2018新课标新高考第一轮总复习生物教案（选修三）.DOCX
文档属性
| 名称 | 2018新课标新高考第一轮总复习生物教案（选修三）.DOCX |  | |
| 格式 | zip | ||
| 文件大小 | 5.1MB | ||
| 资源类型 | 教案 | ||
| 版本资源 | |||
| 科目 | 生物学 | ||
| 更新时间 | 2017-06-22 13:03:45 | ||
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文档简介
专题1 基因工程
第四十五课时
1．基因工程的诞生 2.基因工程的原理及技术(含PCR)
夯
实
基
础 【P172】
考点一 基因工程的理论基础和基本工具
【回扣教材】
1．基因工程的概念
(1)供体：提供__目的基因__。
(2)操作环境：__体外__。
(3)操作水平：__分子__水平。
(4)原理：__基因重组__。
(5)受体：目的基因表达的场所。
(6)优点：克服__远缘杂交不亲和__的障碍，定向改造生物的__遗传性状__。
2．基因拼接的理论基础
(1)__DNA__是主要遗传物质。
(2)DNA的基本组成单位都是__四种脱氧核苷酸__。
(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的__双螺旋__结构。
3．外源基因在受体内表达的理论基础
(1)__基因__是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循__中心法则__。
(3)生物界共用一套__遗传密码__。
4．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶
①来源：主要是从__原核__生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的__核苷酸序列__并切开相应两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__。
③结果：产生__黏性末端__或平末端。
④下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是__GAATTC__，切割位点在__G和A__之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是__CCCGGG__，切割位点在__C和G__之间；说明限制酶具有__专一性__。
(2)DNA连接酶：常用的DNA连接酶有
E．coliDNA连接酶：来源于__大肠杆菌__
T4
DNA连接酶
(3)载体：携带目的基因进入受体细胞
条件：能在宿主细胞中保存下来并大量__复制__，有一个至多个__限制性核酸内切酶__切割位点，有特殊的__标记基因__，便于筛选。
种类：__质粒__(常用)、λ噬菌体的衍生物、__动植物病毒__。
质粒的特点：小型双链环状DNA分子；能自主复制；有一个至多个__限制酶切割位点__；有特殊的__标记基因__。
作用：①作为运载工具，将__目的基因__转移到宿主细胞内；②在宿主细胞内连同目的基因一起大量__复制__。
【命题角度分析】
角度一 考査DNA重组技术的概念、
基本原理及工具
【例1】下列有关基因工程叙述错误的是(A)
A．基本原理是DNA具有双螺旋结构以及遗传信息传递和表达方式相同
B．最常用的载体是质粒
C．工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶
D．该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换
【解析】基本原理是DNA具有双螺旋结构以及生物共用一套遗传密码，A错误；基因工程中最常用的载体是质粒，B正确；基因工程所用工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，C正确；基因工程技术能人为地增加生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换，D正确。
角度二 考査DNA重组技术的基本工具的应用
【例2】chlL基因是蓝藻DNA上控制叶绿素合成的基因，为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞。技术路线如图甲所示，请据图分析回答：
(1)与真菌相比较，蓝藻在结构上最主要的特点是__没有以核膜为界限的细胞核__，在功能上最主要的特点是__能够进行光合作用__。
(2)①②过程中均使用的工具酶有__限制性核酸内切酶和DNA连接酶__。
(3)构建重组质粒B在整个操作过程中的目的是__破坏chlL基因并筛选出该变异株细胞__。
(4)若含有chlL基因的DNA片段和选用的质粒上的限制酶切割位点如图乙所示。请回答：
①构建含chlL基因的重组质粒A时，应选用的限制酶是__酶1和酶3__，对__质粒和含chlL基因的DNA__进行切割。
②同时用酶1和酶4切割图乙中的质粒，则产生含有1
800对碱基和8
200对碱基的两种片段；用图中四种酶同时切割此质粒。则产生含有600对碱基和8
200对碱基的两种长度片段；若换用酶1和酶3同时切割此质粒，则产生的片段长度是__含有1__200对碱基和8__800对碱基的两种长度片段__。
【解析】(1)蓝藻为原核生物，没有以核膜为界限的细胞核，其体内含有光合色素，能进行光合作用。(2)表达载体构建时需限制酶和DNA连接酶等工具酶。(3)由题干信息“构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞”可知，构建重组质粒B的目的在于破坏chlL基因并筛选出变异株细胞。(4)①由图乙知，获得chlL基因需酶1和酶3对此基因所在的DNA进行切割，同时对质粒也要用同种酶切割处理，以便构建重组质粒A。②由题意知四种酶同时切割时含600对碱基的片段共有3个。若用酶1和酶3同时切割时，产生的片段有8
200＋600＝8
800对碱基；另一片段为600×2＝1
200对碱基。
【知识拓展】
1．巧辨基因工程操作工具的8个易错点
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。
(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体本质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；细胞膜上载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
2．限制酶选择的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切位点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②插入的目的基因的表达需要调控序列，用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子，所以所选限制酶的切点应该“前有启动子，后有终止子”。
③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选限制酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶
DNA聚合酶
作用实质
都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键
是否需模板
不需要
需要
连接类型DNA链
单链
单链
作用过程
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键
作用结果
将存在的DNA片段连接成重组DNA分子
合成新的DNA分子
【随堂练习】
1．下列有关基因工程和酶的叙述，正确的是(C)
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．运载体的化学本质与载体蛋白相同
C．限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸
D．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
【解析】一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，因此具有专一性；运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，成分不单一，载体蛋白本质是蛋白质；烟草花叶病毒的核酸为RNA，限制酶不能切割；DNA连接酶可催化黏性末端黏合后的磷酸二酯键形成。
2．(2016全国Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有__能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点__(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长__；并且__含有质粒载体__和__含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)__的细胞也是不能区分的，其原因是__二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长__。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有__四环素__的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于__受体细胞__。
【解析】(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。(2)依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，而氨苄青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。(3)噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳仍留在细胞外；在噬菌体的DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
考点二 基因工程基本操作程序
【回扣教材】
基因工程的基本操作程序
第一步：__目的基因的获取__
1．目的基因主要是指__编码蛋白质的结构基因__，也可以是一些具有调控作用的因子。目的基因的获取途径常见的有：__从自然界中已有的物种中分离出来__、__人工合成目的基因__、__利用PCR技术扩增目的基因__。
2．基因文库：将含有某种生物不同基因的许多__DNA片段__导入__受体菌__的群体中储存，各个__受体菌__分别含有这种生物的__不同的基因__，称为基因文库。常见的基因文库有__基因组文库__和__cDNA文库__。
3．PCR技术扩增目的基因
PCR是__聚合酶链式反应__的缩写，是一项在__生物体外__复制特定DNA片段的核酸合成技术，可以在短时间内__大量扩增目的基因__。其原理是__DNA双链复制__，其过程是：①加热至90～95
℃，__DNA解旋__；②冷却到55～60
℃，__引物结合到互补DNA链__；③加热至70～75
℃，__热稳定DNA聚合酶(如Taq酶)从引物起始进行互补链的合成__。
第二步：__基因表达载体的构建__
1．目的：使目的基因在受体细胞中__稳定存在__，并且可以__遗传给下一代__，同时使目的基因能够__表达和发挥作用__。
2．基因表达载体的组成：__启动子__＋__目的基因__＋__终止子__＋__标记基因__
(1)启动子：是一段有特殊结构的__DNA片段__，位于基因的首端，是__RNA聚合酶__识别和结合的部位，能驱动基因__转录出mRNA__，最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子：是一段有特殊结构的__DNA短片段__，位于基因的__尾端__。
(3)标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中__是否含有目的基因__，从而将__含有目的基因的细胞__筛选出来。常用的标记基因是__抗生素抗性基因__。
第三步：__将目的基因导入受体细胞__
1．转化的概念：是目的基因进入__受体细胞内__，并且在受体细胞内__维持稳定和表达__的过程。
2．常用的转化方法：
(1)将目的基因导入植物细胞：
①采用最多的方法是__农杆菌转化法__，农杆菌特点：易感染__双子叶__植物和裸子植物，对大多数__单子叶__植物没有感染力；农杆菌中的Ti质粒上的T—DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的__染色体的DNA__上。
②其次还有__基因枪法__，是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
③__花粉管通道法__，是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法(我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的)。
(2)将目的基因导入动物细胞：
①最常用的方法是__显微注射技术__。此方法的受体细胞多是__受精卵__。
②操作程序：目的基因表达载体__提纯__→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到__雌__性动物的__输卵管或子宫__内发育→新性状动物。
(3)将目的基因导入微生物细胞：
感受态细胞法
①原核生物特点：__繁殖快__、__多为单细胞__、__遗传物质相对较少__等，因此早期的基因工程都用原核生物作为受体细胞。
②大肠杆菌最常用的转化方法是：__Ca2＋__处理细胞→__感受态__细胞→表达载体与感受态细胞混合→__感受态__细胞吸收DNA分子。
3．重组目的基因导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是__标记基因是否表达__。
第四步：__目的基因的检测与鉴定__
1．首先要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，方法是__DNA分子杂交技术__。
2．其次还要检测__目的基因是否转录出了mRNA__，方法是__用标记的目的基因作探针与mRNA杂交__。
3．最后检测__目的基因是否翻译成蛋白质__，方法是从转基因生物中提取__蛋白质__，用相应的抗体进行__抗原—抗体杂交__。
4．有时还需进行__个体生物学水平__的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
【命题角度分析】
角度一 考査基因工程操作中的基本知识
【例1】下列对基因工程的四大操作步骤的理解有错误的是一项是(D)
A．将人的生长素基因在大肠杆菌表达，最好从cDNA文库获取目的基因
B．基因表达载体的构建是核心步骤，其组成包括启动子、终止子等
C．农杆菌法是将目的基因导入双子叶植物细胞的方法
D．目的基因的检测与鉴定过程均需要DNA探针进行分子杂交
【解析】A.原核细胞基因中不含内含子，因此将人的生长激素基因在大肠杆菌表达，最好从cDNA文库获取目的基因，A正确；B.基因表达载体的构建是核心步骤，其组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因，B正确；C.农杆菌法是将目的基因导入双子子叶植物细胞的方法，C正确；D.在检测目的基因是否表达时利用抗原—抗体杂交的方法，并且在利用个体水平在对目的基因检测时也不需要利用DNA探针进行分子杂交，D错误。故选D。
角度二 考査目的基因的检测与鉴定
【例4】为达到相应的目的，必须通过分子检测的是(B)
A．携带链霉素抗性基因受体菌的筛选
B．产生抗人白细胞介素 8抗体的杂交瘤细胞的筛选
C．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定
D．21三体综合征的诊断
【解析】熟悉检测手段应用的范围是解决本题的关键。逐项解析如下：携带链霉素抗性基因受体菌的筛选方法有两种：①可利用含链霉素的培养基培养菌体进行，②用标记的链霉素抗性基因通过分子杂交技术筛选；A项错误。筛选出抗人白细胞介素 8抗体的杂交瘤细胞，只能用抗原—抗体杂交技术；B项正确。转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定，属于个体生物学水平的鉴定，需要做抗虫的接种实验来确定；C项错误。21 三体综合征是由于患者的21号染色体比正常者的多一条导致，因此该病的诊断可通过显微镜下对染色体的观察确定，D项错误。
角度三 考査基因工程的基本操作程序的应用
【例5】(2016全国Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓ ↓
↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
——CTTAAG—— ——CCTAGG—— ——CTAG——
↑ ↑
↑
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被__Sau3AⅠ__酶切后的产物连接，理由是__两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端__。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有__甲和丙__，不能表达的原因是__甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录__。
甲
乙
丙
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有__EcoRⅠDNA连接酶__和__T4DNA连接酶__，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__T4DNA连接酶__。
【解析】(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)启动子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子也是一段有特殊结构的DNA短片段，相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。而图甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录，所以都不能表达目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有EcoRⅠ
DNA连接酶和T4
DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4
DNA连接酶。
【知识拓展】
1．将目的基因导入受体细胞的比较
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
2.基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
3．PCR反应的过程及结果
(1)PCR反应过程：
①变性：当温度上升到90～95
℃时，双链DNA解旋为单链，如下图：
②复性：系统温度下降至55～60
℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
③延伸：当系统温度上升至70～75
℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
(2)结果：
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
【随堂练习】
1．(2016海南)基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即__人工合成__和从__生物材料__中分离。
(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是__cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因__。
(3)在基因表达载体中，启动子是__RNA__聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是__大肠杆菌(或细菌)__。
(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有__金粉__和__钨粉__颗粒。
【解析】(1)获取目的基因主要有两个途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。
(2)植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA逆转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。
(3)在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌(或细菌)。
(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。
2．萤火虫发光是体内萤光素酶催化一系列反应所产生的现象。如果荧光素酶存在于植物体内，也可使植物体发光。一直以来荧光素酶的唯一来源是从荧光虫腹部提取。但加利福尼亚大学的一组科学家成功地通过转基因工程实现了将荧光素酶基因导入大肠杆菌体内，并在大肠杆菌体内产生荧光素酶。请你根据已有的知识回答下列有关问题：
(1)在此转基因工程中，目的基因是__荧光素酶基因__，具体操作过程中下图所示的黏性末端一般是由__2__种限制性核酸内切酶作用产生的。
(2)将此目的基因导入大肠杆菌体内需要载体的帮助，则作为载体必须具备能够在宿主细胞内复制并稳定保存，以及__具有特定的限制酶切割位点、具有某些标记基因(缺一不可)__(至少答出两点)等条件。
