(共28张PPT)
第3课时 血红蛋白的提取和分离
知识点
教学突破策略
学习技巧点拨
凝胶色谱法的用途
介绍凝胶色谱法,引导查阅资料了解该方法的其他用途
阅读教材,查阅资料
凝胶色谱法分离蛋白质的原理
结合教材插图,直观认识凝胶色谱法分离蛋白质的过程,并以血红蛋白的提取与分离为例,理解其原理
结合教材插图和文字叙述分析理解
缓冲溶液的组成、作用机理、配制方法和应用
复习血浆pH的稳态,结合生活中的缓冲现象,让学生充分理解缓冲溶液的重要性,进而引入新课的学习
回顾已有知识,联系生活现象,分析理解,查阅资料
电泳的基本原理和类型
做演示实验,给学生以直观印象,然后分析电泳原理并介绍电泳类型
运用比较的方法辨析,理顺相关概念间的关系
1.概念:也称作①
,是根据②
分离蛋白质的有效方法。
2.原理
(1)由③
构成的凝胶,内部有许多贯穿的通道。
(2)当蛋白质通过凝胶时,相对分子质量④
的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程⑤
,移动速度⑥
,而相对分子质量⑦
的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在外部移动,路程⑧
,移动速度⑨
,从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。
一、凝胶色谱法
分配色谱法
相对分子质量的大小
较慢
多糖类化合物
较小
较长
较大
较短
较快
1.作用:在一定范围内,抵制外界的⑩
对溶液pH的影响,维持pH基本不变。
2.配制:由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成,通过调节缓冲剂的
就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
1.概念:指
在电场的作用下发生迁移的过程。
2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷
的电极移动。
酸和碱
相反
11
12
13
比例
带电粒子
二、缓冲溶液
三、电泳
3.作用:电泳利用了待分离样品中各种分子
的差异及分子本身的
的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。
4.方法:常用的电泳方法有
和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用
。
带电性质
14
大小、形状
15
琼脂糖凝胶电泳
16
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
17
1.样品处理:通过红细胞的洗涤、
、离心等操作收集血红蛋白溶液。
2.粗分离:即透析。将血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入一定量适宜浓度的
中,透析12
h。
3.纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量
的杂质蛋白除去。
4.纯度鉴定:在鉴定的方法中,使用最多的是
。
血红蛋白的释放
18
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
21
磷酸缓冲液
19
较大
20
四、实验操作
1.蛋白质的分离和提取的原理是什么
知识点一:凝胶色谱法
根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同蛋白质。
答案：
2.透析的目的是什么 依据了什么原理 什么叫缓冲溶液 缓冲溶液有何作用 你认为在血红蛋白分离的整个实验中用的缓冲液是什么 用它的目的是什么
答案:透析的目的在于去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的蛋白质,透析依据的原理是半透膜只允许小分子透过,不允许大分子透过。在一定的范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫作缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫作缓冲溶液。在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱对溶液的pH的影响,维持pH基本不变。
使用的是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性)。
知识总结
1.蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等,可以作为分离不同种类的蛋白质的依据。
2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理:
相对分
子质量
直径大小
运动方式
运动
速度
运动
路程
洗脱次序
大
大于凝胶颗粒空隙直径、被排阻在外面
垂直向下移动
较快
较短
先从凝胶柱洗脱出来
小
小于凝胶颗粒空隙直径,可以进入颗粒内部
垂直向下移动,无规则扩散进入凝胶颗粒
较慢
较长
后从凝胶柱洗脱出来
例1 (2014年桐城期末)非蛋白物质X的相对分子质量比果胶酶的相对分子质量小,试剂P能使其溶液显红色。为验证物质X的分子量比果胶酶的相对分子质量小,某同学利用如图实验装置进行实验:配制20
mL一定浓度的物质X和果胶酶的混合液,并将其中的10
mL混合液加入实验装置中,得到滤液。请以混合液和滤液为材料,写出继续实验的思路,并预测实验结果。
【解析】根据图示装置判断分离非蛋白物质X与
果胶酶的方法是凝胶色谱法,X的相对分子质量比
果胶酶的相对分子质量小,将它们的混合液加到装置中,先流出来的是果胶酶;混合液中既有X又有果胶酶,加试剂P显红色,加双缩脲试剂显紫色;滤液中只含果胶酶,加双缩脲试剂显紫色。
【答案】在A1、A2两支试管中加入混合液,在B1、B2两支试管中加入滤液;然后在A1、B1中加入双缩脲试剂,在A2、B2中加入试剂P;观察到A1、B1中的溶液均变为紫色;A2中的溶液均变为红色,而B2中的溶液没有明显颜色变化。
技巧归纳
理解凝胶色谱法的原理要注意两点:一是凝胶的作用。凝胶可以允许小分子物质从中穿过,而不允许大分子物质通过(大分子物质只能从凝胶外通过)。二是经过的路程长短以及运动速度的大小。因为小分子物质要通过凝胶,所以经过的路程长,速度慢,而大分子物质通过的路程短,速度快。最后的结果是在同一个起点的大分子物质和小分子物质因经过的路程及速度不同,而导致它们在装置末端分开。
知识点二:电泳
1.电泳常见的种类有哪些
答案:①琼脂糖凝胶电泳:由于琼脂糖本身不带电荷,所以,各种分子在电场中的迁移速度因各种分子的带电性质的差异以及分子大小、形状的不同而不同,从而得以分离。
②聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵)和催化剂(四甲基乙二胺)的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。故常用于测定蛋白质的相对分子质量。
2.凝胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同
答案:凝胶色谱法分离分子是依据相对分子质量大小,利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来,而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异,以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现在电场中各种分子的分离。
知识总结
1.蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质的大小相关;在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的大小相关外,蛋白质的带电性质影响其在电场中的运动方向及其在电场中的电量、形状、运动速度。
2.电泳现象:在盛有红褐色Fe(OH)3胶体的U形管的两个管口,各插入一个电极。通直流电后,发现阴极附近的颜色逐渐变深,阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe(OH)3胶体粒子带正电荷,在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下,带电粒子发生迁移的现象就叫作电泳。
例2
右图表示对某蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素),下列相关叙述不正确的是( )。
A.蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电,电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B.蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少
C.蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于其相对分子质量的大小
D.电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种,但也
可能只有一种
B
【解析】蛋白质的氨基与羧基可发生解离,使其带正电或负电,在电场中发生迁移。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷,故其移动速度与本身所带电荷无关,而由其分子大小决定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链,故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链),也可能是两种蛋白质。
知识点三:血红蛋白分离实验操作
1.如何洗涤红细胞 洗涤的目的是什么
红细胞洗涤方法是分离(低速短时间离心)→用胶头吸管吸去上层透明黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此重复三次)。红细胞的洗涤目的是去除杂蛋白,以利于后续步骤的分离纯化。
答案：
2.如何分离血红蛋白溶液
搅拌好的混合液
混合液分层(第1层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,即脂溶性物质的沉淀层,第3层是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质沉淀)→过滤除去杂质得血红蛋白溶液。
答案：
3.如何制作和填装凝胶色谱柱 该过程中需注意的问题有哪些 为什么凝胶的装填要紧密、均匀
答案:制作凝胶色谱柱:①取长40
cm,内径为1.6
cm的玻璃管,两端需用砂纸磨平。②柱底制作:橡皮塞打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100目的尼龙纱包好。③柱顶制作:橡皮塞打孔→安装玻璃管。④组装:将上述三者按相应位置组装,并在下端出口处连接带开关的尼龙管,尼龙管放入收集器。
填装凝胶色谱柱:固定色谱柱→称好凝胶并用蒸馏水充分溶胀配成凝胶悬浮液,并将悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内→装填并用20
mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12
h
。
需要注意的问题:①由于干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大,因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需的凝胶量。②色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现有气泡,必须重装。
如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,影响分离的效果。
例3 下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图1)和洗脱(图2)示意图,请据图回答下列问题。
(1)在加样示意图(图1)中,正确的加样顺序是 。
(2)用吸管加样时,应注意正确操作,包括
、
、
。
(3)等样品 时,才加入缓冲液。
(4)待 接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每 mL收集一管,连续收集。
④①②③
不要触及凝胶面
贴着管壁加样
使吸管管口沿管壁环绕移动
完全进入凝胶层
红色的蛋白质
5
【解析】进行凝胶色谱操作加样时,加样前,打开色谱柱下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,用吸管小心地将1
mL透析后的样品加到色谱柱的顶端,注意不可破坏凝胶面。吸管应贴着管壁加样,待样品完全进入凝胶层后才可关闭下端出口,加入缓冲液,待红色蛋白质接近色谱柱底端时,用吸管收集流出液,每5
mL收集一管,连续收集。
技巧归纳
凝胶色谱操作是本实验的关键,该操作要注意以下几个方面:
1.实验结果如果不理想,需要重做时,必须进行凝胶色谱柱的再生。一般情况下,凝胶不会与其他溶质发生任何作用,因此,在一次分离以后,稍加平衡就可以进行下一次的操作。平衡时,需用3倍柱体积的洗脱液过柱。
2.如果实验操作中有一些杂质污染了色谱柱,可以用物质的量浓度为0.2
mol/L的氢氧化钠和物质的量浓度为0.5
mol/L的氯化钠混合液处理交联葡聚糖凝胶。
