(共14张PPT)
长句表达(五)基因工程类大题突破
【典例示范】 (2024·山东卷)研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。利用基因工程技术编辑基因L,可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaⅠ切点处插入大豆基因L的向导DNA序列,将载体导入大豆细胞后,其转录产物可引导核酸酶特异性结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图所示。
图甲:载体信息
图乙:目标基因L部分序列
图丙:限制酶识别序列、切割位点及电泳结果
(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时,所用的引物越短,引物特异性越 (填“高”或“低”)。限制酶在切开DNA双链时,形成的单链突出末端为黏性末端,若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,理论上可产生的黏性末端最多有 种。载体信息如图甲所示,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'- -3'和5'- -3'。
(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞,使用抗生素 筛选到具有该抗生素抗性的植株①~④。为了鉴定基因编辑是否成功,以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示,PCR产物完全酶切后的电泳结果如图丙所示。据图可判断选用的限制酶是 ,其中纯合的突变植株是 (填序号)。
低
256
GTTT
CAAT
卡那霉素
SacⅠ
④
(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株,该植株具有抗生素抗性,检测发现其体细胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代,其中突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例为 ,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
1/4
【思维模板】
1.信息获取与处理——明确向导DNA序列和目标基因序列的作用
2.问题分析与解答[第(1)小题]
若用BsaⅠ酶切大豆基因组DNA,图中给出的只是载体信息,大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测,BsaⅠ切割产生的黏性末端是NNNN,四个碱基最多可能有256种排列顺序。根据图甲所示的载体信息,在载体的碱基序列上有两个BsaⅠ的酶切位点,经BsaⅠ酶切后,载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'和5'-GTTT-3'(注意是载体上保留的黏性末端序列,也就是靠近LB和RB边界的保留,中间切下来的那段换成大豆基因L的向导DNA序列),酶切情况如图所示:
3.逻辑推理[第(2)小题]
基因L的目标序列跟突变序列只在SacⅠ酶切位点上存在差异,BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ这两个酶切位点完全相同
↓
根据图丙及题意可知,要以上述抗性植株的DNA为模板,通过PCR扩增目标基因L,并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而判断植株含有的是目标序列还是突变序列,因此只能选用限制酶SacⅠ,限制酶SacⅠ在突变序列存在酶切位点,但是目标序列没有,因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两条,目标序列是一条带,根据图丙结果可知,只有④为纯合的突变植株
4.演绎推理[第(3)小题]
根据图示可知,抗生素抗性基因在T-DNA片段上,因此如果用抗生素来筛选该植株的自交子代,根据分离定律,其配子中含有抗生素抗性基因的比例为1/2,不含T-DNA(对抗生素敏感)的配子比例为1/2,因此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4,因此,突变位点纯合且具有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4,筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。
【长句训练】
1.(2023·全国乙卷节选)GFP是水母体内存在的能发绿色荧光的一种蛋白。科研人员以GFP基因为材料,利用基因工程技术获得了能发其他颜色荧光的蛋白,丰富了荧光蛋白的颜色种类。科研人员从构建的GFP突变基因文库中提取目的基因(均为突变基因)构建表达载体。
(1)将构建好的表达载体导入大肠杆菌中进行表达,发现大肠杆菌有的发绿色荧光,有的发黄色荧光,有的不发荧光。请从密码子特点的角度分析,发绿色荧光的可能原因是 (答出1点即可)。
(2)新蛋白与突变基因的关联性分析。将上述发黄色荧光的大肠杆菌分离纯化后,对其所含的GFP突变基因进行测序,发现其碱基序列与GFP基因的不同,将该GFP突变基因命名为YFP基因(黄色荧光蛋白基因)。若要通过基因工程的方法探究YFP基因能否在真核细胞中表达,实验思路是 。
提示 (1)GFP基因虽然发生了突变,但由于存在密码的简并现象(密码子的简并性),突变基因所编码的氨基酸序列并未改变
(2)将YFP基因插入表达载体,再将构建成功的重组表达载体导入不能发黄色荧光的真核细胞中,观察黄色荧光是否出现
2.目前在PCR反应中使用Taq DNA聚合酶而不使用大肠杆菌DNA聚合酶的主要原因是 。
提示 Taq DNA聚合酶热稳定性高,而大肠杆菌DNA聚合酶在高温下会失活
3.若要使目的基因在受体细胞中表达,需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞,原因是 。
提示 目的基因无复制原点;目的基因无表达所需的启动子
4.人的T细胞可以产生某种具有临床价值的蛋白质(Y),天然的Y通常需要在低温条件下保存。假设将Y的第6位氨基酸甲改变为氨基酸乙可提高其热稳定性,若要根据蛋白质工程的原理对Y进行改造以提高其热稳定性,具体思路是 。
提示 找到第6位氨基酸对应的碱基所在的基因位置,参照密码子表,将第6位氨基酸甲的碱基替换为氨基酸乙的碱基
5.叶绿体基因工程是指向叶绿体基因组中引入外源目的基因,并使之表达。试从安全性和实用性的角度分析叶绿体基因工程的优势。
。
提示 安全性:外源基因不会随花粉扩散;实用性:其有性生殖时后代不会发生性状分离(共83张PPT)
层级二 二轮核心 精研专攻
突破点1 微生物培养与发酵
聚焦1微生物的选择培养、鉴定和计数
【链真题 明方向】
D
1.(2025·黑吉辽蒙卷)科研人员通过稀释涂布平板法筛选出高耐受且降解金霉素(C22H23ClN2O8)能力强的菌株,旨在解决金霉素过量使用所导致的环境污染问题。下列叙述错误的是( )
A.以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基
B.逐步提高培养基中金霉素的浓度有助于获得高耐受的菌株
C.配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求
D.用接种环将菌液均匀地涂布在培养基表面
解析 要筛选降解金霉素能力强的菌株,以金霉素为唯一碳源可制备选择培养基,只有能利用金霉素的菌株才能在选择培养基上生长,A项正确。逐步提高培养基中金霉素的浓度,可对菌株进行选择,有助于获得高耐受的菌株,B项正确。微生物的生长需要适宜的pH,配制选择培养基时,需确保pH满足实验要求,C项正确。用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面,接种环用于平板划线法,D项错误。
2.(2024·山东卷)酵母菌在合成色氨酸时需要3种酶X、Y和Z,trpX、trpY和trpZ分别为相应酶的编码基因突变的色氨酸依赖型突变体。已知3种酶均不能进出细胞,而色氨酸合成途径的中间产物积累到一定程度时可分泌到胞外。将这3种突变体均匀划线接种到含有少量色氨酸的培养基上,生长情况如图。据图分析,3种酶在该合成途径中的作用顺序为( )
A.X→Y→Z B.Z→Y→X
C.Y→X→Z D.Z→X→Y
A
则可以合成1、2,2突变则可合成1、3,1突变则可合成2、3。突变体3可以为培养基提供中间产物A、B,供突变体1、2利用合成色氨酸,突变体1可利用中间产物A合成色氨酸,突变体2可利用中间产物B合成色氨酸,两者竞争中间产物B,其结果为各突变体得到的色氨酸的量不同,其中突变体3>1>2,反映到菌落生长情况,突变体3优于1,1优于2,故A项符合题意。
