专题十四 细胞工程与基因工程
INCLUDEPICTURE "课程标准lll.TIF" INCLUDEPICTURE "课程标准lll.TIF" \* MERGEFORMAT 1.植物细胞工程包括组织培养和体细胞杂交等技术。 2.动物细胞工程包括细胞培养、核移植、细胞融合和干细胞的应用等技术。 3.对动物早期胚胎或配子进行显微操作和处理以获得目标个体。 4.基因工程是一种重组DNA技术。 5.蛋白质工程是基因工程的延伸。 6.转基因产品的安全性引发社会的广泛关注。 7.中国禁止生殖性克隆人。 8.世界范围内应全面禁止生物武器。
INCLUDEPICTURE "生物表14lll.TIF" INCLUDEPICTURE "生物表14lll.TIF" \* MERGEFORMAT
[答案自填] ①细胞的全能性 ②细胞增殖 ③细胞膜的流动性 ④细胞核的全能性 ⑤获能 ⑥桑葚胚、囊胚 ⑦将内细胞团均等分割 ⑧限制酶 ⑨利用PCR获取和扩增 ⑩基因表达载体的构建 分子水平 基因
命题点1 植物细胞工程
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1．植物细胞工程的两大技术
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2．植物组织培养的条件
(1)植物组织培养的关键
↑
添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
①条件：________，一定营养物质，激素(生长素、细胞分裂素)等。
②培养基状态：固体培养基。→加入的琼脂不能被利用
③体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
(2)植物激素的使用
生长素与细胞分裂素的比值 作用效果
高 促进根分化、抑制______形成
低 促进芽分化、抑制根形成
适中 促进________________形成
3.植物体细胞杂交的关键
(1)酶解法——用________和__________去除细胞壁。
INCLUDEPICTURE "箭头A.TIF" INCLUDEPICTURE "箭头A.TIF" \* MERGEFORMAT
不能利用病毒融合法
(2)融合的方法——电融合法、离心法、聚乙二醇(PEG)融合法、高Ca2＋—高pH融合法等。
(3)杂种细胞的形成标志——____________的形成。
(4)培养杂种植株的技术——植物组织培养。
(5)杂种植株培育成功的原理——细胞具有全能性。
[答案自填] 全能性 离体 芽 愈伤组织 纤维素酶
果胶酶 新细胞壁
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1．(选择性必修3 P40图2－7)单倍体植株是进行体细胞诱变育种和研究遗传突变的理想材料，其原因是大多数单倍体植株的细胞中只含有一套染色体，染色体加倍后得到的植株的隐性性状容易显现。
2．(选择性必修3 P116附录1)不同作用的培养基
(1)诱导菊花愈伤组织的培养基：在MS培养基中加入BA(苄基腺嘌呤)和NAA(萘乙酸)，质量浓度均为0.5 mg/L。
(2)诱导菊花生芽的培养基：在MS培养基中加入BA和NAA，质量浓度分别为2～3 mg/L和0.02～0.3 mg/L。
(3)诱导菊花生根的培养基：将上述MS培养基中NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O和CaCl2·2H2O的用量减半，并添加NAA或IAA(吲哚乙酸)，质量浓度均为0.1 mg/L。
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【最新考情】
1．(2024·浙江1月选考)山药在生长过程中易受病毒侵害导致品质和产量下降。采用组织培养技术得到脱毒苗，可恢复其原有的优质高产特性，流程如图。下列操作不可行的是( )
外植体→愈伤组织→丛生芽→试管苗
A．选择芽尖作为外植体可减少病毒感染
B．培养基中加入抗生素可降低杂菌的污染
C．将丛生芽切割后进行继代培养可实现快速繁殖
D．提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成丛生芽
解析：选D。芽尖等分生组织分裂旺盛，病毒浓度很低甚至无病毒，故选择芽尖作为外植体可减少病毒感染，A不符合题意。培养基中有大量的营养物质，其容易被杂菌污染，加入抗生素可降低杂菌的污染，B不符合题意。将初代培养获得的培养物转移到新的培养基上继续进行扩大培养称为继代培养，其又可以分为第二代培养、第三代培养等。大多数植物每隔4～6周进行一次继代培养，每继代培养一次，培养物一般能增殖3～4倍。正因为培养物可以不断继代培养，所以离体繁殖速度比常规方法通常要快数万倍，可实现快速繁殖，C不符合题意。提高生长素和细胞分裂素的比值可促进愈伤组织形成根，D符合题意。
2．(2024·湖北选择考)植物甲抗旱、抗病性强，植物乙分蘖能力强、结实性好。科研人员通过植物体细胞杂交技术培育出兼有甲、乙优良性状的植物丙，过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．过程①中酶处理的时间差异，原因可能是两种亲本的细胞壁结构有差异
B．过程②中常采用灭活的仙台病毒或PEG诱导原生质体融合
C．过程④和⑤的培养基中均需要添加生长素和细胞分裂素
D．可通过分析植物丙的染色体，来鉴定其是否为杂种植株
解析：选B。利用纤维素酶和果胶酶去除植物细胞壁时，可能因植物细胞壁结构差异而调整酶处理的时间，A正确；灭活的仙台病毒是动物细胞融合特有的诱导剂，B错误；植物组织培养过程中的脱分化(④)和再分化(⑤)过程均需要添加生长素和细胞分裂素，但两过程中两种激素比例不同，C正确；杂种植物细胞应含有两种生物的染色体，因此可通过分析植物丙的染色体，来鉴定植物丙是否为杂种植株，D正确。
[把脉高考] 该知识点为中低频考点。试题情境常与生活、生产、育种紧密联系，考查教材知识的内涵和外延。
【历年考情】
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(1)(2022·辽宁T14)宜选用蓝莓成熟叶片为材料制备外植体。( )
(2)(2022·浙江1月T7)农作物秸秆的回收利用方式很多，其中之一是将秸秆碎化后作为食用菌的栽培基质。碎化秸秆中纤维所起的作用，相当于植物组织培养中固体培养基的琼脂＋蔗糖。( )
(3)(2021·江苏T5)植物组织培养过程中，用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异。( )
(4)(2020·北京T13)为培育具有市场竞争力的无子柑橘，研究者设计如下流程。
过程③需应用植物组织培养技术。( )
INCLUDEPICTURE "练表达lll.TIF" INCLUDEPICTURE "练表达lll.TIF" \* MERGEFORMAT
(5)(2020·天津T15节选)在诱导形成愈伤组织阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是__________________________________________。
(6)(经典高考题)①植物微型繁殖是植物繁殖的一种途径。与常规的种子繁殖方法相比，这种微型繁殖技术的特点有_______________________________
______________________________________________(答出2点即可)。
②用脱毒苗进行繁殖，可以减少作物感染病毒。为了获得脱毒苗，可以选取植物________进行组织培养。
提示：(1)× (2)√ (3)× (4)√ (5)细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织 (6)①能保持优良品种的遗传特性、繁殖速度快 ②茎尖
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1．(2024·河北唐山高三一模)紫杉醇具有良好的抗癌作用。科研人员用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中进行细胞悬浮培养，以获得更多紫杉醇。下列叙述错误的是( )
外植体―→愈伤组织―→―→
―→
A．诱导愈伤组织需要考虑外植体的取材部位、培养基组成和激素种类等
B．由愈伤组织得到悬浮细胞可以使用纤维素酶和果胶酶进行处理
C．使用液体培养基并振荡有利于细胞获取氧气和营养物质，促进细胞生长
D．利用植物细胞培养技术获得初生代谢物紫杉醇能避免大量破坏野生红豆杉种群
解析：选D。诱导愈伤组织需要考虑外植体的取材部位、培养基组成和激素种类等，A正确；由愈伤组织得到悬浮细胞可以使用纤维素酶和果胶酶进行处理，去除细胞壁，B正确；使用液体培养基并振荡可增大培养基溶氧量，使细胞与培养基充分接触，有利于细胞获取氧气和营养物质，促进细胞生长，C正确；紫杉醇属于次生代谢物，D错误。
2．(2024·广东梅州高三一模)花椰菜易受黑腐病菌的危害而患黑腐病，野生黑芥具有黑腐病的抗性基因。用一定剂量的紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，并丧失再生能力。利用此原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，以获得抗黑腐病杂种植株。流程如下图所示，下列相关叙述错误的是( )
A．融合成功的杂种细胞中染色体数目可能不同
B．最终获得的抗病植株具有完整的黑芥和花椰菜的遗传信息
C．初步筛选杂种细胞可在过程②后，以融合的活细胞中有叶绿体为标志
D．可将黑腐病菌接种到杂种植株上以鉴定其是否具有抗病性状
解析：选B。由题干可知，紫外线处理黑芥原生质体可使其染色体片段化，故融合成功的杂种细胞染色体数目可能不同，A正确；利用经紫外线处理的黑芥原生质体作为部分遗传物质的供体与完整的花椰菜原生质体融合，因黑芥原生质体提供部分遗传物质，因此最终获得的抗病植株不具有完整的黑芥遗传信息，B错误；叶肉细胞原生质体和根细胞原生质体融合细胞，有叶绿体的存在，说明细胞融合初步成功，可以以融合的活细胞中有无叶绿体的存在作为初步筛选杂种细胞的标志，C正确；个体水平上鉴定转基因植株是否具有抗黑腐病的性状，可用黑腐病菌侵染该植株，观察植物生长状况，D正确。
命题点2 动物细胞工程与胚胎工程
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1.
2. INCLUDEPICTURE "23SD89A合.TIF" INCLUDEPICTURE "23SD89A合.TIF" \* MERGEFORMAT
3.
[易错提醒] 核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：
(1)克隆动物的遗传物质来自两个亲本。
(2)发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。
(3)外界环境可能引起不可遗传的变异。
4.
(2)生理学基础
5．胚胎分割
[答案自填] 特定抗原 特定抗体 MⅡ期 去核 重构胚 超数排卵 妊娠 桑葚胚或囊胚 动物的无性繁殖或克隆
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1．(选择性必修3 P44旁栏思考)动物细胞培养时不能用胃蛋白酶分散细胞的原因：胃蛋白酶适于在较强的酸性条件下发挥作用，多数动物细胞培养的适宜pH为 7.2～7.4，胃蛋白酶在此环境下没有活性。
2．(选择性必修3 P46正文)干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞等。2006年，科学家通过体外诱导小鼠成纤维细胞，获得了诱导多能干细胞(简称iPS细胞)。
3．(选择性必修3 P48相关信息)灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但并不破坏它们的抗原结构。
4．(选择性必修3 P50思考·讨论)抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADC的抗体具有特异性识别肿瘤细胞的作用，药物有杀伤肿瘤细胞的作用。
5．(选择性必修3 P60正文)胚胎工程技术目前在医学和生产上应用较多的是体外受精、胚胎移植和胚胎分割等，借助这些技术，可进一步挖掘动物的繁殖潜力。
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【最新考情】
1．(2024·黑吉辽选择考)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养，在传代后的不同时间点检测细胞数目，结果如图。下列叙述正确的是( )
A．传代培养时，培养皿需密封防止污染
B．选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C．直接用离心法收集细胞进行传代培养
D．细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
解析：选D。动物细胞培养需要O2、CO2等气体，因此传代培养时，培养皿不能密封，A错误；原代培养的细胞出现接触抑制现象后，需要分瓶进行传代培养，①的细胞处于增长初期，细胞还未出现接触抑制现象，因此选取②的细胞进行传代培养比①更合理，B错误；由于成纤维细胞贴壁生长，进行传代培养时，需用胰蛋白酶等处理，使其分散成单个细胞后再用离心法收集，C错误；细胞密度过大时，产生的代谢废物较多，营养物质消耗较快，可能导致细胞增长进入平台期，D正确。
2．(2024·甘肃选择考)甘加藏羊是甘肃高寒牧区的优良品种，是季节性发情动物，每年产羔一次，每胎一羔，繁殖率较低。为促进畜牧业发展，研究人员通过体外受精、胚胎移植等胚胎工程技术提高藏羊的繁殖率，流程如下图。下列叙述错误的是( )
A．藏羊甲需用促性腺激素处理使其卵巢卵泡发育和超数排卵
B．藏羊乙的获能精子能与刚采集到的藏羊甲的卵母细胞受精
C．受体藏羊丙需和藏羊甲进行同期发情处理
D．后代丁的遗传物质来源于藏羊甲和藏羊乙
解析：选B。可使用促性腺激素促进卵巢卵泡发育和超数排卵，A正确；卵母细胞需培育到MⅡ期才能与获能的精子结合形成受精卵，B错误；受体藏羊丙需要和供体藏羊甲进行同期发情处理，C正确；后代丁是藏羊甲和藏羊乙通过受精作用产生的，其遗传物质来自藏羊甲和藏羊乙，D正确。
[把脉高考] 该知识点为高频考点。试题常结合免疫调节和基因工程进行综合考查，涉及人体健康、制药，渗透社会责任。
【历年考情】
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(1)(2023·湖南T21)研究人员通过肺上皮干细胞诱导生成肺类器官，可自组装或与成熟细胞组装成肺类装配体。肺类装配体培养需要满足适宜的营养、温度、渗透压、pH、无菌、无毒环境、含95%空气和5%CO2的气体环境等基本条件。( )
(2)(2023·北京T12)研究者制备单克隆抗体用于快速检测甲状旁腺激素(PTH)，制备过程中能筛选分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞。( )
(3)(2023·广东T3)科学家采用体外受精技术获得紫羚羊胚胎，并将其移植到长角羚羊体内，使后者成功妊娠并产仔，该工作有助于恢复濒危紫羚羊的种群数量。此过程不涉及精子获能处理。( )
(4)(2023·浙江1月T12)胚胎分割技术提高了移植胚胎的成活率。( )
(5)(2022·湖北T7)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究，结果发现其培养的原代神经元生长缓慢，其原因不可能是血清经过高温处理后加入培养基。( )
(6)(2021·江苏T11)将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。( )
(7)(2021·浙江1月T18)动物细胞培养过程中用盐酸溶解细胞间物质使细胞分离。( )
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(8)(2023·湖北T22节选)①添加脂溶性物质PEG可促进细胞融合，该过程中PEG对细胞膜的作用是________________________________________________
________________________________________________________。
②在杂交瘤细胞筛选过程中，常使用特定的选择培养基(如HAT培养基)，该培养基对__________和_________________________________生长具有抑制作用。
③单克隆抗体筛选中，将抗体与该病毒外壳蛋白进行杂交，其目的是______________________________________________________________________
______________________________________________________________。
(9)(2022·全国甲T38节选)①为了实现体外受精需要采集良种公羊的精液，精液保存的方法是________。在体外受精前要对精子进行获能处理，其原因是_____________________________________________________________。
②请以保存的囊胚和相应数量的非繁殖期受体母羊为材料进行操作，以获得具有该公羊优良性状的后代。主要的操作步骤是______________________________________________________________________
______________________________________________________________。
提示：(1)√ (2)× (3)× (4)× (5)× (6)× (7)× (8)①使细胞接触处细胞膜的脂类分子发生疏散和重组，从而导致细胞膜相互亲和，促进融合 ②未融合的(亲本)细胞 融合的具有同种核的细胞 ③通过抗体检测呈阳性来获得分泌所需抗体的杂交瘤细胞 (9)①冷冻保存 刚排出的精子不能与卵子受精，只有获能后才具备受精能力(合理即可) ②对受体母羊进行同期发情处理，将保存的囊胚进行胚胎移植
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突破1 动物细胞的培养及核移植
1．Vero细胞系来源于非洲绿猴肾上皮细胞，具有无限分裂和贴壁生长的特性。将新冠病毒接种到Vero细胞后，经Vero细胞培养、新冠病毒灭活及提纯，可制成新冠病毒灭活疫苗。下列叙述错误的是( )
A．Vero细胞可作为新冠病毒大量繁殖的“培养基”
B．向Vero细胞培养液中加入适量抗生素可防止杂菌污染
C．分瓶前需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的Vero细胞
D．每传代1次，培养瓶中的Vero细胞分裂1次
解析：选D。将新冠病毒接种到Vero细胞，Vero细胞可作为新冠病毒大量繁殖的“培养基”，A正确；向Vero细胞培养液中加入适量抗生素可防止杂菌污染，B正确；分瓶进行传代培养前需要用胰蛋白酶处理贴壁生长的Vero细胞，C正确；每传代1次，培养瓶中的Vero细胞可能分裂多次，D错误。
