专题14 基因工程和细胞工程-2017年高考生物二轮核心考点总动员 解析版
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| 名称 | 专题14 基因工程和细胞工程-2017年高考生物二轮核心考点总动员 解析版 |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 3.0MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | 人教版（新课程标准） | ||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2017-03-25 09:19:04 | ||
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文档简介
【考点定位】
（1）基因工程的诞生（Ⅰ）
（2）基因工程的原理及技术（含PCR技术）
（Ⅱ）
（3）基因工程的应用（Ⅱ）
（4）蛋白质工程（Ⅰ）
（5）植物的组织培养（Ⅱ）
（6）动物细胞培养与体细胞克隆（Ⅱ）
（7）细胞融合与单克隆抗体（Ⅱ）
【直击高考】
1.（2016江苏卷.9）下列有关细胞工程的叙述，正确的是（
）
A.PEG是促细胞融合剂，可直接诱导植物细胞融合
B.用原生质体制备人工种子，要防止细胞破裂
C.骨髓瘤细胞经免疫处理，可直接获得单克隆抗体
D.核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供卵母体
【答案】D
2.（2015·江苏卷.3）下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述,正确的是（
）
A.
乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养
B.
细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行
C.
采用胚胎分割技术产生同卵多胚的数量是有限的
D.
培养早期胚胎的培养液中含维生素、激素等多种能源物质
【答案】C
【解析】乳腺癌细胞的分裂能力比乳腺细胞强，所以乳腺癌细胞比乳腺细胞更容易进行离体培养，A错误；细胞核移植发生在同种或异种生物的细胞之间，B错误；由于胚胎分割形成的多胚中遗传物质少，营养物质少，成功的可能性低，所以胚胎分割技术产生同卵多胚的数量有限，C正确；培养早期胚胎的培养液中维生素、激素起调节作用，不是能源物质，D错误。
3.（2015·广东卷.25）图9为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图
下列叙述正确的是（
）
过程①所用的人β-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得
过程②可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植
过程③可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体
过程④人β-酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译
【答案】AC
4.（2015·北京卷.5）在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（
）
A.用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B.用选择培养基筛法导入目的基因的细胞
C.用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合
D.用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽
【答案】C
【解析】农杆菌侵染细菌是基因工程中常常用到的把目的基因导入植物细胞的方法，A正确；目的基因是否导入了细胞，需要在选择培养基上进行筛选，B正确；在植物细胞组织培养的过程中，需要调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，来达到是对其脱分化和再分化的控制，D也正确；在农杆菌侵染植物细胞的过程中并没有涉及到原生质体的融合，所以C错误。
5.(
2015·重庆卷.6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
【解析】人肝细胞中胰岛素基因不表达，因而不存在胰岛素mRNA；A错误。复制原点是基因表达载体复制的起点，而胰岛素基因表达的起点是启动子；B错误。借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来；C正确。启动子与RNA聚合酶结合启动转录过程，终止密码子是翻译的终止信号；D错误。
6.（2016江苏卷.33）（9分）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用______两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过__________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于__________________态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_____________。
（3）若BamH
I酶切的DNA末端与Bcl
I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为
，对于该部位，这两种酶
（填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。
（4）若用Sau3A
I切图1质粒最多可能获得
种大小不同的DNA片段。
【答案】（1）BclI和HindⅢ
连接
感受
（2）四环素
引物甲和引物丙
（3）
都不能
（4）7
（3）根据BamH
I和Bcl
I的酶切位点，BamH
I酶切的DNA末端与Bcl
I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，与两种酶的酶切位点均不同。
（4）根据BamH
、Bcl
I和Sau3A
I的酶切位点，Sau3A
I在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A
I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
7.（2016课标1卷.40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_____________的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________
【答案】（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可）
（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长
含有质粒载体
含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）
二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
四环素
（3）受体细胞
该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr
）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。
8.（2016新课标Ⅲ卷.40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR
I、BamH
I和Sau3A
I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR
I、Sau3A
I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH
I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是___________。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【答案】（1）Sau3AⅠ
两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲和丙
甲中目的基因插入在启动子的上游，
丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录（3）E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
T4DNA连接酶
【解析】（1）由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamH
I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
9.（2016天津卷.7）
(12分)人血清白蛋白(HSA)
具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A.人血细胞启动子
B.水稻胚乳细胞启动子
C.大肠杆菌启动子
D.农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是__________________________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_______________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。
【答案】（12分）（1）总RNA
（或mRNA）
（2）B（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工（5）HAS
【解析】（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过逆转录过程。采用PCR技术扩增HSA基因时，两条引物分别与模板链的5’端结合，扩增方向相反。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与天然的HSA生物学功能一致。
10.（2016新课标2卷.40)[生物——选修3：现代生物科技专题]（15分）
下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。
回答下列问题：
（1）图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用_______的方法。②代表的过程是__________。
（2）经过多次传代后，供体细胞中______的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。
（3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是______。
（4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了__________。
【答案】（15分）（1）XX或XY
显微操作（去核法）
胚胎移植（2）遗传物质
（3）卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响（4）已经分化的动物体细胞核具有全能性。
【解析】（1）提供体细胞的供体可能为雌性，也可能为雄性，因此图中A（正常细胞核）的性染色体组成为XX或XY。常采用显微操作去核法来去除卵母细胞的细胞核。②过程表示将早期胚胎移入受体，其过程为胚胎移植。
（4）克隆动物的培育采用的是核移植技术，核移植技术的原理是：已经分化的动物体细胞核具有全能性。
11.（2016海南卷.31）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即______和从_______中分离。
（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是______。