3.如果凝胶长期不用,可以加入抑菌剂低温保存,使用时再进行充分的平衡。
1.以下与凝胶色谱的分离原理有关的叙述,错误的是( )。
A.凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道
B.相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,通过的路程较短,移动速度较快
C.样品中相对分子质量较小的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最大的分子最后流出
D.如果凝胶装填得不够紧密、均匀,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序
C
【解析】凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢。因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后流出,从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序,影响分离的效果。
2.有关血红蛋白分离的完整过程的叙述,错误的是( )。
A.血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定
B.首先为样品的处理:洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液
C.然后为粗分离:经过透析去除分子量较小的杂质
D.最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化
D
【解析】血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除分子量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去,即样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
3.下列有关提取和分离血红蛋白的叙述不正确的是( )。
A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质,此为样品的粗提取
C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化
D.可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
B
【解析】B项错误,粗分离透析除去分子较小的杂质。
4.(2014年衡南期末)下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置,请回答下列问题:
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分,其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有
功能。
(2)甲装置中,B是血红蛋白溶液,则A是
;
乙装置中C溶液的作用是 。
【解析】以实验装置图为信息载体,考查蛋白质的提取与分离。图甲是透析装置,加入磷酸缓冲液,通过它可去除样品中分子量较小的杂质;乙装置方法叫凝胶色谱法,它是依据蛋白质相对分子质量的大小来分离蛋白质的。
运输
磷酸缓冲液
洗脱血红蛋白
(3)甲装置用于
,目的是
。用乙装置分离蛋白质的方法叫
,是根据
分离蛋白质的有效方法。
(4)用乙装置分离血红蛋白时,待
时,用试管收集流出液,每5
mL收集一管,连续收集。
透析(粗分离)
去除样品中分子量较小的杂质
凝胶色谱法
相对分子质量的大小
红色的蛋白质接近色谱柱底端第3课时 血红蛋白的提取和分离
1.了解凝胶色谱法的用途和凝胶色谱法分离蛋白质的原理。
2.通过尝试从血液中提取和分离血红蛋白,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。
3.理解缓冲溶液的组成和作用机理,熟悉一般缓冲液的配制方法。
4.理解电泳的基本原理,了解常用的电泳方法。
一、凝胶色谱法
1.概念:也称作①,是根据②分离蛋白质的有效方法。
2.原理
(1)由③构成的凝胶,内部有许多贯穿的通道。
(2)当蛋白质通过凝胶时,相对分子质量④的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程⑤,移动速度⑥,而相对分子质量⑦的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在外部移动,路程⑧,移动速度⑨,从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。
二、缓冲溶液
1.作用:在一定范围内,抵制外界的⑩对溶液pH的影响,维持pH基本不变。
2.配制:由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成,通过调节缓冲剂的就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
三、电泳
1.概念:指在电场的作用下发生迁移的过程。
2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷的电极移动。
3.作用:电泳利用了待分离样品中各种分子的差异及分子本身的的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。
4.方法:常用的电泳方法有和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用。 四、实验操作
1.样品处理:通过红细胞的洗涤、、离心等操作收集血红蛋白溶液。
2.粗分离:即透析。将血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入一定量适宜浓度的中,透析12
h。
3.纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量的杂质蛋白除去。
4.纯度鉴定:在鉴定的方法中,使用最多的是。
1.凝胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同
2.透析的目的是什么 依据了什么原理
3.凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢。为什么凝胶的装填要紧密、均匀呢
知识点一:凝胶色谱法
1.蛋白质的分离和提取的原理是什么
2.凝胶色谱法的原理是什么
3.什么叫缓冲溶液 缓冲溶液有何作用 你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么 它的目的是什么
知识点二:电泳