2．(2024·河北沧州八县高三联考)为研究治疗性克隆技术能否用于帕金森病的治疗，科研人员利用帕金森病模型鼠进行下图所示实验，下列叙述错误的是( )
A．过程①中选择MⅡ期的卵母细胞有利于细胞核全能性恢复
B．过程②重组细胞培养经历了桑葚胚、原肠胚和囊胚等过程
C．过程③的关键是利用特定条件诱导胚胎干细胞相关基因表达
D．过程④无需对受体小鼠注射免疫抑制剂以抑制其细胞免疫功能
解析：选B。由于卵母细胞含有易于细胞核表达的物质，过程①中选择MⅡ期的卵母细胞有利于细胞核全能性恢复，A正确；过程②重组细胞培养并获取胚胎干细胞，依次经历了桑葚胚、囊胚过程，B错误；过程③的关键是利用特定条件诱导胚胎干细胞相关基因表达，使之分化形成神经元，C正确；由于移植神经元来自小鼠自身皮肤细胞的诱导分化，不会出现免疫排斥反应，因此过程④中无需对受体小鼠注射免疫抑制剂，D正确。
突破2 动物细胞融合及单克隆抗体
3．(2024·河北衡水高三一模)科研人员研发出单克隆抗体—肺癌药物偶联物以减少肺癌药物对正常细胞的伤害，基本流程如下图。下列相关叙述正确的是( )
A．注射的特定抗原是正常肺细胞和肺癌细胞共有的大分子
B．抗体—肺癌药物偶联物中a代表肺癌药物，b代表抗体
C．经②③最终得到的杂交瘤细胞只能产生针对肺癌细胞的抗体
D．抗体—肺癌药物偶联物只能定向运输至肺癌细胞，将其杀伤
解析：选C。由题意可知，科研人员研发出单克隆抗体—肺癌药物偶联物，以减少肺癌药物对正常细胞的伤害，据此可推测，该单克隆抗体制备过程中需要注射的特定抗原是肺癌细胞特有的大分子，A错误；抗体—肺癌药物偶联物中b代表肺癌药物，a代表抗体，B错误；经②③两次筛选最终得到的杂交瘤细胞只能产生针对肺癌细胞的抗体，C正确；抗体—肺癌药物偶联物能运输到全身各处，但只能定向作用于肺癌细胞，将其杀伤，D错误。
4．采用抗原试剂盒可以进行甲流病毒检测。试剂盒中的一种抗PD-L1单克隆抗体能与甲流病毒表面的PD-L1特异性结合，发挥诊断作用。利用小鼠制备抗PD-L1单克隆抗体的流程如下图所示，下列叙述错误的是( )
A．制备抗PD-L1单克隆抗体使用的B淋巴细胞取自注射过PD-L1的小鼠的脾
B．放入96孔板的细胞为多种杂交瘤细胞，均能大量增殖，其中部分还能产生所需抗体
C．杂交瘤细胞在培养过程中一般无接触抑制现象，不需要用胰蛋白酶处理
D．将图中细胞群a在体外大规模培养，可以提取出大量的抗PD-L1单克隆抗体
答案：B
突破3 胚胎工程综合应用
5．(2024·湖南长沙高三联考)第三代试管婴儿技术(PGD/PGS)是对早期胚胎细胞进行基因诊断和染色体检测后再进行胚胎移植，流程如下图所示。图中检测包括PGD、PGS(PGD是指胚胎植入前的基因诊断，PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测)。下列叙述正确的是( )
A．采集的卵子需培养至MⅠ期才能与获能的精子进行受精
B．PGD和PGS技术可分别用于筛选红绿色盲和唐氏综合征
C．将成熟的精子放入ATP溶液中进行获能处理
D．“理想胚胎”需培养至桑葚胚或原肠胚才能植入子宫
解析：选B。体外受精时，需要将采集到的卵母细胞在体外培养到MⅡ期，才可以与获能的精子完成受精作用，A错误。PGD是指胚胎植入前的基因诊断，PGD可用于筛选红绿色盲；PGS是指胚胎植入前的染色体数目和结构检测，PGS可用于筛选唐氏综合征，B正确。将精子放在一定浓度的肝素或Ca2＋载体溶液中，用化学药物诱导精子获能，C错误。“理想胚胎”需培养至桑葚胚或囊胚才能植入子宫，D错误。
命题点3 基因工程、生物技术的安全性与伦理问题
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1．基因工程的操作流程
(1)目的基因的筛选与获取
[易错提醒] (1)目的基因主要是指编码蛋白质的基因。
(2)在已有mRNA前提下，可通过逆转录法获取目的基因。
(3)当基因较小且序列已知时，可采用化学合成法进行人工合成。
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
[易错提醒] (1)基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。
(2)启动子、终止子
①启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)。
②终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA上)。
③目的基因插入位置：启动子与终止子之间。
④利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺蛋白基因的启动子连接到一起。
(3)将目的基因导入受体细胞
[易错提醒] 农杆菌转化法中的“两个两次”
(4)目的基因的检测与鉴定
[易错提醒] PCR不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。
2．蛋白质工程
3．生物技术的安全性与伦理问题
(1)理性看待转基因技术
①需要以完备的相关科学知识为基础，即清晰地了解转基因技术的原理和操作规程。
②应看到人们的观点受到许多复杂的政治、经济和文化等因素的影响。
③要靠确凿的证据和严谨的逻辑进行思考和辩论。
(2)治疗性克隆与生殖性克隆的关系
项目 类型
治疗性克隆 生殖性克隆
区别 目的 用于医学研究和治疗疾病 用于生育，获得人的复制品
水平 细胞、组织或器官水平 个体水平
联系 都属于无性生殖；产生的新个体或新组织遗传信息相同
(3)区分试管婴儿和“设计试管婴儿”
①“设计试管婴儿”比试管婴儿多出的是过程________。
②试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，“设计试管婴儿”可用于致命血液病等疾病的治疗。
[答案自填] Ca2＋处理法 PCR PCR 抗原—抗体 基因合成 新的蛋白质 蛋白质结构 脱氧核苷酸序列 d
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1．(选择性必修3 P68科技探索之路)艾弗里等人通过肺炎链球菌的转化实验，不仅证明了遗传物质是DNA，还证明了DNA可以在同种生物的不同个体之间转移。
2．(选择性必修3 P74拓展应用1)限制酶不能切割细菌自身DNA分子的原因：原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
3．(选择性必修3 P77相关信息)真核细胞和细菌的DNA聚合酶都需要Mg2＋激活。因此，PCR反应缓冲液中一般要添加Mg2＋。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。
4．(选择性必修3 P81资料卡)农杆菌细胞内含有Ti质粒，当它侵染植物细胞后，能将Ti质粒上的T-DNA(可转移的DNA)转移到被侵染的细胞中，并且将其整合到该细胞的染色体DNA上。
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【最新考情】
1．(2024·高考新课标卷)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。
(1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是__________________________________________________
___________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和________。
(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是________________________________________________________。
(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是_______________________________________________(答出2点即可)。
解析：(1)限制酶(限制性内切核酸酶)能识别双链DNA分子的特定核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。N基因表达需要RNA聚合酶与启动子结合启动转录，还需要终止子终止转录，在题述对应位置插入M1与M2片段，可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子在插入B1的基因组时被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达。(2)向导RNA中存在碱基A、G、C、U，而B1基因组DNA中存在碱基A、G、C、T，RNA与DNA互补配对时也遵循碱基互补配对原则，可以形成的碱基对有G—C、A—T和U—A。(3)根据题意，为验证片段甲是否插入了细菌B1基因组，应该以菌株B2的基因组DNA为模板进行PCR。该模板没有引物P4的结合位置，若用该模板与引物P3和P4进行PCR，则实验结果是无法扩增出目的产物。(4)秸秆焚烧会产生浓烟和二氧化碳等物质，造成环境污染，而利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆，可在一定程度上有效减少环境污染；无火灾隐患，更加安全；此外降解产物中含有大量的葡萄糖，可以作为原料生产燃料乙醇等，实现废物利用。
答案：(1)磷酸二酯键 可以防止N基因上游的启动子和下游的终止子被破坏，保证N基因能在菌株B2中表达 (2)A—T、U—A (3)菌株B2基因组DNA 无法扩增出目的产物 (4)减少环境污染；实现废物利用(合理即可)
2．(2024·河北选择考)新城疫病毒可引起家禽急性败血性传染病，我国科学家将该病毒相关基因改造为γ2HN，使其在水稻胚乳特异表达，制备获得γ2HN疫苗，并对其免疫效果进行了检测。回答下列问题：
(1)实验所用载体的部分结构及其限制酶识别位点如图1所示。其中GtP为启动子，若使γ2HN仅在水稻胚乳表达，GtP应为____________________________启动子。Nos为终止子，其作用为________________。γ2HN基因内部不含载体的限制酶识别位点。因此，可选择限制酶________和________对γ2HN基因与载体进行酶切，用于表达载体的构建。
(2)利用________方法将γ2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测γ2HN表达情况，可通过PCR技术检测__________________________，通过______技术检测是否翻译出γ2HN蛋白。
(3)获得转基因植株后，通常选择单一位点插入目的基因的植株进行研究。此类植株自交一代后，γ2HN纯合体植株的占比为__________。选择纯合体进行后续研究的原因是________________________________。
(4)制备γ2HN疫苗后，为研究其免疫效果，对实验组鸡进行接种，对照组注射疫苗溶剂。检测两组鸡体内抗新城疫病毒抗体水平和特异应答的CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)水平，结果如图2所示。据此分析，获得的γ2HN疫苗能够成功激活鸡的________免疫和________免疫。
(5)利用水稻作为生物反应器生产γ2HN疫苗的优点是______________________________________________________。
(答出两点即可)
解析：(1)根据题意可知，若使γ2HN基因仅在水稻胚乳表达，GtP(启动子)应为水稻胚乳中特异表达的基因的启动子。Nos为终止子，其作用为终止转录过程。GtP内部含有Kpn Ⅰ的酶切位点，用Kpn Ⅰ酶切会破坏启动子，Nos下游含有Sac Ⅰ的酶切位点，用Sac Ⅰ酶切会使重组基因表达载体缺失终止子，故构建基因表达载体时，可选择限制酶Hind Ⅲ和EcoRⅠ对γ2HN基因与载体进行酶切。(2)水稻是单子叶植物，可用农杆菌转化法将γ2HN基因导入水稻愈伤组织。为检测γ2HN基因表达情况，可用PCR检测γ2HN基因是否转录出mRNA，若要检测γ2HN基因是否翻译出γ2HN蛋白，可用抗原—抗体杂交技术。(3)选择单一位点插入目的基因的植株(用IO表示，其中I表示目的基因，O表示无相关基因)进行自交一代，根据分离定律，γ2HN基因的纯合体植株(II)占，无γ2HN基因的纯合体植株(OO)占，杂合体植株(IO)占。由于纯合体植株遗传性状稳定，故选择γ2HN基因的纯合体植株进行后续研究。(4)通过体液免疫，机体可产生较多相应抗体，通过细胞免疫，机体可产生较多细胞毒性T细胞。据题图可知，实验组的抗体和CD8＋T细胞(细胞毒性T细胞)均明显高于对照组，因此获得的γ2HN疫苗能够成功激活鸡的体液免疫和细胞免疫。(5)利用水稻作为生物反应器生产γ2HN疫苗，有生产成本低、生物安全性较高、提取和处理目标产物简易等优点。
答案：(1)水稻胚乳中特异表达的基因的 终止转录过程 Hind Ⅲ EcoR Ⅰ (2)农杆菌转化 γ2HN基因是否转录出了mRNA 抗原—抗体杂交 (3) 遗传性状稳定
(4)体液 细胞 (5)生产成本低、生物安全性较高
[把脉高考] 基因工程和蛋白质工程代表了生物科学技术的前沿，体现了生物科学的应用性和创新性，因此该知识点属于高频考点，也是高考的必考点，试题情境专业性较强，常涉及PCR、电泳技术和基因表达的调控机制等。基因工程也常与细胞工程、遗传、育种等知识联系并结合生活、生产、临床实践，探究科技前沿，渗透生命观念和社会责任。
【历年考情】
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(1)(2023·全国乙T38)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因翻译。( )
(2)(2022·山东T25)两种引物分别与两条模板链3′端的碱基序列互补配对。( )
(3)(2022·山东T20)通过转基因技术可减少啤酒酵母双乙酰的生成，缩短啤酒的发酵周期。( )
(4)(2021·湖北T16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，可以提高复性的温度。( )
(5)(2020·天津T11)目的基因是基因工程的关键要素，必须从动物、植物或微生物的基因组文库中直接获取。( )
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(6)(2023·全国甲T38节选)乙肝病毒是一种DNA病毒。重组乙肝疫苗的主要成分是利用基因工程技术获得的乙肝病毒表面抗原(一种病毒蛋白)。回答下列问题。
①接种上述重组乙肝疫苗不会在人体中产生乙肝病毒，原因是______________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
②若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白，请简要写出实验思路。_____________________________________________________
_________________________________________________________。
(7)(2022·全国乙T38节选)已知某种病毒的特异性蛋白S(具有抗原性)的编码序列(目的基因)。为了制备蛋白疫苗，可以通过基因工程技术获得大量蛋白S。基因工程的基本操作流程是________________________________________________
______________________________________________________________。
(8)(2022·湖北T22节选)制备转基因植物时，用农杆菌侵染植株叶片外植体，其目的是_____________________________________________________
______________________________________________________________。
(9)(2022·广东T22节选)研究者构建了一种表达载体pMTL80k，用于在梭菌中建立多基因组合表达库，经筛选后提高丙酮的合成量。该载体包括了启动子、终止子及抗生素抗性基因等，其中抗生素抗性基因的作用是_____________________________________________________，
终止子的作用是___________________________________________。
提示：(1)× (2)√ (3)√ (4)√ (5)× (6)①重组乙肝疫苗成分为蛋白质，无法在宿主体内增殖 ②通过使用相应抗体，利用抗原—抗体杂交技术，检测目的基因是否翻译形成蛋白质 (7)获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定 (8)通过农杆菌的转化作用，使目的基因进入植物细胞 (9)作为标记基因，筛选含有目的基因的受体细胞 终止转录，使转录在需要的地方停下来
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突破1 基因工程的操作步骤及应用
1．(2024·湖南张家界高三二模)某生物的W基因可编码一种营养价值极高的W物质。为了大批量获得W物质，某研究小组构建了W基因的表达载体，并利用工程菌生产W物质。质粒、含W基因的DNA片段及限制酶切割位点如下图所示，下表为有关限制酶识别序列。回答下列问题：
部分限制酶及其识别序列
限制酶 识别序列和切割位点(5′→3′)
BamHⅠ ↓GGATTC
EcoRⅠ ↓ GAATTC
MfeⅠ ↓CAATTG
KpnⅠ ↓GGTACC
Hind Ⅲ ↓AAGCTT
(1)质粒作为常用的载体，其特点有_______________________________
___________________________________________________(答出2点即可)。
(2)若图中W基因的转录方向是从左向右，结合图1和图2分析，应使用限制酶__________切割图中质粒，使用限制酶____________切割图中含W基因的DNA片段。不能选择BamHⅠ切割质粒和含W基因的DNA片段的理由是______________________________________________________________。
(3)若图中W基因的转录方向是从左向右，则W基因转录的模板链是____________(填“甲链”或“乙链”)。利用PCR对W基因进行扩增的原理是_______________________________________________________________。
(4)研究人员利用W基因的mRNA进行逆转录得到了cDNA，已知其mRNA的序列为5′—UGAACGCUA…(中间序列)…GUCGACUCG—3′。为了便于将扩增后的基因和载体连接构建重组质粒，用于PCR扩增的引物应为________。
A．5′—GAATTCTGAACG—3′
B．5′—AAGCTTCGAGTC—3′
C．5′—GAATTCCGAGTC—3′
D．5′—AAGCTTTGAACG—3′