【归纳拓展】
1.选择培养基四种常见的制备方法
(1)加入某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)
(2)改变培养基的营养成分
(3)利用培养基“特定化学成分”分离
(4)通过某些“特殊环境”分离
2.辨析两种微生物计数方法
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
原理 当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌,通过统计平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少活菌 利用特定细菌计数板或血细胞计数板,在显微镜下计算一定体积的样品中微生物的数量
比较项目 间接计数法(稀释涂布平板法) 直接计数法(显微计数法)
公式 每克样品中的菌数=C/V×M。C:某稀释度下平板上生长的平均菌落数;V:涂布平板时所用的稀释液的体积(mL);M:稀释倍数 每毫升原液所含细菌数:每小格内平均细菌数×400×104×稀释倍数
缺点 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 不能区分活菌和死菌
结果 比实际值偏小 比实际值偏大
【练模拟 拓角度】
3.双层平板法是对噬菌体进行计数的常用方法。在培养皿中倒入琼脂含量为2%的培养基凝固成底层平板后,将琼脂含量为1%的培养基熔化并冷却至45~48 ℃,然后加入敏感指示菌和待测噬菌体稀释悬液的混合液,充分混匀后立即倒入底层平板上形成双层平板。培养一段时间后,根据噬菌斑的数目可计算原液中噬菌体的数量。下列叙述错误的是( )
A.倒平板前需利用不同方法对培养基和培养皿进行灭菌
B.若利用双层平板法对T2噬菌体进行计数,可选用乳酸菌为敏感指示菌
C.上层平板中出现噬菌斑的原因是噬菌体侵染宿主细菌使其裂解死亡
D.若上层平板中琼脂浓度较低,可能形成的噬菌斑较大,有利于计数
答案 B
解析 对培养基进行灭菌常用高压蒸汽灭菌法,而对培养皿进行灭菌常用干热灭菌法,A项正确;T2噬菌体是专门寄生在大肠杆菌中的病毒,故T2噬菌体的宿主细菌是大肠杆菌,不能用其他细菌代替,B项错误;噬菌体寄生于宿主细菌内,二者混合培养一段时间后,在上层平板上出现一些噬菌斑,这是噬菌体侵染宿主细菌使其裂解死亡所致,C项正确;与底层平板相比,上层平板中琼脂浓度较低的优点是形成的噬菌斑较大,有利于计数,D项正确。
A
4.亚硒酸钠对细菌的生长有明显的毒害作用,土壤中的富硒细菌可将其还原为红色单质硒,如图为土壤中富硒细菌的筛选和纯化过程,①~⑤为相应步骤。下列相关叙述错误的是( )
A.培养富硒细菌时,培养基应调至酸性并添加维生素
B.步骤①中的培养基可进行高压蒸汽
灭菌,对吸管、培养皿等可采用干热
灭菌
C.步骤②→③采用的是稀释涂布平板
法,该方法可用于微生物分离和活菌计数
D.步骤④中可以根据菌落周围是否出现红色区域对目的菌株进行筛选
解析 培养细菌时,培养基应该调至中性或弱碱性,且培养某些细菌时(如乳酸杆菌)才需要在培养基中添加维生素,A项错误;获得纯净的微生物培养物的关键是防止杂菌污染,培养基需要灭菌但又需保持其中水分,因此可用高压蒸汽灭菌,吸管、培养皿等需要保持干燥,可用干热灭菌,B项正确;由题图可知,步骤②→③采用的是稀释涂布平板法,稀释涂布平板法可用于微生物分离和活菌计数,C项正确;富硒细菌可将亚硒酸钠还原为红色单质硒,步骤④中,如果菌落周围出现红色区域,则说明为富硒细菌,为了筛选出高效菌株,可比较单菌落周围红色区域的大小,从平板中挑取实验效果明显的目的菌株,接种于新的培养基平板,对菌株进行进一步的纯化,D项正确。
聚焦2传统发酵技术与发酵工程
【链真题 明方向】
BC
5.(不定项)(2025·山东卷)酿造某大曲白酒的过程中,微生物的主要来源有大曲和窖泥。大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物,制曲过程需经堆积培养,培养时温度可达60 ℃左右;将大曲和酿酒原料混合,初步发酵后放入窖池;窖池发酵是白酒酿造过程中微生物发酵的最后阶段。下列说法正确的是( )
A.堆积培养过程中的高温有利于筛选酿酒酵母
B.大曲中存在能分泌淀粉酶的微生物
C.窖池发酵过程中,酵母菌以无氧呼吸为主
D.窖池密封不严使酒变酸是因为乳酸含量增加
解析 堆积培养可使白酒酿造过程中糖化所需微生物增多,但不能筛选出耐高温的酿酒酵母,大曲主要提供白酒酿造过程中糖化所需的微生物,是能合成淀粉酶的微生物,所以堆积培养过程中的高温有利于筛选产淀粉酶的微生物,A项错误,B项正确。窖池发酵过程是在缺氧的环境中进行,酵母菌以无氧呼吸为主,C项正确。窖池密封不严使酒变酸是因为乙酸含量增加,D项错误。
6.(2024·山东卷)在发酵过程中,多个黑曲霉菌体常聚集成团形成菌球体,菌球体大小仅由菌体数量决定。黑曲霉利用糖类发酵产生柠檬酸时需要充足的氧。菌体内铵离子浓度升高时,可解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制。下列说法错误的是( )
A.相同菌体密度下,菌球体越大柠檬酸产生速率越慢
B.发酵中期添加一定量的硫酸铵可提高柠檬酸产量
C.发酵过程中pH下降可抑制大部分细菌的生长
D.发酵结束后,将过滤所得的固体物质进行干燥即可获得柠檬酸产品
D
解析 相同菌体密度下,菌球体越大,其中的菌体得到的氧越少,柠檬酸的产生速率越慢,A项正确;发酵中期添加一定量的硫酸铵,可使菌体内铵离子浓度升高,进而解除柠檬酸对其合成途径的反馈抑制,有利于提高柠檬酸的产量,B项正确;发酵过程中pH下降使不耐酸的细菌(适合中性或弱碱性)难以生存,可抑制大部分细菌的生长,C项正确;柠檬酸属于代谢物,不能用过滤法获取,D项错误。
【归纳拓展】
1.发酵过程中控制杂菌的措施
(1)通过发酵条件控制杂菌:①无氧发酵时的无氧环境可以抑制好氧细菌;②乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境抑制杂菌繁殖。
(2)利用盐控制杂菌:如腐乳的制作。
(3)利用酒精控制杂菌:如果酒、腐乳的制作。
2.发酵工程与传统发酵技术的区别
与传统发酵技术相比,大规模工业发酵能够通过选育菌种、控制发酵过程和分离、提纯产品等过程批量生产发酵产品。其操作流程如下:
【练模拟 拓角度】
7.(2025·黑龙江“六校联盟”联考)酸菜是我国北方的一种传统发酵制品,由新鲜白菜经乳酸菌发酵后形成。目前,我国的酸菜发酵生产工艺主要分为两种,一是传统自然发酵,二是纯种发酵法。下列关于两种发酵法的叙述错误的是( )
A.稀释涂布平板法可用于纯化乳酸菌进行纯种发酵
B.传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主
C.用两种工艺制作酸菜时,白菜都相当于微生物生长的培养基
D.用两种工艺制作酸菜时,都需要对缸体、盐水等进行严格灭菌
D
解析 稀释涂布平板法可用于微生物纯化培养,因而可用于纯化乳酸菌进行纯种发酵,A项正确。传统发酵以混合菌种的固体发酵及半固体发酵为主,通常是家庭式或作坊式的,B项正确。用两种工艺制作酸菜时,白菜都相当于微生物生长的培养基,为微生物的生长提供营养物质,C项正确。用传统自然发酵工艺制作酸菜时,不需要对缸体、盐水等进行严格灭菌,纯种发酵法需要对缸体、盐水等进行严格灭菌,D项错误。
8.某企业通过发酵制作酱油的流程示意图如下。米曲霉为异养好氧型微生物,能产生制作酱油过程所需的酶类,能将发酵池中的蛋白质和脂肪分解成易于吸收、风味独特的成分。乳酸菌是促进其风味物质形成的重要微生物,它可以生成乳酸等小分子有机酸,进而与酵母菌产生的醇类生成酯类呈香物质,增加酱油香气。
下列叙述正确的是( )
A.大豆中的蛋白质可为米曲霉的生长提供碳源,小麦中的淀粉可为米曲霉的生长提供氮源
B.实验室制备米曲霉分离纯化培养基时,先进行干热灭菌,再调节pH最后分装到培养皿
C.实验室纯化培养米曲霉时应用涂布器从盛有菌液的试管中蘸取菌液均匀涂布于平板
D.发酵池发酵阶段应密封发酵,该阶段可以抑制杂菌生长的物质有乳酸、酒精和食盐
D
解析 淀粉不含氮元素,只能提供碳源,不能提供氮源,A项错误;制备微生物培养基时应先调pH再用高压蒸汽灭菌法灭菌,B项错误;用稀释涂布平板法进行纯化培养时,应该用微量移液器从盛有菌液的试管中取0.1 mL菌液,再用涂布器涂布,C项错误;乳酸、酒精、食盐都能起到抑制杂菌的作用,D项正确。
突破点2 比较植物细胞工程和动物细胞工程
聚焦1植物组织培养和动物细胞培养
【链真题 明方向】
A
1.(2025·黑吉辽蒙卷)利用植物组织培养技术获得红豆杉试管苗,有助于解决紫杉醇药源短缺问题。下列叙述正确的是( )