（3）在基因表达载体中，启动子是______聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是______。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_____和______颗粒。
【答案】（15分）（1）人工合成
生物材料（每空2分，共4分，其他合理答案可酌情给分）
（2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因（5分，其他合理答案可酌情给分）（3）RNA（2分）
大肠杆菌（或答细菌）（2分）（4）金粉
钨粉（每空1分，共2分）
【解析】（1）获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉
和钨粉颗粒。
12.（2016上海卷.九）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
在图27所示的质粒PZHZ11（总长为3.6kb，1kb=1000对碱基因）中，lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。
68.若先用限制酶BamHI切开pZHZ11，然后灭活BamHI酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1kb质粒的细胞颜色为；含3.6kb质粒的细胞颜色为。
69.若将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因长度为kb。
70.上述4.9kb的重组质粒有两种形式，若用BamHI和EcoRI联合酶切其中一种，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得kb和kb两种DNA片段。
71.若将人的染色体DNA片段先导入大肠杆菌细胞中克隆并鉴定目的基因，然后再将获得的目的基因转入植物细胞中表达，最后将产物的药物蛋白注入小鼠体内观察其生物功能是否发挥，那么上述过程属于。
A.人类基因工程
B.动物基因工程
C.植物基因工程
D.微生物基因工程
【答案】68.白色
白色和蓝色/白色或蓝色69.1.8
70.1.4
3.5
71.C
【解析】68.3.1kb质粒lacZ基因被破坏，含3.1kb质粒的细胞颜色为白色；加DNA连接酶进行连接，被切下的片段可能反向连接，所含3.6kb质粒的细胞可能含有正常质粒和异常质粒，也可能只含有正常质粒或异常质粒，颜色为白色和蓝色（白色或蓝色）。
69.pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段被切除后，剩余3.1kb，将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因插入，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因大小为4.9-3.1=1.8kb。
71．题干所述目的是让人的基因在植物细胞中表达，属于植物基因工程。
【考情解读】
本专题以最新基因工程和细胞工程的研究成果为背景，联系其他生物技术工程，综合命题考查基因工程的原理与技术操作、植物组织培养、克隆技术，题型主要以非选择题为主。
【考点突破】
考点一、基因工程的基本工具
1.三种工具比较
限制酶
DNA连接酶
载体
作用
切割目的基因和载体
拼接DNA片段，形成重组DNA
携带目的基因进入受体细胞
作用部位
两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间的磷酸二酯键
作用特点(条件)
识别特定的核苷酸序列；在特定位点上切割
E·coli
DNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端
能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；有多个限制酶切割位点；具有特殊的标记基因
【特别提醒】
①DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
②限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开，而解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。
③DNA连接酶和限制酶的关系
④EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的比较
EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
2.如何确定限制酶的种类
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
3.载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
【典型例题1】
若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
【答案】D
【典型例题2】
如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是( )
A.HindⅢ
B.EcoRⅠ
C.EcoB
D.PstⅠ
【答案】C
【解析】A处有BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ限制酶的切点，使用A～D中的EcoB切割时，才能让目的基因插入到A处。
考点二、基因工程基本操作程序
1．目的基因的获取途径
(1)直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。
(2)人工合成目的基因(常用方法如下)：
①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
②人工合成法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。
③利用PCR技术扩增。
2．基因表达载体的构建——重组质粒的构建
(1)表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。
(2)启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。
(3)基因表达载体的构建过程：
3.将目的基因导入受体细胞——转化
(1)导入方法因受体细胞的种类不同而异
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞(用Ca2＋处理)
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
(2)转化的实质：目的基因导入受体细胞染色体基因组中并表达和发挥作用。
4．目的基因的检测与鉴定
(1)导入检测：DNA分子杂交技术(使用DNA探针)。
(2)表达检测
(3)个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。
【典型例题1】
下图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法中正确的是( )
A.图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物
B.图示中构建基因表达载体时，需用到一种限制性核酸内切酶
C.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
D.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
【答案】D
【典型例题2】
下面图1为某植物育种流程，图2表示利用农杆菌转化法获得某种转基因植物的部分操作步骤。下列相关叙述错误的是( )
A.图1子代Ⅰ与原种保持遗传稳定性，子代Ⅱ和子代Ⅲ选育原理相同
B.图1子代Ⅲ选育显性性状需自交多代，子代Ⅴ可能发生基因突变和染色体变异
C.图2中①过程的完成需要限制酶和DNA连接酶的参与
D.图2中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多种蛋白质
【答案】D
【解析】子代植株Ⅰ是体细胞培养产生的，利用的原理是植物细胞的全能性，属于无性繁殖，所以与原种保持着遗传稳定性；子代植株Ⅱ为基因工程育种产生的、子代植株Ⅲ为杂交育种产生的，选育的原理都为基因重组，A正确；子代Ⅲ的选育过程为杂交育种，如果需要显性纯合子，则一定要自交选育多代；子代Ⅴ的选育过程需要用物理因素、化学因素等来处理生物，所以可能发生基因突变和染色体变异，B正确；图2中①过程是构建基因表达载体，其完成需要限制酶和DNA连接酶的参与，C正确；图2中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多个同种蛋白质分子，D错误。
考点三、植物细胞工程
1.植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
名称
植物组织培养
植物体细胞杂交
原理
细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性
过程
选材
选取根尖、茎尖、形成层部位最容易诱导脱分化
不同的植物细胞
技术操作
脱分化、再分化等
除脱分化、再分化外，还要用酶解法去除细胞壁，用一定的方法诱导细胞融合
关系
植物组织培养是植物体细胞杂交的基础，植物体细胞杂交所用的技术更复杂
2.植物体细胞杂交过程中杂种细胞类型及检测方法
(1)诱导产物(假设用于杂交的两种植物细胞分别为A、B)：
①未融合的细胞：A和B。
②两两融合的细胞：AA、BB和AB。
③多细胞融合体。
(2)检测方法：对诱导产物中的细胞进行植物组织培养，然后根据得到的植物性状进行判断。
①若只表现出一种植物的性状，说明是未融合细胞。
②若得到的是具有两种亲本性状的植物，说明是杂种植株。
③若得到的是具有两种亲本性状的植物，且一种植物的性状得到加强，则是多细胞融合体。
④若只表现出一种植物的性状且效果得到加强，则是同种细胞融合的结果。
【典型例题1】
下图是通过植物细胞工程技术获得紫杉醇的途径，下列叙述不正确的是( )
A.该途径依据的原理是植物细胞具有全能性
B.过程①需控制好培养基中植物激素的比例
C.经过程①细胞的形态和结构发生了变化
D.过程③需使用液体培养基，有利于细胞增殖
【答案】A
【典型例题2】
“白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短、耐热性强和易于储藏等优点。如图是“白菜—甘蓝”的杂交过程示意图。以下说法正确的是( )
A.除去细胞壁形成原生质体，可运用的酶是纤维素酶、淀粉酶和果胶酶
B.通常可诱导上述原生质体相互融合的方法是PEG和灭活的病毒诱导
C.杂种细胞形成的标志是诱导产生了新的细胞壁
D.愈伤组织形成“白菜—甘蓝”植物体必须经过脱分化和再分化两个过程
【答案】C
【解析】除去细胞壁的酶有纤维素酶和果胶酶；诱导植物原生质体融合不能用灭活的病毒；杂种细胞形成的标志是诱导产生了新的细胞壁；愈伤组织形成“白菜—甘蓝”植物体属于再分化过程。
考点四、动物细胞培养与体细胞克隆
1.动物细胞培养与动物体细胞核移植的比较
项目
动物细胞培养
动物体细胞核移植
原理
细胞增殖
动物细胞核的全能性
过程
动物组织块↓剪碎、胰蛋白酶处理细胞悬液↓转入培养液中原代培养↓胰蛋白酶处理细胞悬液↓分瓶、转入培养液中传代培养
结果
获得细胞群
获得与供体遗传物质基本相同的个体
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物
(1)动物体细胞核移植技术的过程
(2)原理：动物体细胞核具有全能性。
(3)结果：产生新个体。
(4)应用：①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；②保护濒危物种；③生产医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植。
【典型例题】
如图所示为哺乳动物生殖的过程。其中b为卵细胞，c为体细胞。下列叙述不正确的是( )
A.形成动物①②的过程分别属于有性生殖和无性生殖
B.产生动物②的过程中可发生基因突变、基因重组等
C.动物②的产生表明动物细胞的细胞核具有全能性
D.a、b、c细胞的形成过程，仅c细胞为有丝分裂
【答案】B
考点五、动物细胞融合与单克隆抗体的制备
1.动物细胞融合
(1)原理：细胞膜的流动性。
(2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