解析：(1)质粒作为常用的载体，其特点是具有多个限制酶切割位点、具有标记基因、能在受体细胞内复制等。(2)结合题图1和题图2分析，BamHⅠ会切割质粒的启动子，导致目的基因(W基因)无法转录；EcoRⅠ会在2个位点切割质粒，从而影响重组DNA分子的构建；MfeⅠ会切割W基因，使用KpnⅠ会使W基因和质粒反向连接，故应使用限制酶MfeⅠ、HindⅢ切割题图中质粒，使用限制酶EcoRⅠ、HindⅢ切割题图中含W基因的DNA片段。(3)若W基因的转录方向是从左向右，则mRNA链的合成方向为从左向右5′→3′，与乙链从左向右3′→5′互补，故W基因转录的模板链是乙链。利用PCR扩增目的基因的原理是DNA的半保留复制。(4)W基因经逆转录得到的cDNA的序列为5′—CGAGTCGAC…(中间序列)…TAGCGTTCA—3′，利用PCR对cDNA进行扩增，PCR过程需要两种引物，它们能分别与目的基因两条链的3′端通过碱基互补配对结合，并具有EcoRⅠ、HindⅢ的识别序列，故PCR扩增时所需引物的碱基序列为5′—GAATTCTGAACG—3′，5′—AAGCTTCGAGTC—3′，A、B符合题意。
答案：(1)具有多个限制酶切割位点、有标记基因、能在受体细胞内复制(答出2点即可) (2)MfeⅠ、HindⅢ EcoRⅠ、HindⅢ BamHⅠ会切割质粒的启动子，导致目的基因(W基因)无法转录 (3)乙链 DNA半保留复制 (4)AB
2．(2024·广东深圳高三一模)番茄在种植过程中容易发生虫害。研究人员将双价抗虫载体转入番茄中，获得具有抗虫特性的转基因番茄。下图为所用载体的部分结构示意图，其中Bar为除草剂抗性基因，Cry1Ac为苏云金杆菌毒蛋白基因，Pta为半夏凝集素基因。
回答下列问题：
(1)双价抗虫载体中的P1、P2和P3属于基因表达载体中的________，其作用是_____________________________________________________。
(2)构建的载体通常用________________法转入番茄子叶中并进行植物组织培养，并在培养基中添加__________用于筛选转基因番茄。
(3)为验证Pta基因是否转入番茄基因组中，研究人员使用________(填技术)筛选转基因番茄中的Pta基因，再进行凝胶电泳鉴定，结果如下图所示。
图中①为阳性对照，②为阴性对照，③为待测植株，试分析③中出现2条条带的可能原因是____________________________________________________
______________________ ______________________________________。
(4)对于成功转化的番茄植株还需进一步进行抗虫鉴定，研究人员选取3株阳性转基因番茄进行小菜蛾幼虫抗性实验，结果见下表。
株系编号 CK 1 2 3
幼虫致死率/% 0 39.8 6.5 48.9
注：CK表示对照。
由表中可知，株系2的幼虫致死率较低，推测其可能原因是_________________________________________________________。
解析：(1)双价抗虫载体中的P1、P2和P3位于基因的首端，属于基因表达载体中的启动子，启动子是转录的起点，是RNA聚合酶识别和结合的位点。(2)番茄为双子叶植物，常用农杆菌转化法将构建的载体转入番茄子叶中并进行植物组织培养，基因表达载体中有Bar(除草剂抗性基因)，可作为标记基因，可在培养基中添加除草剂用于筛选转基因番茄。(3)为验证Pta基因是否转入番茄基因组中，可使用PCR筛选转基因番茄中的Pta基因，再进行凝胶电泳鉴定，若PCR过程中引物特异性不高，可能会出现多条条带，③中出现2条条带的可能原因是所使用的Pta引物特异性不高。(4)由题表数据可知，株系2的幼虫致死率较低，可能是因为抗虫基因在转基因番茄株系2的表达水平比较低。
答案：(1)启动子 RNA聚合酶识别和结合的位点 (2)农杆菌转化 除草剂 (3)PCR 所使用的Pta引物特异性不高
(4)抗虫基因在转基因番茄株系2的表达水平比较低
突破2 蛋白质工程基本原理及应用
3．(2024·辽宁沈阳高三二模)基于AI(人工智能)的蛋白质设计方法可以利用现有蛋白质数据库以及机器深度“学习算法”来预测新型蛋白质的结构及功能。下列说法错误的是( )
A．AI可帮助人们更深入了解蛋白质的结构与功能关系
B．AI预测新型蛋白质的结构和功能依据原理是中心法则
C．可通过改造或合成基因来获得AI设计的蛋白质
D．AI可帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质
解析：选B。AI可以利用现有蛋白质数据库帮助人们更深入了解蛋白质的结构与功能关系，A正确；AI对新型蛋白质的预测应从预期的蛋白质功能出发，设计预期的蛋白质结构，B错误；获得新型蛋白质是通过改造或合成基因来完成的，C正确；AI可用于蛋白质工程，帮助人们高效地设计出自然界没有的蛋白质，D正确。
4．(2022·湖南选择考)水蛭是我国的传统中药材，主要药理成分水蛭素为水蛭蛋白中重要成分之一，具有良好的抗凝血作用。拟通过蛋白质工程改造水蛭素结构，提高其抗凝血活性。回答下列问题：
(1)蛋白质工程流程如图所示，物质a是__________，物质b是__________。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是___________________________________________________________________。
(2)蛋白质工程是基因工程的延伸，基因工程中获取目的基因的常用方法有________________________、________________________和利用 PCR 扩增。PCR遵循的基本原理是___________________________________________。
(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，分析水解产物中的肽含量及其抗凝血活性，结果如图所示。推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的__________(填“种类”或“含量”)有关，导致其活性不同的原因是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、上述水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，简要写出实验设计思路。______________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
解析：(1)蛋白质工程的基本思路：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到并改变相对应的脱氧核苷酸序列(基因)或合成新的基因→获得所需要的蛋白质。由此可知，物质a是多肽链，物质b是mRNA。在生产过程中，物质b可能不同，合成的蛋白质空间构象却相同，原因是密码子具有简并性，即一种氨基酸可由几个密码子编码。(2)基因工程中获取目的基因的常用方法有通过构建基因文库获取、用化学合成法进行人工合成和利用 PCR 扩增。PCR遵循的基本原理是 DNA半保留复制。(3)将提取的水蛭蛋白经甲、乙两种蛋白酶水解后，据题图可知，水解产物中的肽含量随着酶解时间的延长均上升，且两种酶差别不大；而水解产物抗凝血活性差异较大，经酶甲处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后相对稳定，经酶乙处理后，随着酶解时间的延长，抗凝血活性先上升后下降，且酶甲处理后的酶解产物的抗凝血活性最终高于经酶乙处理后的酶解产物的抗凝血活性，差异明显，据此推测两种处理后酶解产物的抗凝血活性差异主要与肽的种类有关，导致其活性不同的原因是提取的水蛭蛋白的酶解时间和酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏。(4)若要比较蛋白质工程改造后的水蛭素、题述两种水蛭蛋白酶解产物和天然水蛭素的抗凝血活性差异，实验设计思路为取四支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、题述两种水蛭蛋白酶解产物、天然水蛭素，再向四支试管中各加入等量的新鲜血液，观察四支试管中血液的凝固情况。
答案：(1)多肽链 mRNA 密码子具有简并性 (2)通过构建基因文库获取 用化学合成法进行人工合成 DNA半保留复制 (3)种类 提取的水蛭蛋白的酶解时间和处理的酶的种类不同，导致水蛭蛋白空间结构有不同程度破坏 (4)取四支试管，分别加入等量的蛋白质工程改造后的水蛭素、题述两种水蛭蛋白酶解产物、天然水蛭素，再向四支试管中各加入等量的新鲜血液，观察四支试管中血液的凝固情况
突破3 生物技术的安全性与伦理问题
5．(2024·浙江1月选考)关于生物技术的安全与伦理问题，我国相关法规明令禁止的是( )
A．试管动物的培育 B．转基因食品的生产
C．治疗性克隆研究 D.生物武器的发展和生产
解析：选D。试管动物的培育属于胚胎工程，我国对此没有禁止，A不符合题意；我国目前不反对转基因食品的生产，B不符合题意；我国政府坚持反对生殖性克隆，不反对治疗性克隆，但主张对其进行有效监控和严格审查，C不符合题意；生物武器致病能力强、攻击范围广，世界范围内应全面禁止生物武器，D符合题意。
6．(2024·辽宁协作体高三模拟)生物技术的进步在给人类带来福祉的同时，也会引起人们对其安全性和伦理道德的关注，下列关于相关生物技术的说法中，合理的是( )
A．为防止生物技术用于生产生物武器，严禁进行生物技术的新研究
B．只要数量不太大，生殖性克隆人是允许的
C．在移植前对人类胚胎进行遗传学诊断不符合伦理要求
D．基因工程将创造出新物种而影响区域生态平衡
解析：选C。可合理地使用生物技术进行新研究，A不合理；我国禁止生殖性克隆人，B不合理；设计试管婴儿在移植前对人类胚胎进行遗传学诊断，虽然能解决一些问题比如治疗白血病，但不符合伦理要求，C合理；基因工程是指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品，基因工程不能创造出新物种，D不合理。
eq \o(\s\up7( INCLUDEPICTURE "创设情境长句特训lll.TIF" INCLUDEPICTURE "创设情境长句特训lll.TIF" \* MERGEFORMAT ),\s\do5())
事实概述类
1．植物组织培养技术可与基因工程技术相结合获得转基因植株。将含有目的基因的细胞培养成一个完整植株的基本程序是______________________________________________________________________
________________________________________________________________
(用流程图表示)。
答案：含目的基因的细胞愈伤组织小植株
2．在单克隆抗体制备过程中，有两次筛选，其目的分别是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
答案：第一次是筛选出杂交瘤细胞(用选择培养基)；第二次是进一步筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞(用抗原—抗体杂交法)
3．质粒载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
为使载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外，还可用另一种限制性内切核酸酶切割，该酶必须具有的特点是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
答案：切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的DNA片段末端相同
4．为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要利用________________进行分子水平检测，又要在个体生物学水平上进行鉴定，后者的具体过程是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
答案：PCR 将培育的烟草幼苗栽培于含有一定盐的土壤中，观察该烟草植株的生长状态
5．从受体细胞中分离纯化出用基因工程方法制备的HIV某蛋白(目的蛋白)，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是________________，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是______________________________________________________________。
答案：抗体 抗原与抗体特异性结合
原因分析类
6．若想利用植物体细胞杂交技术培养出马铃薯—草莓杂种植物，以提高土地的利用率，____________(填“能”或“不能”)把两物种细胞直接融合，理由是______________________________________________________________________
________________________________________________________________。
答案：不能 植物细胞外面有一层细胞壁，阻碍了细胞间的融合
7．动物体细胞进行体外培养时，______________(填“需要”或“不需要”)脱分化过程，原因是_____________________________________________
_________________________________________________________。
答案：不需要 高度分化的动物细胞分化的潜能变窄，失去发育成完整个体的能力
8．若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_____________________________________________
_______________________________________________________。
答案：未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
实验探究类
9．蛋白质NLP是拟南芥细胞内的硝酸盐受体，与硝酸盐结合后会激活硝酸盐响应基因的启动子。科研人员通过构建多种转基因拟南芥研究NLP的功能，在NLP研究中利用硝酸盐响应基因的启动子与荧光素酶基因组成报告基因。回答下列问题：
(1)报告基因中添加荧光素酶基因的优点是____________________________。报告基因的受体拟南芥须为NLP合成突变型，以避免__________对实验的干扰。
(2)为获得NLP的氨基端和羧基端以分别研究其功能，科研人员构建了包含NLP片段的重组基因，如下图所示，其中需要人为添加起始密码子编码序列的是_______________________________________________________。
若通过引物同时为NLP基因片段添加限制酶识别序列和起始密码子编码序列，起始密码子编码序列需添加在限制酶识别序列的________(填“3′端”“5′端”或“3′端、5′端均可以”)。
(3)利用报告基因与上述三种重组NLP基因分别制备转基因拟南芥，并编号为1组、2组、3组，与对照组分别置于含KCl或KNO3的培养基中培养，实验结果如下图。
对照组拟南芥的实验处理是__________________________。根据实验结果可知激活硝酸盐响应基因表达的是________(填“氨基端”“羧基端”或“氨基端、羧基端均可以”)；硝酸盐存在时，NLP激活硝酸盐响应基因表达的机制是_____________________________________________________________
__________________________________________________________。
答案：(1)荧光素酶基因表达产物可催化荧光素氧化发出荧光，易于检测 细胞内NLP (2)编码羧基端的NLP基因片段 3′端 (3)导入报告基因，不导入重组NLP基因 羧基端 NLP的氨基端会抑制羧基端的激活作用，硝酸盐能够解除抑制作用热考提升练(五) 基因工程的操作过程及应用
1．在乙肝病毒(HBV)的结构蛋白中，用来制备疫苗的主要是HBsAg蛋白。目前HBsAg基因已在生物体系中成功表达。下图表示用农杆菌转化法培育转基因番茄，生产乙肝疫苗的技术路线，请回答下列问题：
(1)利用PCR获取HBsAg基因片段时，需要用到________________酶，还需要根据HBsAg基因的序列合成下列四种引物中的______(填字母)。
(2)基因工程的核心步骤是______________________________________。
图中过程①需要用到的限制酶是____________________，这样可以保证__________________________________________________________。
(3)利用植物组织培养技术将转基因番茄细胞培育成试管苗的过程中，培养基中需要加入__________________以诱导番茄细胞脱分化和再分化，还需要加入____________以筛选出导入了HBsAg基因的受体细胞。用该植株结出的番茄果实饲喂小鼠，若在小鼠的血清中检测到__________，则说明该转基因乙肝疫苗口服时有效。
解析：(1)利用PCR扩增目的基因片段时，需要耐高温的DNA聚合酶，即Taq DNA聚合酶。耐高温的DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，因此要扩增目的基因，应选用题图中的B和C作为引物。(2)基因工程的核心步骤是构建基因表达载体。由题图可知，含有目的基因的外源DNA分子中含有限制酶Hind Ⅲ、SmaⅠ和 XhoⅠ 的切割位点，但其中限制酶SmaⅠ的切割位点位于目的基因上，因此过程①用到的限制酶是 Hind Ⅲ 和 XhoⅠ；用这两种限制酶可以保证目的基因和质粒正确连接。(3)脱分化和再分化过程中要加入生长素和细胞分裂素来进行诱导。用限制酶Hind Ⅲ和XhoⅠ切割后破坏了四环素抗性基因，但不会破坏卡那霉素抗性基因，导入重组质粒的受体细胞能在含卡那霉素的培养基上生存下来。用该植株结出的番茄果实饲喂小鼠，若在小鼠的血清中检测到抗乙肝病毒的抗体，则说明HBsAg蛋白(抗原)可以进入小鼠体内，即该转基因乙肝疫苗口服有效。
答案：(1)耐高温的DNA聚合(或Taq DNA聚合) B、C (2)构建基因表达载体 Hind Ⅲ和XhoⅠ HBsAg基因和质粒正确连接 (3)生长素和细胞分裂素 卡那霉素 抗乙肝病毒的抗体
2．(2024·广东湛江高三一模)他汀类药物是目前应用广泛、效果理想的降脂药物，醇脱氢酶是该药物催化合成过程中的关键酶。研究人员对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR，并将其导入大肠杆菌BL-21中，构建重组醇脱氢酶工程菌，利用LB培养基可大量生产醇脱氢酶。请回答下列问题：
(1)对酿酒酵母醇脱氢酶基因进行PCR时，需要先设计引物，引物应选择图1中的____________________________________________________。