A.细胞分裂素和生长素的比例会影响愈伤组织的形成
B.培养基先分装到锥形瓶,封口后用干热灭菌法灭菌
C.芽原基细胞由于基因选择性表达,不能用作外植体
D.紫杉醇不能通过细胞产物的工厂化生产来获取,植物组织培养优势明显
解析 植物组织培养中,细胞分裂素和生长素的比例会影响植物细胞的发育方向,包括脱分化形成愈伤组织的过程,A项正确。培养基分装封口后常用高压蒸汽灭菌法灭菌,干热灭菌法适用于耐高温和需要保持干燥的物品,B项错误。芽原基细胞具有全能性,可作为外植体,C项错误。紫杉醇可通过培养红豆杉细胞进行细胞产物的工厂化生产来获取,D项错误。
2.(2024·黑吉辽卷)迷迭香酸具有多种药理活性。进行工厂化生产时,先诱导外植体形成愈伤组织,再进行细胞悬浮培养获得迷迭香酸,加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量。下列叙述错误的是( )
A.迷迭香顶端幼嫩的茎段适合用作外植体
B.诱导愈伤组织时需加入NAA和脱落酸
C.悬浮培养时需将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团
D.茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢物的合成速率
B
解析 顶端幼嫩的茎再生能力强,病毒少,甚至无病毒,适合用作外植体,A项正确。诱导愈伤组织时需加入生长素和细胞分裂素,不需要脱落酸,B项错误。悬浮培养时将愈伤组织打散成单个细胞或较小的细胞团可增大细胞与培养液的接触面积,获得更多的氧气和营养物质,以利于其进一步分裂,C项正确。迷迭香酸是迷迭香的次生代谢物,由题意可知,加入诱导剂茉莉酸甲酯可大幅提高产量,由此推测茉莉酸甲酯改变了迷迭香次生代谢物的合成速率,D项正确。
D
3.(2024·黑吉辽卷)从小鼠胚胎中分离获取胚胎成纤维细胞进行贴壁培养,在传代后的不同时间点检测细胞数目,结果如下图。下列叙述正确的是
( )
A.传代培养时,培养皿需密封防止污染
B.选取①的细胞进行传代培养比②更合理
C.直接用离心法收集细胞进行传代培养
D.细胞增长进入平台期可能与细胞密度过大有关
解析 动物细胞培养需要的条件有无菌、无毒的环境、营养物质、适宜的温度和pH、95%空气和5% CO2的混合气体环境,因此不能将培养皿密封,A项错误。处于指数增长期的细胞形态和生理特性相对稳定,适合进行传代培养。离体培养的细胞生命力比较脆弱,需要适应培养基的环境,原代培养的贴壁细胞最好在达到生长基质的80%表面积后进行传代培养,选取②的细胞进行传代培养比①更合理,B项错误。在进行传代培养时,贴壁细胞需要重新用胰蛋白酶等处理,使之分散成单个细胞,再用离心法收集,C项错误。细胞增长进入平台期,可能是因为细胞密度过大,有害代谢物积累,培养液中营养物质缺乏,发生接触抑制,D项正确。
【归纳拓展】
比较植物组织培养与动物细胞培养
项目 植物组织培养 动物细胞培养
取材 植物幼嫩部位 动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官、组织
过程
项目 植物组织培养 动物细胞培养
结果 获得植株个体,可以体现全能性 获得新的细胞,不能形成个体,不能体现全能性
条件 ①无菌 ②营养物质 ③适宜条件 ④植物激素 ①无菌、无毒的环境
②营养物质(血清等)
③适宜温度、pH和渗透压
④气体环境:95%空气和5%CO2
【练模拟 拓角度】
4.某科学小组探索长寿花组织培养过程中外植体的消毒条件,实验结果如下表所示。下列分析不正确的是( )
5%次氯酸钠溶液处理时间/min 8 10 12 70%酒精处理时间/s 20 30 40 20 30 40 20 30 40
污染率/% 25.6 21.1 13.3 22.2 16.7 12.2 20 17.8 8.9
褐化率/% 0 0 8.9 0 5.6 14.4 7.8 16.7 16.7
注:褐化是指培养材料在组织培养过程中向培养基中释放褐色物质并变褐死亡的现象。
A.消毒处理时间越长,组织培养成功率越高
B.消毒处理时间越长,外植体的污染率越低
C.诱导培养外植体脱分化为愈伤组织的过程中一般不需要光照
D.组织培养过程中提高生长素与细胞分裂素的比例有助于生根
答案 A
解析 由表格信息可知,消毒处理时间越长褐化率越高,死亡率越高,组织培养成功率越低,A项错误;表中数据显示消毒处理时间越长外植体的污染率越低,B项正确;诱导愈伤组织形成过程中一般不需要光照,因为光可以诱导产生维管组织,不利于愈伤组织形成,C项正确;生长素和细胞分裂素的比值大时有利于根的形成,因此提高生长素与细胞分裂素的比例有助于生根,D项正确。
聚焦2植物体细胞杂交和动物细胞融合
【链真题 明方向】
5.(不定项)(2025·黑吉辽蒙卷)下图是制备抗白细胞介素-6(IL-6)单克隆抗体的示意图。下列叙述错误的是( )
A.步骤①给小鼠注射IL-6后,应
从脾中分离筛选T淋巴细胞
B.步骤②在脾组织中加入胃蛋
白酶,制成单细胞悬液
C.步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合,体现了细胞膜的流动性
D.步骤④经过克隆化培养和抗体检测筛选出了杂交瘤细胞
ABD
解析 步骤①给小鼠注射IL-6后,应从脾中分离筛选B淋巴细胞,A项错误。步骤②在脾组织中加入胰蛋白酶或胶原蛋白酶,制成单细胞悬液,B项错误。步骤③加入灭活病毒或PEG诱导细胞融合,体现了细胞膜的流动性,C项正确。步骤④用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞,步骤⑤经过克隆化培养和抗体检测筛选出了能产生特定抗体的杂交瘤细胞,D项错误。
6.(2025·湖北卷)利用犬肾细胞MDCK扩增流感病毒,生产流感疫苗,具有标准化、产量高等优点。但MDCK细胞贴壁生长的特性不利于生产规模的扩大,严重制约疫苗的生产效率。研究人员通过筛选,成功获得一种无成瘤性的(多代培养不会癌变)、可悬浮培养的MDCK细胞——XF06。下列叙述错误的是( )
A.XF06悬浮培养可提高细胞密度,进而提升生产效率
B.细胞贴壁生长特性的改变是由于流感病毒感染所导致
C.可采用离心技术从感染病毒的细胞裂解液中分离出流感病毒
D.采用无成瘤性细胞生产疫苗,是为了避免疫苗中有致瘤DNA的污染
B
解析 悬浮培养允许细胞在生物反应器中自由生长,无需贴附表面,可显著提高XF06的密度,从而提高疫苗生产效率,A项正确。根据题干信息可知,XF06的悬浮培养特性是通过筛选获得的遗传改变,而非流感病毒感染所致,B项错误。在疫苗生产中,感染病毒的细胞需裂解释放病毒,离心技术(如差速离心或密度梯度离心)是标准方法,用于分离和纯化流感病毒颗粒,去除细胞碎片等杂质,C项正确。成瘤性细胞可能含有致癌基因或病毒DNA,若污染疫苗,存在潜在安全风险,XF06无成瘤性(多代培养不癌变),可减少疫苗中致瘤DNA污染的可能性,D项正确。
C
7.(2025·陕晋宁青卷)科研人员通过对绵羊受精卵进行基因编辑和胚胎移植等操作,获得了羊毛长度显著长于对照组的优良品系。下列叙述错误的是( )
A.为获取足够的卵子,需对供体绵羊注射促性腺激素进行超数排卵处理
B.为确保受体绵羊与供体绵羊生理状态一致,需进行同期发情处理
C.受精卵发育至桑葚胚阶段,细胞数量和胚胎总体积均增加
D.对照组绵羊的选择需考虑年龄、性别等无关变量的影响
解析 胚胎移植过程中通过对优良供体母畜注射促性腺激素,使其超数排卵,从而获取足够的卵子,A项正确。为确保早期胚胎移植后供体和受体处于相同的生理状态,需要对供体和受体进行同期发情处理,B项正确。受精卵发育至桑葚胚阶段,细胞数量增加,但胚胎总体积并不增加,C项错误。对照实验中无关变量应保持相同且适宜,所以对照组绵羊的选择应考虑年龄、性别等的影响,D项正确。
【归纳拓展】
比较植物体细胞杂交与动物细胞融合
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
原理 细胞膜的流动性、植物细胞的全能性 细胞膜的流动性
过程
项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合
相关酶 纤维素酶和果胶酶 胰蛋白酶或胶原蛋白酶
融合方法 物理法:电融合法、离心法等;化学法:PEG融合法、高Ca2+—高pH融合法等 PEG融合法、电融合法和灭活病毒诱导法等
结果 杂种植株 杂交细胞
【练模拟 拓角度】
B
8.(2024·湖北卷)糖尿病是危害人类健康的主要疾病之一。恢复功能性胰岛B细胞总量是治疗糖尿病的重要策略。我国学者研究发现,向患有糖尿病的小鼠注射胰高血糖素受体单克隆抗体(mAb),可以促进胰岛A细胞增殖,诱导少数胰岛A细胞向胰岛B细胞转化,促进功能性胰岛B细胞再生。根据上述实验结果,下列叙述错误的是( )
A.mAb的制备可能涉及细胞融合技术
B.注射mAb可降低胰腺分泌胰高血糖素的量
