突破练48　基因工程的基本工具与操作程序--2026全国版高中生物学突破练（含答案）

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2026全国版高中生物学突破练
突破练48
(选择题每小题3分)
基础·满分练
命题角度1　基因工程的基本工具
1.(2026湖南怀化模拟)链状DNA分子经限制酶切割产生的黏性末端如图所示。下列叙述正确的是(　　)
注:N代表任一碱基。
A.限制酶切断的是同一条链上两个特定相邻碱基间的氢键
B.图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖、磷酸基团各2个
C.每条链5'端、3'端的碳原子分别与羟基、磷酸基团相连接
D.理论上,图示黏性末端最多可能有256种
2.(2026重庆模拟)用XhoⅠ和SalⅠ两种限制酶分别处理同一DNA片段,酶切位点及酶切产物分离结果如图。下列叙述错误的是(　　)
图1　酶切位点图
图2　电泳结果示意图
A.两种限制酶识别的核苷酸序列不同,限制酶的识别序列越短,则该DNA被该酶切割的概率越高
B.泳道②中是用XhoⅠ处理得到的酶切产物
C.若用XhoⅠ和SalⅠ两种酶同时处理该DNA片段后电泳,会同时得到泳道①②对应条带
D.电泳技术中最终能够肉眼看到多条电泳条带,离不开核酸染料对DNA的染色和紫外灯的照射
命题角度2　基因工程的基本操作程序
3.(2026江西抚州模拟)下图表示培育转基因抗病毒农作物的过程图,下列叙述正确的是(　　)
A.过程a需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B.过程b需要用CaCl2处理,以提高农作物细胞壁的通透性
C.抗病毒基因一旦整合到农作物细胞的染色体上,就能正常表达
D.转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒进行鉴定
4.(2026河北邢台模拟)某小组将抗盐基因导入番茄细胞,培育转基因植株。下列操作错误的是(　　)
A.将胚接种到含生长素和细胞分裂素的培养基上可诱导形成愈伤组织
B.用Ca2+处理番茄细胞后,可将重组质粒直接导入番茄细胞
C.利用PCR技术可检测待测番茄细胞中是否含有抗盐基因
D.将转基因番茄种植在盐碱地中,可检测其是否有抗盐性状
5.(2026湖北模拟)如图是利用基因工程技术培育抗除草剂作物的部分过程,其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制酶,且切割DNA分子后形成的末端均不同。下列说法正确的是(　　)
A.图示质粒分子在SmaⅠ切割前后分别含有0或1个游离的磷酸基团
B.培育抗除草剂作物的核心是将含bar基因的表达载体导入受体细胞
C.可选用PstⅠ和EcoRⅠ切割质粒和bar基因,确保目的基因正确插入
D.利用PCR技术可从分子水平检测bar基因是否能翻译出抗除草剂蛋白
6.(2025江西卷)为了获得抗白叶枯病的水稻品种,研究人员构建了含有抗病基因D的重组Ti质粒(如图),通过农杆菌转化法将D基因导入水稻种子诱导的愈伤组织,最终获得抗病植株。下列叙述正确的是(　　)
A.水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶无法识别U6启动子
B.在含重组Ti质粒的农杆菌中U6启动子不能驱动卡那霉素抗性基因表达
C.农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入卡那霉素
D.愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗属于抗病植株
7.(2026陕西咸阳模拟)为了提高基因M的表达能力,可将基因M与外源强启动子连接,如图所示(图中①②③④表示引物)。下列叙述错误的是(　　)
A.强启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位
B.可用DNA连接酶将基因M与外源强启动子连接
C.利用PCR技术检测连接是否成功时选择的引物可为①③
D.引物可使DNA聚合酶从引物的5'端开始连接脱氧核苷酸
8.(2026江苏南通模拟)下图表示PCR过程中某个阶段反应体系的情况,①②③④表示相关物质,L、R表示方向。下列叙述正确的是(　　)
A.DNA体内复制与体外复制(PCR)所需能量均只来自dNTP
B.PCR过程中需要添加缓冲液,其中所含的Mg2+可用于激活DNA聚合酶
C.②链从L到R的方向为3'端→5'端,①②链均可作为子链合成的模板
D.引物③的5'端添加了某序列,至少需经3次循环才可获得该序列的双链产物
命题角度3　实验:DNA的粗提取与鉴定、DNA片段的扩增及电泳鉴定
9.(2024安徽卷)下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述,错误的是(　　)