(2)PCR反应过程如图2所示，其中50 ℃复性45 s的目的是________________。Taq DNA聚合酶在图2中的________________过程中发挥作用。
(3)pET-28b质粒(图3)中a区段表示的是______结构，a区段的作用是________________。构建重组质粒时最好选用限制酶__________________。将重组质粒导入BL-21中后，培养在含有______的LB固体培养基上，以达到筛选的目的。
限制酶 识别序列
NcoⅠ C↓CATGG
XhoⅠ C↓TCGAG
EcoRⅠ G↓AATTC
(4)通常用______________的方法，检测工程菌BL-21是否生产出了醇脱氢酶。
解析：(1)PCR过程中，子链延伸方向为5′→3′，因此选用的引物为引物Ⅱ、引物Ⅲ。(2)PCR过程中复性的目的是使引物与模板的碱基之间形成氢键从而结合；Taq DNA聚合酶作用为催化形成磷酸二酯键，延伸子链，因此在延伸和后延伸过程中起作用。(3)目的基因要插入启动子和终止子之间，所以a区段为启动子，启动子的作用是与RNA聚合酶结合，启动转录；构建重组质粒时最好选用限制酶NcoⅠ和XhoⅠ以避免破坏标记基因(卡那霉素抗性基因)，若只选其中一个有可能出现目的基因的反向连接或目的基因和质粒的自身环化；由于标记基因是卡那霉素抗性基因，故需要在含有卡那霉素的LB固体培养基上培养，以达到筛选的目的。(4)抗原与抗体的结合具有特异性，由于醇脱氢酶的本质是蛋白质，故检测醇脱氢酶是否产生，通常采用抗原—抗体杂交。
答案：(1)引物Ⅱ、引物Ⅲ (2)使引物与模板结合 延伸和后延伸 (3)启动子 与RNA聚合酶结合，启动转录 NcoⅠ和XhoⅠ 卡那霉素 (4)抗原—抗体杂交
3．(2024·河北承德高三二模)多不饱和脂肪酸(PUFAs)是人体必需脂肪酸，为解决猪肉中PUFAs含量不足的问题，研究者从线虫中获得控制PUFAs合成的必需酶基因fat1，培育转fat1基因猪，操作过程如下图所示。图中GFP基因表达出绿色荧光蛋白。据图回答下列问题：
(1)利用PCR在体外扩增目的基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、_____________________________________________________
_________________________________________________(答出2点即可)等。
(2)由图可知，在构建基因表达载体时，为克服目的基因自身环化，即线性DNA的末端相互连接形成圆环，以及便于目的基因与载体的连接，切割含目的基因的DNA和载体的限制酶应选用______和________。
(3)构建的基因表达载体中，GFP基因的作用是______________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
未标注出的必需元件有________。
(4)猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期_________________________________________________________，
以防止细胞代谢物积累对细胞自身造成伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为________________。此过程中，对于悬浮培养的细胞直接用________法收集细胞处理成细胞悬液。
(5)经检测，fat1基因成功整合在猪基因组DNA后，不能说明成功培育转基因猪，还需要___________________________________________________
__________________________________________________________。
解析：(1)利用PCR在体外扩增目的基因时，PCR扩增仪中要加入缓冲液、目的基因、引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶等。(2)据题图可知，载体有三种限制酶位点可供选择，目的基因fat1两侧有EcoRⅠ和BamHⅠ两种限制酶酶切位点，正好载体上也有这两种限制酶位点，为防止目的基因自身环化使用双酶切，可选用EcoRⅠ和BamHⅠ切割含目的基因的DNA和载体。(3)构建的基因表达载体中，GFP基因的作用是作为标记基因，使相关细胞发出绿色荧光方便进行筛选。基因表达载体必需具备的元件有目的基因、标记基因、启动子、终止子和复制原点；所构建的重组基因表达载体中未标注出的必需元件有复制原点。(4)猪成纤维细胞在培养瓶中培养时，除必须保证环境是无菌、无毒外，还必须定期更换培养液，以防止细胞代谢物积累对细胞自身造成伤害。培养到一定程度后，需要分瓶再继续培养，分瓶后的培养过程称为传代培养，此过程中，对于悬浮培养的细胞直接用离心法收集细胞处理成细胞悬液。(5)转基因猪已经培育成功的标志是fat1基因在转基因猪体内成功表达，此时能够检测到转基因猪体内含有fat1基因表达的蛋白质，转基因猪体内具有较高的PUFAs含量。而该实验没有检测fat1基因是否成功表达；没有在个体生物学水平鉴定转基因猪的PUFAs含量，不能说明成功培育转基因猪。
答案：(1)引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶(答出2点即可) (2)EcoRⅠ BamHⅠ (3)作为标记基因，使相关细胞发出绿色荧光方便进行筛选 复制原点
(4)更换培养液 传代培养 离心 (5)进行个体生物学水平的鉴定，即检测转基因猪体内的PUFAs是否增加
4．(2024·湖南长沙高三模拟)人乳铁蛋白(hLF)具有多种生理功能，被认为是一种极具开发潜力的食品添加剂。下图是某食品公司利用乳腺生物反应器生产hLF的过程。回答以下问题：
(1)要从hLF乳腺表达载体中获取目的基因并使之成功表达生产hLF，使用的限制酶最佳是________。将目的基因导入成纤维细胞中一般应用的技术是________。
(2)成纤维细胞培养液中添加H2PO、HPO和HCO的作用是________。在导入目的基因之前，成纤维细胞需用________处理使之分散成单个细胞。
(3)在核移植过程中，先将采集到的卵母细胞体外培养到________期后去核，再将成纤维细胞从切口注射到卵周隙内，使用电刺激或化学方法促进________，形成重构胚。
(4)在获取卵母细胞和胚胎移植前要注射促卵泡生成激素或氯前列烯醇等性激素。对供卵母羊注射促卵泡生成激素等激素，其目的是________________________；对受体母羊(代孕羊)注射氯前列烯醇，其目的是_______________________________________________________。
(5)为检验乳腺生物反应器是否成功，研究人员进行了抑菌实验。其结果如下表：
组别 1 2 3 4
滤纸上物质 0.4万IU青霉素0．25万IU链霉素 人乳清(浓缩20倍) 转基因羊乳清(浓缩20倍) ？(浓缩20倍)
抑菌圈直径/cm 2.2 1.9 1.7 无
①组别4滤纸上的物质是________________。
②与人的hLF相比，乳腺生物反应器生产的hLF抑菌效果________。
(6)为确保转基因产品的安全性，该食品公司后阶段应进行的工作是________(填字母)。
A．实施转基因产品标识
B．进行食用安全性评估
C．检测转基因羊乳成分
D．鉴定基因是否稳定遗传
解析：(1)对目的基因进行切割时，通常选用两种不同的限制酶，分析题图所给的hLF乳腺表达载体，从中获取目的基因并使之成功表达生产hLF，使用的限制酶最佳是SalⅠ和NotⅠ，XhoⅠ和NheⅠ这两种限制酶具有两处可以作用的切割位点，并破坏相关基因不宜选用。将目的基因导入成纤维细胞(动物细胞)中一般应用的技术是显微注射法。(2)成纤维细胞培养液中添加H2PO、HPO和HCO的作用是维持pH。在导入目的基因之前，成纤维细胞需用胰蛋白酶等处理使之分散成单个细胞。(3)在核移植过程中，先将采集到的卵母细胞体外培养到MⅡ期后去核，再将成纤维细胞从切口注射到卵周隙内，使用电刺激或化学方法促进细胞融合，形成重构胚。(4)在获取卵母细胞和胚胎移植前要注射促卵泡生成激素或氯前列烯醇等性激素。对供卵母羊注射促卵泡生成激素等激素，其目的是使其超数排卵，获得更多的卵母细胞；对受体母羊(代孕羊)注射氯前列烯醇，其目的是同期发情，使受体和供体处于相同的生理状态。(5)①为检验乳腺生物反应器是否成功，组别4滤纸上的物质是正常羊乳清(浓缩20倍)。②从题表数据可知，与人的hLF相比，转基因羊乳清(浓缩20倍)实验组的抑菌圈直径更小，说明乳腺生物反应器生产的hLF抑菌效果差。(6)为确保转基因产品的安全性，该食品公司后阶段应进行的工作是实施转基因产品标识、进行食用安全性评估以及检测转基因羊乳成分，由于羊乳为外分泌液，鉴定基因是否稳定遗传不影响其产品，A、B、C符合题意。
答案：(1)SalⅠ和NotⅠ 显微注射法 (2)维持pH 胰蛋白酶 (3)MⅡ 细胞融合 (4)使其超数排卵，获得更多的卵母细胞 同期发情，使受体和供体处于相同的生理状态 (5)①正常羊乳清 ②差 (6)ABC
5．(2024·湖南岳阳高三二模)蔗糖合酶是调控蔗糖代谢的关键酶，催化蔗糖进入各种代谢途径。为探究铁皮石斛蔗糖合酶2(DoSUS2)在非生物胁迫响应中的调控机制，科研人员从铁皮石斛叶组织中克隆了DoSUS2基因，并对其进行了生物信息学分析和表达特性研究，以下是部分研究结果，请回答下列问题：
(1)以铁皮石斛叶组织cDNA为模板，扩增DoSUS2基因，可以采用________方法，该反应体系中需要加入的物质有：铁皮石斛叶组织cDNA、一定的缓冲液、______________________________。该方法扩增出来的DoSUS2基因与原细胞中的DoSUS2基因相比不含____________________。扩增结果如图1，推测正常情况下铁皮石斛蔗糖合酶2最多可由_________________________个氨基酸组成。
(2)DoSUS2基因在低温、干旱和脱落酸处理下的转录结果如图2所示，据图可看出在低温胁迫下DoSUS2基因的表达水平随着处理时间延长整体上呈________________趋势，在低温和脱落酸处理6 h后表达量达到峰值，干旱处理9 h后表达量达到峰值，表明DoSUS2基因的表达受到________________的诱导。据此推测在低温、干旱等非生物胁迫下，铁皮石斛的应对机制和意义是______________________________________________________________________
__________________________________________________________________
_____________________________________________________________。
解析：(1)以cDNA为模板扩增目的基因，利用PCR扩增，PCR扩增的条件有模板、缓冲液、引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸等。cDNA是以mRNA为模板通过逆转录过程合成的，由于mRNA中不含内含子、启动子、终止子序列，所以扩增出来的DoSUS2基因不含内含子、启动子、终止子。题图1显示DoSUS2基因有2 424个碱基对，转录形成的mRNA最多有2 424个碱基，三个相邻的碱基编码一个氨基酸，同时除去一个终止密码子，所以最多可以翻译形成(2 424－3)÷3＝807个氨基酸。(2)从题图2看出，随着低温处理时间的延长，DoSUS2基因的表达水平先升高后降低。DoSUS2基因的表达水平在低温和脱落酸处理6 h后表达量达到峰值，干旱处理9 h后表达量达到峰值，表明DoSUS2基因的表达受到低温、干旱和脱落酸的诱导。在低温、干旱等非生物胁迫下DoSUS2基因的表达加强，蔗糖合酶催化蔗糖代谢途径，进而参与低温和干旱胁迫应答，以适应变化的环境。
答案：(1)PCR 引物、耐高温的DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸 内含子、启动子、终止子 807 (2)先上升后下降 低温、干旱和脱落酸 DoSUS2基因的表达加强，蔗糖合酶催化蔗糖代谢途径，进而参与低温和干旱胁迫应答，以适应变化的环境
6．(2024·山东青岛高三一模)CRISPR-Cas12a系统是第二类用于编辑哺乳动物基因组的CRISPR-Cas系统，该系统主要包含crRNA和Cas12a蛋白两部分，crRNA能特异性识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas12a蛋白到相应位置剪切DNA。某科研团队基于CRISPR-Cas12a系统对宫颈癌细胞中的KIFC1基因进行敲除，来探讨KIFC1基因在宫颈癌细胞中的功能及对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。回答下列问题：
(1)在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域最多含________种核苷酸；细菌细胞中的__________也能起类似Cas12a蛋白的作用。若要将KIFC1基因从目标DNA上剪切下来，需要设计______种crRNA。
(2)为保证目的基因与PX458质粒正确连接，在扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，其中P1的碱基序列为5′______________3′(写出前9个碱基)。利用PCR对一个DNA进行扩增时，第n次循环共需要引物________个。
(3)将crRNA-Cas12a重组载体成功转染至HeLa细胞，与对照组相比，实验组中KIFC1蛋白表达量如图2所示，细胞数目的变化如图3所示，由此可得出的结论是______________________________________________________
________________________________________________________，
判断依据是______________________________________________________
_____________________________________________________________
__________________________________________________________________
_______________________________________________________________。
解析：(1)在CRISPR-Cas12a系统中，crRNA的序列与目的基因特定碱基序列部分结合，结合区域既有DNA也有RNA，故最多有8种核苷酸(4种脱氧核苷酸和4种核糖核苷酸)；Cas12a蛋白可以到相应位置剪切DNA，其作用相当于限制酶；若要将KIFC1基因从目标DNA上剪切下来，需要有两个切口，而crRNA的识别具有特异性，故需要2种crRNA。(2)扩增目的基因时，应在引物端加入相应的限制酶序列，引物需要与模板链的3′端结合，按照碱基互补配对原则保证子链从5′端向3′端延伸，结合题图1可知，P1的碱基序列为5′—CAGCTGCTC—3′；第n次复制形成2n个DNA，相当于新合成2n－1个DNA分子，合成一个DNA分子需要两个引物，因此需要的引物数目为2n－1×2＝2n个。(3)结合图示可知，敲除细胞株中KIFC1蛋白表达量明显下降，证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功；KIFC1基因敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1基因敲除可使HeLa细胞增殖能力下降，据此可知，KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖。
答案：(1)8 限制酶(或限制性内切核酸酶) 2
(2)—CAGCTGCTC— 2n (3)KIFC1基因可以促进HeLa细胞的增殖 敲除细胞株中KIFC1蛋白表达量明显下降，证明HeLa细胞KIFC1基因敲除成功；KIFC1基因敲除组细胞数目显著低于对照组，表明KIFC1基因敲除可使HeLa细胞增殖能力下降专题强化训练
一、选择题
1．(2024·山东烟台高三一模)科学家用紫外线照射板蓝根原生质体，使其部分染色体丢失，将处理后的板蓝根原生质体与油菜原生质体融合，培育出了只含一条板蓝根染色体和油菜全部染色体的非对称杂种植株，该过程运用了非对称细胞融合技术。下列说法正确的是( )
A．原生质体由细胞膜、液泡膜及两者之间的细胞质组成
B．融合原生质体需放在无菌水中培养，以防杂菌污染
C．非对称细胞融合技术降低了不同物种间基因表达的干扰程度
D．非对称细胞融合技术提高了植物细胞的全能性，属于细胞工程
解析：选C。原生质体是用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁后的植物细胞，而由细胞膜、液泡膜及两者之间的细胞质组成的结构称为原生质层，A错误；原生质体放在无菌水中会吸水涨破，应放到较高渗的溶液中，保持原生质体的完整性，B错误；非对称融合过程中部分染色体丢失，从而降低了不同物种间基因表达的干扰程度，C正确；非对称融合过程中部分染色体丢失(断裂)，所以会降低植物细胞的全能性，D错误。
2．(2024·湖南长沙高三联考)下列关于动物细胞工程的叙述，正确的是( )
A．动物细胞培养应在含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行，CO2的主要作用是刺激细胞呼吸
B．在体外培养条件下，B淋巴细胞能够无限增殖
C．抗体—药物偶联物(ADC)中单克隆抗体主要发挥靶向运输作用
D．克隆牛技术涉及体外受精、动物细胞培养、胚胎移植等过程
解析：选C。动物细胞培养应在含95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中进行，CO2的主要作用是维持培养液的pH，A错误；B淋巴细胞不能无限增殖，B错误；抗体具有特异性，可以特异性地结合抗原，所以抗体—药物偶联物 (ADC) 中单克隆抗体主要发挥靶向运输作用，C正确；克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植等过程，该技术属于无性繁殖技术，不涉及体外受精，D错误。
3．(2024·广东惠州高三模拟)水牛养殖是中国重要的农业产业之一。与传统繁殖方法相比，家畜胚胎工程技术可以挖掘动物的繁殖潜力，提升家畜种质资源质量。以下选项错误的是( )
A．取滋养层细胞进行DNA分析、选育优良品种，可以提升水牛种质资源
B．注射促性腺激素超数排卵和体外受精可以增加水牛胚胎数量
C．胚胎移植使优良母畜免去了冗长的妊娠期，同时需要用免疫抑制剂处理代孕母畜
D．同一胚胎分割产生的后代具有相同的遗传物质，是动物无性繁殖或克隆的方法之一
解析：选C。从囊胚中取滋养层细胞做DNA分析、选育优良品种，可以提升水牛种质资源，A正确；用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理，以获得大量卵母细胞，再通过体外受精可以增加水牛胚胎数量，B正确；一般来说，受体母畜的子宫对于植入的具有抗原性质的胚胎并不产生排斥现象，因此不需要使用免疫抑制剂处理代孕母畜，C错误；同一胚胎分割产生的后代具有相同的遗传物质，是动物无性繁殖或克隆的方法之一，D正确。