(3)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2.单克隆抗体
(1)制备过程
(2)优点：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
(3)用途：作为诊断试剂；用于治疗疾病和运载药物。
【方法点拨】制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的
项目
第一次筛选
第二次筛选
筛选原因
诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选方法
用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长
用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
筛选目的
得到杂交瘤细胞
得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
【典型例题】
单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可以大量制备，已被广泛应用于疾病的诊断和治疗。用H7N9病毒制备单克隆抗体的流程如下图所示：
(1)过程③常用的方法是_________________________________________________________。
(2)向小鼠体内注射抗原蛋白，使小鼠产生________免疫。从小鼠体内分离的细胞Ⅰ是___________________________，细胞Ⅱ应具有的特点是____________________________。
(3)体外培养细胞Ⅱ，首先应保证其处于______________________________的环境中，其次需要提供充足的营养和适宜的温度。培养箱充入二氧化碳的作用是______________________。
(4)对于转基因成功的细胞Ⅱ还要进行克隆化培养和__________________检测。
(5)若要预防H7N9禽流感，可用图中的______________作为疫苗。
【答案】(1)显微注射技术 (2)体液(只答特异性不可) B淋巴细胞(浆细胞或已免疫的B淋巴细胞) 既能无限增殖，又能产生特异性抗体 (3)无菌、无毒(缺一不可)
维持培养液的pH (4)(专一)抗体 (5)抗原蛋白
【能力提升】
1．下列有关基因工程和酶的相关叙述，正确的是（
）
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．运载体的化学本质与载体蛋白相同
C．限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸
D．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
【答案】C
【解析】一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，体现酶的专一性。既可以切割目的基因又可以切割质粒，说明含有目的基因的DNA片段和质粒上均含有该限制酶的识别序列，
A项错误；运载体的化学本质是DNA，而细胞膜上载体的化学本质是蛋白质，B项错误；限制酶能识别并切割DNA分子，而烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，C项正确；DNA连接酶可以连接被限制酶切割开的核苷酸之间的磷酸二酯键，不催化氢键的形成，D错误。
2．EcoRI和Sma
I限制酶识别的序列均由6个核苷酸组成，但切割后产生的结果不同，其识别序列和切割点（图中箭头处）分别如下图所示，请据图分析正确的是（
）
A．所有限制酶的识别位点均由6个核苷酸序列组成
B．SmaI限制酶切割后产生的是黏性末端
C．用连接酶连接平末端和黏性末端的连接效率一样
D．细菌细胞内限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵
【答案】D
3．下图为某生物工程操作流程模式图，下列说法正确的是（
）
A．若此图表示基因工程的操作流程，若A为质粒，则B表示重组DNA分子
B．若此图表示动物细胞融合过程，则形成C（杂种细胞）的原理是细胞全能性
C．若此图为试管婴儿的培育过程，则应包括体外受精、细胞培养和胚胎移植等方面
D．若此图为试管牛生产的技术流程图，则获得A（精子）后可直接与B进行体外受精
【答案】C
【解析】A、如果此图表示基因工程的操作流程，若A为质粒，则B表示目的基因，C表示重组DNA分子，故A错误；B、如果此图表示动物细胞融合过程，则形成C（杂种细胞）的原理是细胞膜的流动性，故B错误；C、若此图为试管婴儿的培育过程，则应包括人工受精、细胞培养（早期胚胎培养）和胚胎移植等方面，故C正确；D、若此图为试管牛生产的技术流程图，则获得A（精子）后，需要获能处理才能与B进行体外受精，故D错误．故选C．
4．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、Hind
Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是（
）
A．如果用EcoRⅠ对外源DNA和质粒进行酶切，将多个含有目的基因的DNA片段与多个质粒的酶切产物用DNA连接酶进行连接后，两两连接所形成的产物有三种
B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ酶切点有1个
C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时应使用BamHⅠ和Hind
Ⅲ两种限制酶同时处理
D．一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
【答案】B
5．小麦是世界最主要的粮食作物之一，纹枯病是小麦的三大病害之首，一种野生山羊草具有纹枯病的抗性基因。现用一定剂量的紫外线处理山羊草原生质体，破坏其所有的细胞核。且使染色体片段化，井丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体，与完整的小麦原生质体融合，以获得抗纹枯病的杂种植株。流程如图，下列相关叙述中错误的是（
）
A．①过程利用了酶的专一性原理，获取的原生质体应培养在0．9%的氯化钠溶液中
B．②过程利用了膜的流动性原理，同时含有叶绿体和细胞核是筛选杂种细胞的标志
C．③过程利用了细胞的全能性原理，该过程中需用不同激素不同浓度的培养基培养
D．④过程利用了生物大分子杂交原理进行筛选，最后还需用纹枯病菌感染进行鉴定
【答案】A
6．SOD是一种抗氧化酶，它能催化O2－形成H2O2，增强植物的抗逆性。下图为培育农作物新品种的一种方式。以下叙述正确的是（
）
A．①过程中最常用的方法是采用显微注射技术将SOD基因导入植物细胞
B．②、③分别表示脱分化、再分化过程，均无需严格的无菌操作就可以完成
C．利用植物组织培养生产SOD时，需要将外植体培养到胚状体
D．该育种方式利用了细胞工程和基因工程，能体现细胞的全能性
【答案】D
【解析】①过程中最常用的方法是采用农杆菌转化法将SOD基因导入植物细胞，A项错误；②、③分别表示脱分化、再分化过程，除了需要严格的无菌条件，还需要适宜的温度、pH、一定的营养等条件，B项错误；利用植物组织培养生产SOD时，需要将外植体培养到愈伤组织即可，C项错误；该育种方式利用了细胞工程和基因工程，从植物细胞培育成植物个体，能体现细胞的全能性，D项正确。
7．对于下面制备单克隆抗体过程示意图，不正确的叙述是（
）
A．④中的筛选是通过抗原、抗体反应进行的
B．①表示B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，均是从小鼠的脾脏中提取的
C．②促进细胞融合的方法可以利用灭活的病毒作介导
D．⑤可以无限增殖
【答案】B
8．下图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程。下列叙述不正确的是（
）
A．甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原
B．乙需通过人工诱导细胞融合才能获得
C．用特定的选择培养基对乙筛选，融合细胞均能增殖
D．需对丙进行抗体检测，多次筛选后才可获得丁
【答案】C
【解析】用甲注射小鼠，产生能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，用于制备抗人体胃癌的单克隆抗体，则
9．
内皮素（ET）是一种含21个氨基酸的多肽，具有强烈的血管收缩和促进平滑肌细胞增殖等作用，其功能异常与高血压、糖尿病、癌症等有着密切联系。内皮素(ET)主要通过与靶细胞膜上的ET受体(ETA)结合而发挥生物学效应。ETA是ET的主要受体。科研人员通过构建表达载体，实现ETA基因在大肠杆菌细胞中的高效表达，其过程如下图所示，图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因,限制酶ApaⅠ的识别序列为C↓CCGGG,限制酶XhoⅠ的识别序列为C↓TCGAG。请分析回答：
(1)完成过程①需要加入缓冲液、原料、_______和引物等，,过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是_____________。
(2)过程③和⑤中，限制酶XhoI切割DNA,使__________键断开，用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是_________。
(3)构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子的作用是__________，除图示结构外，完整的基因表达载体还应具有____________等结构(至少写出两个结构)。
(4)过程⑥中,要用CaCl2预先处理大肠杆菌,使其处于容易吸收外界DNA的_______的细胞。
(5)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因,目的是_______________。
【答案】
(1).
逆转录酶和ATP
(2).
使RNA链与DNA链分开
(3).
磷酸二酯键
(4).
使目的基因定向连到运载体上（防止目的基因自身环化）
(5).
RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因的转录
(6).
复制原点、终止子
(7).
感受态
(8).
检测ETA能否表达及表达量
【解析】（1）过程①以mRNA合成目的基因，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和ATP和引物等，过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是使RNA链和DNA链分开。
（4）过程⑥中，要用CaCl2预先处理大肠杆菌，使其成为处于容易吸收外界DNA的感受态的细胞。
（5）利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是检测ETA基因能否表达及表达量。
10．我们日常吃的大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。下面为培育转基因水稻过程示意图，请回答：
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（1）在上述工程中，铁结合蛋白基因称为________，获取该基因后常用________技术进行扩增。
（2）构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制酶分别切割___________和________。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用________处理农杆菌，使重组Ti质粒易于导入。
（3）将含有重组Ti质粒的农杆菌与水稻愈伤组织共同培养时，通过培养基2的筛选培养，可以获得_____________；培养基3与培养基2的区别是_________________。
（4）检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻________________。
【答案】（1）目的基因
PCR
（2）含目的基因的DNA片段
质粒
CaCl2
（3）含有重组质粒的愈伤组织
生长素和细胞分裂素的浓度比例
（4）种子中铁含量