A.实验中如果将研磨液更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低
B.利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA
C.DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同,该原理可用于纯化DNA粗提物
D.将溶解的DNA粗提物与二苯胺试剂反应,可检测溶液中是否含有蛋白质杂质
10.(2026福建福州模拟)提取细菌中质粒时常通过调节pH使DNA先变性再复性。在特定的pH条件下,拟核DNA分子因无法复性与其他较大的分子沉淀下来,而质粒可复性并与其他小的核酸分子留在上清液中。下列叙述正确的是(　　)
A.实验中不可将细菌置于无菌水中使其裂解释放DNA分子
B.可通过调节温度来替代调节pH使DNA先变性再复性
C.实验中可在上清液中加入2 mol/L的NaCl溶液析出质粒
D.电泳分离质粒时,条带迁移速率不受质粒大小和构象影响
能力·高分练
11.(10分)(2025河南卷)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。某研究小组拟筛选具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种用于生产卡拉胶寡糖。回答下列问题。
(1)选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌的原因是　　　　　　　　　　　　　　　。将培养后的菌液混匀并充分　　　　,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2)为构建携带cg(CG的编码基因)的大肠杆菌表达载体(图1),对cg的PCR扩增产物和质粒进行双酶切,随后用E.coli DNA连接酶连接。为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有　　　酶切位点。另有两组同学选用了各不相同的双酶切组合和T4 DNA连接酶重复上述实验,获得的部分重组质粒分子大小符合预期,但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割,其原因是　　　　　　　　　　　　　　。
限制酶的识别序列和切割位点如下:
图1
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,随后在含　　　　和　　　　的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)已知空间上邻近的两个半胱氨酸易形成二硫键,从而提升蛋白质的耐热性。为提高CG的耐热性,研究人员分析了五个氨基酸位点的空间距离和保守度(保守度值越大表明该位点对酶的功能越关键),如图2所示。根据分析结果,选择第　　　　位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适,原因是　 　　　　　　　　　　　　　　　。
图2
12.(10分)(跨模块融通)(2025四川卷)杆菌M2合成的短肽拉索西丁能有效杀死多种临床耐药细菌。拉索西丁能与细菌的核糖体结合,阻止携带氨基酸的tRNA进入核糖体位点2。有人将合成拉索西丁的相关基因(lrcA-lrcF)导入链霉菌,基因克隆流程及拉索西丁的作用机制如下图。回答下列问题。
注:①F1、F2、F3和F4为与相应位置的DNA配对的单链引物,“→”指引物5'-3'方向。②密码子对应的氨基酸为AAA—赖氨酸;AUG—甲硫氨酸(起始);UUC—苯丙氨酸;ACA—苏氨酸;UCG—丝氨酸。
(1)用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用　　　　引物。本研究载体使用了链霉菌的复制原点,其目的是　 　　　　　　　　　　　　　　　。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生　　条电泳条带,电泳检测酶切产物的目的是　　　　　　　　　　　　　　　　　。
(3)由图可知,拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带　　　　(填氨基酸名称)的tRNA进入结合位点,导致　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌的目的基因产物经验证有杀菌活性,但重组菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出1点即可)。
13.(7分)(2025湖南卷)非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒,可引起急性猪传染病。基因A编码该病毒的主要结构蛋白A,其在病毒侵入宿主细胞和诱导机体免疫应答过程中发挥重要作用。回答下列问题。