4．(2024·河北石家庄高三二模)我国育种专家用普通小麦与耐盐偃麦草体细胞杂交获得耐盐新品种山融3号，培育过程如下图所示。下列叙述正确的是( )
A．使用胰蛋白酶处理可获得具有活力的原生质体
B．用PEG诱导原生质体融合与细胞膜的选择透过性有关
C．愈伤组织再分化形成的芽产生的生长素会抑制愈伤组织生根
D．可将获得的试管苗先移栽至适宜的培养液中培养一段时间，之后移栽于高盐土壤中进行筛选后再推广栽培
解析：选D。植物细胞使用纤维素酶和果胶酶去除细胞壁，A错误；用PEG诱导原生质体融合与细胞膜的流动性有关，B错误；愈伤组织再分化形成的芽产生的生长素会促进愈伤组织生根，C错误；可将获得的试管苗先移栽至适宜的培养液中培养一段时间，之后移栽于含高盐土壤中进行筛选后再推广栽培，D正确。
5．(2024·湖南永州高三二模)新冠病毒表面的S蛋白可与宿主细胞表面受体结合，介导病毒侵入细胞。S蛋白的单克隆抗体可有效阻断新冠病毒的感染。制取新冠病毒S蛋白的单克隆抗体部分过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．该单克隆抗体制备过程中，为获得大量免疫过的小鼠B淋巴细胞，可多次注射S蛋白
B．与诱导原生质体融合的方法相比，诱导动物细胞融合的特有方法为PEG融合法
C．经过筛选1会淘汰未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞
D．抗体筛选过程应用了抗原与抗体特异性结合的原理
解析：选B。 制备S蛋白单克隆抗体的过程中，需多次向小鼠体内注射S蛋白，刺激相应B淋巴细胞产生，A正确；诱导动物细胞融合特有的方法为灭活病毒诱导法，B错误；经过筛选1会淘汰未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞，C正确；抗体筛选过程应用了抗原与抗体特异性结合的原理，D正确。
6．(2024·湖南大联考高三模拟)为获得导入 R 基因的转基因小鼠，科研人员进行了如下图所示的操作过程。相关叙述错误的是( )
A．过程①需用促性腺激素处理以获得更多的卵母细胞
B．过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵
C．过程③需使用药物抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥
D．过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态
解析：选C。为了胚胎移植成功往往需要更多的卵母细胞，所以过程①用促性腺激素对供体进行超数排卵处理，A正确；将目的基因导入受体细胞用多个表达载体和多个受精卵可以提高成功率，所以过程②操作中通常需多个表达载体和多个受精卵，B正确；受体对移入子宫的外来胚胎一般不发生免疫排斥反应，故过程③不需要使用药物抑制雌鼠b对植入胚胎的免疫排斥，C错误；胚胎移植成功需要受体和供体达到相同的生理状态，所以过程④处理的目的是使多只雌鼠b处于受孕准备状态，D正确。
7．(2024·广东深圳高三一模)基因工程的发展离不开理论的突破和技术的创新。下列科学研究体现了基因工程正式问世的是( )
A．艾弗里等人通过肺炎链球菌的体外转化实验证明DNA可以转移
B．沃森和克里克建立了DNA双螺旋结构模型并提出遗传物质自我复制假说
C．科学家利用质粒作为载体构建重组DNA并导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达
D．科学家发现了多种限制性内切核酸酶、DNA连接酶和逆转录酶
解析：选C。科学家利用质粒作为载体构建重组DNA并导入受体细胞，使外源基因在原核细胞中成功表达，体现了基因工程正式问世，C符合题意。
8．(2024·辽宁辽阳高三一模)棉花是我国重要的经济作物，黄萎病是棉花的最主要病害之一，有棉花的“癌症”之称。我国科学家在世界上首次获得转基因抗黄萎病棉花新株系，这将使棉花“癌症”有望得到根治。科学家将从海岛棉中分离出来的抗黄萎病基因At7导入陆地棉中，使陆地棉获得抗病性状。下列对转基因棉的检测与鉴定的叙述，错误的是( )
A．检测转基因棉是否导入基因At7，需要一段能与基因At7互补的短单链核酸引物
B．检测转基因棉中的基因At7是否转录出mRNA，其原理是抗原与抗体的特异性结合
C．检测到转基因棉表达出At7蛋白，说明转基因棉中成功导入了基因At7并能表达
D．检测转基因棉是否抗黄萎病，可接种黄萎病的病原体到转基因棉植株上
解析：选B。检测转基因棉是否导入基因At7，可采用PCR，PCR扩增时需要一段能与基因At7互补的短单链核酸引物，A正确；检测转基因棉中的基因At7是否转录出mRNA可采用PCR，其原理是DNA的半保留复制，B错误；基因表达包括转录和翻译，检测到转基因棉表达出At7蛋白，说明转基因棉中成功导入了基因At7并能表达，C正确；个体水平检测转基因棉是否抗黄萎病，可接种黄萎病的病原体到转基因棉植株上，D正确。
9．(2024·广东江门高三一模)在构建基因表达载体时，传统方法常受限于限制酶识别序列。科研人员研发了新的DNA重组方法： In-Fusion技术。该技术的关键是要在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列。主要操作过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端、连接磷酸二酯键
B．载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化
C．形成重组质粒时，如果温度远高于50 ℃，那么黏性末端的碱基不容易互补配对
D．该技术无需识别特定切割位点，需识别目的基因与线性化质粒任意同源序列
解析：选A。分析题意可知，该技术的过程是在目的基因两端构建与线性化质粒末端相同的DNA序列(即同源序列)，然后用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，最终形成的重组质粒会在受体细胞内形成完整的重组序列，推测In-Fusion酶的作用是识别同源序列、形成黏性末端，不具有连接磷酸二酯键的作用，A错误；载体A端和B端的序列不同，可防止目的基因与质粒反向连接及自身环化，B正确；重组质粒形成时如果温度远高于50 ℃，那么氢键不容易形成，黏性末端的碱基不容易互补配对，C正确；分析题意，传统方法常受限于限制酶识别序列，故科研人员研发了新的DNA重组方法： In-Fusion技术，结合题图可知，该技术无需识别特定切割位点，但用In-Fusion酶处理，使同源序列形成黏性末端，故需识别目的基因与线性化质粒任意同源序列，D正确。
10．(2024·广东惠州高三模拟)某植物组织培养的最佳激素(浓度单位：μmol/L)配比见下表。下列相关叙述正确的是( )
组织培养阶段 细胞分裂素浓度 生长素浓度
Ⅰ——诱导形成愈伤组织 m1 n1
Ⅱ——诱导形成幼芽 m2 n2
Ⅲ——诱导生根 m3 n3
A.不同阶段m/n值是不同的，此值最大的阶段是Ⅲ阶段
B．在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段中只有Ⅱ阶段会发生基因选择性表达
C．Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体
D．用该技术进行细胞产物工厂化生产时激素配比最好为m2和n2
解析：选C。细胞分裂素用量/生长素用量(m/n值)，比值低时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值高时，有利于芽的分化、抑制根的形成；比值适中时，促进愈伤组织的形成，因此不同阶段m/n值是不同的，此值最大的阶段是Ⅱ阶段，A错误。Ⅰ过程为脱分化，Ⅱ、Ⅲ过程是形成幼芽、根的再分化过程，脱分化和再分化都存在基因的选择性表达，故Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段都存在基因的选择性表达，B错误。Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是茎尖、幼叶细胞分化程度低，容易诱导产生愈伤组织，C正确。细胞分裂素用量/生长素用量，比值适中时，促进愈伤组织形成，用该技术进行细胞产物工厂化生产时激素配比最好为m1和n1，D错误。
11．(2024·广东广州高三一模)抗CD20抗体可用于治疗淋巴瘤等疾病。研究人员将表达抗CD20单克隆抗体的 DHFR-CHO杂交瘤细胞接种于反应器中培养，培养过程中不补充培养液，抽样检测产物浓度和细胞生长情况(通过台盼蓝染色结合显微镜直接计数统计细胞密度和活性)。下列叙述正确的是( )
A．杂交瘤细胞培养过程中需置于37 ℃、含5%O2的气体条件下进行培养
B．显微镜下只统计单位体积中被染色的细胞数量，即可得到活细胞密度
C．随着培养过程的进行，产物持续增多，最高浓度约为95 mg·L－1
D．培养一段时间后，培养液中营养物质的减少制约了细胞的生长和活性
解析：选D。进行杂交瘤细胞培养时，需置于(36.5±0.5) ℃、含有95%空气和5%CO2的混合气体的CO2培养箱中培养，A错误；死细胞会被台盼蓝染成蓝色，活细胞不会，因此，显微镜下应该统计单位体积中没有被染色的细胞数量，B错误；由于培养过程中不补充培养液，随着培养过程的进行，产物先增多后减少，C错误；结合题图可知，培养一段时间后，活细胞密度会减小，细胞活性会降低，由于培养过程中不补充培养液，故培养一段时间后，培养液中营养物质的减少制约了细胞的生长和活性，D正确。
12．(2024·广东佛山高三二模)为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，研究者提出了如下思路：剔除猪的某些基因，用猪的器官作为供体。借助CRISPR-Cas9基因编辑技术可以剔除猪的相关基因，下图为Cas9蛋白依据sgRNA片段切割DNA的示意图(设计特定的sgRNA可以识别需剔除的DNA序列)。相关叙述错误的是( )
A．上述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因
B．上述基因编辑过程还需细胞内的限制酶及DNA连接酶参与
C．上述基因编辑技术能定点切除目标基因取决于sgRNA
D．可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵
解析：选B。免疫排斥主要与标明身份的标签的蛋白质相关，所以为解决跨物种器官移植出现的免疫排斥反应，题述需要剔除的基因可能是标明猪细胞身份的标签蛋白基因，A正确；由题图可知，使用CRISPR-Cas9进行基因编辑时，sgRNA的碱基序列与基因组DNA中特定碱基序列根据碱基互补配对原则结合在一起，该过程不需要酶催化，然后由Cas9催化磷酸二酯键水解，不需要细胞内的限制酶参与，B错误；Cas9-sgRNA复合体能够精准识别某核苷酸序列的原因可能是单链sgRNA可与特定核苷酸序列碱基互补配对，所以题述基因编辑技术能定点切除目标基因取决于sgRNA，C正确；可以利用显微注射技术将Cas9-sgRNA复合体导入猪的受精卵，D正确。
二、非选择题
13．(2024·河北保定高三一模)人的血清白蛋白在临床上需求量很大，为提高其产量，科学家通过转基因技术和克隆技术培育出能分泌血清白蛋白的奶牛，流程如下图所示，图中数字表示相关的实验操作步骤。据图回答下列问题：
(1)为获得人血清白蛋白基因，首先要从细胞中获取总RNA，通过________获得cDNA，再进行PCR获得人血清白蛋白。进行PCR需要设计引物，引物的作用是________________________。已知引物3′端和模板间发生错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，引发链的合成效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间。为保证PCR得到正确扩增产物，引物3′端最好选择___________________________________________________碱基。
(2)同位酶是指识别相同的序列但切割位点不同的一类限制酶；同尾酶是指识别不同的序列但产生相同的黏性末端的一类限制酶。为成功构建血清白蛋白基因表达载体，且在一定程度上防止重组质粒再次被切割，则可使用________(填“同位酶”或“同尾酶”)对DNA进行切割。人血清白蛋白cDNA中不含限制酶识别序列，为构建基因表达载体，需在PCR使用的引物的__________(填“3′”或“5′”)端上加入限制酶的识别序列。
(3)进行实验操作步骤①时，需选用__________(填“雄性”或“雌性”)的胚胎细胞。若用体细胞取代胚胎细胞，则经过步骤②后得到早期胚胎的成功率会________，原因是________________________________________________
___________________________________________________________。
(4)得到细胞B时，需将供体细胞A的细胞核注入去核的卵母细胞中，去掉卵母细胞的细胞核的原因是______________________________________________
______________________________________________________________。
(5)进行实验操作步骤③时，需要定期更换培养液，目的是______________________________________________________________________
_________________________________________________________________。
实验操作步骤④涉及的现代生物技术有______________________________________________________________________
________________________________________________(答出2点即可)。
解析：(1)从细胞中获取总RNA，通过逆转录，根据碱基互补配对原则获得cDNA。由于DNA聚合酶不能从头合成，所以在PCR中需要加入引物，引物的作用是在合成子链时，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。由于当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，引发链的合成效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间。为保证PCR得到正确扩增产物，引物3′端最好选择碱基T。(2)同尾酶是指识别不同的序列但产生相同的黏性末端的一类限制酶。为成功构建血清白蛋白基因表达载体，且在一定程度上防止重组质粒再次被切割，则可使用同尾酶对DNA进行切割。人血清白蛋白cDNA中不含限制酶识别序列，为构建基因表达载体，需在PCR使用的引物的5′端上加入限制酶的识别序列，因为引物的作用是在合成子链时，使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，若将限制酶的识别序列加到3′端，使用限制酶切割目的基因时会破坏目的基因。(3)依题意可知，要培育出能分泌血清白蛋白的奶牛，进行实验操作步骤①时，需选用雌性的胚胎细胞。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难(动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易)，所以若用体细胞取代胚胎细胞，则经过步骤②后得到早期胚胎的成功率会降低。(4)为了使后代牛的性状主要由供体细胞核决定，故得到细胞B时，需将供体细胞A的细胞核注入去核的卵母细胞中。(5)进行实验操作步骤③时需要定期更换培养液，目的是清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养。实验操作步骤④涉及的现代生物技术有胚胎分割和胚胎移植。
答案：(1)逆转录 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 T (2)同尾酶 5′ (3)雌性 降低 动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难(或动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易) (4)使后代牛的性状主要由供体细胞核决定 (5)清除代谢物，防止细胞代谢物积累对细胞自身造成危害，同时给细胞提供足够的营养 胚胎分割、胚胎移植
14．(2024·河北邯郸高三一模)某科研团队首次利用转基因猪的唾液腺作为生物反应器，高效合成一种对人的神经性疾病具有良好治疗作用的蛋白质——人神经生长因子(hNGF)，为生产高活性的人类药用蛋白提供了一种高效的新技术，拓展了畜牧动物在人类医学中的应用。下图为该团队构建的基因表达载体，请回答下列相关问题：
(1)科研人员曾经利用小鼠唾液腺组织中分离纯化的鼠源神经生长因子(mNGF)及大肠杆菌表达的hNGF进行一些神经损伤疾病的治疗，但其治疗效果均比人体自身合成的hNGF差。请分析mNGF治疗效果较差的原因可能是_______________________________________________________，
导致mNGF的活性较低；大肠杆菌表达的hNGF治疗效果也较差的原因可能是___________________________________________________
___________________________________________________，
导致大肠杆菌表达的hNGF活性也较低。
(2)家畜的唾液腺是一种高效的生物反应器，与乳腺生物反应器相比较，其优点是________________________________________________________
_________________________________________________________
_____________________________________________________(答出两点)；
在构建hNGF基因表达载体时，需将hNGF基因与________________________等控制元件重组在一起，通过________技术将基因表达载体导入猪的受精卵中，经________________________等技术将受精卵培养成胚胎并转移到受体猪体内。
(3)为确定转基因猪是否培育成功，除了分子水平的鉴定，还要进行个体水平的鉴定，具体的方法是_________________________________________________