【解析】本题中培育转基因水稻的目的是获得铁含量比普通大米高的大米，因此目的基因为铁结合蛋白基因，要大量获得此基因一般采用PCR技术进行扩增。若构建重组质粒则要用同种限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒。将外植体培养成试管苗的过程要用到不同的培养基，各培养基最明显的差别在于所添加激素的比例不同。
11．为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。其基本流程如下图（Amp表示氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因被SHH基因插入后不表达）。
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请回答：
（1）重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，________（填“需要”或“不需要”）启动子。
（2）步骤②中，用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为________细胞，然后导入重组载体。实验中，用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，未导入质粒的细菌将会死亡，原因是这些细菌不含有________基因。
（3）能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和X gal的培养基上会形成蓝色菌落，易于识别。根据上述原理可以初步判断____（填“蓝色”或“白色”）菌落中的大肠杆菌为重组菌。
（4）将制备的探针加入角化囊肿切片中，探针将与__________形成杂交带，进而判断SHH基因的转录情况。
【答案】（1）需要
（2）感受态
Amp（或氨苄青霉素抗性或抗性）
（3）白色
（4）SHH转录的mRNA（只写mRNA不对）
12．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由
（基团）连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是
末端，其产物长度为
。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有
种不同DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是
。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加
的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是
。
（5）有关质粒描述错误的是（
）
A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子
B、质粒是唯一的载体
C、质粒上有多个酶切位点
D、质粒可在宿主外单独复制
【答案】（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖（2）平
537bp、790bp、661bp（3）4（4）BamH
I
抗生素B
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接（5）B、D
【解析】（1）一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖连接。
（2）限制酶SmaⅠ的酶切位点是CCC↓GGG，其切割产生的是平末端。图1中DNA片段含有两个SmaⅠ酶切位点，被SmaⅠ酶完全切割后出现三个长度的片段，分别是537bp、790bp、661bp．
（4）基因表达载体构建的过程中需要利用限制酶和DNA连接酶。限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点位于目的基因D上，若用这两种酶切割会被破坏目的基因D；载体的两个标记基因上都有限制酶MboⅠ的切割位点，用该酶切割会破坏这两个标记基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和载体。用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基培养。由于同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接，这样会导致部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达。
（5）质粒是能够自我复制的环状DNA分子，质粒上有多个酶切位点，病毒也可以作为载体，质粒必须在宿主细胞内复制。
13．[生物选修3：现代生物技术专题]科学家利用植物体细胞杂交技术成功获得了番茄—马铃薯杂种植株，为了便于杂种细胞的筛选和鉴定，科学家利用红色荧光和绿色荧光分别标记番茄和马铃薯的原生质体膜上的蛋白质，其培育过程如图所示：
（1）植物体细胞杂交依据的生物学原理有______________________。
（2）过程①常用的酶是__________，细胞融合完成的标志是_________________。
（3）植物原生质体融合过程常利用化学试剂__________诱导融合，在鉴定杂种原生质体时可用显微镜观察，根据细胞膜表面的荧光的不同可观察到______种不同的原生质体，当观察到____________________时可判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的。
（4）过程③和过程④依次为______________，过程④中的培养基常添加的植物激素是________________。
（5）若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞中含n条染色体，则“番茄—马铃薯”细胞在有丝分裂后期含______条染色体。若杂种细胞培育成的“番茄—马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于________植株。
【答案】（1）细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
（2）纤维素酶和果胶酶
形成了新的细胞壁
（3）聚乙二醇（或PEG）
5
融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光
（4）脱分化和再分化
生长素和细胞分裂素
（5）2（m+n）
单倍体
AB型；当观察到融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光时，可判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的。
（4）过程③和过程④依次为脱分化和再分化，④再分化过程中的培养基常添加的植物激素是生长素和细胞分裂素。
14．[生物——选修3:现代生物科技专题]
细胞的融合技术有着广泛的应用：有性生殖的生物产生后代需进行受精作用，植物体细胞杂交要进行原生质体的融合，单克隆抗体的制备需进行动物细胞融合。下列为细胞融合的简略过程，请据图回答相关问题：
（1）细胞融合利用的原理是：细胞膜具有___________________。
（2）若图示方法表示培育良种牛，a是某良种牛的精子，则b须发育至_______________才能完成受精作用。哺乳动物受精时在卵细胞膜和透明带的间隙通常观察到两个极体而不是三个，因为____________________________________。
（3）若a、b分别表示两种植物的体细胞，这种育种方法的优点是____________________。
（4）采用图示方法制备单克隆抗体，若a、b分别为小鼠骨髓瘤细胞和小鼠B淋巴细胞，用选择培养基筛选获得d细胞，d细胞的特点是_______________________。然后还需克隆化培养和_________检测才能进一步扩大生产。
（5）若培育转基因动物，形成的受精卵d
常作为培育转基因动物的___________，外源基因导入d之前要构建基因表达载体，下列不属于基因表达载体组件的是（
）。（多选）
A.目的基因
B.终止密码
C.启动子
D.标记基因
E.终止子
F.起始密码
【答案】（1）（一定的）流动性（2）减数第二次分裂中期（MⅡ中期）；多数哺乳动物的第一极体通常不分裂（3）克服了远缘杂交（不亲和的）障碍（或打破生殖隔离）（4）能迅速大量繁殖，又能产生某种专一的抗体；抗体（5）受体细胞；BF
【解析】（1）细胞膜具有流动性，所以两个细胞可以在促融剂的作用下发生融合。
（2）a是某良种牛的精子，则b是卵子，须发育至减数第二次分裂中期才能完成受精作用。多数哺乳动物减数第一次分裂产生的极体一般不分裂。
15．下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。
回答下列问题：
（1）图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用
的方法。②代表的过程是__________。
（2）经过多次传代后，供体细胞中__________的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。
（3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是
。
（4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了
。
【答案】（1）XX或XY
显微操作
胚胎移植
（2）遗传物质（3）卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响（4）动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
【解析】（1）提供体细胞的供体可能为雌性，也可能为雄性，因此图中A（正常细胞核）的性染色体组成为XX或XY。常采用显微操作去核法来去除卵母细胞的细胞核。②过程表示将早期胚胎移入受体，其过程为胚胎移植。
（2）取供体动物的体细胞培养，一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。超过10代继续培养，则其遗传物质（或核型）的稳定性会降低。
（3）克隆动物的细胞核基因来自供体，因此大部分性状与供体相同，但细胞质基因来源于受体（或提供卵母细胞的个体），即卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响，这就决定了克隆动物的性状与供体不完全相同。
（4）克隆动物的培育采用的是核移植技术，核移植技术的原理是：已经分化的动物体细胞核具有全能性。
16．下图为培育“三亲婴儿”的过程示意图，回答下列问题：
（1）①表示
技术，捐献卵母细胞时，通常给捐献者注射激素使其
。
（2）②过程需在培养液中添加抗生素，目的是
；进行③过程前需对精子进行体外培养，目的是
；⑤过程表示
；培育“三亲婴儿”的过程属于
（填“有性”或“无性”）生殖。
（3）已知母亲（甲）患有线粒体肌病（一种线粒体基因缺陷造成的疾病），若母亲（甲）自然受孕，其子女患该病的情况是
，“三亲婴儿”技术能有效避免上述情况发生，原因是
。
【答案】（1）（动物细胞）核移植
超数排卵（2）防止杂菌污染
使精子获能
胚胎移植
有性（3）子女均患病
三亲婴儿的线粒体基因来自捐献者的卵母细胞
（3）线粒体基因通过母本遗传给后代。若患有线粒体肌病（一种线粒体基因缺陷造成的疾病）的母亲（甲）自然受孕，则其子女均患病。三亲婴儿的线粒体基因来自捐献者的卵母细胞，所以“三亲婴儿”技术能有效避免上述情况发生
（1）基因工程的诞生（Ⅰ）
（2）基因工程的原理及技术（含PCR技术）
（Ⅱ）
（3）基因工程的应用（Ⅱ）
（4）蛋白质工程（Ⅰ）
（5）植物的组织培养（Ⅱ）
（6）动物细胞培养与体细胞克隆（Ⅱ）
（7）细胞融合与单克隆抗体（Ⅱ）
【直击高考】
1.（2016江苏卷.9）下列有关细胞工程的叙述，正确的是（
）
A.PEG是促细胞融合剂，可直接诱导植物细胞融合
B.用原生质体制备人工种子，要防止细胞破裂
C.骨髓瘤细胞经免疫处理，可直接获得单克隆抗体
D.核移植克隆的动物，其线粒体DNA来自供卵母体
【答案】D
2.（2015·江苏卷.3）下列关于动物细胞工程和胚胎工程的叙述,正确的是（
）
A.
乳腺细胞比乳腺癌细胞更容易进行离体培养
B.
细胞核移植主要在同种动物、同种组织的细胞之间进行
C.
采用胚胎分割技术产生同卵多胚的数量是有限的
D.