1.什么是电泳 电泳的原理是什么
2.电泳常见方法有哪些
知识点三:实验操作
1.如何洗涤红细胞 洗涤的目的是什么
2.如何分离血红蛋白溶液
3.如何制作和填装凝胶色谱柱 该过程中需注意的问题有哪些
例1 凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( )。
A.具有相同的相对分子质量
B.相对分子质量不同,但都是相对分子质量较大的分子
C.相对分子质量不同,但都是相对分子质量较小的分子
D.具有相对分子质量不同的蛋白质
例2 右图表示对某蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素),下列相关叙述不正确的是( )。
A.蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电,电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B.蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少
C.蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于其相对分子质量的大小
D.电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种,但也可能只有一种
例3 凝胶色谱柱取长为40
cm,内径为1.6
cm,下列有关说法不正确的是
( )。
A.凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果,但直径过大造成洗脱液体积增大,样品的稀释度过大
B.凝胶色谱柱过高超过1
m,不影响分离的效果,但耗用洗脱液过多,样品的稀释度过大
C.凝胶色谱柱过矮,则影响混合物的分离度
D.以上说法有两种正确
1.以下与凝胶色谱的分离原理有关的叙述,错误的是( )。
A.凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道
B.相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,通过的路程较短,移动速度较快
C.样品中相对分子质量较小的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最大的分子最后流出
D.如果凝胶装填得不够紧密、均匀,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序
2.有关血红蛋白分离的完整过程的叙述,错误的是( )。
A.血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定
B.首先为样品的处理:洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液
C.然后为粗分离:经过透析去除分子量较小的杂质
D.最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化
3.下列有关提取和分离血红蛋白的叙述不正确的是( )。
A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质,此为样品的粗提取
C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化
D.可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
4.下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入(图1)和洗脱(图2)示意图,请据图回答下列问题。
(1)在加样示意图(图1)中,正确的加样顺序是 。
(2)用吸管加样时,应注意正确操作,包括 、 、 。
(3)等样品 时,才加入缓冲液。
(4)待 接近色谱柱底端时,用试管收集流出液,每 mL收集一管,连续收集。
参考答案
第3课时 血红蛋白的提取和分离
知识体系梳理
①分配色谱法 ②相对分子质量的大小 ③多糖类化合物 ④较小 ⑤较长 ⑥较慢 ⑦较大 ⑧较短 ⑨较快 ⑩酸和碱 比例 带电粒子 相反 带电性质 大小、形状 琼脂糖凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
血红蛋白的释放 磷酸缓冲液 较大 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
基础学习交流
1.凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小,利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来,而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异,以及分子本身的大小、形状不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现在电场中将各种分子分离。
2.透析的目的在于去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的蛋白质,透析依据的原理是半透膜只允许小分子透过,不允许大分子透过。
3.如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,影响分离的效果。
重点难点探究
知识点一:凝胶色谱法
1.根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同蛋白质。
2.当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢,而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
3.在一定的范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱对溶液的pH的影响,维持pH基本不变。
使用的是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性)。
知识点二:电泳
1.电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。其原理是许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。
2.①琼脂糖凝胶电泳:由于琼脂糖本身不带电荷,所以,各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同,从而得以分离。
②聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵)和催化剂(四甲基乙二胺)的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。常用于测定蛋白质的相对分子质量。
知识点三:实验操作
1.红细胞洗涤方法是分离(低速短时间离心)→用胶头吸管吸去上层透明黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此重复三次)。红细胞的洗涤目的是去除杂蛋白,以利于后续步骤的分离纯化。
2.搅拌好的混合液混合液分层(第1层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,即脂溶性物质的沉淀层,第3层是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质沉淀)→过滤除去杂质得血红蛋白。
3.制作凝胶色谱柱:①取长40
cm,内径为1.6
cm的玻璃管,两端需用砂纸磨平。②柱底制作:橡皮塞打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100目的尼龙纱包好。③柱顶制作:橡皮塞打孔→安装玻璃管。④组装:将上述三者按相应位置组装,并在下端出口处连接带开关的尼龙管,尼龙管放入收集器。
填装凝胶色谱柱:固定色谱柱→称好凝胶并用蒸馏水充分溶胀配成凝胶悬浮液,并将悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内→装填并用20
mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12
h
。
需要注意的问题:①由于干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大,因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需的凝胶量。②色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现有气泡而且无法消除,必须重装。
思维拓展应用
例1 C
【解析】对于分子大小不同,但同属于凝胶分离范围内的各种分子,在凝胶床中的分布情况是不同的。分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内,而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内,这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短,分子较小的移动距离较长,即利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时,按照分子量大小“排队”,从而将各种成分分开,在每种凝胶分离范围之外的分子,在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
例2 B
【解析】蛋白质的氨基与羧基可发生解离,使其带正电或负电,在电场中发生迁移。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷,故其移动速度与本身所带电荷无关,而由其分子大小决定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链,故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链),也可能是两种蛋白质。
例3 B
【解析】凝胶色谱柱直径大小不影响分离的效果,但是直径过大会造成洗脱液体积增大,样品的稀释度过大,因此应选择直径不超过2
cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关,一般不超过1
m,过短也会影响混合物的分离。
基础智能检测
1.C 2.D 3.B
全新视角拓展
4.(1)④①②③ (2)不要触及凝胶面 贴着管壁加样 使吸管管口沿管壁环绕移动 (3)完全进入凝胶层 (4)红色的蛋白质 5
【解析】进行凝胶色谱操作加样时,加样前,打开色谱柱下端的流出口,使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐,用吸管小心地将1
mL透析后的样品加到色谱柱的顶端,注意不可破坏凝胶面。吸管应贴着管壁加样,待样品完全进入凝胶层后才可关闭下端出口,加入缓冲液,待红色蛋白质接近色谱柱底端时,用吸管收集流出液,每5
mL收集一管,连续收集。《血红蛋白的提取和分离》教师教学实施参考方案
授课年级
高二
课题
第5单元
第3课时 血红蛋白的提取和分离
课程类型
新授课
课程学习目标
目标解读
1.了解凝胶色谱法的用途和凝胶色谱法分离蛋白质的原理。2.通过尝试从血液中提取和分离血红蛋白,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。3.理解缓冲溶液的组成和作用机理,熟悉一般缓冲液的配制方法。4.理解电泳的基本原理,了解常用的电泳方法。
重点难点
课程重点:凝胶色谱法的原理和方法。课程难点:1.样品的预处理;2.色谱柱填料的处理和色谱柱的填装。
课程导学建议
课前准备
1．教师研究本课时教材，预计学生自主学习过程中可能出现的问题和疑难点.2．在导学案的基础上根据本班学生学习情况进行二次备课.3．收集相关教学资源,制作教学用的PPT。
教学建议
课题背景通过当今生物科学在蛋白质研究领域的进展,说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性,进而明确地提出课程学习目标:以血红蛋白为实验材料,学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。通过了解当前有关蛋白质研究的新进展,体会分离纯化蛋白质的过程和方法。理解凝胶色谱法、电泳法的基本原理及过程与方法。
课
堂
教
学
过
程
设
计
程序
学习内容
教师行为
学生行为
媒体运用
导入新课
创设情境
蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？
积极思考老师所提出的话题
图片、口头表达
第一层级学习过程
自主预习
1.让学生了解本节课的学习目标。在目标的指引下，回顾所学的与目标相对应的知识点。2.引导阅读导学案【知识体系梳理】3.指导学生完成【知识体系梳理】4.巡视全班学生学习状态，对个别不进入状态的学生要予以关注
1.了解学习目标，按目标指示，进行知识梳理。2.阅读并思考导学案中【知识体系梳理】3.独立完成【知识体系梳理】
口头表达和ppt演示
交流讨论
1.PPT演示【知识体系梳理】答案2.点拔学生学习过程中提出的问题3.引导学生思考导学案中【基础学习交流】栏目的问题，要求通过小组讨论交流后，各小组将问题的答案以实物投影呈现出来，并给以评价。