__________________________________________________________。
解析：(1)从小鼠唾液腺组织中分离纯化的鼠源神经生长因子(mNGF)治疗效果较差的原因可能是mNGF与hNGF的结构存在差异，导致mNGF的活性较低，因为蛋白质的结构决定蛋白质的功能。在大肠杆菌中表达的hNGF治疗效果也较差，可能是因为大肠杆菌为原核生物，没有内质网、高尔基体等细胞器，hNGF合成后不能进行加工、修饰，导致大肠杆菌表达的hNGF活性也较低。(2)家畜的唾液腺是一种高效的生物反应器，与乳腺生物反应器相比较，其优点是在整个生命周期都可以在唾液腺中表达hNGF；不受性别的限制；唾液的分泌量大、唾液中蛋白质的种类和含量比乳汁中少，便于收集。为了使特定的蛋白在猪的唾液腺细胞中表达，在构建基因表达载体时，需将hNGF基因与唾液腺中特异性表达的基因的启动子等控制元件重组在一起，通过显微注射技术导入猪的受精卵中，利用体外胚胎培养技术先将受精卵培养成早期胚胎，然后利用胚胎移植技术将早期胚胎转移到受体猪体内，以培育成完整个体。(3)为确定转基因猪是否培育成功，除了分子水平的鉴定，还要进行个体水平的鉴定。因基因表达载体中存在绿色荧光蛋白基因，可以在黑暗的环境中用紫外光照射转基因猪的唾液，观察绿色荧光是否出现。
答案：(1)mNGF与hNGF的结构存在部分差异 大肠杆菌没有内质网和高尔基体等细胞器，合成的hNGF不能进一步修饰和加工 (2)在整个生命周期都可以在唾液腺中表达hNGF；不受性别的限制；唾液的分泌量大、唾液中蛋白质的种类和含量比乳汁中少，便于收集 唾液腺中特异性表达的基因的启动子 显微注射 体外胚胎培养技术和胚胎移植 (3)在黑暗的环境中用紫外光照射转基因猪的唾液，观察绿色荧光是否出现INCLUDEPICTURE "生物版块五lll.TIF" INCLUDEPICTURE "生物版块五lll.TIF" \* MERGEFORMAT
专题十三 发酵工程
INCLUDEPICTURE "课程标准lll.TIF" INCLUDEPICTURE "课程标准lll.TIF" \* MERGEFORMAT 1.获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。 2.发酵工程为人类提供多样的生物产品。
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[答案自填] ①醋酸菌 ②碳源 ③尿素 ④稀释涂布平板法
命题点1 微生物的培养、分离与计数
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1．无菌技术常用方法
2．微生物的纯化技术
(1)制备马铃薯琼脂培养基
(2)两种纯化微生物方法的比较
3．微生物分离与计数的两个实例
(1)土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(2)纤维素分解菌的分离
[易错提醒] 关注两种对照组与一种重复组
(1)将一未接种的选择培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认培养基灭菌是否彻底(制备是否合格)。
(2)将一接种的普通培养基与接种的选择培养基一起培养——用于确认选择培养基是否起“筛选”作用。
(3)进行微生物计数时，每一稀释度下至少涂布三个平板，即设置重复组，是为了求平均值，提高计数准确度。
[答案自填] 紫外线 接种环 涂布器 选择 纤维素 红色复合物 透明圈
INCLUDEPICTURE "教材易漏排查lll.TIF" INCLUDEPICTURE "教材易漏排查lll.TIF" \* MERGEFORMAT
1．(选择性必修3 P12探究·实践)平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以避免培养基表面的水分过快地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2．(选择性必修3 P18正文)当菌落数目稳定时，选取菌落数为 30～300的平板进行计数，在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值。
3．(选择性必修3 P18正文)用稀释涂布平板法计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
4．(选择性必修3 P18探究·实践)判断培养基是否被杂菌污染的方法是设置未接种(或接种等量无菌水)的培养基作为空白对照。
5．(选择性必修3 P20拓展应用2)在筛选纤维素分解菌时，采用刚果红染色法，当纤维素被纤维素分解菌分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
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【最新考情】
(2024·黑吉辽选择考改编)某些香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，其筛选流程及抗性检测如图。下列操作错误的是( )
A．在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从健康植株上采集样品
B．将采集的样品充分消毒后，用蒸馏水冲洗，收集冲洗液进行无菌检测
C．将无菌检测合格的样品研磨，经稀释涂布平板法分离得到内生菌的单菌落
D．判断内生菌的抗性效果需比较有无接种内生菌的平板上的病原菌菌斑大小
解析：选B。香蕉植株组织中存在的内生菌可防治香蕉枯萎病，因此，若要采集样品分离内生菌，则应在大量感染香蕉枯萎病的香蕉种植园内，从健康植株上采集，A正确；应用无菌水冲洗消毒后的样品，B错误；由题图可知，无菌检测合格的样品研磨后，经稀释涂布平板法可分离得到内生菌的单菌落，C正确；由题图可知，判断内生菌的抗性效果需要将接种与未接种内生菌的平板进行比较，观察病原菌菌斑大小，D正确。
[把脉高考] 该知识点为高频考点。考查点主要包括无菌技术、培养基的配制、微生物的接种方法、微生物的培养等。试题情境常涉及生活、生产实践和环境治理，又渗透科学实验与探究。
【历年考情】
INCLUDEPICTURE "辨正误lll.TIF" INCLUDEPICTURE "辨正误lll.TIF" \* MERGEFORMAT
(1)(2023·山东T15)不含氮源的平板不能用于微生物培养。( )
(2)(2023·广东T10)研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线(如图)和选择培养基筛选原理来判断，最可能筛选到目标菌的条件组合是c点时取样、角蛋白氮源培养基。( )
(3)(2021·江苏T18)将培养基分装于培养皿中后灭菌，可降低培养基污染的概率。( )
(4)(2021·江苏T18)为提高一株石油降解菌的净化能力，将菌涂布于石油为唯一碳源的固体培养基上，以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。涂布用的菌浓度应控制在30～300个/mL。( )
(5)(2021·浙江6月T17)稀释涂布平板法和平板划线法均能得到单菌落，都可用于细胞计数。( )
INCLUDEPICTURE "练表达lll.TIF" INCLUDEPICTURE "练表达lll.TIF" \* MERGEFORMAT
(6)(2023·全国乙T37节选)采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，培养基中还需要加入氮源等营养成分，氮源的主要作用是____________________________________(答出1点即可)。
(7)(2022·浙江6月T29节选)为快速分离产淀粉酶的枯草杆菌，可将土样用________制成悬液，再将含有悬液的三角瓶置于80℃的________中保温一段时间，其目的是______________________________________。
(8)(2022·河北T23节选)枯草芽孢杆菌为好氧微生物，液体培养时应采用________(填“静置”或“摇床振荡”)培养。培养过程中抽样检测活菌数量时，应采用________________(填“稀释涂布平板法”或“显微镜直接计数法”)，其原因是_____________________________________________________
________________________________________________________。
提示：(1)× (2)√ (3)× (4)× (5)× (6)用于合成微生物细胞中的含氮化合物，如核酸、蛋白质等 (7)无菌水 水浴 杀死不耐热微生物 (8)摇床振荡 稀释涂布平板法 用稀释涂布平板法在培养基上看到的每一个菌落一般都来自一个活细胞，而显微镜直接计数法会将死亡的枯草芽孢杆菌也计算在内
INCLUDEPICTURE "题组模拟素养提升lll.TIF" INCLUDEPICTURE "题组模拟素养提升lll.TIF" \* MERGEFORMAT
突破1 培养基的制备与无菌操作
1．(2024·山东聊城高三一模)在一些传统食品的制作过程中，灭菌、消毒、防腐等是控制有害微生物的常用方法。下列说法正确的是( )
A．葡萄制作果酒过程中，葡萄用清水冲洗后需用70%的酒精消毒
B．火腿制作过程中盐腌等防腐措施能抑制微生物生长繁殖
C．制作泡菜时泡菜坛要密封，主要目的是避免外界杂菌的污染
D．泡菜腌制过程中，通常用加入抗生素的方法来抑制杂菌
解析：选B。发酵瓶、榨汁机等器具需要用体积分数为70%的酒精消毒，葡萄制作果酒过程中，葡萄用清水冲洗后沥干即可，A错误；火腿制作过程中盐腌等防腐措施能抑制微生物生长繁殖，这是因为食盐的主要成分是NaCl，外界环境盐浓度过高导致微生物细胞失水，B正确；制作泡菜时泡菜坛要密封，主要目的是提供无氧环境，使乳酸菌无氧呼吸产生乳酸，C错误；制作泡菜时，会加入质量分数为5%～20%的盐水(煮沸冷却后加入)，盐浓度高可抑制杂菌生长，防止泡菜发霉、变质，所以我们在泡菜水中会加盐来抑制杂菌而非添加抗生素，D错误。
2．(2024·湖南株洲高三一模)L-天冬酰胺酶由细菌和真菌合成，可分解天冬酰胺释放出氨，然后与奈斯勒试剂反应呈棕色。为筛选获得L-天冬酰胺酶高产菌株，设计了如下固体培养基。固体培养基：主要成分有牛肉膏、蛋白胨、水、NaCl、琼脂、奈斯勒试剂。实验结果如下图。下列叙述错误的是( )
A．根据实验结果可知，接种时采用的是稀释涂布平板法
B．应选择菌落C作为高产L-天冬酰胺酶菌株进行大量培养
C．该培养基从功能来看属于选择培养基，其中充当氮源的成分是牛肉膏
D．无菌技术还可以避免操作者被有害微生物感染，实验结束后的培养基不能直接丢弃
解析：选C。从接种结果来看，菌落分布较为均匀，应该采用的是稀释涂布平板法，A正确；菌落B和菌落C周围棕色圈的直径相同，但菌落C的直径更小，因此菌落C的单个细胞产生的L-天冬酰胺酶更多，应选择菌落C进行大量培养，B正确；培养基中加入奈斯勒试剂，若微生物能产生L-天冬酰胺酶则菌落周围会出现棕色圈，因此该培养基从功能来看属于鉴别培养基，其中充当氮源的成分是牛肉膏和蛋白胨，C错误；无菌技术可用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染，还可以避免操作者被有害微生物感染，但实验结束后为避免环境污染，培养基在丢弃前要进行灭菌处理，D正确。
突破2 微生物的培养、筛选与计数
3．(2024·湖北高三二模)以纤维素为唯一碳源并加入刚果红的培养基经接种后，若微生物能分解纤维素，则会出现以菌落为中心的透明圈。科研人员从土壤中分离了五种能分解纤维素的细菌菌株，培养基中出现了因分解纤维素而产生的透明圈，操作过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．在该实验过程中制备培养基时应先调pH再灭菌
B．分解纤维素能力最强的是E菌株，应对其扩大培养
C．药品称量、溶化和倒平板等操作都必须在酒精灯火焰旁进行
D．若平板中平均菌落数为120个，则1 g土壤中含有能分解纤维素的细菌数为1.2×108个
解析：选C。制备培养基时应先调pH再灭菌，A正确；分解纤维素能力最强的是E菌株，应对其扩大培养，因为E菌落外围的透明圈直径和E菌落直径的比值最大，B正确；药品称量、溶化是进行培养基配制的过程，培养基配制后才需要灭菌，故称量和溶化不需要无菌操作，倒平板过程需要进行无菌操作，C错误；若平板中平均菌落数为120个，题图实验所用的涂布菌液共稀释了105倍，则1 g土壤中含有能分解纤维素的细菌数为120÷0.1×105＝1.2×108个，D正确。
4．(2024·湖南长沙高三联考)野生型大肠杆菌能在基础培养基上生长，氨基酸营养缺陷型突变株由于无法合成某种氨基酸，只能在完全培养基上生长。下图为纯化某氨基酸营养缺陷型突变株的部分流程图，①②③④代表培养基，A、B、C表示操作步骤，D、E为菌落。下列叙述正确的是( )
A．A操作的目的是提高基因突变的概率，使其发生定向突变，增加突变株的数量
B．B的正确操作是用接种环蘸取菌液后在②表面涂布来接种菌种
C．图中①②③为完全培养基，培养基一般用高压蒸汽灭菌法进行灭菌
D．若要获得氨基酸营养缺陷型突变株，可从④中挑取D进行纯化培养
解析：选D。A操作为紫外线处理，该操作可以提高突变的概率，增加突变株的数量，但无法实现定向突变，A错误；据题图分析，B操作是将菌液滴加到培养基表面，再用涂布器将菌液均匀地涂布在②表面，B错误；结合题图信息分析可知，野生型大肠杆菌能在基础培养基上生长，而氨基酸营养缺陷型菌株由于发生基因突变无法合成某种氨基酸只能在完全培养基上生长，且③中只有部分菌落，故题图中①②④为完全培养基，③为基础培养基，C错误；④为完全培养基，③为基础培养基，若要获得氨基酸营养缺陷型突变株，可从④中挑取D(在③中相应位置无菌落)进行纯化培养，D正确。
命题点2 传统发酵技术的应用
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1.
2．泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
[答案自填] 乙酸 30～35 榨汁
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1．(选择性必修3 P6探究·实践一)制作泡菜时用水密封泡菜坛的目的是隔绝空气。泡菜坛只能装八成满，原因之一是装完菜料后还需要加入冷却的盐水，留有一定空间，便于冷却好的盐水淹没全部菜料。
2．(选择性必修3 P7正文)当O2、糖源都充足时，醋酸菌可以将糖分解为乙酸；当O2充足、缺少糖源时，醋酸菌可将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸。
3．(选择性必修3 P24思考·讨论)生产啤酒时，需进行后发酵的原因是主发酵结束后，发酵液不适合饮用，要在低温、密闭的环境下储存一段时间进行后发酵，这样才能形成澄清、成熟的啤酒。
4．(选择性必修3 P28拓展应用2)生产燃料乙醇需要消耗大量粮食，会增加粮食短缺的风险，在生产时，为了规避这一风险，应该使用陈化粮食(如陈化的稻谷等)或者非粮食生物材料(如秸秆等)。使用陈化粮食来生产燃料乙醇，还有利于防止问题粮食流入市场。
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【最新考情】
1．(2024·湖北选择考)制醋、制饴、制酒是我国传统发酵技术。醋酸菌属于好氧型原核生物，常用于食用醋的发酵。下列叙述错误的是( )
A．食用醋的酸味主要来源于乙酸
B．醋酸菌不适宜在无氧条件下生存
C．醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶
D．葡萄糖在醋酸菌中的氧化分解发生在线粒体内
解析：选D。醋酸菌常用于食用醋的发酵，食用醋的酸味主要来源于醋酸菌发酵产生的乙酸，A正确；醋酸菌是好氧细菌，不适宜在无氧条件下生存，B正确；当缺少糖源时，醋酸菌可将乙醇转化为乙醛，再将乙醛变为乙酸，所以醋酸菌含有催化乙醇氧化成乙酸的酶，C正确；醋酸菌是原核生物，其细胞内无线粒体，D错误。
2．(2024·河北选择考改编)中国传统白酒多以泥窖为发酵基础，素有“千年老窖万年糟”“以窖养糟，以糟养泥”之说。多年反复利用的老窖池内壁窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物。下列叙述错误的是( )
A．传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的
B．窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，使酿造过程不易污染杂菌
C．从窖泥中分离的酿酒酵母扩大培养时，需在CO2或N2环境中进行
D．从谷物原料发酵形成的酒糟中，可分离出产淀粉酶的微生物
解析：选C。白酒的酿造主要依靠酿酒酵母，由于窖泥中含有大量与酿酒相关的微生物，故传统白酒的酿造是在以酿酒酵母为主的多种微生物共同作用下完成的，A正确；窖池内各种微生物形成了相对稳定的体系，且酿造过程产生的酒精也会抑制杂菌的生长与繁殖，使酿造过程不易污染杂菌，B正确；酵母菌是兼性厌氧菌，与无氧呼吸相比，细胞有氧呼吸产生的能量更多，更能满足酵母菌大量繁殖时的需求，因此，对分离的酿酒酵母扩大培养时需要在有氧的环境条件下进行，C错误；谷物原料如高粱、玉米、大米等富含淀粉，因此从谷物原料发酵形成的酒糟中可分离出产淀粉酶的微生物，D正确。
3．(2024·山东等级考)在发酵过程中，多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体，菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是( )
A．相同菌体密度下，菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B．发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C．发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D．发酵结束后，将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
解析：选D。在氧气充足的条件下，黑曲霉可以利用糖类发酵产生柠檬酸，在相同菌体密度下，菌球体越大，越不容易获得氧气，柠檬酸产生速率越慢，A正确。由题目所给信息“菌体内铵离子浓度升高时，可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制”可推出发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量，B正确。大部分细菌适合在中性或弱碱性环境中生存，发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长，C正确。如果发酵产品是微生物细胞本身，可在发酵结束之后，采用过滤、沉淀等方法将菌体分离和干燥，即可得到产品。如果产品是代谢物，可根据产物的性质采取适当的提取、分离和纯化措施来获得产品。柠檬酸属于代谢物，D错误。
[把脉高考] 该知识点为中频考点。考查点主要包括利用传统发酵技术制作泡菜、果酒和果醋；利用发酵工程进行啤酒制作；发酵工程在食品工业、医药工业和农牧业等领域中的应用等。试题情境多联系生活、生产实践，指导应用性较强。
【历年考情】
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(1)(2023·浙江6月T12)关于小曲白酒的酿造过程，糖化主要是利用霉菌将淀粉水解为葡萄糖。( )