(1)制备特定抗原
①获取基因A,构建重组质粒(该质粒的部分结构如图所示)。重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和　　　　　　　等;为确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用图中的一对引物　　　　对待测质粒进行PCR扩增,预期扩增产物的片段大小为　　　　bp。
注:P1、P2和P3表示引物。
②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌。培养重组菌,诱导蛋白A合成。收集重组菌发酵液进行离心,发现上清液中无蛋白A,可能的原因是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出两点即可)。
(2)制备抗蛋白A单克隆抗体
用蛋白A对小鼠进行免疫后,将免疫小鼠B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合,诱导融合的常用方法有　　　　　　　　　　　　　　　　　　　(答出一种即可)。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和　　　　,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。体外培养或利用小鼠大量生产的抗蛋白A单克隆抗体,可用于非洲猪瘟的早期诊断。
参考答案
基础·满分练
1.D　限制酶的作用对象是DNA分子的两条链中脱氧核糖和磷酸之间的磷酸二酯键,DNA分子有两条链,因此,限制酶切断的是DNA分子两条链上两个特定相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,A项错误。图中同一条链上两个相邻碱基N间有脱氧核糖2个、磷酸基团1个,B项错误。图中每条链5'端、3'端的碳原子分别与磷酸基团、羟基相连接,C项错误。图中黏性末端含有4个碱基,因此,理论上,图示黏性末端最多可能有44=256种,D项正确。
2.C　酶具有专一性,不同的限制酶识别并切割不同的核苷酸序列,限制酶的识别序列越短,则该DNA被该酶切割的概率越高,A项正确。分析图1可知,限制酶Xho Ⅰ有两处切割位点,切割后产生3个DNA片段,故泳道②中是用Xho Ⅰ处理得到的酶切产物,B项正确。泳道①②是分别用Sal Ⅰ和Xho Ⅰ切割DNA分子电泳得到的结果,若用Xho Ⅰ和Sal Ⅰ两种酶同时处理该DNA片段后电泳,应该在一个泳道里出现6种条带,C项错误。电泳条带染色是通过化学或荧光染料与分离后的分子(如DNA、RNA、蛋白质)特异性结合,使其在凝胶中显现,以便观察、分析和记录的关键步骤。因此电泳技术中最终能够肉眼看到多条电泳条带,离不开核酸染料对DNA的染色和紫外灯的照射,D项正确。
3.D　图中过程a为构建基因表达载体,需要用到限制酶和DNA连接酶,A项错误。CaCl2处理能提高农杆菌细胞壁的通透性,B项错误。抗病毒基因整合到农作物细胞的染色体上,不一定能正常表达,因为基因表达受到多种因素的调控,如染色体的结构、基因的启动子等调控元件是否正常,以及细胞内的环境等,所以即使整合了,也可能无法正常转录或翻译,从而不能正常表达出抗病毒的相关蛋白,C项错误。转基因抗病毒农作物是否培育成功可通过接种特定病毒,观察农作物是否被感染来进行鉴定,D项正确。
4.B　植物组织培养中,外植体(如胚)在含有适宜比例生长素和细胞分裂素的培养基中可脱分化形成愈伤组织,A项正确。Ca2+处理法常用于细菌(如大肠杆菌)感受态细胞的制备,而植物细胞导入重组质粒需通过农杆菌转化法等方法,直接导入无法实现,B项错误。PCR技术通过特异性引物扩增目的基因片段,可检测抗盐基因是否存在,C项正确。在盐碱地中种植转基因番茄,通过观察其抗盐性状可直接验证目的基因的表达效果,D项正确。
5.C　质粒为环状DNA分子,Sma Ⅰ切割后形成线性DNA分子,含2个游离的磷酸基团,A项错误。基因工程的核心步骤是构建基因表达载体,B项错误。Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ切割可避免质粒自身环化和目的基因反向连接,C项正确。利用PCR技术检测目的基因是否导入,利用抗原—抗体杂交技术检测是否能翻译出蛋白质,D项错误。