1.修正答案2.倾听老师的指点，解决学习中的问题，并作以记录3.积极思考【基础学习交流】栏目的问题，经小组讨论，将答案写在纸上
口头表达和PP和演示答案
第二层级学习过程
知识点一：凝胶色谱法
【导学诱思】
思考1：蛋白质的分离和提取的原理是什么？
思考2：凝胶色谱法的原理是什么 思考3：什么叫缓冲溶液 缓冲溶液有何作用 你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么 它的目的是什么
1.学生先独立思考，完成相关问题，发现问题，利用对学、群学的形式与小组同学交流讨论，积极参与讨论、交流过程2.其中一大组得到解答任务后，派出代表，把集体讨论出的答案陈述出来。随后，询问另一大组同学有无不同意见，若有不同意见可直接提出，并相互辩论。3.每位同学用笔记好教师的点评总结。
口头表达、PPT演示
知识点二：电泳
1.原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2.分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。3.分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。完成预学案中知识点二的1、2、小问。
1.学生先独立思考，完成相关问题，发现问题，利用对学、群学的形式与小组同学交流讨论，积极参与讨论、交流过程2.其中一大组得到解答任务后，派出代表，把集体讨论出的答案陈述出来。随后，询问另一大组同学有无不同意见，若有不同意见可直接提出，并相互辩论。3.每位同学用笔记好教师的点评总结。
口头表达、PPT演示
知识点三：实验操作
1.蛋白质的提取和分离一般分为4步：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
思考
人们用鸡的红细胞提取DNA，用人
的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？2.观看样品处理和凝胶色谱操作视频。3.成果评价：（1）血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
（2）凝胶色谱柱的装填是否成功？由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。（3）血红蛋白的分离是否成功？如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
1.学生认真观看视频，记录各实验步骤及注意事项。2.认真思考老师提出的问题，并用笔记好老师的点评总结。
视频、PPT
第三层级学习过程
课堂巩固
1
教师安排学生完成【基础智能检测】2
教师巡视学生对知识的掌握情况.
学生独立完成
口头表达
展示讲评
根据巡视了解的情况，有目的地展示一部分小组答案，并进行点评
学生积极配合教师的课堂安排，对不明白的内容提出疑问。
幻灯片
第四层级学习过程
反思感悟
体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神
对老师讲解前后突然领悟的内容做一个归纳总结。
口头表达和板书
课堂小结
师生共同梳理本节课的主干知识。2.再次强调【基础智能检测】中所出现的典型问题。
1.配合老师共同完成本节课主干知识的梳理。2.基本掌本实验原理、步骤。
口头表达和板书
课外拓展
继续探究
引导学有余力的学生课后做聚丙烯酰胺凝胶电泳实验(共28张PPT)
第3课时 血红蛋白的提取和分离
1.了解凝胶色谱法的用途和凝胶色谱法分离蛋白质的原理。
2.通过尝试从血液中提取和分离血红蛋白,体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法。
3.理解缓冲溶液的组成和作用机理,熟悉一般缓冲液的配制方法。
4.理解电泳的基本原理,了解常用的电泳方法。
1.概念:也称作①
,是根据②
分离蛋白质的有效方法。
2.原理
(1)由③
构成的凝胶,内部有许多贯穿的通道。
(2)当蛋白质通过凝胶时,相对分子质量④
的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程⑤
,移动速度⑥
,而相对分子质量⑦
的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在外部移动,路程⑧
,移动速度⑨
,从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。
一、凝胶色谱法
分配色谱法
相对分子质量的大小
较慢
多糖类化合物
较小
较长
较大
较短
较快
1.概念:指
在电场的作用下发生迁移的过程。
2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷
的电极移动。
1.作用:在一定范围内,抵制外界的⑩
对溶液pH的影响,维持pH基本不变。
2.配制:由1~2种缓冲剂溶解于水中配制而成,通过调节缓冲剂的
就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
酸和碱
相反
11
12
13
比例
带电粒子
二、缓冲溶液
三、电泳
3.作用:电泳利用了待分离样品中各种分子
的差异及分子本身的
的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。
4.方法:常用的电泳方法有
和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用
。
带电性质
14
大小、形状
15
琼脂糖凝胶电泳
16
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
17
1.样品处理:通过红细胞的洗涤、
、离心等操作收集血红蛋白溶液。
2.粗分离:即透析。将血红蛋白溶液装入透析袋中,将透析袋放入一定量适宜浓度的
中,透析12
h。
3.纯化:通过凝胶色谱柱将相对分子质量
的杂质蛋白除去。
4.纯度鉴定:在鉴定的方法中,使用最多的是
。
血红蛋白的释放
18
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
21
磷酸缓冲液
19
较大
20
四、实验操作
凝胶色谱法分离分子是依据分子质量大小,利用凝胶色谱柱使大分子优先洗脱出来,而小分子后分离出来。电泳法分离分子则是依据各种分子带电性质的差异,以及分子本身的大小、形状不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现在电场中将各种分子分离。
1.凝胶色谱法和电泳法在实现分子分离的原理方面有何不同
答案：
2.透析的目的是什么 依据了什么原理
透析的目的在于去除血红蛋白溶液中相对分子质量较小的蛋白质,透析依据的原理是半透膜只允许小分子透过,不允许大分子透过。
答案：
