第2课时 多聚酶链式反应扩增
DNA片段
1.通过与细胞内DNA分子的复制相比较,了解PCR技术的基本操作、反应条件。
2.能根据DNA分子的结构特征、增殖方式,说明PCR的原理。
3.通过对PCR实验的操作及结果分析,培养严谨的科学态度和实事求是的科研精神。
一、PCR的概念
PCR全名是①反应,它是一种②迅速扩增DNA片断的技术,其特点是以极少量的③为模板,在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。?
二、PCR扩增的条件及原理
1.PCR扩增的方向:通常将DNA的羟基(—OH)末端称为④,而磷酸基团末端称为⑤。DNA的合成方向总是从子链的⑥延伸。?
2.PCR原理(即利用DNA复制原理):双链DNA⑨。?
3.PCR反应的条件:PCR反应需要在⑩中才能进行,需提供:DNA模板,,四种脱氧核苷酸,,同时要控制温度。?
4.PCR扩增的过程:反应的每一轮循环都包括、和延伸三步。?
(1)变性:温度以上,双链DNA在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA。?
(2)复性:温度下降到50 ℃左右,两种引物通过与两条单链DNA结合。?
(3)延伸:温度上升到左右,在聚合酶的作用下,以四种脱氧核苷酸为原料,根据碱基互补配对原则,从引物的5'→3'端延伸合成与模板互补的DNA新链。?
三、实验操作步骤
1.准备。
2.移液:用按照配方在微量离心管中依次加入各组分。?
3.混合:盖严离心管的盖子,用手指轻轻弹击壁管。
4.离心:将微量离心管放在离心机上,离心约10 s,目的是。?
5.反应:将离心管放入PCR仪中,设置程序进行反应。
1.DNA复制为什么必须有引物?
2.PCR的反应过程包括哪三个阶段?
3. PCR操作中模板DNA是否需要解旋?需要解旋酶吗?
知识点一: PCR原理
1.体外DNA复制需要哪些条件?什么是3'端,什么是5'端?如何理解DNA复制的方向?
2.DNA的热变性原理是什么?
3.比较细胞内DNA复制和细胞外PCR扩增,完成表中内容。
项目
细胞内DNA复制
PCR扩增
不
同
点
能量
① ATP提供能量?
② ATP提供能量?
酶
③ 酶、④ 聚合酶?
耐热的⑤ DNA聚合酶?
是否
有转录
伴有转录、产生引物
无转录、需加入⑥ ?
温度
体内温度
⑦ ?
相
同
点
1. 原料为⑧ ;?
2.复制原理为严格遵循⑨ 原则;?
3.模板为DNA;
4.都需要与模板相结合的⑩ ?
知识点二:PCR的反应过程及实验设计
1.PCR一般经历三十多次循环,每次循环可以分为三个基本步骤——变性、复性和延伸。
(1)PCR 循环第一步加热变性的具体变化是什么?这种变化有何意义?
(2)PCR 循环第二步引物与靶序列退火的温度为多少?具体的变化是什么?
(3)PCR 循环第三步延伸模板是什么?需要什么酶?遵循什么原则?
2.PCR技术具有哪些特点?
3.如何测定DNA的含量?
例1 (1)PCR利用了DNA的 原理,在 的高温下,作为模板的 解聚为 ,这个过程称为 。?
(2)PCR反应需要的条件: 、 、 、 、 。?
(3)在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是 。?
例2 下列关于PCR实验操作过程的叙述错误的是( )。
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在-20 ℃储存
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换
1.标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三个步骤,这三个步骤需要的温度依次是( )。
A.94 ℃、55 ℃、72 ℃ B.72 ℃、55 ℃、94 ℃
C.55 ℃、94 ℃、72 ℃ D.80 ℃、55 ℃、72 ℃
2.下列有关PCR技术的叙述正确的是( )。
A.作为模板的DNA序列必须不断地加入每一次的扩增当中
B.作为引物的脱氧核苷酸序列必须不断地加入每一次的扩增当中
C.反应需要的DNA聚合酶必须不断地加入每一次扩增当中
D.解旋酶必须不断地加入每一次扩增当中
3.碱基互补配对发生在下列哪些生理过程或生物技术中?( )。
①PCR循环第三步引物延伸过程 ②病毒的增殖过程 ③PCR循环第二步引物与靶序列退火过程
④基因的表达过程 ⑤PCR循环第一步加热变性过程
A.①②③④ B.①②③⑤
C.②④⑤ D.①③⑤
4.PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的方法,用于放大特定的DNA片段,数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。PCR需要模板DNA、引物、脱氧核糖核苷酸和DNA聚合酶等条件。下图为模板DNA分子及2种引物,请回答相关问题:
(1)PCR的全称是 。PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度环境的不同,在PCR中先用90 ℃以上的高温处理的目的是 ,而这一过程中在细胞内是通过 实现的。?