(3)在此转基因工程中，将体外重组DNA导入大肠杆菌体内，并使其在细胞内__维持稳定和表达__的过程称为转化。最常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是__使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围DNA分子的生理状态(或使大肠杆菌处于感受态细胞状态)__。
(4)目的基因在受体细胞是否能转录出mRNA，可用__分子杂交__技术来检测；目的基因是否表达出相应的蛋白质，除了通过大肠杆菌是否发光来确定外，还可以通过__抗原—抗体__特异性反应来判断。
【解析】(1)在此转基因工程中，目的基因是荧光素酶基因；图中所示的黏性末端是由2种限制性核酸内切酸作用产生的，其中第一个和第三个是由一种限制酶切割产生的，另外两个是由另一种限制酶切割产生的。(2)作为基因工程的载体必须具备的条件：要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗性基因)，以便于受体细胞的筛选；能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。(3)基因工程中，将体外重组DNA导入大肠杆菌体内，并使其在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。最常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围DNA分子的生理状态。(4)检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因，常用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否表达出相应的蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术。
考
点
集
训 【P303】
课时练习四十五
一、选择题(每小题只有一个正确选项)
1．下列关于基因工程的叙述中，错误的是(D)
A．首先要获取目的基因，然后要让目的基因与运载体结合
B．一般用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和获取目的基因
C．目的基因导入受体细胞后可以随着受体细胞的繁殖而复制
D．一次基因工程操作中，受体细胞均能够摄入重组DNA分子
【解析】首先要获取目的基因，然后要让目的基因与运载体结合，构建基因表达的载体，A项正确；同一种限制性核酸内切酶切割质粒和获取目的基因，形成相同的黏性末端，B项正确；目的基因导入受体细胞后可以随着受体细胞的繁殖而复制，实现遗传信息的传递，C项正确；基因工程操作中，有重组DNA分子的受体细胞、非重组DNA分子的受体细胞、不含运载体的受体细胞，其中含重组DNA分子的受体细胞很少，D项错误。
2．右图为某质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示目的基因的插入位点。实验中可能有的受体细胞(某种细菌，该细菌无相关的抗性基因)没有导入质粒，有的细胞导入的质粒没有连接到目的基因(空载质粒)。为了筛选出真正导入了重组质粒的受体细胞，科学家将受体细胞分别培养在含四环素的培养基中，有的培养基形成了菌落。从每个菌落中挑取少量菌种分别接种到含氨苄青霉素的培养基中，有的培养基无菌落产生。下列分析正确的是(D)
A．在含四环素的培养基中未形成菌落的为导入了空载质粒的细菌
B．在含四环素的培养基中形成菌落的为导入了重组质粒的细菌
C．在含氨苄青霉素的培养基中能正常生长的为导入了重组质粒的细菌
D．在含氨苄青霉素的培养基中不能正常生长的为导入了重组质粒的细菌
【解析】在含四环素的培养基中未形成菌落，说明无四环素抗性基因，即未导入质粒；在含四环素的培养基中形成菌落，说明有四环素抗性基因，即导入了重组质粒或空载质粒；在含氨苄青霉素的培养基中能正常生长，说明相关的抗性基因未被破坏，即导入了空载质粒；在含氨苄青霉素的培养基中不能正常生长，而在含四环素的培养基中可以生长，说明有四环素抗性基因无青霉素抗性基因，即导入了重组质粒。
3．在基因表达载体的构建中，下列说法正确的是(B)
A．一个表达载体的组成只包括启动子、终止子
B．只有存在启动子时才能驱动基因转录出mRNA
C．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
D．终止密码子的作用是使转录在所需要的地方停止
【解析】基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等，A错误；启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始，B正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，C错误；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束，而终止密码子是存在于mRNA上的，D错误。
4．下列对基因工程的四大操作步骤的理解有错误的一项是(D)
A．限制性核酸内切酶主要存在于原核生物体内，识别位点具有特异性
B．DNA连接酶是恢复被切开的两条脱氧核苷酸链之间的磷酸二酯键
C．目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些有调控作用的因子
D．目的基因的检测与鉴定的过程中只能用含青霉素的选择培养基
【解析】限制性内切酶主要存在于原核生物体内，识别位点具有特异性，A正确；DNA连接酶是连接被切开的两条脱氧核苷酸链之间的磷酸二酯键，B正确；目的基因是指能编码蛋白质的基因，或调控作用的因子，C正确；目的基因的检测与鉴定的过程中只能用含抗生素的选择培养基，D错误。
5．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是(B)
A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性
B．有利于对目的基因是否导入进行检测
C．增加质粒分子的分子量
D．便于与外源基因连接
【解析】在基因工程中，往往选择的质粒会带有一定的抗性基因，抗性基因的主要作用是有利于检测目的基因是否导入到受体细胞了。
6．获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取常用的方法是(C)
A．从基因组文库中获取
B．从cDNA文库中获取
C．从含目的基因生物细胞中获取
D．利用PCR技术获取
【解析】获得目的基因的常用方法是：
①从基因文库(基因组文库和cDNA文库)中获取；
②利用PCR技术扩增；
③人工合成(化学合成)；从含目的基因生物细胞中获取，其目的性不强，且工作量大，一般不采用。综上所述，A、B、D三项均错误，C项正确。
7．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的是(C)
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
【解析】95
℃下使模板DNA变性是使DNA分子两条链碱基对之间的氢键断裂，从而解链，A项正确；引物是单链的DNA片段，因此引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成，
B项正确；PCR技术实际上就是DNA的复制，因此用的原料是脱氧核苷酸，故C项错误；细胞内DNA复制是生物体内完成的，因此最适温度就是生物体的体温，而PCR技术的温度是不断循环变化的，总体来说PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，D项正确。
8．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是(C)
①检测受体细胞是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录 ④检测目的基因是否翻译出蛋白质
A．①②③
B．②③④
C．①③④
D．①②④
【解析】目的基因检测和鉴定，首先要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，即检测受体细胞是否有目的基因，①正确；其次要检测目的基因是否转录出mRNA，③正确；最后检测目的基因是否翻译出蛋白质，④正确；致病基因不属于目的基因，与目的基因的检测和鉴定无关，②错误。综上所述，供选答案组合，C项正确，A、B、D三项均错误。
9．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法错误的是(A)
图1 图2
A．一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割
C．图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用EcoRⅠ
D．为了获取重组质粒，最好用BamHⅠ和HindⅢ同时切割质粒和外源DNA
【解析】一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团，A项错误。
10．关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是(B)
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是花粉管通道法
B．将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射技术
C．为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用缓冲液进行处理
D．在显微注射技术中，不需先构建基因表达载体
【解析】将目的基因导入植物细胞，常采用农杆菌转化法，A错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最有效的方法，B正确；为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使其成为感受态细胞，C错误；在显微注射技术中，导入受体细胞的也是构建好的基因表达载体，D错误。
11．下图是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制性核酸内切酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是(D)
A．基因amp和tet是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因
B．质粒是细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和病毒中的DNA
C．限制性核酸内切酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D．用质粒4将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长
【解析】质粒上不含等位基因；质粒是细胞染色体(拟核)外能够自主复制的很小的环状DNA分子；限制性核酸内切酶的作用部位是DNA分子中特定的两个相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，而不是氢键。
12．质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(A)
细菌在含氨芐青霉素
培养基上生长情况
细菌在含四环素
培养基上生长情况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A.①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
【解析】第①组中细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是c；第②组中细胞能在含青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因被破坏，说明了外源基因插入的位置是b；第③组中细胞不能在含青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是a。
二、非选择题
13．(2016上海)回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
在下图所示的质粒pZHZ11(总长为3.6
kb，1
kb＝1
000对碱基)中，lacZ基因编码β 半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。
(1)若先用限制酶BamH
Ⅰ切开pZHZ11，然后灭活BamH
Ⅰ酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1
kb质粒的细胞颜色为__白色__；含3.6
kb质粒的细胞颜色为__白色和蓝色/白色或蓝色__。
(2)若将两端分别用限制酶BamH
Ⅰ和BglH
Ⅰ切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5
kb的BamH
Ⅰ酶切片段，形成4.9
kb的重组质粒，则目的基因长度为__1.8__kb。
(3)上述4.9
kb的重组质粒有两种形式，若用BamH
Ⅰ和EcoR
Ⅰ联合酶切其中一种，只能获得1.7
kb和3.2
kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得__1.4__
kb和__3.5__kb两种DNA片段。
(4)若将人的染色体DNA片段先导入大肠杆菌细胞中克隆并鉴定目的基因，然后再将获得的目的基因转入植物细胞中表达，最后将产物的药物蛋白注入小鼠体内观察其生物功能是否发挥，那么上述过程属于__C__。
A．人类基因工程
B．动物基因工程
C．植物基因工程
D．微生物基因工程
【解析】(1)3.1
kb质粒lacZ基因被破坏，含3.1
kb质粒的细胞颜色为白色；加DNA连接酶进行连接，被切下的片段可能反向连接，所含3.6
kb质粒的细胞可能含有正常质粒和异常质粒，也可能只含有正常质粒或异常质粒，颜色为白色和蓝色(白色或蓝色)。(2)pZHZ11中0.5
kb的BamHⅠ酶切片段被切除后，剩余3.1
kb，将两端分别用限制酶BamHⅠ和BglHⅠ切开的单个目的基因插入，形成4.9
kb的重组质粒，则目的基因大小为4.9－3.1＝1.8
kb。(3)限制酶BamHⅠ和BglHⅠ切割产生的黏性末端可以进行连接，但连接后不能被两者中的任何一个识别并切割，用BamHⅠ切割4.9
kb的重组质粒，只有一个切割位点。用BamHⅠ和EcoRⅠ联合酶切其中一种，只能获得1.7
kb和3.2
kb两种DNA片段；联合酶切同等长度的另一种重组质粒，可获得1.7＋1.8＝3.5
kb和3.2－1.8＝1.4
kb两种DNA片段。(4)题干所述目的是让人的基因在植物细胞中表达，属于植物基因工程。
14．研究发现，转基因抗虫植物能杀死昆虫的原理是该基因控制合成的蛋白质被昆虫食用后，在消化道中被蛋白酶水解产生具有毒性的活性肽，与昆虫肠道细胞上的受体结合，使细胞渗透压失衡，最终导致昆虫死亡。下图表示从苏云金杆菌中获取BT抗虫基因以培养抗虫玉米的部分过程。其中①～⑧表示操作流程，a、b表示分子，c～e表示培养过程(其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养)。
(1)通过图示流程①获取BT抗虫基因需使用__限制__酶，将其与切割后的质粒重组需使用__DNA连接__酶；在流程⑤中，细菌经培养不断分裂产生更多的子代细菌，该步骤的主要目的是__扩增目的基因__。
(2)目前多个国家已批准种植转BT基因抗虫玉米供人食用，请结合题意分析其可行的原因是__毒蛋白能在消化道中被蛋白酶水解后产生具有毒性的活性肽，与昆虫细胞上的受体结合，而人体中没有相应的受体，所以对人体不会有影响__。
(3)已知BT基因能够成功整合到玉米染色体上，某玉米植株体细胞中BT基因在染色体上的整合情况如图所示(黑点表示BT基因的整合位点)，其后代只要含有BT基因就具有抗虫性，该植株进行自交，子一代中具有抗虫特性的植株所占比例为__63/64__。
15．土壤农杆菌是一种能引起双子叶植物产生冠瘿瘤的土壤细菌，它带有一个大的质粒叫Ti质粒(含冠瘿瘤基因)，Ti质粒上的T－DNA片段可转移到植物细胞的基因组，其结构及转化过程如下图所示，回答相关问题：
(1)若用Ti质粒作为抗旱基因的运载体，为了使某种植物具有抗旱性状而又不引起植物产生冠瘿瘤，需对Ti质粒进行修饰，即__去除冠瘿瘤基因__，将抗旱基因转移至Ti质粒的__T－DNA__中，且要保证复制起始位点和__用于转移T－DNA的片段__不被破坏。然后在一定条件下将外植体在含有__重组Ti质粒__的土壤农杆菌的稀释培养基上培养，使得抗旱基因转入植物细胞并整合到植物基因组中。
(2)转基因是否成功应对转基因植物进行鉴定，如果培育成的植株能适应干旱环境，还应进行__DNA__水平鉴定，以确定该变异能否遗传给后代。为获得纯合的转基因植株，还需要对转基因植株进行__连续自交(单倍体育种)__。
16．一位科学家正在使用氨苄青霉素敏感型菌株进行研究，该菌株不能利用乳糖，这是因为它的乳糖操纵基因异常。现有两种质粒，一种含有正常的乳糖操纵基因，另一种含有氨苄青霉素抗性基因。她运用限制酶和DNA连接酶，获得了一些含有这两个基因的重组质粒。然后在一个仅以葡萄糖为唯一能源的培养基中培养敏感型细菌，并向其中加入高浓度的重组质粒，使细菌增殖。再将实验组细菌(含重组质粒)和对照组细菌(不含重组质粒)放入下表所示环境中让其生长。请回答下列问题：
葡萄糖培养基
葡萄糖和氨苄青霉素
葡萄糖、乳糖和氨苄青霉素
含重组质粒的菌株
1号
2号
3号
不含重组质粒的菌株
4号
5号
6号
(1)在基因工程的基本操作程序中，__基因表达载体的构建__是基因工程的核心。限制酶是基因工程中常用的工具，若要提取限制酶，可选择的生物是__大肠杆菌(答出的生物属于原核生物即可)__(举出一例)。本实验中使用限制酶的作用是：__在质粒DNA上切割(合理即可)__。
(2)在以葡萄糖为唯一能源的培养基中加入高浓度的质粒，为了促进细菌更好的吸收重组质粒，还应用__Ca2＋__处理细菌，使细菌处于__感受态__。该培养基以葡萄糖为能源是因为__葡萄糖是单糖，可被细菌吸收，确保细菌在此培养基中均能正常生长__。
(3)若没有新的突变发生，细菌最有可能在哪些培养基上生长出菌落？(C)
A．只有1、2和4号
B．只有3、5和6号
C．只有1、2、3和4号
D．只有4、5和6号
(4)如果在准备制作重组质粒时未使用DNA连接酶，则细菌最可能在__1__号和__4__号平板上长出菌落。
(5)若该科学家用如下培养基进行另一项实验，该培养基中用乳糖为唯一能源，则细菌能在哪一培养基中长出菌落(C)
乳糖培养基
乳糖和氨苄青霉素
含重组质粒的菌株
7号
8号
不含重组质粒的菌株
9号
10号
A.只有10号
B．只有8号
C．7和8号
D．8和10号
17．回答下列关于基因工程的问题：
(1)目的基因主要是指__编码蛋白质__的基因，例如，培育抗虫转基因植物时用于杀虫的基因主要是__Bt毒蛋白__、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)获取目的基因时，可利用PCR技术扩增目的基因，它是利用__DNA双链复制__的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。过程是：目的基因DNA受__热变性__后解旋为单链，__引物__与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸。此过程中的DNA聚合酶具有__耐高温__的特点。
(3)构建好的目的基因表达载体除具有目的基因外，还必须有__启动子、终止子及标记基因__。
(4)导入受体细胞后，检测目的基因是否翻译成蛋白质时，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的__抗体__进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
第四十六课时
1．基因工程的应用 2.蛋白质工程 3.实验：DNA的粗提取与鉴定
夯
实
基
础 【P177】
考点一 基因工程的应用
【回扣教材】
1．基因工程的成果归纳总结
类型
项目
外源基因类型及举例
成果举例
植物基因工程的成果
抗虫转基因植物
用于杀虫的基因主要是：__Bt毒蛋白基因__、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因
抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米
抗病转基因植物
抗病毒基因常用的是__病毒外壳蛋白基因__和病毒的复制酶基因；
抗真菌基因有：几丁质酶基因和__抗毒素合成基因__
抗病毒烟草、抗病毒小麦、抗病毒番茄、抗病毒甜椒
抗逆转基因植物
常用的抗逆基因有：渗透压调节基因、__抗冻蛋白基因__和__抗除草剂基因__
抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆和玉米
改良品质的转基因植物
优良性状基因如：能提高必需氨基酸含量的__蛋白质__编码基因、控制番茄成熟的基因、与花青素代谢有关的基因
高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛
动物基因工程的成果
提高生长速度的转基因动物
可用__外源生长激素__基因
转基因绵羊、转基因鲤鱼
改善畜产品品质的转基因动物
可用肠乳糖酶基因
乳汁中含乳糖较少的转基因牛
生产药物的转基因动物
药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的启动子
转基因动物具有乳腺生物反应器
作器官移植供体的转基因动物
外源的抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因
无免疫排斥的转基因猪
基因
治疗
__体外基因治疗__
腺苷酸脱氨酶基因
治疗复合型免疫缺陷症
__体内基因治疗__
治疗囊性纤维化病基因
治疗遗传性囊性纤维化病
2.基因治疗
(1)概念：是把__正常基因__导入病人体内，使该__基因的表达产物__发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗人类遗传病最有效的手段。
(2)成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。
(3)方法：a.
