培养基中含有5-氟乳清酸(5-FOA)时,尿嘧啶可将5-FOA转化为有毒的5-氟尿嘧啶而抑制细胞生长。Cas9蛋白在sgRNA引导下切割ARO8基因实现对ARO8基因的敲除。实现敲除后,为避免质粒残留带来后续影响,研究人员将获得的单菌落多次传代,随后稀释涂布在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的平板上,筛选并获得不再含有质粒2的菌落。
(4)为验证ARO8基因的缺失对2-PE合成的影响,研究人员对2-PE发酵产量进行了检测,图2显示,在24 h的发酵时间中,ARO8基因缺失的突变株生产的2-PE浓度比原型株更高,说明ARO8基因的缺失能提高2-PE产量(或ARO8的表达会导致2-PE产量较低)。
聚焦3PCR引物的选择与设计
1.引物及其作用
(1)PCR需要引物的原因:PCR必须加入引物,这是由DNA聚合酶的特点决定的。与体内DNA复制一样,DNA聚合酶不能直接催化两个游离的脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,只能把脱氧核苷酸添加到一段脱氧核苷酸链的3'端。在PCR中,直接加入一对单链DNA作为引物,这样可以避免像体内DNA复制那样,复制完毕后因切除RNA引物而造成子链DNA长度变短的情况。所以引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸;体外是DNA,体内是RNA。引物的作用是把脱氧核苷酸添加到一段脱氧核苷酸链的3'端。
(2)引物的特点
①PCR的引物必须是成对的(两种)。如果只加一种引物,经过n轮循环,只能产生n条新的单链DNA,无法实现双链DNA的指数形式扩增。
②一对引物分别特异性结合在模板链上的目的基因两侧,引物与模板的结合位点决定了特异性扩增产物的起点和终点。
(3)结果:DNA聚合酶能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列。经过多轮扩增后,非目标片段可以忽略不计。因此PCR的产物主要是目的基因,即实现了特异性扩增。
[问题设计]
(1)PCR需要两种引物,但是引物序列不同是由于
。
(2)如图为X蛋白的部分基因序列,所示序列为引物结合的部分,据图分析:
扩增X蛋白基因所需的引物序列是 ;
。
DNA是反向平行的双链,DNA聚合酶只能从引物3'端延伸DNA链,用两种引物才能确保DNA两条链同时被扩增
5'-ATGCCGTAAGTCCTAC-3'
5'-TGATCTACGGCTTACA-3'
(3)对人干扰素基因进行PCR扩增时需要一对引物,应从下图中A、B、C、D四种单链DNA片段中选取 (填字母)作为引物。
B、C
(4)为了对重金属污染的土壤进行生物修复,研究者将从杨树中克隆的重金属转运蛋白基因(HMA3)与外源高效启动子连接,导入杨树基因组中(如图)。
注:①②③④表示引物。
为检测获得的转基因杨树苗中是否含有导入的HMA3基因,同时避免内源HMA3基因的干扰,在进行PCR扩增时,应选择的引物组合是
。
①+②(或①+④)
2.引物的设计
(1)设计PCR所用引物时,需注意引物不能与模板的其他区域结合,从而保证扩增的特异性,还要避免引物内部或者两条引物之间互补配对。
(2)引物的大小:复性时,为何两条模板链能与引物结合而不是模板链之间结合呢 这是因为,引物一般只有20~30个核苷酸,复性温度就是根据引物序列专门设定的,而且引物的浓度远大于模板的浓度,所以当温度下降到复性温度时,引物会更快地特异性结合在模板上。引物太短造成特异性差,会出现杂链;引物太长会增加合成成本,另外过长的引物会使复性温度提高,甚至会超过Taq DNA聚合酶的最适温度,从而影响扩增效率。
(3)PCR的复性温度受引物中G、C碱基含量的影响。温度过高,不利于引物与模板结合;温度过低,引物可能会与模板发生非特异性结合。
[问题设计]
(5)请回答基因工程方面的有关问题:设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的2组引物如图,都不合理,请分别说明理由。
①第1组: ;
②第2组: 。
引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
引物Ⅰ'自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(6)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示,除了目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生,以下措施中有效的是( )
A.增加模板DNA的量
B.延长热变性的时间
C.延长延伸的时间
D.提高复性的温度
D
(7)若对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,结果发现有两个或多个条带,从引物角度分析,原因可能是 。
引物过短导致引物的特异性下降
3.引物的修饰
(1)引物的5'端决定着PCR产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。
(2)引物5'端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光等;引入蛋白质结合DNA序列;引入点突变、插入突变、缺失突变序列;引入启动子序列等。特别是在基因工程中,为了便于扩增的DNA片段与表达载体的连接,在片段的5'端添加限制酶的识别序列的方式经常考查。
(3)通常,两种引物上设计不同的酶切位点,以确保目的基因与载体的正向连接。
[问题设计]
(8)引物用PCR技术将DNA分子中的A1片段进行扩增,设计了引物Ⅰ、Ⅱ,其连接部位如图所示,X为某限制酶识别序列。扩增后得到的绝大部分DNA片段是图中的( )
A
B
C
D
D
(9)木质纤维素是地球上最为丰富的可再生资源,中国科学家利用基因工程的方法构建了一株嗜热厌氧杆菌H,以花生壳、玉米芯等为原料发酵生产生物燃料乙醇,以期提高农业废弃物的整体利用价值。基于嗜热厌氧杆菌的特殊代谢能力(图a),研究人员构建了双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)的过量表达载体,图b为构建表达载体时所需的关键条件。
图a
图b
为保证双功能醇醛脱氢酶基因(Adh)能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和引物2,其中引物1的序列为5'- -3'。
GGTACCGTACCTTTGT
【练真题 明方向】
8.(2025·湖南卷)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题。
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和 等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物 对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为 bp。
注:P1、P2和P3表示引物。
终止子、复制原点
P1和P3
782
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是______________________________________________________
_______________________________________________________________ (答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有________________________________________________
(答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和 ,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解
聚乙二醇(PEG)融合法(或灭活病毒诱导法、电融合法)
抗体检测
解析 (1)①重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子、复制原点等。要确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用引物P1和P3。因为P1与基因A下游的非编码区互补配对,P3与基因A上游且靠近启动子的区域互补配对,这样扩增产物的片段大小为200+582=782(bp)。②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌,培养后上清液中无蛋白A,可能的原因有:重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外,转速过高使蛋白A发生沉淀,蛋白A亲水性较差发生沉淀,蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解等。
(2)诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等,这里答出其中一种即可,比如聚乙二醇(PEG)融合法。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