培养早期胚胎的培养液中含维生素、激素等多种能源物质
【答案】C
【解析】乳腺癌细胞的分裂能力比乳腺细胞强，所以乳腺癌细胞比乳腺细胞更容易进行离体培养，A错误；细胞核移植发生在同种或异种生物的细胞之间，B错误；由于胚胎分割形成的多胚中遗传物质少，营养物质少，成功的可能性低，所以胚胎分割技术产生同卵多胚的数量有限，C正确；培养早期胚胎的培养液中维生素、激素起调节作用，不是能源物质，D错误。
3.（2015·广东卷.25）图9为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图
下列叙述正确的是（
）
过程①所用的人β-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得
过程②可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植
过程③可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体
过程④人β-酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译
【答案】AC
4.（2015·北京卷.5）在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（
）
A.用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B.用选择培养基筛法导入目的基因的细胞
C.用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合
D.用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽
【答案】C
【解析】农杆菌侵染细菌是基因工程中常常用到的把目的基因导入植物细胞的方法，A正确；目的基因是否导入了细胞，需要在选择培养基上进行筛选，B正确；在植物细胞组织培养的过程中，需要调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，来达到是对其脱分化和再分化的控制，D也正确；在农杆菌侵染植物细胞的过程中并没有涉及到原生质体的融合，所以C错误。
5.(
2015·重庆卷.6)下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
【解析】人肝细胞中胰岛素基因不表达，因而不存在胰岛素mRNA；A错误。复制原点是基因表达载体复制的起点，而胰岛素基因表达的起点是启动子；B错误。借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来；C正确。启动子与RNA聚合酶结合启动转录过程，终止密码子是翻译的终止信号；D错误。
6.（2016江苏卷.33）（9分）下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
（1）用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用______两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过__________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于__________________态的大肠杆菌。
（2）为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加__________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中_____________。
（3）若BamH
I酶切的DNA末端与Bcl
I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为
，对于该部位，这两种酶
（填“都能”、“都不能”或“只有一种能”）切开。
（4）若用Sau3A
I切图1质粒最多可能获得
种大小不同的DNA片段。
【答案】（1）BclI和HindⅢ
连接
感受
（2）四环素
引物甲和引物丙
（3）
都不能
（4）7
（3）根据BamH
I和Bcl
I的酶切位点，BamH
I酶切的DNA末端与Bcl
I酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为，与两种酶的酶切位点均不同。
（4）根据BamH
、Bcl
I和Sau3A
I的酶切位点，Sau3A
I在质粒上有三个酶切位点，完全酶切可得到记为A、B、C三种片段，若部分位点被切开，可得到AB、AC、BC、ABC四种片段，所以用Sau3A
I切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
7.（2016课标1卷.40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_____________的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________
【答案】（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可）
（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长
含有质粒载体
含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）
二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长
四环素
（3）受体细胞
该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（Tetr
）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。
8.（2016新课标Ⅲ卷.40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR
I、BamH
I和Sau3A
I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR
I、Sau3A
I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH
I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是___________。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【答案】（1）Sau3AⅠ
两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端（2）甲和丙
甲中目的基因插入在启动子的上游，
丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录（3）E·coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
T4DNA连接酶
【解析】（1）由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamH
I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。
9.（2016天津卷.7）
(12分)人血清白蛋白(HSA)
具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A.人血细胞启动子
B.水稻胚乳细胞启动子
C.大肠杆菌启动子
D.农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是__________________________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_______________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。
【答案】（12分）（1）总RNA
（或mRNA）
（2）B（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工（5）HAS
【解析】（1）合成总cDNA需提取细胞中所有的mRNA，然后通过逆转录过程。采用PCR技术扩增HSA基因时，两条引物分别与模板链的5’端结合，扩增方向相反。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与天然的HSA生物学功能一致。
10.（2016新课标2卷.40)[生物——选修3：现代生物科技专题]（15分）
下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。
回答下列问题：
（1）图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用_______的方法。②代表的过程是__________。
（2）经过多次传代后，供体细胞中______的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。
（3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是______。
（4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了__________。
【答案】（15分）（1）XX或XY
显微操作（去核法）
胚胎移植（2）遗传物质
（3）卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响（4）已经分化的动物体细胞核具有全能性。
【解析】（1）提供体细胞的供体可能为雌性，也可能为雄性，因此图中A（正常细胞核）的性染色体组成为XX或XY。常采用显微操作去核法来去除卵母细胞的细胞核。②过程表示将早期胚胎移入受体，其过程为胚胎移植。
（4）克隆动物的培育采用的是核移植技术，核移植技术的原理是：已经分化的动物体细胞核具有全能性。
11.（2016海南卷.31）基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
（1）在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即______和从_______中分离。
（2）利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是______。
（3）在基因表达载体中，启动子是______聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是______。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有_____和______颗粒。
【答案】（15分）（1）人工合成
生物材料（每空2分，共4分，其他合理答案可酌情给分）
（2）cDNA文库中只含有叶细胞已转录（或已表达）的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因（5分，其他合理答案可酌情给分）（3）RNA（2分）
大肠杆菌（或答细菌）（2分）（4）金粉
钨粉（每空1分，共2分）