__体外基因治疗__：先从病人体内获得__某种细胞__，如T淋巴细胞，进行培养。然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。
b.
体内基因治疗：直接向人体组织细胞中__转移基因__的治疗方法。如1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒作载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者肺组织中。
【命题角度分析】
角度一 考査基因工程的应用
【例1】人类在预防与诊疗传染性疾病的过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，疫苗生产和抗体制备的部分流程如下图：
(1)过程①代表的是__逆转录__。
(2)过程③构建A基因重组载体时，必须使用限制性核酸内切酶和__DNA连接酶__两种工具酶。由过程③构建A基因重组载体，其组成除了目的基因外，还必须有启动子、__终止子、标记基因__以及复制原点等。
(3)过程④要检测A基因是否进入受体细胞，常用的方法是__DNA分子杂交__法；要检测A基因在受体细胞内是否翻译出蛋白质，需用__抗原—抗体杂交__法。
(4)过程⑦采用的实验技术是__细胞融合技术__。
【解析】(1)分析流程图可知①是逆转录过程。(2)构建A基因重组载体时，首先需用限制性核酸内切酶切割含有A基因的外源DNA分子和运载体，再用DNA连接酶连接A基因和运载体形成A基因重组载体。重组载体的结构包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等。(3)要检测目的基因是否进入受体细胞，常用的是DNA分子杂交法，检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交的方法。(4)⑦是动物细胞融合过程，需采用细胞融合技术。
【知识拓展】
1．基因治疗与基因诊断的不同点
原理
操作过程
进展
基因治疗
__基因表达__
利用__正常基因__导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
__碱基互补配对__
制作特定__DNA探针__与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
2.转基因食品安全评价：
随着转基因技术向农业、食品和医药领域的不断渗透和迅速发展，转基因食品安全性现成为全球关注的热点问题之一。
【随堂练习】
1．将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有T DNA片段能转移到植物细胞中)。
(1)过程①需用同种__限制性核酸内切__酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用__选择__培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让__T DNA__进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是__筛选获得T DNA片段的植物细胞__。
(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加__细胞分裂素浓度__以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是__芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化__。
(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是__投放棉铃虫__。种植转基因抗虫棉能减少__农药__的使用，以减轻环境污染。
【解析】(1)切割目的基因和载体应使用同种限制性核酸内切酶，筛选细菌应使用选择培养基。
(2)农杆菌转化法的原理是农杆菌感染植物时，Ti质粒上的T DNA片段能够转移并整合到植物细胞的染色体DNA上。因为T DNA上具有卡那霉素抗性基因，所以可用含卡那霉素的培养基筛选出获得T DNA片段的植物细胞。
(3)植物组织培养过程中，可加入激素调节植物细胞的脱分化和再分化。生长素用量比细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成。幼嫩的芽顶端可以产生生长素并向基部运输，促进根的分化，故芽在无激素的培养基中也可以生根。
(4)在个体水平上检测抗虫棉时可在抗虫棉上投放害虫来判断其是否具有抗虫的性状；抗虫棉因具有抗虫性状，故可减少农药的使用，以减轻环境污染。
2．如图为转基因猪的培育过程。请回答：
(1)在对胎猪细胞进行培养时，需要在细胞培养液中添加一定量的__抗生素__，以防止培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止__细胞代谢产物积累__对细胞自身造成危害。
(2)构建基因表达载体的目的是__使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用__。基因表达载体的组成必须要有目的基因、__启动子__、终止子和__标记基因__等。
(3)可用__促性腺激素__处理母猪以获取更多的卵(母)细胞。
(4)重构胚发育到__桑椹胚或囊胚__阶段才能进行胚胎移植，被移植的胚胎之所以能够在受体母猪的子宫内存活，是因为受体母猪对移入子宫的外来胚胎基本上不发生__免疫排斥反应__。
【解析】(1)细菌对抗生素敏感，动物细胞培养时，需要在细胞培养液中添加一定量的抗生素，以防止培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。(2)基因工程中构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成必须要有目的基因、启动子、终止子和标记基因。(3)为获取更多的卵(母)细胞，可用促性腺激素处理供体母畜，使其超数排卵。(4)重构胚发育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行胚胎移植，被移植的胚胎之所以能够在受体母畜的子宫内存活，是因为受体母畜对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。
考点二 蛋白质工程
【回扣教材】
1．概念：是指以蛋白质分子的__结构规律__及其与__生物功能__的关系作为基础，通过__基因修饰__或__基因合成__，对__现有蛋白质__进行改造，或制造一种__新的蛋白质__，以满足人类的生产和生活的需求。
2．过程：预期蛋白质功能→设计预期的__蛋白质结构__→推测应有的__氨基酸序列__→找到对应的__脱氧核苷酸序列(基因)__。
3．蛋白质工程的流程图：
写出流程图中字母代表的含义：
A．__转录__，B.__翻译__，C.__分子设计__，D.__多肽链__，E.__预期功能__。
4．结果：改造了现有蛋白质或制造出__新的蛋白质__。
5．应用：主要集中应用于对__现有蛋白质__进行改造，改良生物性状。
【命题角度分析】
考査蛋白质工程的基本原理
【例2】已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的__氨基酸序列(或结构)__进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__P__基因或合成__P1__基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括__DNA和RNA(或遗传物质)__的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)__。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__设计蛋白质的结构__和__推测氨基酸序列__，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物__功能__进行鉴定。
【解析】(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。
(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。
中心法则的内容如下图所示：
由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。
(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
【知识拓展】
1．基因工程与蛋白质工程的11个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的
基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。
(3)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
(4)一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
(5)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。
(6)不熟悉标记基因的种类和作用：标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。
(7)对受体细胞模糊不清：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。
(8)还应注意的问题有：①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。②基因表达载体的构建是基因工程中最核心、最关键的一步，在体外进行。
(9)对蛋白质分子进行改造，其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质分子还是无法遗传。
(10)蛋白质工程的实质是根据蛋白质的结构，创造新基因或者改造原来基因，是基因工程的发展与延续。
(11)蛋白质工程与DNA分子重组技术是分不开的，常用到基因工程工具酶，如限制酶和DNA连接酶。
2．蛋白质工程与基因工程的关系
项目
区别与联系
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
(1)蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程
(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
【随堂练习】
1．某些适应寒冷环境的生物，能够产生一类抑制冰晶生长(能降低水溶液冰点的大分子)的蛋白质，即抗冻蛋白。科学家利用昆虫抗冻蛋白(AFPS)基因的异源表达，现已成功地提高了双子叶植物——烟草的抗冻能力。请分析回答下列相关问题：
(1)为使抗冻蛋白基因在烟草细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的抗冻蛋白基因片段正确插入基因表达载体的__启动子__和__终止子__之间。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有__引物__、__耐热性的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)__、4种脱氧核糖核苷酸和DNA模板，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(3)将AFPS基因导入烟草细胞中，常用__农杆菌转化__法，此操作过程中使用的载体是__Ti质粒__。若要检测烟草是否产生了抗冻蛋白，一般采用__抗原—抗体杂交__法检测杂交带。
(4)假如用得到的二倍体转基因抗冻植株自交，子代中抗冻与不抗冻植株的数量比为15∶1，可推测该抗冻基因整合到了__两条非同源染色体上__(填“一对同源染色体的一条染色体上”、“两条非同源染色体上”或“一对同源染色体的两条染色体上”)。
2．现代生物技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的。下图表示利用乳腺生物反应器生产某种动物蛋白的流程示意图，请分析回答下列问题：
(1)该生产流程中应用到的现代生物技术有__蛋白质工程__、__基因工程__、__胚胎移植技术(任写两种)__(写出其中两种)。
(2)图中A、B分别表示__推测应有的氨基酸序列、基因表达载体__。
(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行__DNA(核酸)分子杂交__检测，对受体动物的处理是用__促性腺激素__进行同期发情处理。
(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是__改造后的基因能够遗传(且改造基因易于操作)__。
【解析】(1)由图分析知该生产流程中应用到的现代生物技术有蛋白质工程、基因工程、胚胎移植技术等。(2)图中A、B分别表示推测应有的氨基酸序列、基因表达载体。(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行DNA分子杂交，对受体动物的处理是用促性腺激素进行同期发情处理。(4)由于改造后的基因能够遗传(且改造基因易于操作)，因此蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质。
考点三 DNA的粗提取与鉴定
【回扣教材】
1．DNA粗提取的原理
对于DNA的粗提取，就是要利用DNA和RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取__DNA__，去除其他成分。
(1)根据DNA的溶解性来粗提取DNA的原理：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中__溶解度__不同，通常选用2
mol/L
NaCl溶液溶解细胞中的__DNA__，此时杂质易沉淀；在0.14
mol/L
NaCl溶液中DNA溶解度__最小__，可使__DNA析出__。酒精是一种常用有机溶剂，DNA却不能溶于酒精(特别是95%冷却酒精)，但细胞中的某些__蛋白质__可溶于酒精，利用这一点可以将DNA和蛋白质进一步分离。
(2)利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理来粗提取DNA：__蛋白酶__能专一性地水解蛋白质而不会对DNA产生影响，故可用__蛋白酶__处理达到粗提取DNA的目的；60～80
℃的高温会使大多数__蛋白质变性__，而DNA在80
℃以上才会变性，故可用60～80
℃的高温处理材料以达到粗提取DNA的目的；__洗涤剂__能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响，故可用该试剂来使细胞破裂，更好的提取DNA。
综上所述：不同浓度的__NaCl溶液__、__酒精__、__蛋白酶__、60～80
℃的__高温__及__洗涤剂__均可用来提取DNA。
2．DNA鉴定的原理
在__沸水浴__条件下，DNA遇二苯胺呈现__蓝色__，因此，__二苯胺__可以作为鉴定DNA的试剂。
原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。
3．实验设计
(1)实验材料的选取：不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着__DNA含量高__、材料易得、便于提取的原则。
(2)破碎细胞，获取含DNA的滤液：如果选用鸡血作材料，可在鸡血细胞液中加入一定量__蒸馏水__(作用是__使血细胞大量吸水而涨裂__)，并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；如果用洋葱作材料，则要先切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐(洗涤剂能__瓦解细胞膜__；食盐能溶解__DNA__)；进行充分地搅拌和研磨(研磨能够__破碎细胞壁，使DNA更多地溶解在NaCl溶液中__)，过滤后收集研磨液。
(3)去除滤液中的杂质
最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。具体做法如下：
方案一：滤液＋NaCl(2
mol/L)→过滤除去杂质→加入蒸馏水使NaCl溶液浓度为0.14
mol/L→DNA析出→过滤得到过滤物→放到2
mol/L
NaCl溶液中再溶解出DNA→过滤含有DNA的NaCl溶液
方案二：滤液＋嫩肉粉(木瓜蛋白酶)→静置10～15
min→过滤获得DNA滤液
方案三：滤液→60～75
℃处理→过滤获得DNA滤液
方案一的原理是__DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同__；方案二的原理是__蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA__；方案三的原理是__蛋白质和DNA的变性温度不同__。
(4)DNA的析出与鉴定。
滤液与__等体积的冷却酒精__混合均匀，静置2～3
min，析出的白色丝状物是__DNA__。
DNA的鉴定：试管2支，编号甲、乙→各加2
mol/L的__NaCl溶液__5
mL→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4
mL__二苯胺__，混合均匀→__沸水浴__5
min→观察颜色变化。
【命题角度分析】
角度一 考査DNA的粗提取与
鉴定的基本操作过程
【例3】图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述不正确的是(A)
图1
图2
A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
【解析】A项，图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，图2中加入蒸馏水的目的是调节盐溶液的浓度，使DNA析出。B项，图1中含有DNA的核物质位于滤液中，因此完成过滤后应保留滤液。C项，图2中析出的DNA在纱布上，因此完成过滤后应弃去滤液。D项，嫩肉粉中含有木瓜蛋白酶，能催化杂质蛋白分解。