C.mAb和胰高血糖素均能与胰高血糖素受体特异性结合
D.胰高血糖素主要通过促进肝糖原分解和非糖物质转化为糖,升高血糖水平
解析 动物细胞融合技术的主要应用是制备单克隆抗体,A项正确;注射mAb可促进胰岛A细胞增殖,所以不会降低胰腺分泌胰高血糖素的量,B 项错误;mAb是胰高血糖素受体的单克隆抗体,所以mAb和胰高血糖素均能与胰高血糖素受体特异性结合,C 项正确;胰高血糖素主要通过促进肝糖原分解和非糖物质转化为糖,从而升高血糖,D项正确。
9.(2024·重庆九龙坡模拟)图1为单克隆抗体的制备原理和方法,这样制得的抗体为鼠源性抗体,图2为鼠、人抗体基因示意图。下列叙述错误的是
( )
图1
图2
A.图1获得的杂交瘤细胞的特点是既能迅速大量增殖,又能产生特异性抗体
B.细胞培养时除特殊营养成分外,还需提供95%空气和5% CO2的气体条件
C.图1获得单克隆抗体过程中,需要进行克隆化培养和抗体检测
D.将图2中的A和D连接进行基因改造可以降低鼠源抗体的免疫原性
D
解析 杂交瘤细胞既具有B细胞的特点又具有骨髓瘤细胞的特点,即既能无限增殖又能产生特异性抗体,A项正确;动物细胞培养时除特殊营养成分外,还需提供95%空气和5% CO2的气体条件,B项正确;对细胞进行克隆化培养后通过抗原—抗体杂交技术进行抗体检测,才能确认是所需抗体,C项正确;为降低鼠源抗体的免疫原性,进行基因改造时,应该把图2中的C和B进行连接,D项错误。
突破点3 表达载体的构建及基因编辑技术
聚焦1限制酶的选取与基因表达载体的构建
【链真题 明方向】
1.(不定项)(2025·江苏卷)图示人体正常基因A突变为致病基因a及Hind Ⅲ切割位点。AluⅠ限制酶识别序列及切割位点为 ,下列相关叙述正确的有( )
A.基因A突变为a是一种碱基增添的突变
B.用两种限制酶分别酶切A基因后,形成的末端类型不同
C.用两种限制酶分别酶切a基因后,产生的片段大小一致
D.产前诊断时,该致病基因可选用HindⅢ限制酶开展酶切鉴定
答案 BD
解析 基因A突变为致病基因a是由碱基对T—A被G—C替换造成的,A项错误。用Hind Ⅲ限制酶酶切A基因后会形成黏性末端,用AluⅠ限制酶酶切A基因后,形成的是平末端,B项正确。用AluⅠ限制酶切割a基因有3个酶切位点,而Hind Ⅲ酶切位点只有2个,所以两种限制酶分别酶切a基因产生的片段大小不同,C项错误。用Hind Ⅲ限制酶对基因a进行酶切,产生的片段与对基因A的酶切结果不同,通过电泳显示可以进行鉴定诊断,D项正确。
2. (2023·湖北卷)用氨苄青霉素抗性基因(AmpR)、四环素抗性基因(TetR)作为标记基因构建的质粒如图所示。用含有目的基因的DNA片段和用不同限制酶酶切后的质粒,构建基因表达载体(重组质粒),并转化到受体菌中。下列叙述错误的是( )
A.若用HindⅢ酶切,目的基因转录的产物可能不同
B.若用PvuⅠ酶切,在含Tet(四环素)培养基中的菌
落,不一定含有目的基因
C.若用SphⅠ酶切,可通过DNA凝胶电泳技术鉴定重组质粒构建成功与否
D.若用SphⅠ酶切,携带目的基因的受体菌在含Amp(氨苄青霉素)和Tet的培养基中能形成菌落
D
解析 用一种限制酶切割,目的基因在质粒上可以正向或反向插入,进而导致基因转录产物的不同,A项正确。用一种限制酶切割后,质粒有可能发生自身环化,导致目的基因未能插入,B项正确。SphⅠ酶切会在重组质粒上产生特定的片段,通过DNA凝胶电泳技术可以分离和检测这些片段,从而确定重组质粒是否构建成功,C项正确。根据质粒图示,携带目的基因的受体菌需要同时具有AmpR和TetR基因才能在含有氨苄青霉素和四环素的培养基中形成菌落,若用SphⅠ酶切,会破坏四环素抗性基因(TetR),D项错误。
【归纳拓展】
1.限制酶的选择技巧
(1)根据目的基因两端的限制酶切点选择限制酶
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶,不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择SmaⅠ。
②为避免目的基因和质粒的自身环化和反向连接,也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒,如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点,如图乙)
(2)根据质粒的特点选择限制酶(如图)
2.基因表达载体的构建过程
【练模拟 拓角度】
3.(不定项)自然界中很少出现蓝色的花,天然蓝色花产生的主要原因是花瓣细胞液泡中花青素在碱性条件下显蓝色。我国科学家利用链霉菌的靛蓝合成酶基因(idgS)及其激活基因(sfp)构建基因表达载体(如下图所示),通过农杆菌转化法导入白玫瑰中,在细胞质基质中形成稳定显色的靛蓝。
注:PmeⅠ、BamHⅠ、SpeⅠ、SacⅠ为不同限制酶。
下列说法不正确的是( )
A.上述获得蓝色玫瑰的方案中需转入能调控液泡pH的基因
B.将sfp基因插入Ti质粒时使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ
C.sfp和idgS基因表达时分别以T-DNA的不同链为模板进行转录
D.农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰细胞质基因组中防止基因扩散
ABD
解析 靛蓝能够稳定显色,不受pH的影响,故本题方案中无需转入能调控液泡pH的基因,A项错误;结合图示可知,将sfp基因插入Ti质粒时若使用的限制酶是PmeⅠ和BamHⅠ,则会将终止子一同切除,故只能用BamHⅠ,B项错误;sfp和idgS基因具有各自的启动子,表达是相互独立进行的,转录是以DNA的一条链为模板进行的,由启动子方向可知,两基因转录的模板不同,C项正确;农杆菌可将Ti质粒上的T-DNA整合到白玫瑰染色体DNA上,D项错误。
4.人乳铁蛋白广泛分布于乳汁等外分泌液中,在初乳中含量较高,对细菌、真菌和病毒等有抑制作用。下图表示利用基因工程技术构建人乳铁蛋白基因重组质粒的过程(图中Tetr表示四环素抗性基因,Ampr表示氨苄青霉素抗性基因),五种限制酶的识别序列及切割位点如下表所示。回答下列问题。
限制酶 BamHⅠ Hae Ⅲ
识别序列 及切割位点
限制酶 BclⅠ Sau3AⅠ
识别序列 及切割位点
限制酶 NotⅠ —
识别序列 及切割位点 —
2
(1)要将人乳铁蛋白基因插入载体中,若只允许使用一种限制酶,应选择的限制酶是 。基因工程技术中通常选择 种限制酶进行酶切。
(2)人乳铁蛋白基因可利用PCR技术进行扩增,扩增需要引物 (在“Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ”中选择),连续扩增5次后至少需要引物 个。
(3)据图分析,成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒需要在含有
(填“四环素”或“氨苄青霉素”)的培养基上进行筛选,然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵,再利用 工程技术获得转基因小牛。
Sau3AⅠ
Ⅱ、Ⅲ
62
氨苄青霉素
胚胎
抗原—抗体杂交
(4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用 技术,若 ,则表明目的基因已翻译形成蛋白质。
(5)对比大肠杆菌,转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势,其理由是_______________________________________________________
。
检测结果呈阳性
转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器,能够对人乳铁蛋白进行加工,使人乳铁蛋白具有生物活性
解析 (1)根据表中五种限制酶的识别序列及切割位点可知,Sau3AⅠ切割形成的黏性末端与BclⅠ和BamHⅠ切割形成的黏性末端相同,因此要将人乳铁蛋白基因插入载体中,若只允许使用一种限制酶,应选择的限制酶是Sau3AⅠ。为了避免目的基因和质粒自身环化和反向连接,基因工程技术中通常选择2种限制酶进行酶切,以形成不同的黏性末端。
(2)引物的作用是使耐高温的DNA聚合酶从引物的3'端连接游离的脱氧核苷酸,所以引物5'端应该与模板链的3'端配对,故应选择引物Ⅱ、Ⅲ,连续扩增5次后至少需要引物为(25-1)×2=62(个)。
(3)据图分析,成功获得含有人乳铁蛋白基因的重组质粒含有氨苄青霉素抗性基因,需要在含有氨苄青霉素的培养基上筛选,然后将需要的重组质粒导入牛的受精卵,再利用胚胎工程技术获得转基因小牛。
(4)检测人乳铁蛋白基因是否成功翻译常采用抗原—抗体杂交技术,若检测结果呈阳性,则表明目的基因已翻译形成蛋白质。