【解析】（1）获取目的基因主要有两大途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。
（4）将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉
和钨粉颗粒。
12.（2016上海卷.九）回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
在图27所示的质粒PZHZ11（总长为3.6kb，1kb=1000对碱基因）中，lacZ基因编码β-半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。
68.若先用限制酶BamHI切开pZHZ11，然后灭活BamHI酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1kb质粒的细胞颜色为；含3.6kb质粒的细胞颜色为。
69.若将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因长度为kb。
70.上述4.9kb的重组质粒有两种形式，若用BamHI和EcoRI联合酶切其中一种，只能获得1.7kb和3.2kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得kb和kb两种DNA片段。
71.若将人的染色体DNA片段先导入大肠杆菌细胞中克隆并鉴定目的基因，然后再将获得的目的基因转入植物细胞中表达，最后将产物的药物蛋白注入小鼠体内观察其生物功能是否发挥，那么上述过程属于。
A.人类基因工程
B.动物基因工程
C.植物基因工程
D.微生物基因工程
【答案】68.白色
白色和蓝色/白色或蓝色69.1.8
70.1.4
3.5
71.C
【解析】68.3.1kb质粒lacZ基因被破坏，含3.1kb质粒的细胞颜色为白色；加DNA连接酶进行连接，被切下的片段可能反向连接，所含3.6kb质粒的细胞可能含有正常质粒和异常质粒，也可能只含有正常质粒或异常质粒，颜色为白色和蓝色（白色或蓝色）。
69.pZHZ11中0.5kb的BamHI酶切片段被切除后，剩余3.1kb，将两端分别用限制酶BamHI和BglHI切开的单个目的基因插入，形成4.9kb的重组质粒，则目的基因大小为4.9-3.1=1.8kb。
71．题干所述目的是让人的基因在植物细胞中表达，属于植物基因工程。
【考情解读】
本专题以最新基因工程和细胞工程的研究成果为背景，联系其他生物技术工程，综合命题考查基因工程的原理与技术操作、植物组织培养、克隆技术，题型主要以非选择题为主。
【考点突破】
考点一、基因工程的基本工具
1.三种工具比较
限制酶
DNA连接酶
载体
作用
切割目的基因和载体
拼接DNA片段，形成重组DNA
携带目的基因进入受体细胞
作用部位
两核苷酸的脱氧核糖与磷酸间的磷酸二酯键
作用特点(条件)
识别特定的核苷酸序列；在特定位点上切割
E·coli
DNA连接酶只能连接黏性末端；T4DNA连接酶能连接黏性末端和平末端
能在宿主细胞内稳定存在并大量复制；有多个限制酶切割位点；具有特殊的标记基因
【特别提醒】
①DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。
②限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开，而解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。
③DNA连接酶和限制酶的关系
④EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的比较
EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间。
2.如何确定限制酶的种类
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
3.载体上标记基因的标记原理
载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。当含有抗生素抗性基因的载体进入受体细胞后，抗性基因在受体细胞内表达，使受体细胞能够抵抗相应抗生素，所以在受体细胞的培养体系中加入该种抗生素就可以只保留转入载体的受体细胞，原理如下图所示：
【典型例题1】
若要利用某目的基因(见图甲)和P1噬菌体载体(见图乙)构建重组DNA(见图丙)，限制性核酸内切酶的酶切位点分别是BglⅡ(A↓GATCT)、EcoRⅠ(G↓AATTC)和Sau3AⅠ(↓GATC)。下列分析合理的是( )
A.用EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
B.用BglⅡ和EcoRⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
C.用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
D.用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体
【答案】D
【典型例题2】
如图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是( )
A.HindⅢ
B.EcoRⅠ
C.EcoB
D.PstⅠ
【答案】C
【解析】A处有BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ限制酶的切点，使用A～D中的EcoB切割时，才能让目的基因插入到A处。
考点二、基因工程基本操作程序
1．目的基因的获取途径
(1)直接分离：从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取。
(2)人工合成目的基因(常用方法如下)：
①化学合成法：已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板。
②人工合成法：以RNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成。
③利用PCR技术扩增。
2．基因表达载体的构建——重组质粒的构建
(1)表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。
(2)启动子和终止子：启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。
(3)基因表达载体的构建过程：
3.将目的基因导入受体细胞——转化
(1)导入方法因受体细胞的种类不同而异
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法
显微注射技术
感受态细胞(用Ca2＋处理)
受体细胞
受精卵、体细胞
受精卵
原核细胞
(2)转化的实质：目的基因导入受体细胞染色体基因组中并表达和发挥作用。
4．目的基因的检测与鉴定
(1)导入检测：DNA分子杂交技术(使用DNA探针)。
(2)表达检测
(3)个体生物学水平鉴定：如对转基因作物进行抗虫或抗病等的接种实验。
【典型例题1】
下图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法中正确的是( )
A.图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物
B.图示中构建基因表达载体时，需用到一种限制性核酸内切酶
C.一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
D.抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
【答案】D
【典型例题2】
下面图1为某植物育种流程，图2表示利用农杆菌转化法获得某种转基因植物的部分操作步骤。下列相关叙述错误的是( )
A.图1子代Ⅰ与原种保持遗传稳定性，子代Ⅱ和子代Ⅲ选育原理相同
B.图1子代Ⅲ选育显性性状需自交多代，子代Ⅴ可能发生基因突变和染色体变异
C.图2中①过程的完成需要限制酶和DNA连接酶的参与
D.图2中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多种蛋白质
【答案】D
【解析】子代植株Ⅰ是体细胞培养产生的，利用的原理是植物细胞的全能性，属于无性繁殖，所以与原种保持着遗传稳定性；子代植株Ⅱ为基因工程育种产生的、子代植株Ⅲ为杂交育种产生的，选育的原理都为基因重组，A正确；子代Ⅲ的选育过程为杂交育种，如果需要显性纯合子，则一定要自交选育多代；子代Ⅴ的选育过程需要用物理因素、化学因素等来处理生物，所以可能发生基因突变和染色体变异，B正确；图2中①过程是构建基因表达载体，其完成需要限制酶和DNA连接酶的参与，C正确；图2中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多个同种蛋白质分子，D错误。
考点三、植物细胞工程
1.植物组织培养和植物体细胞杂交的比较
名称
植物组织培养
植物体细胞杂交
原理
细胞的全能性
细胞膜具有一定的流动性和细胞的全能性
过程
选材
选取根尖、茎尖、形成层部位最容易诱导脱分化
不同的植物细胞
技术操作
脱分化、再分化等
除脱分化、再分化外，还要用酶解法去除细胞壁，用一定的方法诱导细胞融合
关系
植物组织培养是植物体细胞杂交的基础，植物体细胞杂交所用的技术更复杂
2.植物体细胞杂交过程中杂种细胞类型及检测方法
(1)诱导产物(假设用于杂交的两种植物细胞分别为A、B)：
①未融合的细胞：A和B。
②两两融合的细胞：AA、BB和AB。
③多细胞融合体。
(2)检测方法：对诱导产物中的细胞进行植物组织培养，然后根据得到的植物性状进行判断。
①若只表现出一种植物的性状，说明是未融合细胞。
②若得到的是具有两种亲本性状的植物，说明是杂种植株。
③若得到的是具有两种亲本性状的植物，且一种植物的性状得到加强，则是多细胞融合体。
④若只表现出一种植物的性状且效果得到加强，则是同种细胞融合的结果。
【典型例题1】
下图是通过植物细胞工程技术获得紫杉醇的途径，下列叙述不正确的是( )
A.该途径依据的原理是植物细胞具有全能性
B.过程①需控制好培养基中植物激素的比例
C.经过程①细胞的形态和结构发生了变化
D.过程③需使用液体培养基，有利于细胞增殖
【答案】A
【典型例题2】
“白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短、耐热性强和易于储藏等优点。如图是“白菜—甘蓝”的杂交过程示意图。以下说法正确的是( )
A.除去细胞壁形成原生质体，可运用的酶是纤维素酶、淀粉酶和果胶酶
B.通常可诱导上述原生质体相互融合的方法是PEG和灭活的病毒诱导
C.杂种细胞形成的标志是诱导产生了新的细胞壁
D.愈伤组织形成“白菜—甘蓝”植物体必须经过脱分化和再分化两个过程
【答案】C
【解析】除去细胞壁的酶有纤维素酶和果胶酶；诱导植物原生质体融合不能用灭活的病毒；杂种细胞形成的标志是诱导产生了新的细胞壁；愈伤组织形成“白菜—甘蓝”植物体属于再分化过程。
考点四、动物细胞培养与体细胞克隆
1.动物细胞培养与动物体细胞核移植的比较
项目
动物细胞培养
动物体细胞核移植
原理
细胞增殖
动物细胞核的全能性
过程
动物组织块↓剪碎、胰蛋白酶处理细胞悬液↓转入培养液中原代培养↓胰蛋白酶处理细胞悬液↓分瓶、转入培养液中传代培养
结果
获得细胞群
获得与供体遗传物质基本相同的个体
2.动物体细胞核移植技术和克隆动物
(1)动物体细胞核移植技术的过程
(2)原理：动物体细胞核具有全能性。
(3)结果：产生新个体。