6.B　将T-DNA整合到水稻愈伤组织的染色体DNA后,若要使D基因表达并使水稻植株表现出抗病性状,那么D基因上游的U6启动子需被水稻愈伤组织细胞中RNA聚合酶识别,A项错误。启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段,位于基因的上游,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,并能够驱动基因转录出mRNA,最终表达出蛋白质。由图得出,题述重组Ti质粒中的U6启动子并非位于卡那霉素抗性基因的上游,因而不能驱动卡那霉素抗性基因的表达,B项正确。愈伤组织是指将植物体的某一组织、器官置于特定培养基中培养,诱导产生的无定形的组织团块。当农杆菌侵染愈伤组织后,T-DNA整合到水稻细胞染色体DNA中。通常情况下,若D基因能够表达,那么T-DNA上的潮霉素抗性基因也能表达,从而使得导入T-DNA的水稻愈伤组织具有潮霉素抗性基因;卡那霉素抗性基因不位于T-DNA上,不会发生上述生理过程。因此,在农杆菌侵染愈伤组织后所用的筛选培养基中需加入潮霉素,C项错误。检测是否成功获得转基因品种一般需要经历两个阶段,首先是分子水平的检测,包括检测目的基因是否导入宿主细胞、检测在宿主细胞中目的基因是否转录出mRNA或最终表达出蛋白质;其次,还需要进行个体生物学水平的鉴定。因此愈伤组织再分化获得的含有D基因的幼苗不一定是抗病植株,D项错误。
7.D　RNA聚合酶识别和结合强启动子,启动转录,A项正确。DNA连接酶可以连接两个DNA片段,可用DNA连接酶将基因M与外源强启动子连接,B项正确。由图可知,利用PCR技术检测连接是否成功时选择的引物可为①③,C项正确。引物可使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,D项错误。
8.B　体内DNA复制由ATP(解旋)、dNTP提供能量,体外DNA复制(PCR)由dNTP和加热提供能量,A项错误。DNA聚合酶需要Mg2+来激活,因此PCR反应的缓冲液中一般要添加Mg2+,B项正确。根据DNA分子中两条链反向平行可判断,②链从L到R的方向为5'端→3'端,图中①②链均可作为子链合成的模板,C项错误。引物③的5'端添加了某序列,经过第1次循环,得到的1个DNA分子中有1条链含有该序列;经过第2次循环,得到的1个DNA分子的两条链均含有该序列,所以至少需经2次循环就可获得该序列的双链产物,D项错误。
9.D　研磨液有利于DNA的溶解,若更换为蒸馏水,DNA提取的效率会降低,A项正确。DNA不溶于酒精,但细胞中的某些蛋白质溶于酒精,所以利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异,可初步分离DNA,B项正确。DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同,它能溶于2 mol/L的NaCl溶液,可利用该原理对DNA进行粗提取,C项正确。在沸水浴的条件下,DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色,故二苯胺试剂可用于鉴定DNA,但不能检测溶液中是否含有蛋白质杂质,D项错误。
10.A　细菌细胞具有细胞壁,将细菌置于无菌水中,由于细胞壁的支持和保护作用,细菌不会吸水涨破,无法释放DNA分子,所以实验中不可将细菌置于无菌水中使其裂解来释放DNA分子,A项正确。调节温度也可使DNA先变性再复性,但无法将拟核DNA分子和质粒(DNA分子)分开,B项错误。DNA在2 mol/L的NaCl溶液中溶解度较高,能使质粒(DNA分子)溶解,C项错误。电泳分离质粒时,条带迁移速率受质粒大小和构象影响,一般来说,质粒越小,构象越有利于迁移,其迁移速率越快,D项错误。
能力·高分练
11.(1)在红藻原生环境中筛选到具有卡拉胶降解能力的微生物的可能性较大　稀释
(2)BamH Ⅰ　Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割后均产生平末端,Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割后产生的黏性末端相同,两种情况均会导致部分cg反向连接,新的序列无法被原有酶识别
(3)使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(使细胞处于感受态)　四环素　卡拉胶
(4)44　该位点保守度低,且该位点在空间上与第119位的半胱氨酸接近
解析 (1)卡拉胶是一类源于海洋红藻的大分子多糖,可被某些细菌降解为具有多种应用前景的卡拉胶寡糖。由于在红藻原生环境中筛选到具有卡拉胶降解能力的微生物的可能性较大,故可选择海藻和海泥作为样本筛选卡拉胶降解菌。将培养后的菌液混匀并充分稀释,再接种至微孔板中,经培养和筛选获得了CG活性最高的菌种。