(5)对比大肠杆菌,转基因动物作为生物反应器生产人乳铁蛋白更具有优势,其理由是转基因动物细胞具有内质网和高尔基体等细胞器,能够对人乳铁蛋白进行加工,使人乳铁蛋白具有生物活性。
聚焦2基因编辑技术及其应用
【链真题 明方向】
5.(2021·海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术,Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”,在单链向导RNA(sgRNA)引导下,切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中,为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是 。
(2)过程②中,将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是 。
(3)过程③~⑤中,sgRNA与Cas9蛋白形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,二者结合所遵循的原则是
。随后,Cas9蛋白可切割 序列。
DNA连接酶
感受态细胞法
碱基互补配对原则
目标DNA特定的核苷酸
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1 200 bp的基因,在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是 ,基因敲除成功的判断依据是 。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒,随后将其导入大肠杆菌细胞,通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中,构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。据图简述CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内,将该蛋白酶基因插入到基因组DNA的编辑过程:_____________________________ ____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
DNA分子杂交技术
不出现杂交带
CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中
解析 (1)基因工程所需的工具酶有限制酶和DNA连接酶,限制酶负责切割,DNA连接酶负责连接,因此为构建CRISPR/Cas9重组质粒,需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理,然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上,插入时所需要的酶是DNA连接酶。
(2)大肠杆菌是原核生物,属于微生物,将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
(3)根据题意可知,在CRISPR/Cas9基因编辑技术中,sgRNA是根据靶基因设计的向导RNA,能准确引导Cas9切割与sgRNA配对的靶基因DNA序列。Cas9能借助sgRNA分子与目标DNA进行特异性结合的原因在于sgRNA分子上的碱基序列与目标DNA分子上的碱基序列可以通过碱基互补配对原则实现sgRNA与目标DNA特定序列的特定识别,进而定位;由此可见,Cas9在功能上属于限制酶,可切割目标DNA特定的核苷酸序列。
(4)可利用DNA分子杂交技术判断基因敲除是否成功,若不出现杂交带,则说明基因敲除成功。
(5)根据图示可知:CRISPR/Cas9重组质粒在受体细胞内进行转录和表达,转录的产物是sgRNA,表达的产物是Cas9蛋白,二者形成复合体,该复合体中的sgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合,从而将该蛋白酶基因插入到基因组DNA中。
【情境拓展】
CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑,其原理是由一条单链向导RNA(sgRNA)引导核酸内切酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的sgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定的碱基序列互补,从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合,并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物,与传统的基因工程相比,其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
【命题设计】
(1)从功能上来看,CRISPR/Cas9系统相当于基因工程中的限制性内切核酸酶,该系统广泛存在于细菌中,其在细菌中的作用是___________________ ______________________________________________________________________________。
(2)CRISPR/Cas9基因编辑技术有时存在编辑对象出错而“脱靶”的现象,sgRNA的识别序列越短,基因编辑的脱靶率就越高。请分析原因。
_____________________________________________________________。
切割外源DNA,使之失效,起到保护自身的目的(或抵抗外源DNA的入侵,保护自身或清除入侵病毒DNA)
sgRNA的识别序列短,特异性差,容易与其他DNA片段结合造成编辑出错
【练模拟 拓角度】
6.CRISPR-Cas系统包含CRISPR基因和Cas基因(CRISPR关联基因)两部分,其中CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列,当病毒入侵后,某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR,Cas基因则位于CRISPR基因附近或分散于基因组其他地方,该基因编码的蛋白均可与CRISPR序列区域共同发生作用,CRISPR-Cas系统的组成如图所示,现在CRISPR-Cas9(由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成)已发展成为对靶向基因进行特定修饰的第三代基因编辑技术。下列相关描述错误的是( )
A.CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用
B.该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化
C.内切核酸酶Cas9具有专一性
D.CRISPR基因经过转录、翻译之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割
答案 D
解析 由于CRISPR-Cas9基因编辑技术可以对特定位点进行编辑,因此CRISPR-Cas系统在基因编辑过程中起到限制酶的作用,内切核酸酶Cas9具有专一性,能使特定部位的磷酸二酯键断开,A、C两项正确;CRISPR-Cas系统中的CRISPR是细菌等原核生物基因组内的一段重复序列,当病毒入侵后,某些细菌能够把病毒基因的一小段存储到CRISPR,当病毒再次入侵细胞的时候起到免疫作用,这是细菌与病毒协同进化的结果,该实例说明寄生物与寄主之间存在协同进化,B项正确;CRISPR-Cas9是由一条单链向导RNA和内切核酸酶Cas9组成的,即CRISPR基因经过转录之后可以与内切核酸酶Cas9对目的基因进行切割,D项错误。
7.CRISPR/Cas9基因编辑技术是将编码Cas9酶和sgRNA的基因作为目的基因,构建基因表达载体后导入受体细胞,可对细胞内某个基因定点切割,引发被切割部位的随机突变(图1)。科研人员在CRISPR/Cas9编辑系统基础上开发了CBE单碱基编辑系统,该系统由三个元件构成,其中“dCas9蛋白+脱氨酶”在sgRNA的引导下,对结合区域第4~8位点的碱基C脱氨反应变成U,最终实现C→T的不可逆编辑,不需要DNA链断裂(如图2)。请回答下列问题。
图1
图2
(1)图1中Cas9酶作用于DNA某特定部位的 键。CRISPR/Cas9编辑系统能特异性识别某段特定DNA序列的原理是依靠 与特定DNA序列进行 。
磷酸二酯
sgRNA
碱基互补配对