(4)应用：①加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；②保护濒危物种；③生产医用蛋白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植。
【典型例题】
如图所示为哺乳动物生殖的过程。其中b为卵细胞，c为体细胞。下列叙述不正确的是( )
A.形成动物①②的过程分别属于有性生殖和无性生殖
B.产生动物②的过程中可发生基因突变、基因重组等
C.动物②的产生表明动物细胞的细胞核具有全能性
D.a、b、c细胞的形成过程，仅c细胞为有丝分裂
【答案】B
考点五、动物细胞融合与单克隆抗体的制备
1.动物细胞融合
(1)原理：细胞膜的流动性。
(2)融合方法：聚乙二醇(PEG)、灭活的病毒、电激等。
(3)意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能，也为制造单克隆抗体开辟了新途径。
2.单克隆抗体
(1)制备过程
(2)优点：特异性强、灵敏度高，可大量制备。
(3)用途：作为诊断试剂；用于治疗疾病和运载药物。
【方法点拨】制备单克隆抗体过程中两次筛选的方法及目的
项目
第一次筛选
第二次筛选
筛选原因
诱导融合后得到多种杂交细胞，另外还有未融合的细胞
由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择性培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞
筛选方法
用特定的选择培养基筛选：未融合的细胞和同种细胞融合后形成的细胞(“BB”细胞、“瘤瘤”细胞)都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞(“B瘤”细胞)才能生长
用多孔培养皿培养，在每个孔只有一个杂交瘤细胞的情况下开始克隆化培养和抗体检测，经多次筛选得到能产生特异性抗体的细胞群
筛选目的
得到杂交瘤细胞
得到能分泌所需抗体的杂交瘤细胞
【典型例题】
单克隆抗体的特点是特异性强、灵敏度高、可以大量制备，已被广泛应用于疾病的诊断和治疗。用H7N9病毒制备单克隆抗体的流程如下图所示：
(1)过程③常用的方法是_________________________________________________________。
(2)向小鼠体内注射抗原蛋白，使小鼠产生________免疫。从小鼠体内分离的细胞Ⅰ是___________________________，细胞Ⅱ应具有的特点是____________________________。
(3)体外培养细胞Ⅱ，首先应保证其处于______________________________的环境中，其次需要提供充足的营养和适宜的温度。培养箱充入二氧化碳的作用是______________________。
(4)对于转基因成功的细胞Ⅱ还要进行克隆化培养和__________________检测。
(5)若要预防H7N9禽流感，可用图中的______________作为疫苗。
【答案】(1)显微注射技术 (2)体液(只答特异性不可) B淋巴细胞(浆细胞或已免疫的B淋巴细胞) 既能无限增殖，又能产生特异性抗体 (3)无菌、无毒(缺一不可)
维持培养液的pH (4)(专一)抗体 (5)抗原蛋白
【能力提升】
1．下列有关基因工程和酶的相关叙述，正确的是（
）
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．运载体的化学本质与载体蛋白相同
C．限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸
D．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
【答案】C
【解析】一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，体现酶的专一性。既可以切割目的基因又可以切割质粒，说明含有目的基因的DNA片段和质粒上均含有该限制酶的识别序列，
A项错误；运载体的化学本质是DNA，而细胞膜上载体的化学本质是蛋白质，B项错误；限制酶能识别并切割DNA分子，而烟草花叶病毒的遗传物质是RNA，C项正确；DNA连接酶可以连接被限制酶切割开的核苷酸之间的磷酸二酯键，不催化氢键的形成，D错误。
2．EcoRI和Sma
I限制酶识别的序列均由6个核苷酸组成，但切割后产生的结果不同，其识别序列和切割点（图中箭头处）分别如下图所示，请据图分析正确的是（
）
A．所有限制酶的识别位点均由6个核苷酸序列组成
B．SmaI限制酶切割后产生的是黏性末端
C．用连接酶连接平末端和黏性末端的连接效率一样
D．细菌细胞内限制酶可以切割外源DNA，防止外源DNA入侵
【答案】D
3．下图为某生物工程操作流程模式图，下列说法正确的是（
）
A．若此图表示基因工程的操作流程，若A为质粒，则B表示重组DNA分子
B．若此图表示动物细胞融合过程，则形成C（杂种细胞）的原理是细胞全能性
C．若此图为试管婴儿的培育过程，则应包括体外受精、细胞培养和胚胎移植等方面
D．若此图为试管牛生产的技术流程图，则获得A（精子）后可直接与B进行体外受精
【答案】C
【解析】A、如果此图表示基因工程的操作流程，若A为质粒，则B表示目的基因，C表示重组DNA分子，故A错误；B、如果此图表示动物细胞融合过程，则形成C（杂种细胞）的原理是细胞膜的流动性，故B错误；C、若此图为试管婴儿的培育过程，则应包括人工受精、细胞培养（早期胚胎培养）和胚胎移植等方面，故C正确；D、若此图为试管牛生产的技术流程图，则获得A（精子）后，需要获能处理才能与B进行体外受精，故D错误．故选C．
4．图1为某种质粒简图，图2表示某外源DNA上的目的基因，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ、Hind
Ⅲ的酶切位点。下列有关叙述错误的是（
）
A．如果用EcoRⅠ对外源DNA和质粒进行酶切，将多个含有目的基因的DNA片段与多个质粒的酶切产物用DNA连接酶进行连接后，两两连接所形成的产物有三种
B．如果将一个外源DNA分子和一个质粒分别用EcoRⅠ酶切后，再用DNA连接酶连接，形成一个含有目的基因的重组DNA，此重组DNA中EcoRⅠ酶切点有1个
C．为了防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，酶切时应使用BamHⅠ和Hind
Ⅲ两种限制酶同时处理
D．一个图1所示的质粒分子经EcoRⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团
【答案】B
5．小麦是世界最主要的粮食作物之一，纹枯病是小麦的三大病害之首，一种野生山羊草具有纹枯病的抗性基因。现用一定剂量的紫外线处理山羊草原生质体，破坏其所有的细胞核。且使染色体片段化，井丧失再生能力。再利用此原生质体作为部分遗传物质的供体，与完整的小麦原生质体融合，以获得抗纹枯病的杂种植株。流程如图，下列相关叙述中错误的是（
）
A．①过程利用了酶的专一性原理，获取的原生质体应培养在0．9%的氯化钠溶液中
B．②过程利用了膜的流动性原理，同时含有叶绿体和细胞核是筛选杂种细胞的标志
C．③过程利用了细胞的全能性原理，该过程中需用不同激素不同浓度的培养基培养
D．④过程利用了生物大分子杂交原理进行筛选，最后还需用纹枯病菌感染进行鉴定
【答案】A
6．SOD是一种抗氧化酶，它能催化O2－形成H2O2，增强植物的抗逆性。下图为培育农作物新品种的一种方式。以下叙述正确的是（
）
A．①过程中最常用的方法是采用显微注射技术将SOD基因导入植物细胞
B．②、③分别表示脱分化、再分化过程，均无需严格的无菌操作就可以完成
C．利用植物组织培养生产SOD时，需要将外植体培养到胚状体
D．该育种方式利用了细胞工程和基因工程，能体现细胞的全能性
【答案】D
【解析】①过程中最常用的方法是采用农杆菌转化法将SOD基因导入植物细胞，A项错误；②、③分别表示脱分化、再分化过程，除了需要严格的无菌条件，还需要适宜的温度、pH、一定的营养等条件，B项错误；利用植物组织培养生产SOD时，需要将外植体培养到愈伤组织即可，C项错误；该育种方式利用了细胞工程和基因工程，从植物细胞培育成植物个体，能体现细胞的全能性，D项正确。
7．对于下面制备单克隆抗体过程示意图，不正确的叙述是（
）
A．④中的筛选是通过抗原、抗体反应进行的
B．①表示B淋巴细胞和骨髓瘤细胞，均是从小鼠的脾脏中提取的
C．②促进细胞融合的方法可以利用灭活的病毒作介导
D．⑤可以无限增殖
【答案】B
8．下图表示抗人体胃癌的单克隆抗体的制备过程。下列叙述不正确的是（
）
A．甲是能与抗人体胃癌抗体特异性结合的抗原
B．乙需通过人工诱导细胞融合才能获得
C．用特定的选择培养基对乙筛选，融合细胞均能增殖
D．需对丙进行抗体检测，多次筛选后才可获得丁
【答案】C
【解析】用甲注射小鼠，产生能分泌特异性抗体的B淋巴细胞，用于制备抗人体胃癌的单克隆抗体，则
9．
内皮素（ET）是一种含21个氨基酸的多肽，具有强烈的血管收缩和促进平滑肌细胞增殖等作用，其功能异常与高血压、糖尿病、癌症等有着密切联系。内皮素(ET)主要通过与靶细胞膜上的ET受体(ETA)结合而发挥生物学效应。ETA是ET的主要受体。科研人员通过构建表达载体，实现ETA基因在大肠杆菌细胞中的高效表达，其过程如下图所示，图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因,限制酶ApaⅠ的识别序列为C↓CCGGG,限制酶XhoⅠ的识别序列为C↓TCGAG。请分析回答：
(1)完成过程①需要加入缓冲液、原料、_______和引物等，,过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是_____________。
(2)过程③和⑤中，限制酶XhoI切割DNA,使__________键断开，用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是_________。
(3)构建的重组表达载体，目的基因上游的启动子的作用是__________，除图示结构外，完整的基因表达载体还应具有____________等结构(至少写出两个结构)。
(4)过程⑥中,要用CaCl2预先处理大肠杆菌,使其处于容易吸收外界DNA的_______的细胞。
(5)利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因,目的是_______________。
【答案】
(1).
逆转录酶和ATP
(2).
使RNA链与DNA链分开
(3).
磷酸二酯键
(4).
使目的基因定向连到运载体上（防止目的基因自身环化）
(5).
RNA聚合酶识别和结合部位，驱动基因的转录
(6).
复制原点、终止子
(7).
感受态
(8).
检测ETA能否表达及表达量
【解析】（1）过程①以mRNA合成目的基因，所以需要加入缓冲液、原料、逆转录酶和ATP和引物等，过程①的最后阶段要将反应体系的温度升高到95℃，其目的是使RNA链和DNA链分开。
（4）过程⑥中，要用CaCl2预先处理大肠杆菌，使其成为处于容易吸收外界DNA的感受态的细胞。
（5）利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是检测ETA基因能否表达及表达量。
10．我们日常吃的大米中铁含量极低，科研人员通过基因工程等技术，培育出了铁含量比普通大米高60%的转基因水稻，改良了稻米的营养品质。下面为培育转基因水稻过程示意图，请回答：
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（1）在上述工程中，铁结合蛋白基因称为________，获取该基因后常用________技术进行扩增。