角度二 考査DNA的粗提取与鉴定实验的应用
【例4】某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10
g。剪碎后分成两组，一组置于20
℃、另一组置于－20
℃条件下保存24
h。
DNA粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15
mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10
mL滤液，再加入20
mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2
mol/L的NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测：在上述试管中各加入4
mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5
min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20
℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20
℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题名称是__探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响__。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__DNA断裂__。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20
℃相比，相同实验材料在－20
℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：__等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多__。
②针对结论1，请提出合理的解释：__低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢__。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：__将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液__，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
【解析】(1)该实验中把不同的材料在不同条件(温度)下处理，目的是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。(2)“缓缓地”搅拌是为了减少DNA断裂。(3)分析表格可得出结论：①相同材料在－20
℃条件下保存，DNA的提取量较多。原因可能是低温抑制了DNA酶的活性，DNA降解速度慢。②等质量的不同实验材料，在相同保存温度下，从蒜黄中提取的DNA最多。(4)依据氯仿的特性，可在第三步得到的溶液中加入氯仿，使蛋白质变性。
【知识拓展】
1．DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较
试剂
浓度
用途
原理(“△”为实验的主要原理)
NaCl溶液
2
mol/L
__溶解DNA__
0.14
mol/L
__析出DNA__
2
mol/L
鉴定时的溶剂
DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2
mol/L时最__大__、在0.14
mol/L时最__小__
△
酒精
95%(体积分数)
除去__杂质__以提纯DNA
DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质可以溶于酒精
△
二苯胺
鉴定剂
DNA遇二苯胺(沸水浴)会变__蓝色__
△
柠檬酸钠
0.03
g/mL
抗凝剂
除去血液中的钙离子，防止血液__凝固__
2.DNA粗提取实验材料和方法的选择
(1)不同生物的组织中DNA含量不同
在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
(2)材料不同所采用的提取方法不同
①植物组织：取材→研磨→过滤→沉淀。
②鸡血：制备鸡血细胞液→提取核DNA→溶解细胞核内DNA→析出并滤取DNA→DNA再溶解→提取较纯净的DNA。
【易错警示】DNA粗提取与鉴定实验的易错点。
(1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作材料。
(2)实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。
【随堂练习】
1．DNA的粗提取与鉴定实验中有三次过滤：
(1)过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
(2)过滤含粘稠物的0.14
mol/L
NaCl溶液
(3)过滤溶解有DNA的2
mol/L
NaCl溶液
以上三次过滤分别为了获得(A)
A．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
B．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液
C．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNA
D．含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
【解析】用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤相继处理，方能得到较纯的DNA。DNA在0.14
mol/L
NaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。
2．下图是某种动物蛋白质工程示意图，请据图回答下列问题：
(1)目前，蛋白质工程中难度最大的是图中编号__①__所示的过程，实现③过程的依据有__氨基酸与密码子的对应关系；mRNA与DNA间的碱基互补配对原则__。
(2)在⑤过程中，__T4__DNA__连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。
(3)为获得较多的受精卵进行研究，⑥过程需用激素做__超数排卵__处理。若⑥过程所得的卵母细胞是从屠宰母畜的卵巢中获得的，则体外受精前的⑧过程表示在体外人工培养卵母细胞到__减数第二次分裂中__期。
(4)为提高培育成功率，进行⑩过程之前，需对胚胎进行质量检查，应取部分滋养层细胞，以__目的基因__为探针进行DNA分子杂交检测。对受体动物需要用特定的激素进行__同期发情__处理。
【解析】(1)蛋白质工程中最难的是设计预期的蛋白质结构。由设计好的蛋白质氨基酸序列根据翻译中密码子与氨基酸的关系推算出mRNA，再通过mRNA与DNA间的碱基互补配对原则逆推出相应的脱氧核苷酸序列。(2)T4
DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端。(3)为获得较多的受精卵进行研究，⑥过程需用促性腺激素做超数排卵处理。只有处于减数第二次分裂中期的卵母细胞才能受精。(4)取部分滋养层细胞，以目的基因为探针进行DNA分子杂交检测，目的是看受体细胞是否导入目的基因，从而提高培育成功率。胚胎工程中供体与受体必须进行同期发情处理，这样移植的胚胎才会被受体动物接受。
3．回答下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的问题。下面为该实验过程中的一些重要操作示意图。
(1)正确的操作顺序是__C→B→E→D→A__。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是__加速血细胞的破裂__和__降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出__。
(3)上图A步骤中所用酒精溶液必须经过__充分冷却__才能使用，该步骤的目的是__提取含杂质较少(或较纯净)的DNA__。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可滴加__二苯胺__试剂后沸水浴，如果出现__蓝色__则证明该丝状物的主要成分为DNA。
【解析】DNA粗提取的过程为：鸡血细胞加蒸馏水，破裂后过滤→加2
mol/L
NaCl溶液→过滤除去不溶的杂质→加蒸馏水，析出含DNA的黏稠物→过滤→黏稠物溶解在2
mol/L
NaCl溶液中→过滤→体积分数为95%的冷却的酒精溶液进一步提纯。所以根据图示及以上分析，正确的操作顺序为C→B→E→D→A。图C步骤中往鸡血细胞中加蒸馏水，目的是使鸡血细胞吸水破裂，并释放核物质。图E步骤中往DNA浓NaCl溶液中加蒸馏水，目的是降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出。图A步骤中往浓NaCl溶液中加入95%酒精溶液，目的是利用DNA不溶于酒精的特点析出DNA，以提取含杂质较少的DNA，由于DNA在冷却的酒精溶液中溶解度更低，因此需将酒精冷却后使用。DNA在NaCl溶液中的溶解规律如图所示。在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺后呈现蓝色。
考
点
集
训 【P306】
课时练习四十六
一、选择题(每小题只有一个正确选项)
1．采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是(C)
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中
②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中
③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组导入细菌，用该细菌感染棉花体细胞，再进行组织培养
④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，注射到棉花子房，并进入受精卵
A．①②
B．②③
C．③④
D．④①
【解析】①将毒素蛋白直接注射到棉花受精卵中，没有获得目的基因，子代细胞不会有抗虫性状，①错误；②将编码毒素蛋白的DNA序列，直接注射到棉花受精卵中而没有将目的基因与运载体结合，这样目的基因是不会被保留下来的，很容易被水解掉，②错误；③在植物细胞基因工程中，利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，然后通过植物组织培养技术将植物细胞培养成完整植株，③正确；④在植物细胞基因工程中，可以利用花粉管通道法将目的基因导入受精卵中，然后发育为转基因植株，④正确。
2．人们常用DNA进行亲子鉴定。其原理是：从被测试者的血滴或口腔上皮提取DNA，用限制酶将DNA样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使用特别的DNA“探针”去寻找特定的目的基因。DNA“探针”与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X光下，便会显示由DNA探针凝聚于一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次过程，每一种探针用于寻找DNA的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。请问，DNA“探针”是指(D)
A．某一个完整的目的基因
B．目的基因片段的特定DNA
C．与目的基因相同的特定双链DNA
D．与目的基因互补的特定单链DNA
【解析】DNA“探针”是指与目的基因互补的特定单链DNA，不是一个完整的目的基因，A项错误，D项正确；DNA“探针”不是目的基因片段的特定DNA，B项错误；DNA“探针”是单链DNA，C项错误。
3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成了表达的是(A)
A．酵母菌细胞中提取到人的干扰素
B．棉花细胞中检测到载体上的标记基因
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的基因
D．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA
【解析】酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白，说明目的基因已经在受体细胞中完成了表达，A正确；棉花细胞中检测到细菌抗虫基因，说明目的基因已经成功导入受体细胞，但不能说明目的基因在受体细胞中已经完成表达，B错误；山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的基因，说明目的基因已经成功导入受体细胞，但不能说明目的基因在受体细胞中已经完成表达，C错误；大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA，说明目的基因已经成功导入受体细胞并转录，但不能说明目的基因完成了表达过程，D错误。
4．运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，保护农业生态环境。根据以上信息，下列叙述正确的是(C)
A．Bt基因的化学成分是蛋白质
B．Bt基因中有菜青虫的遗传物质
C．转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于含有Bt基因
D．转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物
【解析】基因是有遗传效应的DNA片段，所以Bt基因的化学成分不是蛋白质，A项错误；由题意可知，将抗菜青虫的Bt基因转移到油菜中，培育出的转基因抗虫油菜对菜青虫有毒杀作用，表明Bt基因不是来源于菜青虫，B项错误；基因控制生物的性状，将抗菜青虫的Bt基因转移到油菜中，培育出的转基因抗虫油菜能产生特异的杀虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，表明转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因，C项正确；转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是一种有机物，而不是无机物，D项错误。
5．下列关于基因工程的应用，说法错误的是(A)
A．我国转基因抗虫棉是转入了植物凝集素基因培育出来的
B．植物基因工程技术可用于提高农作物的抗逆能力
C．提高农作物的抗盐碱和抗干旱能力，与调节渗透压的基因有关
D．基因治疗是把正常基因导入病人体内从而达到治疗疾病的效果
【解析】我国转基因抗虫棉是转入了苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因培育出来的，A错误；植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面，B正确；提高农作物的抗盐碱和抗干旱能力，与调节渗透压的基因有关，C正确；基因治疗是把正常基因导入病人体内从而达到治疗疾病的效果，D正确。
6．下列有关基因工程与蛋白质工程的叙述，正确的是(A)
A．蛋白质工程可合成自然界原本不存在的蛋白质
B．蛋白质工程完全不同于基因工程
C．基因工程需对基因进行操作，蛋白质工程不需对基因进行操作
D．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平操作
【解析】基因工程合成的蛋白质是自然界中已经有的蛋白质，而蛋白质工程可合成自然界原本不存在的蛋白质，A正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，B错误；基因工程和蛋白质工程都需对基因进行操作，C错误；基因工程和蛋白质工程的操作对象都是基因，都属于分子水平上的操作，D错误。
7．下列关于蛋白质工程的说法，错误的是(C)
A．蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
B．实施蛋白质工程的基本途径必须从预期蛋白质功能出发
C．蛋白质工程实施过程中可对关键氨基酸直接置换或增删
D．蛋白质工程是一项难度很大的工程
【解析】蛋白质工程中真正的操作对象仍然是基因，即对基因的修饰或原有基因的改造，不是对蛋白质的结构或者氨基酸的结构进行改造，所以C错误。
8．既然蛋白质工程可以改造生物的蛋白质，当然这里所说的生物也包括大熊猫。因此我们可以通过改造大熊猫体内的某些蛋白质，使大熊猫的生命活动更加适应环境。推测以下关于改造大熊猫体内某蛋白质的说法错误的是(D)
A．改造后的蛋白质有可能成为一种新抗原，使大熊猫产生免疫反应，因此应慎重施行
B．改造蛋白质根本上是通过改造基因来实现的
C．改造蛋白质后的大熊猫和现在的大熊猫仍是一个物种
D．改造蛋白质后的大熊猫的后代不具有改造的蛋白质
【解析】改造后的蛋白质具备抗原的特性，因此对高等动物(特别是人)应慎重进行改造；改造某种蛋白质后的生物和未改造的生物差别若仅是一个或几个蛋白质，不一定引起生殖隔离，因此可能仍属同一物种；改造蛋白质通过改造基因进行，若在受精卵时期进行改造，则可遗传给后代；而若像基因治疗一样，对成体进行改造，则不能遗传，其后代无改造的蛋白质。
9．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将提取获得的含DNA黏稠物(还含有较多杂质)分别处理如下，其中含DNA少的是(B)
第一，放入0.14
mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液①和黏稠物②；
第二，放入2
mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液③和黏稠物④；
第三，放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液⑤和黏稠物⑥。