(2)CBE单碱基编辑系统将靶位点胞嘧啶脱氨基后,细胞复制 次,子代DNA中靶位点碱基对由C—G彻底替换成 ,实现单碱基编辑。
(3)基因编辑可能造成非目标序列的碱基改变,称为脱靶。图3是我国科研工作者建立的一种脱靶检测技术。在小鼠受精卵分裂到2细胞期,编辑其中1个细胞,并使用红色荧光蛋白将其标记。当小鼠胚胎发育到14.5 d时,将整个小鼠胚胎消化成为单细胞,再利用细胞分选技术,进行全基因组测序,比较两组差异。
图3
2
T—A
①小鼠受精卵可以从雌鼠 中采集或通过 技术获得。当小鼠胚胎发育到14.5 d时,将整个小鼠胚胎先用 处理,分散成单细胞再进行分选。
②图3中的标记基因的作用是 。
③在该实验中,没有编辑的那个细胞发育出的细胞的作用是 。经检测,如果两种细胞之间存在基因组碱基序列上的差异,这种差异就是
引起的。与用同一品系小鼠不同受精卵进行脱靶检测相比,上述脱靶检测技术更加精准,这是因为__________________________
。
输卵管
体外受精
胰蛋白酶
分选被编辑细胞与未编辑细胞的后代
对照
基因编辑工具
来自同一受精卵的细胞基因
(组)相同
解析 (1)脱氧核苷酸通过磷酸二酯键连接,Cas9酶可以水解该键。CRISPR/Cas9编辑系统能特异性识别某段特定DNA序列的原理是依靠sgRNA与特定DNA序列进行碱基互补配对。
(2)根据题意,CBE单碱基编辑系统能将靶位点的胞嘧啶C脱氨基成尿嘧啶U,第一次复制后的2个子代DNA中,相应位置的碱基对分别是G—C和U—A,再经过第二次复制,得到的4个子代DNA中相应位置的碱基对分别是G—C、C—G、U—A和A—T,所以复制2次后,子代DNA中靶位点碱基对由C—G彻底替换成T—A。
(3)①受精作用发生在输卵管,小鼠受精卵可以从雌鼠输卵管中采集或通过体外受精技术获得。可用胰蛋白酶将整个小鼠胚胎分散成单细胞。②脱靶检测过程中标记基因的作用是分选被编辑细胞与未编辑细胞的后代。③在该实验中,没有编辑的那个细胞发育出的细胞起到对照作用。如果两种细胞之间存在基因组碱基序列上的差异,这种差异就是基因编辑工具进行基因编辑引起的。若是用同一品系小鼠不同受精卵进行脱靶检测,不同小鼠受精卵的基因会不同,有可能对实验结果造成影响。(共24张PPT)
层级三 素养整合 诠释应用
素养 科学思维与科学探究——PCR技术及应用
【素养提炼】
1.重叠延伸PCR技术
重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸,将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的技术。这项技术目前主要有两个应用方向:基因定点突变;构建融合基因。
【例1】 重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术,其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(如图中的引物2和3,突起处代表与模板链不能互补的突变位点),分别进行PCR,获得有重叠链的两种DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图所示。
(1)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为 才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为 (假设引物为单链DNA)。
T—A或C—G
A或G
(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中,引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,共产生____ 种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为_________________________________________________________
。
(3)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起,设计基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时,特别要注意的问题是
_____________________________________________________________。
3
引物2和3中存在互补配对片段,置于同一反应系统时它们会发生结合而失去作用
M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段
【归纳总结】
(1)基因定点突变,该技术要使用四种引物。考查内容可涉及与突变位点配对的引物设计情况、两个阶段引物的选择、扩增体系及产物等。解答此技术相关问题时可结合题图依据以下原则:引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点,而这两条引物有部分碱基(包括突变位点)是可以互补的。因此,分别利用引物1和2、引物3和4进行PCR后,得到的DNA片段可以通过引物2和3互补的碱基杂交在一起,再在DNA聚合酶的作用下延伸,就能成为一条完整的DNA片段。最后,用引物1和4进行扩增得到含有突变位点的DNA片段。通过测序可以检验定点突变是否成功。
(2)构建融合基因,重叠延伸PCR还可以用于两个或两个以上异源基因DNA片段的拼接。引物上含
有末端互补序列,通过PCR产生的两个DNA片段可通过引物延伸进行剪接和扩增,从而获得重组体,与定点突变不同的是待融合基因的PCR产物来自两个不同的基因,通过引物在两种PCR产物中产生互相重叠的链而获得融合基因。
2.反向PCR技术
反向PCR技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。
【例2】反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是( )
注:引物分别与临近的DNA链互补配对。
A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增
B.设计的引物中G、C碱基含量越高,复性的温度越低
C.PCR产物是包含所有已知序列和未知序列的环状DNA分子
D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶
答案 A
【归纳总结】
当DNA的某些序列已知,而需要扩增已知序列两端的未知序列时,可采用反向PCR技术,反向PCR技术所依据的原理是:用限制性内切核酸酶切割该DNA,随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化,这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物,该引物对已知序列反向,但对未知序列却是相向的,从而得以扩增出未知序列。如下图所示:
3.不对称PCR
正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物,那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫作不对称PCR。
【例3】研究人员常用DNA分子杂交技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上,检测时用 标记的目的基因单链片段作为探针。不对称PCR能够大量制备单链DNA片段,其基本原理是采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物,结果获得大量单链DNA(ss-DNA)。若反应体系中原有100个模板DNA,最初10个循环后限制性引物耗尽,再进行20个循环,理论上可制备ss-DNA (用科学计数法表示),在这30个循环中ss-DNA的产生量主要受
的影响。
放射性同位素
2.048×106
限制性引物和非限制性引物的比例
【归纳总结】
不对称PCR主要只扩增一条模板链,实际操作时,为了增加模板量,也可以加入一对引物,只是两条引物在浓度上应存在差异。如此题经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物。此技术可制备单链DNA片段用于序列分析或核酸杂交的探针。
4.实时荧光定量RT-PCR
实时荧光定量RT-PCR主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,实时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录。在RT-PCR中,通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。