(2)(2022·山东T20)啤酒的工业化生产中，大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后，最终过滤、调节、分装。焙烤是为了利用高温杀死大麦种子的胚并进行灭菌。( )
(3)(2022·山东T14)目前已实现青霉素的工业化生产，选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。( )
(4)(2021·江苏T14)果醋发酵时，发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时。( )
(5)(2021·辽宁T8)酵母菌和醋酸菌发酵过程中控制通气的情况不同。 ( )
(6)(2020·江苏T18)某同学在家用带盖玻璃瓶制作果酒和果醋时将玻璃瓶用酒精消毒后，装满葡萄汁，待酒精发酵后去除瓶盖，盖一层纱布，再进行乙酸发酵。( )
INCLUDEPICTURE "练表达lll.TIF" INCLUDEPICTURE "练表达lll.TIF" \* MERGEFORMAT
(7)[2020·全国ⅢT37(4)]制作果酒需要________________菌，这一过程中也需要O2，O2的作用是_________________________________________。
提示：(1)√ (2)× (3)√ (4)√ (5)√ (6)× (7)酵母 促进有氧呼吸，使酵母菌大量繁殖
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突破1 传统发酵技术的应用
1．泡菜是我国的传统美食，泡菜制作时，使用低浓度的盐水，再经乳酸菌发酵，制成一种带酸味的腌制品，只要乳酸含量达到一定的浓度，并使产品隔绝空气，就可以达到久贮的目的。下列关于泡菜腌制的叙述，错误的是( )
A．参与泡菜腌制的微生物为乳酸菌，在无氧条件下可将葡萄糖分解成乳酸使泡菜具有酸味
B．腌制泡菜时泡菜坛要装至八成满，盐水没过全部菜料，盖上坛盖再用水密封泡菜坛
C．在泡菜腌制过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的含量均会先增加后减少再趋于稳定
D．腌制泡菜时如果加入一些陈泡菜汁，可以缩短腌制时间
解析：选C。在制作泡菜时，选用乳酸菌，乳酸菌为厌氧细菌，在无氧条件下将葡萄糖分解成乳酸使泡菜具有酸味，A正确。腌制泡菜时泡菜坛要装至八成满，盐水没过全部菜料，盖上坛盖再用水密封泡菜坛，隔绝空气，从而创造无氧条件，B正确。在泡菜腌制过程中亚硝酸盐的含量会先增加后减少再趋于稳定；乳酸菌的含量先增加，后由于营养物质缺乏、pH下降而减少；乳酸的含量会先增加后趋于稳定，C错误。陈泡菜汁中含有乳酸菌，坛中加一些陈泡菜汁的目的是加入乳酸菌菌种，这相当于在接种环节增加了乳酸菌的数量，可以缩短腌制时间，D正确。
2．(2024·山东烟台高三一模)用“麦汁酸化”法酿造的酸啤酒既有麦芽清香，又酸甜适口。它是通过微生物发酵将麦汁中的麦芽糖和其他糖类转化为醋酸和乳酸，再结合酒精发酵制作而成。下列说法错误的是( )
A．前期利用醋酸菌和乳酸菌在同一容器中同时进行醋酸和乳酸发酵
B．达到一定酸度的麦汁需经熬煮、冷却后才可接种抗酸性高的酵母菌
C．后期发酵产生酒精时，应将发酵温度控制在18～30 ℃范围内
D．酒精发酵时发酵罐内液面不再有气泡产生，说明发酵基本完毕
解析：选A。醋酸菌是好氧细菌，而乳酸菌是厌氧细菌，所以醋酸菌与乳酸菌在同一容器中发酵时，不能同时产生醋酸和乳酸，A错误；抗酸性高的酵母菌适应酸性环境，达到一定酸度的麦汁需经熬煮、冷却后才可接种，B正确；酒精发酵需要酵母菌，酵母菌发酵的适宜温度范围是18～30 ℃，所以后期发酵产生酒精时，应将发酵温度控制在18～30 ℃范围内，C正确；发酵一定时间后，观察到发酵罐内液面不再有气泡产生，说明酒精发酵停止，即发酵基本完毕，D正确。
突破2 发酵工程及其应用
3．(2024·湖北七市高三联考)发酵工程为人类提供多样的发酵产品。下列关于发酵工程的叙述正确的是( )
A．发酵工程多为无氧发酵，而传统发酵则多为有氧发酵
B．发酵产物可以是微生物的代谢物，即单细胞蛋白
C．发酵生产的微生物肥料可能抑制土壤中病原微生物的生长
D．发酵生产的食品添加剂可延长食品保存期，不能食用
解析：选C。发酵工程多为有氧发酵，如谷氨酸发酵工程、柠檬酸发酵工程等，而传统发酵则多为无氧发酵，如酿酒等，A错误；发酵产物可以是微生物的代谢物，如酒精、氨基酸、抗生素、维生素等，也可以是微生物本身，如单细胞蛋白，B错误；有些发酵生产的微生物肥料可以抑制土壤中病原微生物的生长，从而减少病害的发生，C正确；有些发酵生产的食品添加剂可延长食品保存期，如防腐剂，还有些食品添加剂可改善食品的口味、色泽和品质，属于可食用的，D错误。
4．(2024·辽宁沈阳高三一模)燃料乙醇是一种绿色燃料。研究人员利用酵母菌以霉变的木薯和小麦为原料，混合发酵生产燃料乙醇，流程图如下。下列叙述错误的是( )
A．Ⅰ阶段是该发酵生产的中心环节
B．Ⅱ阶段步骤①是接种酵母菌
C．Ⅱ阶段需将pH调至酸性以利于菌种发酵
D．Ⅲ阶段步骤②是产品的分离、提纯
解析：选A。分析题图可知，Ⅱ阶段是该发酵生产的中心环节，A错误；步骤①是接种酵母菌，B正确；对于真菌而言，适宜的pH为酸性，故Ⅱ阶段需将pH调至酸性以利于菌种发酵，C正确；Ⅲ阶段步骤②是产品的分离、提纯，最终获得燃料乙醇，D正确。专题强化训练
一、选择题
1．(2024·河北石家庄高三二模)关于培养基的叙述，错误的是( )
A．诱导愈伤组织的培养基中需添加有机小分子
B．在含有纤维素的培养基中加入刚果红，可作为纤维素分解菌的选择培养基
C．分离自生固氮菌的无氮源培养基，在灭菌前应将pH调整为中性或弱碱性
D．动物细胞培养基中常加入血清，为动物细胞增殖提供特殊营养物质
解析：选B。植物组织培养过程中必须提供水、无机盐、小分子有机物等营养物质，还需要添加生长素和细胞分裂素等激素，A正确；在含有纤维素的培养基中加入刚果红，可作为纤维素分解菌的鉴别培养基，B错误；培养细菌时，应将培养基调至中性或弱碱性，分离自生固氮菌的无氮源培养基，在灭菌前应将pH调整为中性或弱碱性，C正确；血清能提供营养和促进细胞生长，动物细胞培养基中常加入血清，为动物细胞增殖提供特殊营养物质，D正确。
2．(2024·河北保定高三一模)下列有关微生物培养与应用技术的叙述，错误的是( )
A．倒平板时，拔出锥形瓶棉塞后，应将瓶口迅速通过酒精灯火焰
B．微生物在固体培养基表面或内部生长，可以形成肉眼可见的菌落
C．血细胞计数板适用于酵母菌但不适用于细菌的数量测定
D．传统果酒由于是利用天然菌种发酵获得，其品质比工业化生产的果酒好
解析：选D。倒平板时，拔出锥形瓶棉塞后，应将瓶口迅速通过火焰，以防止杂菌污染，A正确；分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，这就是菌落，B正确；血细胞计数板比细菌计数板厚，常用于相对较大的酵母菌细胞、霉菌孢子等的计数，用细菌计数板可对细菌等较小的细胞进行观察和计数，C正确；传统果酒由于是利用天然菌种发酵获得，其品质比工业化生产的果酒差，D错误。
3．(2024·湖南衡阳高三二模)《黄帝内经》中提到：“米酒甘甜，入肝经，能补血行气。”某品牌的甜酒曲中只有好氧型根霉菌，这种菌促进淀粉水解的能力强，产生酒精的能力较弱，因而用其制作的甜米酒甜味明显又略带酒香。下列相关叙述正确的是( )
A．可用根霉菌和酵母菌一起进行有氧发酵来提高甜米酒的酒精浓度
B．用适宜的选择培养基即可获得某种用于酿制米酒的优质根霉菌菌种
C．蒸好的米饭放至室温再添加甜酒曲可以防止根霉菌因高温而失活
D．用纯根霉菌制作的甜米酒中只有酒精一种代谢物因而更加安全
解析：选C。酵母菌在无氧条件下发酵产生酒精，A错误；用适宜的选择培养基可获得根霉菌菌种，还需经发酵检测才能获得某种用于酿制米酒的优质根霉菌菌种，B错误；蒸好的米饭放至室温再添加甜酒曲可以防止温度过高杀死发酵微生物，C正确；用纯根霉菌制作的甜米酒中不是只有酒精一种代谢物，D错误。
4．(2024·湖南娄底高三模拟)某中学为宣传正确佩戴口罩可降低呼吸道传染疾病的风险进行了相关实验。实验中将牛肉膏蛋白胨培养基置于距正确佩戴口罩的实验者口部前方50 cm处，然后对着培养基讲话1 min或咳嗽2次，再进行微生物培养和观察。下列叙述错误的是( )
A．实验中牛肉膏蛋白胨培养基应为固体培养基，并进行严格灭菌
B．实验者对培养基进行处理后，放入20 ℃恒温培养箱中培养1～2 d
C．实验中还应设置不戴口罩直接讲话或咳嗽进行对照
D．培养结束后可根据菌落的形状、大小、颜色等特征初步区分不同种的微生物
解析：选B。实验中牛肉膏蛋白胨培养基应为固体培养基，为了防止其他微生物的干扰，应进行严格灭菌处理，A正确；分析题意可知，本实验是为了确定正确佩戴口罩可降低呼吸道传染疾病的风险，而人体的体温约为37 ℃，因此应设置与人体体温基本相同的温度，即在37 ℃恒温培养箱中培养1～2 d，B错误；本实验的实验组为正确佩戴口罩对着培养基讲话1 min或咳嗽2次，实验中还应该设置不戴口罩直接讲话或咳嗽进行对照，C正确；不同微生物的菌落具有其特殊的特征，在实验培养结束后，可根据菌落的形状、大小、颜色等特征初步区分不同种的微生物，D正确。
5．(2024·湖南大联考高三模拟)与传统发酵技术相比，发酵工程的产品种类更加丰富，产量和质量明显提高。下列相关叙述正确的是( )
A．通过发酵工程可以从微生物细胞中提取单细胞蛋白
B．发酵工程的产品主要包括微生物的代谢物、酶及菌体本身
C．发酵工程与传统发酵技术最大的区别就是前者可以利用微生物来进行发酵
D．在发酵工程的发酵环节中，发酵条件变化只会影响微生物的生长繁殖
解析：选B。以淀粉或纤维素的水解液、制糖工业的废液等为原料，通过发酵获得的大量微生物菌体就是单细胞蛋白，A错误；微生物的代谢物、酶及菌体本身均可作为发酵工程的产品，B正确；发酵工程与传统发酵技术都要利用微生物来进行发酵，C错误；在发酵工程的发酵环节中，发酵条件变化不仅会影响微生物的生长繁殖，还会影响微生物的代谢途径，D错误。
6．(2024·湖北黄冈高三模拟)解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用。脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色。将等量的、不能直接吸收脂肪的甲、乙两种细菌分别接种在醇溶青琼脂平板上培养，均产生了菌落，甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，下列说法正确的是( )
A．甲菌和乙菌都属于解脂菌
B．甲菌和乙菌均能在该平板上生长说明培养基中含有其他碳源
C．该平板不能用来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力
D．为更好地控制无关变量，应将两种菌分别接种在多个醇溶青琼脂平板上培养
解析：选B。解脂菌能利用分泌的脂肪酶将脂肪分解成甘油和脂肪酸并吸收利用，脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色，甲菌菌落周围呈现深蓝色，乙菌菌落周围不变色，这说明甲菌能分泌脂肪酶，属于解脂菌，乙菌不能分泌脂肪酶，不属于解脂菌，A错误；乙菌不能产生分解脂肪的酶，但乙菌也能在该培养基上生长，说明培养基中含有其他碳源，B正确；据题干“脂肪酸会使醇溶青琼脂平板变为深蓝色”可知，颜色越深，解脂菌分泌脂肪酶的能力越强，可依据固体培养基上深蓝色的深浅来比较解脂菌分泌脂肪酶的能力，C错误；为了更好地控制无关变量，可将两种菌分别接种在同一平板的不同区域进行对比，D错误。
7．(2024·湖北八市高三联考)工业污水中含有的多环芳烃类化合物(仅含C、H元素)会造成农田土壤污染。研究人员按照下图所示的流程从受污染的农田土壤中分离得到能高效降解多环芳烃类化合物的细菌菌株。下列叙述错误的是( )
A．甲、乙培养基应以多环芳烃类化合物为唯一碳源
B．步骤①接种操作需要在酒精灯火焰附近进行
C．步骤②中应用涂布器从培养基甲中蘸取菌液均匀涂布于培养基乙表面
D．步骤③中应从降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落进行挑选
解析：选C。该研究的目的是从被多环芳烃类化合物污染的土壤中分离出高效降解多环芳烃类化合物的菌株，所以甲、乙培养基应以多环芳烃类化合物为唯一碳源，A正确；为了防止杂菌污染，在进行步骤①接种操作时，需要在酒精灯火焰附近进行，B正确；步骤②是采用稀释涂布平板法接种并分离高效降解多环芳烃类化合物的菌株(目的菌)，应先用微量移液器从培养基甲中取0.1 mL菌液滴加到培养基乙的表面，再用涂布器将菌液均匀涂布于培养基乙的表面，C错误；透明圈直径与菌落直径的比值越大，说明目的菌降解多环芳烃类化合物的效果越好，因此步骤③应从降解圈直径与菌落直径比值最大的菌落进行挑选并培养，D正确。
8．(2024·河北衡水部分高中高三一模)某研究小组设计了一个利用秸秆中的纤维素生产乙醇的实验，实验流程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．菌A属于腐生生物，能分泌纤维素酶分解秸秆中的纤维素
B．淋洗液主要为酵母菌的生长繁殖提供碳源和能源等
C．在发酵阶段不能打开瓶盖以保持无氧环境完成乙醇的生成
D．发酵结束后可通过过滤、沉淀等方法获得乙醇
解析：选D。从已死的、腐烂的生物体中获得营养的生物为腐生生物，据题图分析，菌A能分解秸秆，秸秆的主要成分是纤维素，推测菌A为腐生生物，能分泌纤维素酶，A正确；采用液体培养基培养酵母菌，可以用淋洗液为原料制备培养基，淋洗液主要为酵母菌的生长繁殖提供碳源、能源等，B正确；在发酵过程中要保持无氧环境，不能打开瓶盖，C正确；发酵结束后，乙醇属于代谢物，可以采用适当的提取、分离和纯化措施来获得乙醇，不能采取过滤、沉淀的方法，D错误。
9．(2024·广东梅州高三一模)某兴趣小组为研究“使用公筷对餐后菜品细菌数量的影响”，将每道菜分为3 盘，一盘取样冷藏，一盘使用公筷就餐，一盘不用公筷就餐，实验过程如下图所示。下列相关操作或叙述正确的是( )
A．将细菌接种在固体培养基 X上可采用平板划线法
B．根据菌落的特征可以准确判断细菌的种类
C．配制的培养基需经湿热灭菌后调整pH，冷却后倒平板
D．固体培养基 X 对菜品中的细菌没有选择性
解析：选D。据题意可知，在固体培养基X上接种后还需进行计数，故只能用稀释涂布平板法接种而不能用平板划线法，A错误；在一定的培养条件下，不同种微生物表现出各自稳定的菌落特征，根据菌落的形状、大小、颜色等特征，可以初步区分不同种微生物，但不能准确判断，B错误；配制的培养基需调整pH后经湿热灭菌、冷却后倒平板，C错误；固体培养基没有做任何处理，所以对菜品中的细菌没有选择性，D正确。
10．(2024·广东湛江高三二模)蛋白S为菌株C(一种细菌)的分泌产物，可被广泛应用于医药、食品和化工工业。某小组通过实验比较不同碳源对菌体生长和蛋白S产量的影响，结果如下表所示。下列说法正确的是( )
碳源 细胞干重/(g·L－1) 蛋白S产量/(g·L－1)
葡萄糖 3.12 0.15
淀粉 0.01 0
制糖废液 2.30 0.18
A.菌株C的培养基的pH一般要调节至酸性
B．培养基中碳源物质浓度越高，菌株合成蛋白S越多
C．适合菌体生长和生产蛋白S的碳源均为葡萄糖
D．菌株C可能因不能合成淀粉酶而无法利用淀粉
解析：选D。细菌的培养基的pH一般要调至中性或弱碱性，A错误。培养基中碳源物质浓度过高可能会使菌株失水死亡，B错误。分析题表可知，以葡萄糖为碳源时，细胞干重最大，故菌株C生长的最适碳源是葡萄糖；以制糖废液为碳源时，蛋白S产量最高，故用菌株C生产蛋白S的最适碳源是制糖废液，C错误。分析实验结果可知，碳源为淀粉时菌株C不能生长，说明其不能分解利用淀粉，故其不能生长的原因可能是不能合成淀粉酶，D正确。
11．(2024·河北部分高中高三一模)传统食醋酿造过程中，发酵液表面产生的凝胶状膜主要为细菌纤维素，研究人员通过实验研究了细菌纤维素生产过程中各种指标的变化情况，获得的参数曲线如下图所示。下列有关叙述正确的是( )
A．食醋酿造的主要菌种为醋酸菌，在缺少糖源和氧气充足时可间接将乙醇转化为乙酸
B．传统食醋酿造过程中，发酵液表面的细菌纤维素来自细菌的高尔基体
C．结合图示，第6～9 d发酵液残糖含量下降较快的主要原因是菌体大量繁殖
D．影响细菌纤维素产量的因素只有菌体密度和残糖含量
解析：选A。食醋酿造过程中的主要菌种为醋酸菌，为好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，醋酸菌能将糖分解成乙酸，在氧气充足、缺少糖源时可间接将乙醇转化为乙酸，A正确；细菌为原核生物，没有高尔基体，B错误；结合题图所示，第6～9 d菌体密度增加不多，而细菌纤维素产量增加量较多，推测第6～9 d发酵液残糖含量下降较快的主要原因是细菌纤维素产生过程所需的能量由糖类提供，C错误；从题图中可知，影响细菌纤维素产量的因素有菌体密度、培养时间、残糖含量等，D错误。
12．(2024·广东湛江高三一模)豆豉是我国的一种传统发酵豆制品，其风味主要由酯、醛、醇等挥发性物质决定。科研人员从自然发酵的豆豉(约有23种不同的菌株)中分离纯化出1种产香能力较强的菌株(WLW)。纯种WLW的发酵和自然发酵的豆豉挥发性成分对比如下图所示。下列分析正确的是( )
A．WLW纯种发酵比自然发酵得到的豆豉醇香浓郁
B．纯种发酵比自然发酵所产生的挥发性物质的总量更高
C．分离纯化WLW菌种只能采用平板划线法进行接种
D．可以利用菌落特征对WLW进行菌种鉴定
解析：选D。由题图可知，WLW纯种发酵比自然发酵得到的豆豉醇类物质含量低，A错误；纯种发酵比自然发酵所产生的挥发性物质的总量低，B错误；分离纯化菌种可以采用平板划线法或稀释涂布平板法，C错误；自然发酵时约有23种不同的菌株参与，不同菌株的颜色、形态、大小有区别，可以利用菌落特征对WLW进行菌种鉴定，D正确。
二、非选择题
13．葡萄在我国的种植面积不断增大，产量和品质也不断提高，葡萄大量成熟不能及时销售出去时，种植者便将部分葡萄制作成葡萄酒。某校生物兴趣小组的同学开展了有关葡萄酒的制作等方面的研究，下图为同学们从葡萄园的土壤中分离出高效酵母菌所做的实验(Ⅰ～Ⅴ表示过程)，其中乙、丙为酵母菌培养基。回答下列有关问题：
(1)铲取葡萄树下表层土壤，配制甲中的土壤悬液。若土壤悬液经过了一段时间的富集培养，则第Ⅰ步接种最常用的方法是________________；乙、丙培养基中作为主要碳源的应该是________________，在配制乙、丙培养基时，pH应调至5.0～6.0，目的是_________________________________________________
________________________________________________________。
(2)取第Ⅳ步中生长较好的六个菌落，分别接入1～6号试管(含0.05 mol·L－1的葡萄糖溶液)中培养，3 d后用斐林试剂检测，结果如下表所示。其中___________________________________________号试管中的酵母菌最高效。
编号 1 2 3 4 5 6
砖红色相对深度 ＋＋＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋
注：“＋”越多表示砖红色颜色越深。
(3)上述实验Ⅰ～Ⅴ过程需要在____________(填实验条件)操作下进行。
(4)某同学提出能否利用生产葡萄酒的装置来直接生产葡萄醋。请你告诉他是否具有可行性及理由：_______________________________________________