A．①③⑤
B．①④⑤
C．②④⑥
D．②③⑤
【解析】在不同浓度的氯化钠溶液中DNA的溶解度不同。在0.14
mol/L的氯化钠溶液中溶解度最小，DNA析出，呈丝状物，过滤后存在于黏稠物中；在2
mol/L的氯化钠溶液中溶解度最大，所以DNA呈溶解状态，过滤后存在于滤液中；酒精溶液可使DNA分子凝集，因此，在冷却的95%的酒精溶液中DNA凝集，呈丝状物，过滤后，存在于黏稠物中。
10．对乙型肝炎病毒基因组的DNA测序得知该病毒的核心蛋白和表面抗原蛋白的氨基酸序列。下图是应用生物工程生产乙肝疫苗的示意图，据图分析下列叙述不正确的是(C)
乙肝病毒有关基因细菌大量生产疫苗
A．生产乙肝疫苗的过程也达到了定向改造细菌的目的
B．选用细菌作为受体细胞是因为其代谢旺盛繁殖快
C．用于生产疫苗的目的基因编码病毒的核心蛋白
D．在②过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶
【解析】生产乙肝疫苗的过程是利用基因工程技术获得的，基因工程是定向改造生物的遗传特性，A正确；选用细菌作为受体细胞的原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，B正确；病毒的抗原性是由表面抗原蛋白决定的，故生产疫苗的目的基因可编码表面抗原蛋白，C错误；②过程中将目的基因导入受体细胞，需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶处理使目的基因和运载体结合形成重组DNA分子，D项正确。
11．胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，要经过较长的时间才能进入血液，而进入血液的胰岛素又容易分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图推断下列说法不正确的是(B)
A．图中构建新的胰岛素模型的主要依据是蛋白质的预期功能
B．通过人工合成形成的新基因应与原基因结合后转移到大肠杆菌等受体细胞中才能得到准确表达
C．利用大肠杆菌生产速效胰岛素，用到了蛋白质工程和基因工程等
D．图中合成出新的胰岛素基因最关键的一步是构建新的胰岛素模型
【解析】蛋白质工程的目标是：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是蛋白质的预期功能，A项正确；通过人工合成形成的新基因，应与载体构建基因表达载体，之后再导入受体细胞中使之得以表达，B项错误；利用蛋白质工程生产自然界原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，即目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程来生产基因产物，并且在生产过程中要借助工程菌，还需要进行发酵，C项正确；蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)，所以图中合成出新的胰岛素基因最关键的一步是构建新的胰岛素模型，D项正确。
二、非选择题
12．科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。操作过程如图，请根据图回答问题：
(1)人的基因之所以能与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是__人的基因与大肠杆菌DNA的组成成分相同，结构相同，并且具有相同的黏性末端__。
(2)过程(1)表示的是采取__反转录法(逆转录法)__的方法来获取目的基因。
(3)图中(3)过程用人工方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒__侵染__细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用__Ca2＋__处理，使细胞处于能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，这种细胞称为__感受态__细胞，再将__基因表达载体__溶于缓冲液中与该种细胞混合，在一定的温度下完成转化。
(4)大肠杆菌B可能导入了质粒或重组质粒，也可能没有质粒导入其中。筛选出含质粒或重组质粒的细菌可采用的方法是__将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的，说明已导入了质粒A或重组质粒，反之则没有导入__，理由是：__因为普通质粒A和重组质粒上都有抗氨苄青霉素基因__。
(5)如果把已经导入了普通质粒A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，发生的现象是__有的能生长，有的不能生长__，原理是__导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有四环素抗性基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在四环素抗性基因中，破坏了其结构和功能__。
13．HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的__RNA__，以其作为模板，在__逆转录酶__的作用下合成__cDNA(或DNA)__，获取该目的蛋白的基因，构建基因表达载体，随后导入受体细胞。
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的相应分泌蛋白是__抗体__，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是__抗原—抗体特异性结合__。
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分__T(或T淋巴)__细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。
(4)人的免疫系统有__监控和清除__癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。
【解析】(1)HIV的遗传物质是RNA，所以要想获得相应的目的基因，应以HIV的RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA(或DNA)。
(2)目的蛋白注入机体后相当于抗原。在抗原的刺激下，机体进行体液免疫，由浆细胞产生相应抗体(分泌蛋白)，由于该抗体能与目的蛋白(抗原)发生特异性结合，所以可通过抗体检测出有无目的蛋白，从而确定体内有无HIV。
(3)HIV主要攻击人体的T(或T淋巴)细胞，从而降低机体免疫系统的防卫功能。
(4)癌细胞在机体中属于抗原，人体的免疫系统能够监控和清除癌细胞。
14．下面是蛋白质工程操作的基本流程图。请回答下列问题：
(1)蛋白质工程是通过__基因修饰或基因合成__，对__现有蛋白质__进行改造，或制造一种__新的蛋白质__。
(2)图中③过程的主要依据是每种氨基酸都有其对应的__密码子__，后者位于__信使RNA__分子上，其上的核苷酸序列与基因中的脱氧核苷酸序列之间存在着__碱基互补配对__关系。
(3)蛋白质工程中在获得特定的目的基因后，需要通过__基因工程__技术来生产所需要的蛋白质。
(4)目前蛋白质工程成功的例子不多，主要原因是__对大多数蛋白质的高级结构了解还不够__。
【解析】本题考查蛋白质工程的基本原理和操作、蛋白质工程与基因工程的关系等。(1)蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求。(2)蛋白质工程根据氨基酸序列推测相应的脱氧核苷酸序列，氨基酸与脱氧核苷酸之间的联系枢纽是信使RNA，信使RNA由DNA转录形成，而密码子是信使RNA上特定的能决定一个氨基酸的三个相邻的碱基序列。(3)蛋白质工程需要通过基因工程来实现。(4)由于人们现在对大多数蛋白质的高级结构了解还不够，这样就不能对相应基因进行有目的地改造或合成出相应的基因，这是蛋白质工程成功事例不多的主要原因。
15．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，A、B、C、D、E五个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均相同，而且正确，但实验结果却不同。
组别
实验材料
提取核物质时
加入的溶液
去除杂质时
加入的溶液
DNA鉴定时
加入的试剂
A
鸡血
蒸馏水
95%的酒精(25
℃)
二苯胺
B
菜花
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
双缩脲
C
人血浆
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
D
人血细胞
2mol/L的氯化钠
0.14mol/L的氯化钠
双缩脲
E
鸡血
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
(1)实验材料选择错误的组别是__C、D__，其原因是__人的血浆中没有细胞结构，成熟的红细胞中没有细胞核，选用这些材料得不到DNA或得到的DNA很少__。
(2)实验步骤(不包括实验材料)均正确，但得不到DNA的组别是__C__。
(3)沸水浴中试管颜色变蓝的组别是__A、E__；蓝色较淡的是__A__，其原因是__冷却的酒精对DNA的凝集效果较佳，该组使用的是25__℃的酒精__。
(4)B组实验不成功的最主要原因是__菜花细胞在蒸馏水中不能被破坏，得不到DNA(应采用研磨的方法)__。
【解析】(1)人的血浆中没有细胞结构，成熟的红细胞中没有细胞核，在这些材料中是不能得到DNA或得到的DNA很少。
(2)血细胞中有少量的白细胞，其中有DNA，所以只有C组人血浆中没有。
(3)冷酒精对DNA有较好的凝集效果。
(4)菜花细胞外有细胞壁起保护作用，在蒸馏水中不会破裂，所以不能得到DNA。
16．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管序号
A
B
1
加2
mol/L
NaCl溶液5
mL
加2
mol/L
NaCl溶液5
mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4
mL二苯胺，混匀
加4
mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5分钟
沸水浴5分钟
实现现象
__溶液不变蓝色__
__溶液逐渐变蓝色__
实验结论
__DNA在沸水浴的情况下____遇二苯胺会被染成蓝色__
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？
__溶液颜色基本不变__。
(3)在沸水浴中加热的目的是__加快颜色反应速度__，同时说明DNA对高温有较强的__耐受性__。
(4)A试管在实验中的作用是__对照__。
(5)B试管中溶液颜色的深浅主要与__加入试管中的DNA(丝状物)的多少__有关。
【解析】本题主要考查DNA分子的鉴定。A、B两试管形成对
第四十五课时
1．基因工程的诞生 2.基因工程的原理及技术(含PCR)
夯
实
基
础 【P172】
考点一 基因工程的理论基础和基本工具
【回扣教材】
1．基因工程的概念
(1)供体：提供__目的基因__。
(2)操作环境：__体外__。
(3)操作水平：__分子__水平。
(4)原理：__基因重组__。
(5)受体：目的基因表达的场所。
(6)优点：克服__远缘杂交不亲和__的障碍，定向改造生物的__遗传性状__。
2．基因拼接的理论基础
(1)__DNA__是主要遗传物质。
(2)DNA的基本组成单位都是__四种脱氧核苷酸__。
(3)双链DNA分子的空间结构都是规则的__双螺旋__结构。
3．外源基因在受体内表达的理论基础
(1)__基因__是控制生物性状的独立遗传单位。
(2)遗传信息的传递都遵循__中心法则__。
(3)生物界共用一套__遗传密码__。
4．基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶
①来源：主要是从__原核__生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的__核苷酸序列__并切开相应两个核苷酸之间的__磷酸二酯键__。
③结果：产生__黏性末端__或平末端。
④下图中的图1和图2分别表示的是EcoRⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶的作用示意图。EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是__GAATTC__，切割位点在__G和A__之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是__CCCGGG__，切割位点在__C和G__之间；说明限制酶具有__专一性__。
(2)DNA连接酶：常用的DNA连接酶有
E．coliDNA连接酶：来源于__大肠杆菌__
T4
DNA连接酶
(3)载体：携带目的基因进入受体细胞
条件：能在宿主细胞中保存下来并大量__复制__，有一个至多个__限制性核酸内切酶__切割位点，有特殊的__标记基因__，便于筛选。
种类：__质粒__(常用)、λ噬菌体的衍生物、__动植物病毒__。
质粒的特点：小型双链环状DNA分子；能自主复制；有一个至多个__限制酶切割位点__；有特殊的__标记基因__。
作用：①作为运载工具，将__目的基因__转移到宿主细胞内；②在宿主细胞内连同目的基因一起大量__复制__。
【命题角度分析】
角度一 考査DNA重组技术的概念、
基本原理及工具
【例1】下列有关基因工程叙述错误的是(A)
A．基本原理是DNA具有双螺旋结构以及遗传信息传递和表达方式相同
B．最常用的载体是质粒
C．工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶
D．该技术人为地增加了生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换
【解析】基本原理是DNA具有双螺旋结构以及生物共用一套遗传密码，A错误；基因工程中最常用的载体是质粒，B正确；基因工程所用工具酶主要有限制性核酸内切酶和DNA连接酶，C正确；基因工程技术能人为地增加生物变异的范围，实现种间遗传物质的交换，D正确。
角度二 考査DNA重组技术的基本工具的应用
【例2】chlL基因是蓝藻DNA上控制叶绿素合成的基因，为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞。技术路线如图甲所示，请据图分析回答：
(1)与真菌相比较，蓝藻在结构上最主要的特点是__没有以核膜为界限的细胞核__，在功能上最主要的特点是__能够进行光合作用__。
(2)①②过程中均使用的工具酶有__限制性核酸内切酶和DNA连接酶__。
(3)构建重组质粒B在整个操作过程中的目的是__破坏chlL基因并筛选出该变异株细胞__。
(4)若含有chlL基因的DNA片段和选用的质粒上的限制酶切割位点如图乙所示。请回答：
①构建含chlL基因的重组质粒A时，应选用的限制酶是__酶1和酶3__，对__质粒和含chlL基因的DNA__进行切割。
②同时用酶1和酶4切割图乙中的质粒，则产生含有1
800对碱基和8
200对碱基的两种片段；用图中四种酶同时切割此质粒。则产生含有600对碱基和8
200对碱基的两种长度片段；若换用酶1和酶3同时切割此质粒，则产生的片段长度是__含有1__200对碱基和8__800对碱基的两种长度片段__。
【解析】(1)蓝藻为原核生物，没有以核膜为界限的细胞核，其体内含有光合色素，能进行光合作用。(2)表达载体构建时需限制酶和DNA连接酶等工具酶。(3)由题干信息“构建该种生物缺失chlL基因的变异株细胞”可知，构建重组质粒B的目的在于破坏chlL基因并筛选出变异株细胞。(4)①由图乙知，获得chlL基因需酶1和酶3对此基因所在的DNA进行切割，同时对质粒也要用同种酶切割处理，以便构建重组质粒A。②由题意知四种酶同时切割时含600对碱基的片段共有3个。若用酶1和酶3同时切割时，产生的片段有8
200＋600＝8
800对碱基；另一片段为600×2＝1
200对碱基。
【知识拓展】
1．巧辨基因工程操作工具的8个易错点
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端或平末端。
(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端或平末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。
(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体本质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；细胞膜上载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
2．限制酶选择的注意事项
(1)根据目的基因两端的限制酶切位点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，可使用两种不同的限制酶分别切割目的基因和质粒，如图甲可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种限制酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶一致，以确保具有相同的黏性末端。
②插入的目的基因的表达需要调控序列，用作载体的质粒的插入基因部位之前需有启动子，之后需有终止子，所以所选限制酶的切点应该“前有启动子，后有终止子”。
③质粒作为载体必须具备标记基因、启动子和终止子等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选限制酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
DNA连接酶
DNA聚合酶
作用实质
都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键
是否需模板
不需要
需要
连接类型DNA链
单链
单链
作用过程