(2)E.coli DNA连接酶连接具有平末端的DNA片段的效率要远远低于T4 DNA连接酶,因此为保证连接准确性和效率,切割质粒和目的基因时不能选择切割产物为平末端的限制酶,即不能选择EcoRⅤ和Sma Ⅰ。而Spe Ⅰ与Xba Ⅰ切割后形成的黏性末端相同,若选择Spe Ⅰ与Xba Ⅰ切割,会出现质粒和目的基因的自连甚至目的基因倒接,因此切割质粒时Spe Ⅰ与Xba Ⅰ中只能选择一个,而另一个限制酶需要选择BamH Ⅰ。又由于转录的方向是启动子→终止子,mRNA形成的方向是5'端→3'端,且mRNA与DNA的模板链方向相反,因此基因模板链的3'端应靠近启动子,故为保证连接准确性和效率,cg转录模板链的5'端最好含有BamH Ⅰ酶切位点。T4 DNA连接酶既可连接平末端,也可连接黏性末端,在使用不同酶切组合切割后均可以通过T4 DNA连接酶进行连接。在此过程中,“获得的部分重组质粒分子大小符合预期”表明cg基因已经完成插入;“但均无法使用各自构建表达载体的双酶切组合进行切割”表明插入后导致原来的酶切位点发生改变。结合教材可知,在使用两个平末端和两个同尾酶切割cg基因和载体时,均可以产生正接和反接两种方式,但反接之后形成的序列与原先两种酶的识别序列均不同,进而造成无法再被两种酶切割的情况。因此,原因为Sma Ⅰ和EcoR Ⅴ切割后均产生平末端,Spe Ⅰ和Xba Ⅰ切割后产生的黏性末端相同,两种情况均会导致部分cg基因反向连接,新的序列无法被原有酶识别。
(3)为将构建好的表达载体转入大肠杆菌,需要先用Ca2+处理大肠杆菌细胞,目的是使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,便于重组DNA进入受体细胞。由于具有高活性卡拉胶酶(CG)的菌种可分解卡拉胶,使其菌落周围形成透明圈,且重组质粒上含有四环素抗性基因,因此导入目的基因的大肠杆菌可接种在含四环素和卡拉胶的培养基中培养一段时间后,根据菌落周围有无水解透明圈筛选目的菌株。
(4)据图2可知,虚线长度代表氨基酸间的空间距离,由于第44位的氨基酸在空间上与第119位的半胱氨酸更接近,容易形成二硫键,而且保守度低,替换后对酶功能的影响较小,因此选择第44位的氨基酸替换成半胱氨酸最合适。
12.(1)F2、F4　保证载体在链霉菌中正常复制
(2)2　检测重组质粒是否构建成功
(3)苯丙氨酸　翻译过程无法正常进行,细菌无法合成蛋白质
(4)目的基因发生突变或变异(或目的基因表达受到抑制等,合理即可)　发酵的最佳条件(或提高发酵产物产量的方法、产物的分离和纯化方法等,合理即可)
解析 (1)引物需要结合到模板的3'端,且与目的基因的部分碱基序列互补配对,子链延伸方向为5'端→3'端,因此用PCR技术从杆菌M2基因组中扩增lrcA-lrcF目的基因时,应选用F2、F4引物。载体使用链霉菌的复制原点,是为了保证载体在链霉菌中正常复制。
(2)采用EcoRⅠ和BamHⅠ完全酶切构建的重组质粒,会得到载体片段和目的基因片段,产物通过琼脂糖凝胶电泳检测应产生2条电泳条带。电泳检测酶切产物的目的是检测重组质粒是否构建成功,若能得到预期的载体片段和目的基因片段大小的条带,说明酶切成功,重组质粒构建可能成功。但还需要进一步的鉴定。
(3)观察拉索西丁的作用机制图,结合所给密码子信息,可知拉索西丁与核糖体结合后,会阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点。因为位点2对应的密码子是UUC,编码苯丙氨酸。拉索西丁阻止携带苯丙氨酸的tRNA进入结合位点,会导致翻译过程无法正常进行,进而使细菌无法合成蛋白质,最终引起细菌死亡。
(4)重组链霉菌在实验室多次培养后,提取的目的基因产物杀菌活性丧失,可能的原因是目的基因发生突变或变异,导致其表达的产物结构改变,从而失去杀菌活性;也可能是目的基因的表达受到抑制等。若运用发酵工程来生产拉索西丁工程药物,除产物活性外还需进一步研究的问题有:发酵的最佳条件,如温度、pH、溶氧量等;提高发酵产物的产量的方法;产物的分离和纯化方法等。
13.(1)①终止子、复制原点　P1和P3　782　②重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解
(2)聚乙二醇(PEG)融合法(或灭活病毒诱导法、电融合法)　抗体检测
解析 (1)①重组质粒的必备元件包括目的基因、限制酶切割位点、标记基因、启动子和终止子、复制原点等。要确定基因A已连接到质粒中且插入方向正确,应选用引物P1和P3。因为P1与基因A下游的非编码区互补配对,P3与基因A上游且靠近启动子的区域互补配对,这样扩增产物的片段大小为200+582=782(bp)。②将DNA测序正确的重组质粒转入大肠杆菌构建重组菌,培养后上清液中无蛋白A,可能的原因有:重组菌没有裂解或没有将蛋白A释放到细胞外、转速过高使蛋白A发生沉淀、蛋白A亲水性较差发生沉淀、蛋白A被大肠杆菌的蛋白酶降解等。
(2)诱导动物细胞融合的常用方法有聚乙二醇(PEG)融合法、灭活病毒诱导法、电融合法等。选择培养时,对杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测,多次筛选获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。
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