3.凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢。为什么凝胶的装填要紧密、均匀呢
如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序,影响分离的效果。
答案：
1.蛋白质的分离和提取的原理是什么
知识点一:凝胶色谱法
根据蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附的性质和对其他分子的亲和力等等,可以用来分离不同蛋白质。
答案：
2.凝胶色谱法的原理是什么
当不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢,而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
答案：
3.什么叫缓冲溶液 缓冲溶液有何作用 你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么 它的目的是什么
在一定的范围内,能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用,具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。在一定范围内,缓冲溶液能够抵制外界的酸或碱对溶液的pH的影响,维持pH基本不变。
使用的是磷酸缓冲液,目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境,保证血红蛋白的正常结构和功能,便于观察(红色)和科学研究(活性)。
答案：
知识总结
1.蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等,可以作为分离不同种类的蛋白质的依据。
2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理:
相对分
子质量
直径大小
运动方式
运动
速度
运动
路程
洗脱次序
大
大于凝胶颗粒空隙直径、被排阻在外面
垂直向下移动
较快
较短
先从凝胶柱洗脱出来
小
小于凝胶颗粒空隙直径,可以进入颗粒内部
垂直向下移动,无规则扩散进入凝胶颗粒
较慢
较长
后从凝胶柱洗脱出来
知识点二:电泳
1.什么是电泳 电泳的原理是什么
电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。其原理是许多重要的生物大分子,如多肽、核酸等都具有可解离的基团,在一定的pH下,这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。
答案：
2.电泳常见方法有哪些
①琼脂糖凝胶电泳:由于琼脂糖本身不带电荷,所以,各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同,从而得以分离。
②聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂(过硫酸铵)和催化剂(四甲基乙二胺)的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。常用于测定蛋白质的相对分子质量。
答案：
知识总结
1.蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质的大小相关;在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的大小相关外,蛋白质的带电性质影响其在电场中的运动方向及其在电场中的电量、形状、运动速度。
2.电泳现象:在盛有红褐色Fe(OH)3胶体的U形管的两个管口,各插入一个电极。通直流电后,发现阴极附近的颜色逐渐变深,阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe(OH)3胶体粒子带正电荷,在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下,带电粒子发生迁移的现象就叫作电泳。
知识点三:实验操作
1.如何洗涤红细胞 洗涤的目的是什么
红细胞洗涤方法是分离(低速短时间离心)→用胶头吸管吸去上层透明黄色血浆→下层暗红色的红细胞用生理盐水洗涤(如此重复三次)。红细胞的洗涤目的是去除杂蛋白,以利于后续步骤的分离纯化。
答案：
2.如何分离血红蛋白溶液
搅拌好的混合液
混合液分层(第1层为无色透明的甲苯层,第2层为白色薄层固体,即脂溶性物质的沉淀层,第3层是血红蛋白的水溶液,第4层是其他杂质沉淀)→过滤除去杂质得血红蛋白。
答案：
3.如何制作和填装凝胶色谱柱 该过程中需注意的问题有哪些
制作凝胶色谱柱:①取长40
cm,内径为1.6
cm的玻璃管,两端需用砂纸磨平。②柱底制作:橡皮塞打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网,再用100目的尼龙纱包好。③柱顶制作:橡皮塞打孔→安装玻璃管。④组装:将上述三者按相应位置组装,并在下端出口处连接带开关的尼龙管,尼龙管放入收集器。
填装凝胶色谱柱:固定色谱柱→称好凝胶并用蒸馏水充分溶胀配成凝胶悬浮液,并将悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内→装填并用20
mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12
h
。
需要注意的问题:①由于干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积差别很大,因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需的凝胶量。②色谱柱内不能有气泡存在,一旦发现有气泡而且无法消除,必须重装。
答案：
例1
凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法。但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( )。
A.具有相同的相对分子质量
B.相对分子质量不同,但都是相对分子质量较大的分子
C.相对分子质量不同,但都是相对分子质量较小的分子
D.具有相对分子质量不同的蛋白质
C
【解析】对于分子大小不同,但同属于凝胶分离范围内的各种分子,在凝胶床中的分布情况是不同的。分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内,而分子较小的可进入较多的凝胶颗粒内,这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短,分子较小的移动距离较长,即利用分子筛可将分子量不同的物质分离。分子量大小不同的多种成分在通过凝胶床时,按照分子量大小“排队”,从而将各种成分分开,在每种凝胶分离范围之外的分子,在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