在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存在的核酸片段的3′端的羟基上，形成磷酸二酯键
作用结果
将存在的DNA片段连接成重组DNA分子
合成新的DNA分子
【随堂练习】
1．下列有关基因工程和酶的叙述，正确的是(C)
A．同种限制酶既可以切割目的基因又可以切割质粒，因此不具备专一性
B．运载体的化学本质与载体蛋白相同
C．限制酶不能切割烟草花叶病毒的核酸
D．DNA连接酶可催化脱氧核苷酸链间形成氢键
【解析】一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子，因此具有专一性；运载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等，成分不单一，载体蛋白本质是蛋白质；烟草花叶病毒的核酸为RNA，限制酶不能切割；DNA连接酶可催化黏性末端黏合后的磷酸二酯键形成。
2．(2016全国Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有__能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点__(答出两点即可)。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长__；并且__含有质粒载体__和__含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒)__的细胞也是不能区分的，其原因是__二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长__。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有__四环素__的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于__受体细胞__。
【解析】(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有：能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点等。(2)依题意可知，目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，而氨苄青霉素抗性基因(Ampr)仍能行使正常功能。如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞，因二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长，所以是不能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因(Tetr)失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。(3)噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳仍留在细胞外；在噬菌体的DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
考点二 基因工程基本操作程序
【回扣教材】
基因工程的基本操作程序
第一步：__目的基因的获取__
1．目的基因主要是指__编码蛋白质的结构基因__，也可以是一些具有调控作用的因子。目的基因的获取途径常见的有：__从自然界中已有的物种中分离出来__、__人工合成目的基因__、__利用PCR技术扩增目的基因__。
2．基因文库：将含有某种生物不同基因的许多__DNA片段__导入__受体菌__的群体中储存，各个__受体菌__分别含有这种生物的__不同的基因__，称为基因文库。常见的基因文库有__基因组文库__和__cDNA文库__。
3．PCR技术扩增目的基因
PCR是__聚合酶链式反应__的缩写，是一项在__生物体外__复制特定DNA片段的核酸合成技术，可以在短时间内__大量扩增目的基因__。其原理是__DNA双链复制__，其过程是：①加热至90～95
℃，__DNA解旋__；②冷却到55～60
℃，__引物结合到互补DNA链__；③加热至70～75
℃，__热稳定DNA聚合酶(如Taq酶)从引物起始进行互补链的合成__。
第二步：__基因表达载体的构建__
1．目的：使目的基因在受体细胞中__稳定存在__，并且可以__遗传给下一代__，同时使目的基因能够__表达和发挥作用__。
2．基因表达载体的组成：__启动子__＋__目的基因__＋__终止子__＋__标记基因__
(1)启动子：是一段有特殊结构的__DNA片段__，位于基因的首端，是__RNA聚合酶__识别和结合的部位，能驱动基因__转录出mRNA__，最终获得所需的蛋白质。
(2)终止子：是一段有特殊结构的__DNA短片段__，位于基因的__尾端__。
(3)标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中__是否含有目的基因__，从而将__含有目的基因的细胞__筛选出来。常用的标记基因是__抗生素抗性基因__。
第三步：__将目的基因导入受体细胞__
1．转化的概念：是目的基因进入__受体细胞内__，并且在受体细胞内__维持稳定和表达__的过程。
2．常用的转化方法：
(1)将目的基因导入植物细胞：
①采用最多的方法是__农杆菌转化法__，农杆菌特点：易感染__双子叶__植物和裸子植物，对大多数__单子叶__植物没有感染力；农杆菌中的Ti质粒上的T—DNA可转移至受体细胞，并整合到受体细胞的__染色体的DNA__上。
②其次还有__基因枪法__，是单子叶植物中常用的一种基因转化方法，但是成本较高。
③__花粉管通道法__，是我国科学家独创的一种方法，是一种十分简便经济的方法(我国的转基因抗虫棉就是用此种方法获得的)。
(2)将目的基因导入动物细胞：
①最常用的方法是__显微注射技术__。此方法的受体细胞多是__受精卵__。
②操作程序：目的基因表达载体__提纯__→取卵(受精卵)→显微注射→注射了目的基因的受精卵移植到__雌__性动物的__输卵管或子宫__内发育→新性状动物。
(3)将目的基因导入微生物细胞：
感受态细胞法
①原核生物特点：__繁殖快__、__多为单细胞__、__遗传物质相对较少__等，因此早期的基因工程都用原核生物作为受体细胞。
②大肠杆菌最常用的转化方法是：__Ca2＋__处理细胞→__感受态__细胞→表达载体与感受态细胞混合→__感受态__细胞吸收DNA分子。
3．重组目的基因导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是__标记基因是否表达__。
第四步：__目的基因的检测与鉴定__
1．首先要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，方法是__DNA分子杂交技术__。
2．其次还要检测__目的基因是否转录出了mRNA__，方法是__用标记的目的基因作探针与mRNA杂交__。
3．最后检测__目的基因是否翻译成蛋白质__，方法是从转基因生物中提取__蛋白质__，用相应的抗体进行__抗原—抗体杂交__。
4．有时还需进行__个体生物学水平__的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
【命题角度分析】
角度一 考査基因工程操作中的基本知识
【例1】下列对基因工程的四大操作步骤的理解有错误的是一项是(D)
A．将人的生长素基因在大肠杆菌表达，最好从cDNA文库获取目的基因
B．基因表达载体的构建是核心步骤，其组成包括启动子、终止子等
C．农杆菌法是将目的基因导入双子叶植物细胞的方法
D．目的基因的检测与鉴定过程均需要DNA探针进行分子杂交
【解析】A.原核细胞基因中不含内含子，因此将人的生长激素基因在大肠杆菌表达，最好从cDNA文库获取目的基因，A正确；B.基因表达载体的构建是核心步骤，其组成包括启动子、终止子、目的基因和标记基因，B正确；C.农杆菌法是将目的基因导入双子子叶植物细胞的方法，C正确；D.在检测目的基因是否表达时利用抗原—抗体杂交的方法，并且在利用个体水平在对目的基因检测时也不需要利用DNA探针进行分子杂交，D错误。故选D。
角度二 考査目的基因的检测与鉴定
【例4】为达到相应的目的，必须通过分子检测的是(B)
A．携带链霉素抗性基因受体菌的筛选
B．产生抗人白细胞介素 8抗体的杂交瘤细胞的筛选
C．转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定
D．21三体综合征的诊断
【解析】熟悉检测手段应用的范围是解决本题的关键。逐项解析如下：携带链霉素抗性基因受体菌的筛选方法有两种：①可利用含链霉素的培养基培养菌体进行，②用标记的链霉素抗性基因通过分子杂交技术筛选；A项错误。筛选出抗人白细胞介素 8抗体的杂交瘤细胞，只能用抗原—抗体杂交技术；B项正确。转基因抗虫棉植株抗虫效果的鉴定，属于个体生物学水平的鉴定，需要做抗虫的接种实验来确定；C项错误。21 三体综合征是由于患者的21号染色体比正常者的多一条导致，因此该病的诊断可通过显微镜下对染色体的观察确定，D项错误。
角度三 考査基因工程的基本操作程序的应用
【例5】(2016全国Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
↓ ↓
↓
——GAATTC—— ——GGATCC—— ——GATC——
——CTTAAG—— ——CCTAGG—— ——CTAG——
↑ ↑
↑
图(a)
图(b)
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被__Sau3AⅠ__酶切后的产物连接，理由是__两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端__。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有__甲和丙__，不能表达的原因是__甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录__。
甲
乙
丙
图(c)
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有__EcoRⅠDNA连接酶__和__T4DNA连接酶__，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是__T4DNA连接酶__。
【解析】(1)由于限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割后产生的片段具有相同的黏性末端，所以经BamHⅠ酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被Sau3AⅠ酶切后的产物连接。(2)启动子是一段有特殊序列的DNA片段，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。终止子也是一段有特殊结构的DNA短片段，相当于一盏红色信号灯，使转录在所需要的地方停止下来。在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。而图甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录，所以都不能表达目的基因的产物。(3)常见的DNA连接酶有EcoRⅠ
DNA连接酶和T4
DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4
DNA连接酶。
【知识拓展】
1．将目的基因导入受体细胞的比较
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射技术
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入Ti质粒的T DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
2.基因表达载体中启动子、终止子的来源
(1)如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。
(2)如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体生物中，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录的，因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
3．PCR反应的过程及结果
(1)PCR反应过程：
①变性：当温度上升到90～95
℃时，双链DNA解旋为单链，如下图：
②复性：系统温度下降至55～60
℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
③延伸：当系统温度上升至70～75
℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
(2)结果：
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
【随堂练习】
1．(2016海南)基因工程又称为DNA重组技术，回答相关问题：
(1)在基因工程中，获取目的基因主要有两大途径，即__人工合成__和从__生物材料__中分离。
(2)利用某植物的成熟叶片为材料，同时构建cDNA文库和基因组文库，两个文库相比，cDNA文库中含有的基因数目比基因组文库中的少，其原因是__cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因__。
(3)在基因表达载体中，启动子是__RNA__聚合酶识别并结合的部位。若采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，最常用的原核生物是__大肠杆菌(或细菌)__。
(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有__金粉__和__钨粉__颗粒。
【解析】(1)获取目的基因主要有两个途径，即人工合成和从自然界已有的物种中分离。
(2)植物的成熟叶片中基因选择性表达，因此由所有RNA逆转录形成的cDNA文库中只含有叶细胞已转录(或已表达)的基因，而基因组文库中含有该植物的全部基因。
(3)在基因表达载体中，启动子是RNA聚合酶识别并结合的部位。采用原核生物作为基因表达载体的受体细胞，由于易于培养，最常选用大肠杆菌(或细菌)。
(4)将目的基因通过基因枪法导入植物细胞时，常用的携带目的基因的金属颗粒有金粉和钨粉颗粒。
2．萤火虫发光是体内萤光素酶催化一系列反应所产生的现象。如果荧光素酶存在于植物体内，也可使植物体发光。一直以来荧光素酶的唯一来源是从荧光虫腹部提取。但加利福尼亚大学的一组科学家成功地通过转基因工程实现了将荧光素酶基因导入大肠杆菌体内，并在大肠杆菌体内产生荧光素酶。请你根据已有的知识回答下列有关问题：
(1)在此转基因工程中，目的基因是__荧光素酶基因__，具体操作过程中下图所示的黏性末端一般是由__2__种限制性核酸内切酶作用产生的。
(2)将此目的基因导入大肠杆菌体内需要载体的帮助，则作为载体必须具备能够在宿主细胞内复制并稳定保存，以及__具有特定的限制酶切割位点、具有某些标记基因(缺一不可)__(至少答出两点)等条件。
(3)在此转基因工程中，将体外重组DNA导入大肠杆菌体内，并使其在细胞内__维持稳定和表达__的过程称为转化。最常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是__使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围DNA分子的生理状态(或使大肠杆菌处于感受态细胞状态)__。
(4)目的基因在受体细胞是否能转录出mRNA，可用__分子杂交__技术来检测；目的基因是否表达出相应的蛋白质，除了通过大肠杆菌是否发光来确定外，还可以通过__抗原—抗体__特异性反应来判断。
【解析】(1)在此转基因工程中，目的基因是荧光素酶基因；图中所示的黏性末端是由2种限制性核酸内切酸作用产生的，其中第一个和第三个是由一种限制酶切割产生的，另外两个是由另一种限制酶切割产生的。(2)作为基因工程的载体必须具备的条件：要具有限制酶的切割位点；要有标记基因(如抗性基因)，以便于受体细胞的筛选；能在宿主细胞中稳定存在并复制；是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出来。(3)基因工程中，将体外重组DNA导入大肠杆菌体内，并使其在细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。最常用的转化方法是首先用Ca2＋处理大肠杆菌，目的是使大肠杆菌细胞处于能够吸收周围DNA分子的生理状态。(4)检测转基因生物的DNA上是否插入目的基因，常用DNA分子杂交技术；检测目的基因是否表达出相应的蛋白质，常用抗原—抗体杂交技术。
考
点
集
训 【P303】
课时练习四十五
一、选择题(每小题只有一个正确选项)
1．下列关于基因工程的叙述中，错误的是(D)
A．首先要获取目的基因，然后要让目的基因与运载体结合
B．一般用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和获取目的基因
C．目的基因导入受体细胞后可以随着受体细胞的繁殖而复制
D．一次基因工程操作中，受体细胞均能够摄入重组DNA分子
【解析】首先要获取目的基因，然后要让目的基因与运载体结合，构建基因表达的载体，A项正确；同一种限制性核酸内切酶切割质粒和获取目的基因，形成相同的黏性末端，B项正确；目的基因导入受体细胞后可以随着受体细胞的繁殖而复制，实现遗传信息的传递，C项正确；基因工程操作中，有重组DNA分子的受体细胞、非重组DNA分子的受体细胞、不含运载体的受体细胞，其中含重组DNA分子的受体细胞很少，D项错误。
2．右图为某质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示目的基因的插入位点。实验中可能有的受体细胞(某种细菌，该细菌无相关的抗性基因)没有导入质粒，有的细胞导入的质粒没有连接到目的基因(空载质粒)。为了筛选出真正导入了重组质粒的受体细胞，科学家将受体细胞分别培养在含四环素的培养基中，有的培养基形成了菌落。从每个菌落中挑取少量菌种分别接种到含氨苄青霉素的培养基中，有的培养基无菌落产生。下列分析正确的是(D)