__________________________________________________________。
答案：(1)稀释涂布平板法 葡萄糖 满足微生物(酵母菌)对pH的要求 (2)4 (3)无菌 (4)否，生产葡萄酒需要在密封无氧的条件下进行，醋酸菌是好氧细菌，乙酸发酵需要一直通入氧气
14．链孢霉是食用菌生产过程中常产生的一种竞争性真菌，具有危害范围广、繁殖快、防治困难等特点。研究人员从菌袋的污染部位挑取链孢霉孢子，进行了下图所示实验，所得实验结果(即菌落直径，单位：mm)见下表。回答下列问题：
杀菌剂种类 不同稀释倍数下的菌落直径
100 300
百菌清 5.5 11.8
多菌灵 2.3 6.3
霉菌克星 1.6 5.7
高效洁霉净 1.4 5.3
链孢克星 0 4.4
克霉灵 0 3.5
(1)图中除了____________外，其余操作均需在燃烧的酒精灯火焰附近进行。步骤①为配制好的PDA培养基经________________法灭菌后，冷却至不烫手(或50 ℃左右)，实验组分别加入__________________________________________________________________________________________，然后进行步骤②。
(2)接种②是使用________(填接种工具)将孢子悬液用__________法接种在培养基表面。分析表中数据，可以得到的实验结论有______________________________________________________________________
______________________________________________________(答出两点)。
(3)链孢霉虽可采用化学药剂防治，但因存在________________(答出两点)等缺点，研究者欲尝试分离纯化能抑制链孢霉生长的细菌，采用上图中接种方法，将分离得到的单株纯化细菌接种到接种有链孢霉的培养基平板上培养3天，若某细菌和链孢霉之间存在拮抗线(两个不同的菌种相互抵御对方的侵入，从而在两个菌种之间形成一条深色线)，则说明________________。
答案：(1)配制培养基 高压蒸汽灭菌 等量不同种类、不同稀释倍数的杀菌剂 (2)涂布器 稀释涂布平板 6种杀菌剂对链孢霉均有抑菌作用、稀释100倍的克霉灵及链孢克星的抑菌作用最好 (3)污染环境、易产生抗药性 该细菌可抑制链孢霉生长eq \o(\s\up7( INCLUDEPICTURE "情境命题最前沿lll.TIF" INCLUDEPICTURE "情境命题最前沿lll.TIF" \* MERGEFORMAT ),\s\do5( 17 PCR的应用))
INCLUDEPICTURE "情境链接lll.TIF" INCLUDEPICTURE "情境链接lll.TIF" \* MERGEFORMAT
1．实时荧光定量PCR技术检测病毒核酸
病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被耐高温的DNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图甲)，通过实时荧光PCR检测某冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图乙，荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)越小，说明病毒核酸浓度越高。
2．PCR定点突变——重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术的主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(图中的引物2和3，突起处代表与模板链不能互补的突变位点)，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。如某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如下图所示。
3．PCR定点突变——大引物PCR技术
大引物PCR需要用到三条引物进行两轮PCR，这三条引物分别是突变上游引物、常规上游引物和常规下游引物。第一轮PCR利用突变上游引物和常规下游引物进行扩增，得到不完整的含有突变位点的DNA片段；第二轮PCR利用第一轮扩增产物中的一条DNA链作为下游大引物，它与常规上游引物一起扩增得到完整的含有突变位点的DNA片段。原理如下图所示。
4．反向PCR扩增已知序列两侧的未知序列
当DNA的某些序列已知，而需要扩增已知序列两端的未知序列时，可采用反向PCR技术。原理是用限制酶消化该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。原理如下图所示。
5．巢式PCR
首先将目标的DNA模板与第一套引物(外引物)结合。第一套引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片段(图中未显示可能的多种产物)。然后使用第二套引物(内引物)对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。由于第二套引物位于第一轮PCR产物内部，而非目的片段包含两套引物结合位点的可能性极小，因此第二套引物不可能扩增非目的片段。这种巢式PCR扩增确保第二轮PCR产物几乎或者完全没有引物配对特异性不强造成的非特异性扩增的污染。原理如下图所示。
INCLUDEPICTURE "情境演练lll.TIF" INCLUDEPICTURE "情境演练lll.TIF" \* MERGEFORMAT
1.荧光定量PCR技术可定量检测样本中某种DNA的含量，其原理是在PCR体系中每加入一对引物的同时加入一个与某条模板链互补的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处，会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成。下列叙述错误的是( )
A．引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则
B．反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈负相关
C．耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端
D．若用上述技术检测某基因的转录水平，则需要用到逆转录酶
解析：选B。引物与探针均具有特异性，与模板结合时遵循碱基互补配对原则，A正确；模板DNA含量越高，PCR扩增过程中形成的荧光分子越多，荧光强度越大，即反应最终的荧光强度与起始状态模板DNA含量呈正相关，B错误；耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成的方向总是从子链的5′端到3′端，C正确；若要用荧光定量PCR技术检测某基因的转录水平，即检测细胞中mRNA的含量，则先要将mRNA逆转录形成DNA再检测，故需要用到逆转录酶，D正确。
2.大引物PCR定点突变常用来研究蛋白质结构改变导致的功能变化。单核苷酸的定点诱变仅需进行两轮PCR即可获得，第一轮加诱变引物和侧翼引物，第一轮产物作第二轮PCR扩增的大引物，如图表示利用大引物PCR对基因M进行定点诱变。下列说法错误的是( )
A．第一轮PCR中，至少需要2个循环才能获得相应的大引物
B．第二轮PCR所用的引物是第一轮PCR的产物DNA的两条链
C．扩增的定点诱变产物通常需具备启动子、终止子等结构才能进行转录和翻译
D．为了使两轮PCR在同一支试管中进行，设计引物时应考虑不同的复性温度
解析：选B。第一轮PCR中，需要先合成一条链(即诱变引物延伸的子链)，再用这条链合成互补链(大引物)，至少需要2个循环才能获得相应的大引物，A正确；第一轮产物DNA的一条链作第二轮PCR扩增的大引物，第二轮PCR仍需加入的另一种引物是侧翼引物，B错误；若要使目的基因可以表达出蛋白质，则PCR扩增的定点诱变产物上需具备启动子和终止子等结构，诱导基因转录和翻译，C正确；为了使两轮PCR反应在同一支试管中进行，引物设计时应考虑不同的复性温度，D正确。
3．为减少引物与模板之间的非特异性配对，人们对普通PCR进行了改良，发明了巢式PCR，其原理是利用两套引物进行两轮PCR扩增。首先利用第一对引物(外引物)对目的基因所在的DNA进行第一轮扩增(经过15～30次循环)，第二轮扩增以第一轮扩增产物为模板，利用第二对引物(内引物或巢式引物)结合在第一轮扩增产物内部，经过15～30次循环，获得第二轮扩增片段(即目的基因)，最终第二轮扩增片段短于第一轮，基本过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段
B．使用外引物至少经过3次循环，才能得到图示的第一轮扩增产物
C．若第一轮扩增产生错误片段，则其进入第二轮扩增的概率极低
D．与巢式PCR相比，普通PCR特异性更强，错误率更高
解析：选D。两对引物的碱基序列不相同，但均应为单链DNA片段，以便与模板互补配对，A正确；根据DNA的半保留复制的特点，可知PCR前2次循环产生的四个DNA分子的两条链均不等长，第3次循环产生的DNA分子存在等长的两条核苷酸链，即仅含引物之间的序列，因此，至少经过3次循环才能得到图示的第一轮扩增产物，B正确；由于内引物扩增模板是外引物扩增后的产物，第二轮反应能否进行，也是对第一轮反应正确性的鉴定，如果第一轮扩增产生了错误片段，那么第二轮能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，C正确；巢式PCR中加入的组分与常规PCR相同，都含有模板、引物、耐高温的DNA聚合酶、四种游离的脱氧核苷酸、缓冲液、Mg2＋等，第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此产物在内引物的存在下进行第二轮扩增，从而提高反应的特异性，获得的产物特异性更强，D错误。
4．在利用PCR扩增目的基因时，通常在引物一端添加限制酶识别序列，以便将目的基因连接到载体上。如图所示，TA克隆法可以将PCR产物直接连接到具有3′—T突出末端的载体上，这是因为普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体连接。高保真Taq DNA聚合酶可切掉PCR扩增过程中产生的错配碱基，保证扩增的准确性。
(1)PCR依据的原理是________________，该技术通常需要2种引物，引物的具体作用是_____________________________________________________
_______________________________________________________。
(2)一般情况下，利用PCR扩增目的基因时，通常在引物的________端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有________、________等。题述构建重组质粒的方法________(填“需要”或“不需要”)限制酶，________ (填“需要”或“不需要”)DNA连接酶，原因是_______________________________________________________________。
(3)高保真Taq DNA聚合酶不会使PCR扩增产物产生A尾，高保真PCR扩增后，如何加工才能进行TA克隆？____________________________________。
解析：(1)PCR依据的原理是DNA半保留复制；PCR需要引物，引物的具体作用是使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。(2)PCR扩增目的基因时在3′端开始添加脱氧核苷酸，所以通常在引物的5′端添加特定限制酶识别序列。基因工程中使用的载体除质粒外，还有噬菌体和动植物病毒等。依据题意，普通Taq DNA聚合酶具有末端连接酶的活性，可在每个PCR扩增产物的3′端自动添加一个碱基，通常为A，这样扩增产物就可以与有3′—T突出末端的载体在DNA连接酶的作用下直接连接，所以利用TA克隆法构建重组质粒不需要限制酶，需要DNA连接酶。(3)高保真Taq DNA聚合酶不会使PCR产物产生A尾，可利用普通Taq DNA聚合酶添加A尾，同时要添加dATP、缓冲液等，然后在适宜温度下延伸一段时间。
答案：(1)DNA半保留复制 使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸 (2)5′ 噬菌体 动植物病毒(顺序可颠倒) 不需要 需要 PCR扩增产物的3′端有一个碱基A，T载体有3′—T突出末端，二者可以在DNA连接酶的作用下直接连接 (3)先进行PCR产物回收，将其作为模板，再加入dATP、普通TaqDNA聚合酶等延伸一段时间eq \o(\s\up7( INCLUDEPICTURE "情境命题最前沿lll.TIF" INCLUDEPICTURE "情境命题最前沿lll.TIF" \* MERGEFORMAT ),\s\do5( 16 基因编辑技术及其应用))
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CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合， 并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是可将目的基因定点插入所需位点，避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
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1．研究发现，向导RNA能识别特殊的DNA序列，然后引导Cas9蛋白对DNA双链进行切割。据下图分析，下列叙述正确的是( )
A．向导RNA和双链DNA含有的含氮碱基不完全相同
B．虚线框内的核苷酸序列彻底水解的产物是8种核苷酸
C．Cas9蛋白不具有降低化学反应活化能的作用
D．合成Cas9蛋白的细胞结构含有磷脂分子和核酸
解析：选A。RNA含有的4种含氮碱基是A、U、G、C，DNA含有的4种含氮碱基是A、T、G、C，A正确；虚线框内的核苷酸序列包含DNA和RNA，彻底水解的产物是磷酸、核糖、脱氧核糖和含氮碱基，但两条链上不一定含有8种核苷酸，故不能确定彻底水解产物的种类数，B错误；Cas9蛋白能对DNA进行切割，说明Cas9蛋白是一种酶，而酶具有降低化学反应活化能的作用，C错误；合成Cas9蛋白的细胞结构是核糖体，核糖体含有rRNA，但核糖体没有膜结构，不含磷脂分子，D错误。
2．猪瘟病毒能与猪细胞膜上的LamR受体蛋白结合，进而侵入细胞引起猪瘟。利用基因编辑技术改变LamR受体蛋白基因，使LamR受体蛋白不能与猪瘟病毒正常结合，但不影响生理功能，从而培育出抗猪瘟病毒猪。基因编辑原理是由一条人为设计的单链向导RNA(sgRNA)引导Cas9蛋白到特定的DNA位点进行切割，从而完成对目的基因的编辑。基因编辑过程如下图所示。下列叙述错误的是( )
A．培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染
B．Cas9蛋白的功能是准确识别DNA特定序列并进行切割
C．改造后的受体细胞经培养发育到桑葚胚或囊胚时，可将其进行冷冻保存或胚胎移植
D．通过基因编辑技术改造前后的两种LamR基因是等位基因
解析：选B。培育抗猪瘟病毒猪，一般选择受精卵作为基因编辑的受体细胞，改造后的受精卵开始进行胚胎发育，这样获得的个体的所有细胞都无法被猪瘟病毒感染，A正确；根据基因编辑的原理和题图所示过程，单链向导RNA是通过碱基互补配对原则准确地识别并结合到DNA的特定位点，从而引导Cas9蛋白到达准确位置进行DNA的切割，B错误；改造后的受体细胞经培养发育到桑葚胚或囊胚时，可将其进行胚胎移植或冷冻保存，C正确；通过基因编辑技术改造后的LamR基因与改造前的基因位置相同，控制的性状不同，二者是等位基因，D正确。
3．CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA(sgRNA)引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如下图所示。回答下列问题：
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是________________________。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是________________________。
(3)过程③～⑤中，sgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是__________________。随后，Cas9蛋白可切割________________________序列。
(4)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内，将该蛋白酶基因插入基因组DNA的编辑过程：___________________________________________________
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解析：(1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶，限制酶负责切割，DNA连接酶负责连接，因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的 DNA进行酶切处理，然后将其插入经相同酶切处理过的质粒上，插入时需要的酶是DNA连接酶。(2)大肠杆菌是原核生物，属于微生物，将目的基因导入微生物细胞之前需要用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态。(3)根据题图可知，在CRISPR/Cas9基因编辑技术中，sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA，能引导Cas9蛋白切割与sgRNA配对的目标DNA序列。sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以按照碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别，进而定位；Cas9蛋白在功能上属于限制酶，可切割目标DNA特定的核苷酸序列。(4)根据题图可知，CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中。
答案：(1)DNA连接酶 (2)Ca2＋处理法 (3)碱基互补配对原则 目标DNA特定的核苷酸 (4)CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达，转录的产物是sgRNA，表达的产物是Cas9蛋白，二者形成复合体，该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，引导Cas9蛋白切割目标DNA序列，从而将该蛋白酶基因插入基因组DNA中