技巧归纳
理解凝胶色谱法的原理要注意两点:一是凝胶的作用。凝胶可以允许小分子物质从中穿过,而不允许大分子物质通过(大分子物质只能从凝胶外通过)。二是经过的路程长短以及运动速度的大小。因为小分子物质要通过凝胶,所以经过的路程要长,速度也慢,而大分子物质通过的路程要短,速度也快。最后的结果是在同一个起点的大分子物质和小分子物质因经过的路程及速度不同,而导致它们在装置末端分开。
例2
右图表示对某蛋白质溶液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素),下列相关叙述不正确的是( )。
A.蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电,电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B.蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少
C.蛋白质在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于其相对分子质量的大小
D.电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种,但也可能只有一种
B
【解析】蛋白质的氨基与羧基可发生解离,使其带正电或负电,在电场中发生迁移。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷,故其移动速度与本身所带电荷无关,而由其分子大小决定。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链,故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链),也可能是两种蛋白质。
例3
凝胶色谱柱取长为40
cm,内径为1.6
cm,下列有关说法不正确的是
( )。
A.凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果,但直径过大造成洗脱液体积增大,样品的稀释度过大
B.凝胶色谱柱过高超过1
m,不影响分离的效果,但耗用洗脱液过多,样品的稀释度过大
C.凝胶色谱柱过矮,则影响混合物的分离度
D.以上说法有两种正确
B
【解析】凝胶色谱柱直径大小不影响分离的效果,但是直径过大会造成洗脱液体积增大,样品的稀释度过大,因此应选择直径不超过2
cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关,一般不超过1
m,过短也会影响混合物的分离。
技巧归纳
凝胶色谱操作是本实验的关键,该操作要注意以下几个方面:
1.实验结果如果不理想,需要重做时,必须进行凝胶色谱柱的再生。一般情况下,凝胶不会与其他溶质发生任何作用,因此,在一次分离以后,稍加平衡就可以进行下一次的操作。平衡时,需用3倍柱体积的洗脱液过柱。
2.如果实验操作中有一些杂质污染了色谱柱,可以用物质的量浓度为0.2
mol/L的氢氧化钠和物质的量浓度为0.5
mol/L的氯化钠混合液处理交联葡聚糖凝胶。
3.如果凝胶长期不用,可以加入抑菌剂低温保存,使用时再进行充分的平衡。
1.以下与凝胶色谱的分离原理有关的叙述,错误的是( )。
A.凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道
B.相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,通过的路程较短,移动速度较快
C.样品中相对分子质量较小的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最大的分子最后流出
D.如果凝胶装填得不够紧密、均匀,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序
C
凝胶实际上是一些微小的多孔球体,小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部,只能分布在颗粒之间,通过的路程较短,移动速度较快;相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道,通过的路程较长,移动速度较慢。因此,样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出,相对分子质量中等的分子后流出,相对分子质量最小的分子最后流出,从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀,就会在色谱柱内形成无效的空隙,使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过,搅乱洗脱液的流动次序,影响分离的效果。
解析
2.有关血红蛋白分离的完整过程的叙述,错误的是( )。
A.血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定
B.首先为样品的处理:洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集血红蛋白溶液
C.然后为粗分离:经过透析去除分子量较小的杂质
D.最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化
D
解析
血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步,包括:样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液,即样品的处理;再经过透析去除分子量较小的杂质,即样品的粗分离;然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大杂质蛋白除去,即样品的纯化;最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
3.下列有关提取和分离血红蛋白的叙述不正确的是( )。
A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B.通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质,此为样品的粗提取
C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去,即样品的纯化
D.可通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
B
解析
B项错误,粗分离透析除去分子较小的杂质。