A．在含四环素的培养基中未形成菌落的为导入了空载质粒的细菌
B．在含四环素的培养基中形成菌落的为导入了重组质粒的细菌
C．在含氨苄青霉素的培养基中能正常生长的为导入了重组质粒的细菌
D．在含氨苄青霉素的培养基中不能正常生长的为导入了重组质粒的细菌
【解析】在含四环素的培养基中未形成菌落，说明无四环素抗性基因，即未导入质粒；在含四环素的培养基中形成菌落，说明有四环素抗性基因，即导入了重组质粒或空载质粒；在含氨苄青霉素的培养基中能正常生长，说明相关的抗性基因未被破坏，即导入了空载质粒；在含氨苄青霉素的培养基中不能正常生长，而在含四环素的培养基中可以生长，说明有四环素抗性基因无青霉素抗性基因，即导入了重组质粒。
3．在基因表达载体的构建中，下列说法正确的是(B)
A．一个表达载体的组成只包括启动子、终止子
B．只有存在启动子时才能驱动基因转录出mRNA
C．基因表达载体的构建是在生物体的细胞内完成的
D．终止密码子的作用是使转录在所需要的地方停止
【解析】基因表达载体的构建是基因工程的核心内容，一个表达载体的组成，除了目的基因外，还有启动子、终止子和标记基因等，A错误；启动子在基因的首段，它是RNA聚合酶的结合位点，能控制着转录的开始，B正确；由于受体细胞有植物、动物以及微生物之分，以及目的基因导入受体细胞的方法不同，因此基因表达载体的构建是不完全相同的，C错误；终止子在基因的尾端，它控制着转录的结束，而终止密码子是存在于mRNA上的，D错误。
4．下列对基因工程的四大操作步骤的理解有错误的一项是(D)
A．限制性核酸内切酶主要存在于原核生物体内，识别位点具有特异性
B．DNA连接酶是恢复被切开的两条脱氧核苷酸链之间的磷酸二酯键
C．目的基因主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些有调控作用的因子
D．目的基因的检测与鉴定的过程中只能用含青霉素的选择培养基
【解析】限制性内切酶主要存在于原核生物体内，识别位点具有特异性，A正确；DNA连接酶是连接被切开的两条脱氧核苷酸链之间的磷酸二酯键，B正确；目的基因是指能编码蛋白质的基因，或调控作用的因子，C正确；目的基因的检测与鉴定的过程中只能用含抗生素的选择培养基，D错误。
5．人们常选用的细菌质粒分子往往带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因的主要作用是(B)
A．提高受体细胞在自然环境中的耐药性
B．有利于对目的基因是否导入进行检测
C．增加质粒分子的分子量
D．便于与外源基因连接
【解析】在基因工程中，往往选择的质粒会带有一定的抗性基因，抗性基因的主要作用是有利于检测目的基因是否导入到受体细胞了。
6．获取目的基因的方法有多种，下列不属于目的基因获取常用的方法是(C)
A．从基因组文库中获取
B．从cDNA文库中获取
C．从含目的基因生物细胞中获取
D．利用PCR技术获取
【解析】获得目的基因的常用方法是：
①从基因文库(基因组文库和cDNA文库)中获取；
②利用PCR技术扩增；
③人工合成(化学合成)；从含目的基因生物细胞中获取，其目的性不强，且工作量大，一般不采用。综上所述，A、B、D三项均错误，C项正确。
7．PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，下列有关PCR过程的叙述，不正确的是(C)
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
【解析】95
℃下使模板DNA变性是使DNA分子两条链碱基对之间的氢键断裂，从而解链，A项正确；引物是单链的DNA片段，因此引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成，
B项正确；PCR技术实际上就是DNA的复制，因此用的原料是脱氧核苷酸，故C项错误；细胞内DNA复制是生物体内完成的，因此最适温度就是生物体的体温，而PCR技术的温度是不断循环变化的，总体来说PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高，D项正确。
8．目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定的是(C)
①检测受体细胞是否有目的基因 ②检测受体细胞是否有致病基因 ③检测目的基因是否转录 ④检测目的基因是否翻译出蛋白质
A．①②③
B．②③④
C．①③④
D．①②④
【解析】目的基因检测和鉴定，首先要检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因，即检测受体细胞是否有目的基因，①正确；其次要检测目的基因是否转录出mRNA，③正确；最后检测目的基因是否翻译出蛋白质，④正确；致病基因不属于目的基因，与目的基因的检测和鉴定无关，②错误。综上所述，供选答案组合，C项正确，A、B、D三项均错误。
9．下表中列出了几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中箭头表示相关限制酶的酶切位点。下列说法错误的是(A)
图1 图2
A．一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．用图1中的质粒和图2中的目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ切割
C．图2中为防止酶切后单个含目的基因的DNA片段自身连接成环状，不能使用EcoRⅠ
D．为了获取重组质粒，最好用BamHⅠ和HindⅢ同时切割质粒和外源DNA
【解析】一个图1所示的质粒分子经SmaⅠ切割后，含有2个游离的磷酸基团，A项错误。
10．关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是(B)
A．将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是花粉管通道法
B．将目的基因导入动物细胞采用最多的方法是显微注射技术
C．为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用缓冲液进行处理
D．在显微注射技术中，不需先构建基因表达载体
【解析】将目的基因导入植物细胞，常采用农杆菌转化法，A错误；显微注射技术是将目的基因导入动物细胞最有效的方法，B正确；为使大肠杆菌易吸收DNA分子，应先用氯化钙溶液进行处理，使其成为感受态细胞，C错误；在显微注射技术中，导入受体细胞的也是构建好的基因表达载体，D错误。
11．下图是四种不同质粒的示意图，其中ori为复制必需的序列，amp为氨苄青霉素抗性基因，tet为四环素抗性基因，箭头表示同一种限制性核酸内切酶的酶切位点。下列有关叙述正确的是(D)
A．基因amp和tet是一对等位基因，常作为基因工程中的标记基因
B．质粒是细菌细胞中能自我复制的小型环状的DNA和病毒中的DNA
C．限制性核酸内切酶的作用部位是DNA分子中特定的两个核苷酸之间的氢键
D．用质粒4将目的基因导入大肠杆菌，该菌不能在含四环素的培养基上生长
【解析】质粒上不含等位基因；质粒是细胞染色体(拟核)外能够自主复制的很小的环状DNA分子；限制性核酸内切酶的作用部位是DNA分子中特定的两个相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，而不是氢键。
12．质粒是基因工程中最常用的运载体，它存在于许多细菌体内。质粒上有标记基因(如图所示)，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转移成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，下表是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供细菌的生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是(A)
细菌在含氨芐青霉素
培养基上生长情况
细菌在含四环素
培养基上生长情况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A.①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
【解析】第①组中细胞能在含氨苄青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是c；第②组中细胞能在含青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因没有被破坏；细菌不能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因被破坏，说明了外源基因插入的位置是b；第③组中细胞不能在含青霉素培养基上生长，说明抗氨苄青霉素基因被破坏；细菌能在含四环素培养基上生长，说明抗四环素基因没有被破坏，说明了外源基因插入位置是a。
二、非选择题
13．(2016上海)回答下列有关遗传信息传递与表达的问题。
在下图所示的质粒pZHZ11(总长为3.6
kb，1
kb＝1
000对碱基)中，lacZ基因编码β 半乳糖苷酶，后者催化生成的化合物能将白色的大肠杆菌染成蓝色。
(1)若先用限制酶BamH
Ⅰ切开pZHZ11，然后灭活BamH
Ⅰ酶，再加DNA连接酶进行连接，最后将连接物导入足够数量的大肠杆菌细胞中，则含3.1
kb质粒的细胞颜色为__白色__；含3.6
kb质粒的细胞颜色为__白色和蓝色/白色或蓝色__。
(2)若将两端分别用限制酶BamH
Ⅰ和BglH
Ⅰ切开的单个目的基因片段置换pZHZ11中0.5
kb的BamH
Ⅰ酶切片段，形成4.9
kb的重组质粒，则目的基因长度为__1.8__kb。
(3)上述4.9
kb的重组质粒有两种形式，若用BamH
Ⅰ和EcoR
Ⅰ联合酶切其中一种，只能获得1.7
kb和3.2
kb两种DNA片段；那么联合酶切同等长度的另一种重组质粒，则可获得__1.4__
kb和__3.5__kb两种DNA片段。
(4)若将人的染色体DNA片段先导入大肠杆菌细胞中克隆并鉴定目的基因，然后再将获得的目的基因转入植物细胞中表达，最后将产物的药物蛋白注入小鼠体内观察其生物功能是否发挥，那么上述过程属于__C__。
A．人类基因工程
B．动物基因工程
C．植物基因工程
D．微生物基因工程
【解析】(1)3.1
kb质粒lacZ基因被破坏，含3.1
kb质粒的细胞颜色为白色；加DNA连接酶进行连接，被切下的片段可能反向连接，所含3.6
kb质粒的细胞可能含有正常质粒和异常质粒，也可能只含有正常质粒或异常质粒，颜色为白色和蓝色(白色或蓝色)。(2)pZHZ11中0.5
kb的BamHⅠ酶切片段被切除后，剩余3.1
kb，将两端分别用限制酶BamHⅠ和BglHⅠ切开的单个目的基因插入，形成4.9
kb的重组质粒，则目的基因大小为4.9－3.1＝1.8
kb。(3)限制酶BamHⅠ和BglHⅠ切割产生的黏性末端可以进行连接，但连接后不能被两者中的任何一个识别并切割，用BamHⅠ切割4.9
kb的重组质粒，只有一个切割位点。用BamHⅠ和EcoRⅠ联合酶切其中一种，只能获得1.7
kb和3.2
kb两种DNA片段；联合酶切同等长度的另一种重组质粒，可获得1.7＋1.8＝3.5
kb和3.2－1.8＝1.4
kb两种DNA片段。(4)题干所述目的是让人的基因在植物细胞中表达，属于植物基因工程。
14．研究发现，转基因抗虫植物能杀死昆虫的原理是该基因控制合成的蛋白质被昆虫食用后，在消化道中被蛋白酶水解产生具有毒性的活性肽，与昆虫肠道细胞上的受体结合，使细胞渗透压失衡，最终导致昆虫死亡。下图表示从苏云金杆菌中获取BT抗虫基因以培养抗虫玉米的部分过程。其中①～⑧表示操作流程，a、b表示分子，c～e表示培养过程(其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养)。
(1)通过图示流程①获取BT抗虫基因需使用__限制__酶，将其与切割后的质粒重组需使用__DNA连接__酶；在流程⑤中，细菌经培养不断分裂产生更多的子代细菌，该步骤的主要目的是__扩增目的基因__。
(2)目前多个国家已批准种植转BT基因抗虫玉米供人食用，请结合题意分析其可行的原因是__毒蛋白能在消化道中被蛋白酶水解后产生具有毒性的活性肽，与昆虫细胞上的受体结合，而人体中没有相应的受体，所以对人体不会有影响__。
(3)已知BT基因能够成功整合到玉米染色体上，某玉米植株体细胞中BT基因在染色体上的整合情况如图所示(黑点表示BT基因的整合位点)，其后代只要含有BT基因就具有抗虫性，该植株进行自交，子一代中具有抗虫特性的植株所占比例为__63/64__。
15．土壤农杆菌是一种能引起双子叶植物产生冠瘿瘤的土壤细菌，它带有一个大的质粒叫Ti质粒(含冠瘿瘤基因)，Ti质粒上的T－DNA片段可转移到植物细胞的基因组，其结构及转化过程如下图所示，回答相关问题：
(1)若用Ti质粒作为抗旱基因的运载体，为了使某种植物具有抗旱性状而又不引起植物产生冠瘿瘤，需对Ti质粒进行修饰，即__去除冠瘿瘤基因__，将抗旱基因转移至Ti质粒的__T－DNA__中，且要保证复制起始位点和__用于转移T－DNA的片段__不被破坏。然后在一定条件下将外植体在含有__重组Ti质粒__的土壤农杆菌的稀释培养基上培养，使得抗旱基因转入植物细胞并整合到植物基因组中。
(2)转基因是否成功应对转基因植物进行鉴定，如果培育成的植株能适应干旱环境，还应进行__DNA__水平鉴定，以确定该变异能否遗传给后代。为获得纯合的转基因植株，还需要对转基因植株进行__连续自交(单倍体育种)__。
16．一位科学家正在使用氨苄青霉素敏感型菌株进行研究，该菌株不能利用乳糖，这是因为它的乳糖操纵基因异常。现有两种质粒，一种含有正常的乳糖操纵基因，另一种含有氨苄青霉素抗性基因。她运用限制酶和DNA连接酶，获得了一些含有这两个基因的重组质粒。然后在一个仅以葡萄糖为唯一能源的培养基中培养敏感型细菌，并向其中加入高浓度的重组质粒，使细菌增殖。再将实验组细菌(含重组质粒)和对照组细菌(不含重组质粒)放入下表所示环境中让其生长。请回答下列问题：
葡萄糖培养基
葡萄糖和氨苄青霉素
葡萄糖、乳糖和氨苄青霉素
含重组质粒的菌株
1号
2号
3号
不含重组质粒的菌株
4号
5号
6号
(1)在基因工程的基本操作程序中，__基因表达载体的构建__是基因工程的核心。限制酶是基因工程中常用的工具，若要提取限制酶，可选择的生物是__大肠杆菌(答出的生物属于原核生物即可)__(举出一例)。本实验中使用限制酶的作用是：__在质粒DNA上切割(合理即可)__。
(2)在以葡萄糖为唯一能源的培养基中加入高浓度的质粒，为了促进细菌更好的吸收重组质粒，还应用__Ca2＋__处理细菌，使细菌处于__感受态__。该培养基以葡萄糖为能源是因为__葡萄糖是单糖，可被细菌吸收，确保细菌在此培养基中均能正常生长__。
(3)若没有新的突变发生，细菌最有可能在哪些培养基上生长出菌落？(C)
A．只有1、2和4号
B．只有3、5和6号
C．只有1、2、3和4号
D．只有4、5和6号
(4)如果在准备制作重组质粒时未使用DNA连接酶，则细菌最可能在__1__号和__4__号平板上长出菌落。
(5)若该科学家用如下培养基进行另一项实验，该培养基中用乳糖为唯一能源，则细菌能在哪一培养基中长出菌落(C)
乳糖培养基
乳糖和氨苄青霉素
含重组质粒的菌株
7号
8号
不含重组质粒的菌株
9号
10号
A.只有10号
B．只有8号
C．7和8号
D．8和10号
17．回答下列关于基因工程的问题：
(1)目的基因主要是指__编码蛋白质__的基因，例如，培育抗虫转基因植物时用于杀虫的基因主要是__Bt毒蛋白__、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等。
(2)获取目的基因时，可利用PCR技术扩增目的基因，它是利用__DNA双链复制__的原理，将基因的核苷酸序列不断地加以复制，使其数量呈指数方式增加。过程是：目的基因DNA受__热变性__后解旋为单链，__引物__与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶的作用下进行延伸。此过程中的DNA聚合酶具有__耐高温__的特点。
(3)构建好的目的基因表达载体除具有目的基因外，还必须有__启动子、终止子及标记基因__。
(4)导入受体细胞后，检测目的基因是否翻译成蛋白质时，从转基因生物中提取蛋白质，用相应的__抗体__进行杂交，若有杂交带出现，表明目的基因已形成蛋白质产品。
第四十六课时
1．基因工程的应用 2.蛋白质工程 3.实验：DNA的粗提取与鉴定
夯
实
基
础 【P177】
考点一 基因工程的应用
【回扣教材】
1．基因工程的成果归纳总结
类型
项目
外源基因类型及举例
成果举例
植物基因工程的成果
抗虫转基因植物
用于杀虫的基因主要是：__Bt毒蛋白基因__、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因
抗虫水稻、抗虫棉、抗虫玉米
抗病转基因植物
抗病毒基因常用的是__病毒外壳蛋白基因__和病毒的复制酶基因；
抗真菌基因有：几丁质酶基因和__抗毒素合成基因__
抗病毒烟草、抗病毒小麦、抗病毒番茄、抗病毒甜椒
抗逆转基因植物
常用的抗逆基因有：渗透压调节基因、__抗冻蛋白基因__和__抗除草剂基因__
抗盐碱和抗干旱的烟草、抗寒番茄、抗除草剂的大豆和玉米
改良品质的转基因植物
优良性状基因如：能提高必需氨基酸含量的__蛋白质__编码基因、控制番茄成熟的基因、与花青素代谢有关的基因
高赖氨酸玉米、耐储存番茄、新花色矮牵牛
动物基因工程的成果
提高生长速度的转基因动物
可用__外源生长激素__基因
转基因绵羊、转基因鲤鱼
改善畜产品品质的转基因动物
可用肠乳糖酶基因
乳汁中含乳糖较少的转基因牛
生产药物的转基因动物
药用蛋白基因＋乳腺蛋白基因的启动子
转基因动物具有乳腺生物反应器
作器官移植供体的转基因动物
外源的抗原决定基因表达的调节因子或除去供体的抗原决定基因
无免疫排斥的转基因猪
基因
治疗
__体外基因治疗__
腺苷酸脱氨酶基因
治疗复合型免疫缺陷症
__体内基因治疗__
治疗囊性纤维化病基因
治疗遗传性囊性纤维化病
2.基因治疗
(1)概念：是把__正常基因__导入病人体内，使该__基因的表达产物__发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，是治疗人类遗传病最有效的手段。
(2)成果：将腺苷酸脱氨酶基因转入患者淋巴细胞中，治疗复合型免疫缺陷症。
(3)方法：a.