【例4】“实时荧光定量RT-PCR”是一种用于实时扩增和检测特定DNA或RNA序列的分子生物学技术。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针(如图1),其5'端连接荧光基团(R),3'端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时,R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中,当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题。
图1
图2
(1)这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点,主要与试剂盒中的 、 有关。
(2)在实时荧光定量RT-PCR过程中,通过荧光强度的变化监测产生量的变化从而得到一条荧光扩增曲线图(如图3)。最初数个循环里,荧光信号变化不大,设置为基线;之后进入指数扩增期,在这个时期设置一个荧光阈值线;Ct值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则Ct值越小,起始模板量越 ,从而实现对起始模板的相对定量分析。若每分子探针水解释放的R基团荧光强度为定值a,则反应体系中某时刻荧光信号强度(Rn)主要与 、
有关。
引物
TaqMan探针
多
扩增次数
病毒RNA初始数量
图3
【归纳总结】
荧光定量PCR可用于病毒核酸检测,其优点:早期诊断、灵敏度和特异性高,是判断是否感染某病毒的直接证据。基本原理是将病毒RNA逆转录为DNA,通过采用实时荧光定量RT-PCR技术进行检测,因此荧光PCR法所用的试剂盒中通常都应该含有逆转录酶、热稳定性DNA聚合酶(Taq酶)、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+、缓冲剂等。试剂盒中的引物和TaqMan探针决定了这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和高灵敏性。结合图示可以看出,在PCR扩增过程中,Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R,因此,扩增次数越多,样品中病毒初始数量(病毒样品模板RNA含量)越多,则被水解的探针越多,释放出游离的R多,反应体系
中某时刻荧光信号强度(Rn)也越强。由图可知,随着PCR的进行,反应产物不断累积,“杂交双链”荧光信号的强度也等比例增加,超出一定的循环数后,荧光标记的“杂交双链”不再增加,其原因最可能是试剂盒中原料、引物和探针数量、Taq酶活性等有限。图中Ct值是PCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,则Ct值越小,起始模板量越多。
5.巢式PCR
【例5】巢式PCR是指先后用外、内引物扩增目的基因的方法。其原理为:先以比目的基因大的DNA片段为模板,用一对外引物进行扩增,获得大量含目的基因的中间产物,再以扩增后的中间产物为模板,用一对内引物扩增目的基因,如图所示。下列说法错误的是( )
巢式PCR工作原理示意图
A.PCR反应缓冲液中Mg2+的作用是激活DNA聚合酶
B.与传统PCR相比,巢式PCR能有效提高产物中目的基因的比例
C.由于和两套引物都互补的靶序列较少,该技术可大大提高扩增的特异性
D.如果两套引物一起加入反应体系中,外引物的复性温度应显著低于内引物
答案 D
【归纳总结】
巢式PCR共使用了两对引物,进行了两轮PCR,第二次扩增可以减少或排除第一次扩增中出现的非特异性产物,所以该操作可以提高PCR的特异性和灵敏度,可用于极少量DNA模板的扩增。巢式PCR两次扩增所用的引物是不同的,因此两个阶段反应一般不在同一试管完成,如果两套引物一起加入反应体系中,外引物复性温度要明显高于内引物,使外引物先进行反应。(共44张PPT)
层级一 主干知识 自主落实
【单元网络构建】
醋酸菌
巴氏消毒法
湿热灭菌法
碳源、氮源、水、无机盐等
稀释涂布平板法
植物细胞的全能性
细胞增殖
细胞膜的流动性
动物细胞核的全能性
获能
桑葚胚期、囊胚期
将内细胞团均等分割
DNA连接酶
基因表达载体的构建
基因
考点1 发酵工程
【把脉高考】 传统发酵技术和发酵工程主要包括利用传统发酵技术制作泡菜、果酒和果醋;利用发酵工程进行啤酒的生产;发酵工程在食品工业、医药工业和农牧业等领域中的应用等内容。微生物的培养技术及应用是高频考点,考查点主要包括无菌技术、培养基的配制、微生物的接种方法、微生物的纯培养等。试题情境常涉及生活、生产实践和环境治理,渗透科学实验与探究。
三年 高考 2025 黑吉辽蒙卷T4,湖南卷T5,山东卷T15、T20,河北卷T18,安徽卷T15
2024 湖南卷T6,湖北卷T1,山东卷T14、T15
2023 山东卷T12、T15、T20,浙江1月T19,广东卷T10,江苏卷T7、T16
串联整合
1.厘清四种传统发酵食品的制作技术
2.图解发酵工程的基本环节
3.掌握微生物培养中的无菌技术
4.比较两种纯化细菌的方法
5.明确微生物分离与计数的两个实例
对标高考
1.判断——传统发酵技术和发酵工程
(1)(2023·北京卷)向泡菜坛盖边沿的水槽中注满水形成内部无菌环境。
( × )
(2)(2022·山东卷)啤酒的工业化生产中,大麦经发芽、焙烤、碾磨、糖化、蒸煮、发酵、消毒等工序后,最终过滤、调节、分装。其中焙烤是为了利用高温杀死大麦种子的胚并进行灭菌。( × )
(3)(2022·山东卷)选育出的高产菌株经扩大培养后才可接种到发酵罐中。
( √ )
(4)(2021·江苏卷)果醋发酵时,发酵液产生的气泡量明显少于果酒发酵时产生的气泡量。( √ )
(5)(2021·江苏卷)果醋发酵时,用重铬酸钾测定醋酸含量变化时,溶液灰绿色逐日加深。( × )
(6)(2021·湖北卷)酸奶制作过程中,后期低温处理可产生大量乳酸杆菌。
( × )
2.判断——微生物培养技术
(1)(2023·山东卷)不含氮源的平板不能用于微生物培养。( × )
(2)(2022·湖北卷)微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染。( × )
(3)(2022·海南卷)培养细菌时,可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基。( √ )
(4)(2021·江苏卷)将培养基分装于培养皿中后灭菌,可降低培养基污染的概率。( × )
(5)(2021·江苏卷)为提高一株石油降解菌的净化能力,将菌涂布于以石油为唯一碳源的固体培养基上,以致死率为90%的辐照剂量诱变处理。其中涂布用的菌浓度应控制在30~300个/mL。( × )
(6)(2021·浙江卷)涂布分离法和划线分离法均能得到单菌落,都可用于细胞计数。( × )
深挖教材
1.(选择性必修3P7正文)醋酸菌是好氧细菌,当O2、糖源都充足时能通过复杂的化学反应 将糖分解成乙酸 ;当缺少糖源时则 直接将乙醇转化为乙醛,再将乙醛变为乙酸 。
2.(选择性必修3P10正文)获得纯净的微生物培养物的关键是 防止杂菌污染 。
3.(选择性必修3P16思考·讨论)尿素分解菌之所以能分解尿素,是因为
它们能合成脲酶,脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3可作为细菌生长的氮源 。
4.(选择性必修3P18正文)利用稀释涂布平板法计数,统计的菌落数往往比活菌的实际数目少,这是因为 当两个或多个细胞连在一起时,平板上观察到的只是一个菌落 。
5.平板划线法中第二次及其后的划线操作,总是从上一次划线的末端开始划线的原因是 划线后,线条末端细菌的数目比线条起始处要少,每次划线从上一次划线的末端开始,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落 。
6.某同学在纯化土壤中的细菌时,发现培养基上的菌落连成了一片,最可能的原因是 菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌 。
考点2 细胞工程和胚胎工程
【把脉高考】 在高考命题中植物细胞工程属于中低频考点,考查点主要包括植物组织培养技术、植物体细胞杂交技术和植物细胞工程的应用等。在历年高考中动物细胞工程属于高频考点,考查点主要包括动物细胞培养技术、动物细胞融合及单克隆抗体的制备技术、动物细胞核移植技术、干细胞技术等。试题常结合免疫调节、基因工程、胚胎工程进行综合考查,涉及人体健康、制药等方面,渗透社会责任。
三年 高考 2025 黑吉辽蒙卷T8、T9、T19,山东卷T14,河北卷T13,安徽卷T14
2024 黑吉辽卷T14,安徽卷T15,北京卷T11,湖北卷T10、T11,甘肃卷T15、T16