（2）构建重组Ti质粒时，通常要用同种限制酶分别切割___________和________。将重组Ti质粒转入农杆菌时，可以用________处理农杆菌，使重组Ti质粒易于导入。
（3）将含有重组Ti质粒的农杆菌与水稻愈伤组织共同培养时，通过培养基2的筛选培养，可以获得_____________；培养基3与培养基2的区别是_________________。
（4）检测培育转基因水稻的目的是否达到，需要检测转基因水稻________________。
【答案】（1）目的基因
PCR
（2）含目的基因的DNA片段
质粒
CaCl2
（3）含有重组质粒的愈伤组织
生长素和细胞分裂素的浓度比例
（4）种子中铁含量
【解析】本题中培育转基因水稻的目的是获得铁含量比普通大米高的大米，因此目的基因为铁结合蛋白基因，要大量获得此基因一般采用PCR技术进行扩增。若构建重组质粒则要用同种限制酶切割含目的基因的DNA片段和质粒。将外植体培养成试管苗的过程要用到不同的培养基，各培养基最明显的差别在于所添加激素的比例不同。
11．为探究SHH基因与角化囊肿发生的相关性，科研人员利用SHH基因的非模板链转录合成的RNA作为探针，进行分子杂交实验，以检测SHH基因在角化囊肿中的表达情况。其基本流程如下图（Amp表示氨苄青霉素抗性基因；LacZ基因被SHH基因插入后不表达）。
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请回答：
（1）重组载体中SHH基因转录合成RNA探针时，________（填“需要”或“不需要”）启动子。
（2）步骤②中，用Ca2＋处理大肠杆菌，使之成为________细胞，然后导入重组载体。实验中，用添加氨苄青霉素的培养基培养大肠杆菌，未导入质粒的细菌将会死亡，原因是这些细菌不含有________基因。
（3）能表达LacZ基因的大肠杆菌在含有IPTG和X gal的培养基上会形成蓝色菌落，易于识别。根据上述原理可以初步判断____（填“蓝色”或“白色”）菌落中的大肠杆菌为重组菌。
（4）将制备的探针加入角化囊肿切片中，探针将与__________形成杂交带，进而判断SHH基因的转录情况。
【答案】（1）需要
（2）感受态
Amp（或氨苄青霉素抗性或抗性）
（3）白色
（4）SHH转录的mRNA（只写mRNA不对）
12．图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶切割的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。请回答下列问题：
（1）图1的一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由
（基团）连接。
（2）若用限制酶SmaⅠ完全切割图1中DNA片段，产生的末端是
末端，其产物长度为
。
（3）若图1中虚线方框内的碱基对被T－A碱基对替换，那么基因D就突变为基因d。从杂合子分离出图1及其对应的DNA片段，用限制酶SmaⅠ完全切割，产物中共有
种不同DNA片段。
（4）若将图2中质粒和目的基因D通过同种限制酶处理后进行，形成重组质粒，那么应选用的限制酶是
。在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加
的培养基进行培养。经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是
。
（5）有关质粒描述错误的是（
）
A、质粒是能够自我复制的环状DNA分子
B、质粒是唯一的载体
C、质粒上有多个酶切位点
D、质粒可在宿主外单独复制
【答案】（1）脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖（2）平
537bp、790bp、661bp（3）4（4）BamH
I
抗生素B
同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接（5）B、D
【解析】（1）一条脱氧核苷酸链中相邻两个碱基之间依次由脱氧核糖、磷酸、脱氧核糖连接。
（2）限制酶SmaⅠ的酶切位点是CCC↓GGG，其切割产生的是平末端。图1中DNA片段含有两个SmaⅠ酶切位点，被SmaⅠ酶完全切割后出现三个长度的片段，分别是537bp、790bp、661bp．
（4）基因表达载体构建的过程中需要利用限制酶和DNA连接酶。限制酶MspⅠ和SmaⅠ的切割位点位于目的基因D上，若用这两种酶切割会被破坏目的基因D；载体的两个标记基因上都有限制酶MboⅠ的切割位点，用该酶切割会破坏这两个标记基因，因此只能选用限制酶BamHⅠ切割外源DNA分子和载体。用限制酶BamHⅠ切割质粒会破坏抗生素A抗性基因，但不会破坏抗生素B抗性基因，所以导入重组质粒的大肠杆菌能在含有抗生素B的培养基上生存，因此为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加抗生素B的培养基培养。由于同种限制酶切割形成的末端相同，部分目的基因D与质粒反向连接，这样会导致部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达。
（5）质粒是能够自我复制的环状DNA分子，质粒上有多个酶切位点，病毒也可以作为载体，质粒必须在宿主细胞内复制。
13．[生物选修3：现代生物技术专题]科学家利用植物体细胞杂交技术成功获得了番茄—马铃薯杂种植株，为了便于杂种细胞的筛选和鉴定，科学家利用红色荧光和绿色荧光分别标记番茄和马铃薯的原生质体膜上的蛋白质，其培育过程如图所示：
（1）植物体细胞杂交依据的生物学原理有______________________。
（2）过程①常用的酶是__________，细胞融合完成的标志是_________________。
（3）植物原生质体融合过程常利用化学试剂__________诱导融合，在鉴定杂种原生质体时可用显微镜观察，根据细胞膜表面的荧光的不同可观察到______种不同的原生质体，当观察到____________________时可判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的。
（4）过程③和过程④依次为______________，过程④中的培养基常添加的植物激素是________________。
（5）若番茄细胞内有m条染色体，马铃薯细胞中含n条染色体，则“番茄—马铃薯”细胞在有丝分裂后期含______条染色体。若杂种细胞培育成的“番茄—马铃薯”植株为四倍体，则此杂种植株的花粉经离体培育得到的植株属于________植株。
【答案】（1）细胞膜的流动性、植物细胞的全能性
（2）纤维素酶和果胶酶
形成了新的细胞壁
（3）聚乙二醇（或PEG）
5
融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光
（4）脱分化和再分化
生长素和细胞分裂素
（5）2（m+n）
单倍体
AB型；当观察到融合的细胞表面既有红色荧光又有绿色荧光时，可判断该原生质体是由番茄和马铃薯融合而成的。
（4）过程③和过程④依次为脱分化和再分化，④再分化过程中的培养基常添加的植物激素是生长素和细胞分裂素。
14．[生物——选修3:现代生物科技专题]
细胞的融合技术有着广泛的应用：有性生殖的生物产生后代需进行受精作用，植物体细胞杂交要进行原生质体的融合，单克隆抗体的制备需进行动物细胞融合。下列为细胞融合的简略过程，请据图回答相关问题：
（1）细胞融合利用的原理是：细胞膜具有___________________。
（2）若图示方法表示培育良种牛，a是某良种牛的精子，则b须发育至_______________才能完成受精作用。哺乳动物受精时在卵细胞膜和透明带的间隙通常观察到两个极体而不是三个，因为____________________________________。
（3）若a、b分别表示两种植物的体细胞，这种育种方法的优点是____________________。
（4）采用图示方法制备单克隆抗体，若a、b分别为小鼠骨髓瘤细胞和小鼠B淋巴细胞，用选择培养基筛选获得d细胞，d细胞的特点是_______________________。然后还需克隆化培养和_________检测才能进一步扩大生产。
（5）若培育转基因动物，形成的受精卵d
常作为培育转基因动物的___________，外源基因导入d之前要构建基因表达载体，下列不属于基因表达载体组件的是（
）。（多选）
A.目的基因
B.终止密码
C.启动子
D.标记基因
E.终止子
F.起始密码
【答案】（1）（一定的）流动性（2）减数第二次分裂中期（MⅡ中期）；多数哺乳动物的第一极体通常不分裂（3）克服了远缘杂交（不亲和的）障碍（或打破生殖隔离）（4）能迅速大量繁殖，又能产生某种专一的抗体；抗体（5）受体细胞；BF
【解析】（1）细胞膜具有流动性，所以两个细胞可以在促融剂的作用下发生融合。
（2）a是某良种牛的精子，则b是卵子，须发育至减数第二次分裂中期才能完成受精作用。多数哺乳动物减数第一次分裂产生的极体一般不分裂。
15．下图表示通过核移植等技术获得某种克隆哺乳动物（二倍体）的流程。
回答下列问题：
（1）图中A表示正常细胞核，染色体数为2n，则其性染色体的组成可为____________。过程①表示去除细胞核，该过程一般要在卵母细胞培养至适当时期再进行，去核时常采用
的方法。②代表的过程是__________。
（2）经过多次传代后，供体细胞中__________的稳定性会降低，因此，选材时必须关注传代次数。
（3）若获得的克隆动物与供体动物性状不完全相同，从遗传物质的角度分析其原因是
。
（4）与克隆羊“多莉（利）”培养成功一样，其他克隆动物的成功获得也证明了
。
【答案】（1）XX或XY
显微操作
胚胎移植
（2）遗传物质（3）卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的性状产生影响（4）动物已分化体细胞的细胞核具有全能性
【解析】（1）提供体细胞的供体可能为雌性，也可能为雄性，因此图中A（正常细胞核）的性染色体组成为XX或XY。常采用显微操作去核法来去除卵母细胞的细胞核。②过程表示将早期胚胎移入受体，其过程为胚胎移植。
（2）取供体动物的体细胞培养，一般选用传代10代以内的细胞，因为10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型，保证了供体细胞正常的遗传基础。超过10代继续培养，则其遗传物质（或核型）的稳定性会降低。
（3）克隆动物的细胞核基因来自供体，因此大部分性状与供体相同，但细胞质基因来源于受体（或提供卵母细胞的个体），即卵母细胞的细胞质中的遗传物质会对克隆动物的形状产生影响，这就决定了克隆动物的性状与供体不完全相同。
（4）克隆动物的培育采用的是核移植技术，核移植技术的原理是：已经分化的动物体细胞核具有全能性。
16．下图为培育“三亲婴儿”的过程示意图，回答下列问题：
（1）①表示
技术，捐献卵母细胞时，通常给捐献者注射激素使其
。
（2）②过程需在培养液中添加抗生素，目的是
；进行③过程前需对精子进行体外培养，目的是
；⑤过程表示
；培育“三亲婴儿”的过程属于
（填“有性”或“无性”）生殖。
（3）已知母亲（甲）患有线粒体肌病（一种线粒体基因缺陷造成的疾病），若母亲（甲）自然受孕，其子女患该病的情况是
，“三亲婴儿”技术能有效避免上述情况发生，原因是
。
【答案】（1）（动物细胞）核移植
超数排卵（2）防止杂菌污染
使精子获能
胚胎移植
有性（3）子女均患病
三亲婴儿的线粒体基因来自捐献者的卵母细胞
（3）线粒体基因通过母本遗传给后代。若患有线粒体肌病（一种线粒体基因缺陷造成的疾病）的母亲（甲）自然受孕，则其子女均患病。三亲婴儿的线粒体基因来自捐献者的卵母细胞，所以“三亲婴儿”技术能有效避免上述情况发生
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