(2)在PCR技术中所需要的引物实质上是一种 。请在图中绘出引物结合的位置。?
(3)DNA子链复制的方向是 ,这是由于 。?
?
?
?
参考答案
第2课时 多聚酶链式反应扩增
DNA片段
知识体系梳理
①多聚酶链式 ②体外 ③DNA ④3'端 ⑤5'端 ⑥5'端向3'端 ⑦变性 ⑧复性 ⑨DNA单链 ⑩一定的缓冲溶液 引物 耐热的DNA聚合酶 变性 复性
90 ℃ 碱基互补配对 72 ℃ DNA 微量移液器 使反应液集中在离心管底部
基础学习交流
1.DNA聚合酶不能从头合成DNA,而只能以3'端延伸DNA链,故DNA合成时,必须加入引物(其3'端游离)以作为延长DNA子链的“引子”。
2.PCR的反应过程包括以下三个阶段:
(1)变性:当温度上升到90 ℃以上时,双链DNA解聚为单链。
(2)复性:温度下降到50 ℃左右,两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
(3)延伸:温度上升到72 ℃左右,溶液中的四种脱氧核苷酸(A,T,C,G)在DNA聚合酶的作用下,根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
3.PCR操作中,模板DNA仍需解旋,但该解旋过程不是DNA解旋酶催化的结果,而是利用DNA热变性的原理,在80~100 ℃温度范围内,DNA双螺旋结构将解体,双链分开,以此达到解旋的目的。
重点难点探究
知识点一: PCR原理
1.体外DNA复制的条件包括四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶、引物、模板、缓冲溶液和严格控制温度的温控设备。
DNA的两条链是反向平行的,通常将DNA的羟基末端称为3'端,而磷酸基团的末端称为5'端。复制的方向从子链的5'端向3'端延伸。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA,而只能从引物的3'端延伸DNA链,因此,DNA的合成方向总是从子链的5'端向3'端延伸。
2.在DNA的复制过程中,复制的前提是解开双链,在体外可通过控制温度来实现。在80~100 ℃的温度范围内,DNA的双螺旋结构将解体,双链分开,这个过程称为变性。PCR利用了DNA的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。
3.①要 ②不需要 ③解旋 ④DNA ⑤Taq ⑥两种引物 ⑦高温 ⑧四种脱氧核苷酸 ⑨碱基互补配对 ⑩引物
知识点二:PCR的反应过程及实验设计
1.(1)模板DNA经加热至90 ℃以上,模板DNA解旋。一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解聚为单链,以便于它与引物结合,为下轮反应作准备。
(2)模板DNA经加热变性成单链后,温度降到50 ℃左右。引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
(3)模板为结合有引物的DNA单链。需要DNA聚合酶。遵循碱基互补配对与半保留复制的原则。
2.PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便、重复性好、易自动化等特点。
3.DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰,可以利用DNA的这一特点进行 DNA含量的测量。具体方法如下。
(1)稀释:取2 μL PCR反应液,加入98 μL蒸馏水,即将样品进行50倍稀释。
(2)对照调零:以蒸馏水作为空白对照,在波长260 nm处,将紫外分光光度计的读数调节至零。
(3)测定:取DNA稀释液100 μL至比色杯中,测定260 nm 处的光吸收值。
(4)计算:检测DNA片段的扩增情况,可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果,计算公式为DNA含量(μg/mL)=50×(260 nm的读数)×稀释倍数。
思维拓展应用
例1 (1)热变性 90 ℃以上 双链DNA 单链DNA 变性 (2)缓冲溶液 DNA模板 引物 四种脱氧核苷酸 耐热的DNA聚合酶 (3)温度上升到90 ℃以上使双链解聚为单链
【解析】PCR实验中一般不采用解旋酶处理,而是采用DNA的热变性技术,操作过程要注意温度的控制。PCR反应的实质是DNA的复制,体外环境下的复制与体内DNA的复制过程相似,需要液体环境条件、原料等。
例2 C
【解析】PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出,放在冰块上缓慢融化。
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1.A 2.B 3.A
全新视角拓展
4.(1)多聚酶链式反应 使双链DNA解聚为单链(使DNA的两条链解开) 解旋酶的催化 (2)单链DNA或
RNA分子 见右图 (3)5'到3' DNA聚合酶只能从引物的3'端拼接单个脱氧核苷酸分子
【解析】PCR技术又称多聚酶链式反应,在PCR中先用90 ℃以上的高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂,两条链解开,即使DNA分子变性。引物是一种单链DNA或RNA分子,它能与解开的DNA母链的3'端结合,为DNA聚合酶提供吸附位点,使DNA聚合酶从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸,从而决定了DNA子链复制的方向是5'到3'。