2023 山东卷T14,海南卷T7,浙江1月T12,江苏卷T17
串联整合
1.厘清植物细胞工程两大技术
(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是 提供营养和调节渗透压 。
(2)脱分化阶段不需要光,再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时,促进 根 的分化;比值低时,
促进 芽 的分化。
(4)植物体细胞杂交的两个“标志”:植物细胞融合完成的标志是 新细胞壁 的形成;植物体细胞杂交完成的标志是 培育成新植物体 。
(5)植物细胞培养≠植物组织培养。植物细胞培养是指在离体条件下对单个植物细胞或细胞团进行培养使其增殖的技术,可大量获得细胞产物,此过程未体现植物细胞的全能性。
2.动物细胞工程
(1)图解动物细胞培养的过程
(2)厘清克隆动物培育流程
(3)准确记忆单克隆抗体的制备过程和特点
①制备过程
②单克隆抗体的特点:能准确识别抗原的细微差异,与特定抗原发生特异性结合;可以大量制备。
3.胚胎工程
(1)熟知胚胎工程的操作流程
(2)归纳胚胎工程中的三个“两”
对标高考
1.判断——植物细胞工程
(1)(2023·广东卷)科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合,细胞融合前应去除细胞壁。( √ )
(2)(2023·北京卷)对外植体进行消毒以杜绝接种过程中的微生物污染。
( × )
(3)(2023·广东卷)科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合,融合的细胞即为杂交细胞。( × )
(4)(2022·上海卷)地钱具有重要的药用价值,若要利用叶片快速人工繁育,可用单倍体育种技术。( × )
2.判断——动物细胞工程
(1)(2023·北京卷)研究者制备单克隆抗体过程要筛选能分泌多种抗体的单个杂交瘤细胞。( × )
(2)(2022·江苏卷)克隆牛技术涉及体细胞核移植、动物细胞培养、胚胎移植等过程。( √ )
(3)(2022·湖北卷)某兴趣小组开展小鼠原代神经元培养的研究,结果发现其培养的原代神经元生长缓慢,其原因不可能是血清经过高温处理后加入培养基。( × )
(4)(2021·江苏卷)将骨髓瘤细胞和B淋巴细胞混合,经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞。( × )
(5)(2021·辽宁卷)用特定的病毒免疫小鼠可制备单克隆抗体。( √ )
3.判断——胚胎工程
(1)(2023·广东卷)科学家采用体外受精技术获得藏羚胚胎,此过程涉及的操作有超数排卵和精子获能处理。( √ )
(2)(2023·天津卷)培育试管动物需获得MⅡ期的去核卵母细胞。( × )
(3)(2022·江苏卷)哺乳动物体外受精后的早期胚胎培养不需要额外提供营养物质。( × )
(4)(2022·江苏卷)将小鼠桑葚胚分割成2等份获得同卵双胎的过程属于有性生殖。( × )
深挖教材
1.(选择性必修3P58相关信息)在实际胚胎工程操作中,常以观察到 两个极体或者雌、雄原核 作为受精的标志。
2.(选择性必修3P62思考·讨论)胚胎移植实质上是 早期胚胎在相同生理环境条件下空间位置的转移 。
3.作物脱毒时一般选取根尖或茎尖的分生区的组织进行组织培养,原因是
植物顶端分生区附近的病毒极少,甚至无病毒,用该处细胞进行组织培养,能得到大量的脱毒苗 。
4.现有甲、乙两种不同的二倍体植物(各含有一种不同的优良性状),自然状态下,甲、乙植物不能进行杂交的原因是 甲、乙植物不是同一物种,二者存在生殖隔离 。运用植物体细胞杂交技术,获得具有优良性状的目的植株,若甲植物的染色体组成为2N=18,乙植物的染色体组成为4N=32,则目的植株 可育 (填“可育”或“不可育”),原因是 目的植株含有同源染色体,减数分裂过程中联会正常,能产生正常的生殖细胞 。
5.利用小鼠生产的曲妥珠单抗是抗Her2的单克隆抗体,用于阻断癌细胞的生长。给小鼠注射Her2蛋白进行免疫,在获取B淋巴细胞前3天需再次注射Her2蛋白,这样做的目的是 通过二次免疫使产生抗Her2抗体的B淋巴细胞增多 。诱导融合后,获得的细胞有未融合的亲本细胞、融合的具有同种核的细胞和杂交瘤细胞,原因是 细胞融合是随机的,且融合率达不到100% 。
6.收集到的运动性能良好的恒河猴精子不能与采集到的卵母细胞直接完成体外受精,原因是 只有获能后的精子才能完成受精 。
考点3 基因工程和蛋白质工程
【把脉高考】 基因工程和蛋白质工程代表了生物科学技术的前沿,体现了生物科学的应用性和创新性。在高考命题中基因工程是高频考点。试题情境专业性较强,常涉及PCR技术、电泳技术和基因表达的调控机制等,结合生活、生产、临床实践,探究科技前沿,渗透生命观念和社会责任。复习时要注重科技前沿与基因工程的结合,以及基因工程与细胞工程、遗传育种等的综合训练。
三年 高考 2025 黑吉辽蒙卷T25,湖南卷T21,山东卷T25,河北卷T22
2024 黑吉辽卷T7,湖南卷T5、T21,安徽卷T14、T20,山东卷T5、T13、T25
2023 湖南卷T21,全国新课标卷T6,山东卷T25,海南卷T20
串联整合
1.基因工程的基本工具
2.理解、掌握基因工程的操作步骤
(1)目的基因的筛选与获取
(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建
(3)将目的基因导入受体细胞
(4)目的基因的检测与鉴定
3.蛋白质工程
对标高考
1.判断——基因工程
(1)(2023·广东卷)用PCR反应扩增目的基因,用限制性内切核酸酶对PCR产物和载体进行切割,用DNA连接酶将两者连接。( √ )
(2)(2023·全国乙卷)启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位,驱动基因翻译。
( × )
(3)(2023·浙江卷)随着测序技术的发展,为获取富含赖氨酸的酪蛋白基因(目的基因),可通过检索基因文库获取其编码序列,用化学合成法制备得到。再将获得的目的基因与含有乳腺特异性启动子的相应载体连接,构建出乳腺专一表达载体。( √ )
(4)(2023·广东卷)DNA鉴定时加入二苯胺试剂后即呈现蓝色。( × )
(5)(2022·山东卷)“DNA的粗提取与鉴定”实验中,离心研磨液是为了加速DNA的沉淀。( × )
(6)(2022·辽宁卷)为给监管转基因生物安全提供依据,采用PCR方法进行目的基因监测,延伸过程无需引物参与即可完成半保留复制。( × )
(7)(2022·广东卷)基因表达载体中,抗生素抗性基因作为标记基因,可用于筛选含有基因表达载体的受体细胞,终止子可终止翻译,使翻译在需要的地方停下来。( × )
2.(2023·山东卷)与启动子结合的酶是 RNA聚合酶 ,作为载体,质粒需具备的结构有 复制原点、标记基因、限制酶识别(或切割)位点 (答出2个结构即可)。
3.(2023·全国甲卷)(1)目的基因导入酵母细胞后,若要检测目的基因是否插入染色体中,需要从酵母细胞中提取 染色体DNA(或基因组DNA) 进行DNA分子杂交,DNA分子杂交时应使用的探针是 与目的基因特异性互补且带有标记的DNA片段(或带标记的含有目的基因的DNA片段) 。
(2)若要通过实验检测目的基因在酵母细胞中是否表达出目的蛋白,请简要写出实验思路。 从酵母细胞中提取蛋白质,再用相应的抗体进行抗原—抗体杂交,检测是否出现杂交带 。
深挖教材
1.(选择性必修3P71旁栏思考)限制酶主要来源于原核生物,限制酶不能切割自身所在原核生物的DNA分子的原因是 自身所在原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰 。
2.(选择性必修3P81资料卡)农杆菌细胞内含有Ti质粒,当它侵染植物细胞后,能将目的基因导入受体细胞并整合到染色体DNA上,原因是 农杆菌能将Ti质粒上的T-DNA转移到被侵染的细 胞,并且将其整合到该细胞的染色体DNA 上。
3.PCR反应需提供分别与DNA两条链结合的两种引物,引物的作用是
使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸 。
4.PCR反应缓冲溶液中一般要添加Mg2+,原因是 真核细胞和细菌的DNA聚合酶需要Mg2+激活 。
5.转基因植物所携带的目的基因可能传递给非转基因植物,造成基因污染。如果将目的基因导入叶绿体DNA中,就可以有效避免基因污染,原因是 叶绿体基因不会通过花粉传给下一代 。
6.在蛋白质工程中,对蛋白质结构进行改造,最终是通过对基因的直接改造来完成的,而不是直接改造蛋白质,其原因是 蛋白质具有十分复杂的空间结构,基因的结构相对简单,容易改造;改造后的基因可以遗传给下一代,被改造的蛋白质无法遗传 。