__体外基因治疗__：先从病人体内获得__某种细胞__，如T淋巴细胞，进行培养。然后，在体外完成基因转移，再筛选成功转移的细胞扩增培养，最后重新输入患者体内。
b.
体内基因治疗：直接向人体组织细胞中__转移基因__的治疗方法。如1994年美国科学家利用经过修饰的腺病毒作载体，成功地将治疗遗传性囊性纤维化病的正常基因转入患者肺组织中。
【命题角度分析】
角度一 考査基因工程的应用
【例1】人类在预防与诊疗传染性疾病的过程中，经常使用疫苗和抗体。已知某传染性疾病的病原体为RNA病毒，该病毒表面的A蛋白为主要抗原，疫苗生产和抗体制备的部分流程如下图：
(1)过程①代表的是__逆转录__。
(2)过程③构建A基因重组载体时，必须使用限制性核酸内切酶和__DNA连接酶__两种工具酶。由过程③构建A基因重组载体，其组成除了目的基因外，还必须有启动子、__终止子、标记基因__以及复制原点等。
(3)过程④要检测A基因是否进入受体细胞，常用的方法是__DNA分子杂交__法；要检测A基因在受体细胞内是否翻译出蛋白质，需用__抗原—抗体杂交__法。
(4)过程⑦采用的实验技术是__细胞融合技术__。
【解析】(1)分析流程图可知①是逆转录过程。(2)构建A基因重组载体时，首先需用限制性核酸内切酶切割含有A基因的外源DNA分子和运载体，再用DNA连接酶连接A基因和运载体形成A基因重组载体。重组载体的结构包括目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点等。(3)要检测目的基因是否进入受体细胞，常用的是DNA分子杂交法，检测目的基因是否表达可用抗原—抗体杂交的方法。(4)⑦是动物细胞融合过程，需采用细胞融合技术。
【知识拓展】
1．基因治疗与基因诊断的不同点
原理
操作过程
进展
基因治疗
__基因表达__
利用__正常基因__导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
__碱基互补配对__
制作特定__DNA探针__与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
2.转基因食品安全评价：
随着转基因技术向农业、食品和医药领域的不断渗透和迅速发展，转基因食品安全性现成为全球关注的热点问题之一。
【随堂练习】
1．将苏云金杆菌Bt蛋白的基因导入棉花细胞中，可获得抗棉铃虫的转基因棉，其过程如下图所示(注：农杆菌中Ti质粒上只有T DNA片段能转移到植物细胞中)。
(1)过程①需用同种__限制性核酸内切__酶对含Bt基因的DNA和Ti质粒进行酶切。为将过程②获得的含重组质粒的农杆菌筛选出来，应使用__选择__培养基。
(2)过程③中将棉花细胞与农杆菌混合后共同培养，旨在让__T DNA__进入棉花细胞；除尽农杆菌后，还须转接到含卡那霉素的培养基上继续培养，目的是__筛选获得T DNA片段的植物细胞__。
(3)若过程④仅获得大量的根，则应在培养基中增加__细胞分裂素浓度__以获得芽；部分接种在无激素培养基上的芽也能长根，原因是__芽顶端合成的生长素向基部运输，促进根的分化__。
(4)检验转基因棉的抗虫性状，常用方法是__投放棉铃虫__。种植转基因抗虫棉能减少__农药__的使用，以减轻环境污染。
【解析】(1)切割目的基因和载体应使用同种限制性核酸内切酶，筛选细菌应使用选择培养基。
(2)农杆菌转化法的原理是农杆菌感染植物时，Ti质粒上的T DNA片段能够转移并整合到植物细胞的染色体DNA上。因为T DNA上具有卡那霉素抗性基因，所以可用含卡那霉素的培养基筛选出获得T DNA片段的植物细胞。
(3)植物组织培养过程中，可加入激素调节植物细胞的脱分化和再分化。生长素用量比细胞分裂素用量，比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成。幼嫩的芽顶端可以产生生长素并向基部运输，促进根的分化，故芽在无激素的培养基中也可以生根。
(4)在个体水平上检测抗虫棉时可在抗虫棉上投放害虫来判断其是否具有抗虫的性状；抗虫棉因具有抗虫性状，故可减少农药的使用，以减轻环境污染。
2．如图为转基因猪的培育过程。请回答：
(1)在对胎猪细胞进行培养时，需要在细胞培养液中添加一定量的__抗生素__，以防止培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止__细胞代谢产物积累__对细胞自身造成危害。
(2)构建基因表达载体的目的是__使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用__。基因表达载体的组成必须要有目的基因、__启动子__、终止子和__标记基因__等。
(3)可用__促性腺激素__处理母猪以获取更多的卵(母)细胞。
(4)重构胚发育到__桑椹胚或囊胚__阶段才能进行胚胎移植，被移植的胚胎之所以能够在受体母猪的子宫内存活，是因为受体母猪对移入子宫的外来胚胎基本上不发生__免疫排斥反应__。
【解析】(1)细菌对抗生素敏感，动物细胞培养时，需要在细胞培养液中添加一定量的抗生素，以防止培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害。(2)基因工程中构建基因表达载体的目的是使目的基因在受体细胞内稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的组成必须要有目的基因、启动子、终止子和标记基因。(3)为获取更多的卵(母)细胞，可用促性腺激素处理供体母畜，使其超数排卵。(4)重构胚发育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行胚胎移植，被移植的胚胎之所以能够在受体母畜的子宫内存活，是因为受体母畜对移入子宫的外来胚胎基本上不发生免疫排斥反应。
考点二 蛋白质工程
【回扣教材】
1．概念：是指以蛋白质分子的__结构规律__及其与__生物功能__的关系作为基础，通过__基因修饰__或__基因合成__，对__现有蛋白质__进行改造，或制造一种__新的蛋白质__，以满足人类的生产和生活的需求。
2．过程：预期蛋白质功能→设计预期的__蛋白质结构__→推测应有的__氨基酸序列__→找到对应的__脱氧核苷酸序列(基因)__。
3．蛋白质工程的流程图：
写出流程图中字母代表的含义：
A．__转录__，B.__翻译__，C.__分子设计__，D.__多肽链__，E.__预期功能__。
4．结果：改造了现有蛋白质或制造出__新的蛋白质__。
5．应用：主要集中应用于对__现有蛋白质__进行改造，改良生物性状。
【命题角度分析】
考査蛋白质工程的基本原理
【例2】已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的__氨基酸序列(或结构)__进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰__P__基因或合成__P1__基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括__DNA和RNA(或遗传物质)__的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：__DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)__。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__设计蛋白质的结构__和__推测氨基酸序列__，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物__功能__进行鉴定。
【解析】(1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸的排列顺序进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。
(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。
中心法则的内容如下图所示：
由图可知，中心法则的全部内容包括：DNA以自身为模板进行的复制，DNA通过转录将遗传信息传递给RNA，最后RNA通过翻译将遗传信息表达成蛋白质；在某些病毒中RNA可自我复制(如烟草花叶病毒等)，在某些病毒中能以RNA为模板逆转录合成DNA(如HIV)，这是对中心法则的补充。
(3)蛋白质工程的基本途径是预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→合成DNA→表达出蛋白质，经过该过程得到的蛋白质，需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
【知识拓展】
1．基因工程与蛋白质工程的11个易错点
(1)目的基因的插入位点不是随意的
基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象。
第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。
(3)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
(4)一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
(5)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。
(6)不熟悉标记基因的种类和作用：标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。
(7)对受体细胞模糊不清：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。
(8)还应注意的问题有：①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。②基因表达载体的构建是基因工程中最核心、最关键的一步，在体外进行。
(9)对蛋白质分子进行改造，其本质是改变其基因组成。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白质分子还是无法遗传。
(10)蛋白质工程的实质是根据蛋白质的结构，创造新基因或者改造原来基因，是基因工程的发展与延续。
(11)蛋白质工程与DNA分子重组技术是分不开的，常用到基因工程工具酶，如限制酶和DNA连接酶。
2．蛋白质工程与基因工程的关系
项目
区别与联系
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
(1)蛋白质工程是在基因工程基础上，延伸出的第二代基因工程
(2)基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
【随堂练习】
1．某些适应寒冷环境的生物，能够产生一类抑制冰晶生长(能降低水溶液冰点的大分子)的蛋白质，即抗冻蛋白。科学家利用昆虫抗冻蛋白(AFPS)基因的异源表达，现已成功地提高了双子叶植物——烟草的抗冻能力。请分析回答下列相关问题：
(1)为使抗冻蛋白基因在烟草细胞中高效表达，需要把来自cDNA文库的抗冻蛋白基因片段正确插入基因表达载体的__启动子__和__终止子__之间。
(2)利用PCR技术扩增DNA时，需要在反应体系中添加的有机物质有__引物__、__耐热性的DNA聚合酶(或TaqDNA聚合酶)__、4种脱氧核糖核苷酸和DNA模板，扩增过程可以在PCR扩增仪中完成。
(3)将AFPS基因导入烟草细胞中，常用__农杆菌转化__法，此操作过程中使用的载体是__Ti质粒__。若要检测烟草是否产生了抗冻蛋白，一般采用__抗原—抗体杂交__法检测杂交带。
(4)假如用得到的二倍体转基因抗冻植株自交，子代中抗冻与不抗冻植株的数量比为15∶1，可推测该抗冻基因整合到了__两条非同源染色体上__(填“一对同源染色体的一条染色体上”、“两条非同源染色体上”或“一对同源染色体的两条染色体上”)。
2．现代生物技术并不是各自独立的，而是相互联系、相互渗透的。下图表示利用乳腺生物反应器生产某种动物蛋白的流程示意图，请分析回答下列问题：
(1)该生产流程中应用到的现代生物技术有__蛋白质工程__、__基因工程__、__胚胎移植技术(任写两种)__(写出其中两种)。
(2)图中A、B分别表示__推测应有的氨基酸序列、基因表达载体__。
(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行__DNA(核酸)分子杂交__检测，对受体动物的处理是用__促性腺激素__进行同期发情处理。
(4)蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质，原因是__改造后的基因能够遗传(且改造基因易于操作)__。
【解析】(1)由图分析知该生产流程中应用到的现代生物技术有蛋白质工程、基因工程、胚胎移植技术等。(2)图中A、B分别表示推测应有的氨基酸序列、基因表达载体。(3)为提高培育成功率，进行②过程之前，对早期胚胎的处理是取其部分细胞用目的基因探针进行DNA分子杂交，对受体动物的处理是用促性腺激素进行同期发情处理。(4)由于改造后的基因能够遗传(且改造基因易于操作)，因此蛋白质工程中，要对蛋白质结构进行设计改造，必须通过基因修饰或基因合成来完成，而不直接改造蛋白质。
考点三 DNA的粗提取与鉴定
【回扣教材】
1．DNA粗提取的原理
对于DNA的粗提取，就是要利用DNA和RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取__DNA__，去除其他成分。
(1)根据DNA的溶解性来粗提取DNA的原理：DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中__溶解度__不同，通常选用2
mol/L
NaCl溶液溶解细胞中的__DNA__，此时杂质易沉淀；在0.14
mol/L
NaCl溶液中DNA溶解度__最小__，可使__DNA析出__。酒精是一种常用有机溶剂，DNA却不能溶于酒精(特别是95%冷却酒精)，但细胞中的某些__蛋白质__可溶于酒精，利用这一点可以将DNA和蛋白质进一步分离。
(2)利用DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理来粗提取DNA：__蛋白酶__能专一性地水解蛋白质而不会对DNA产生影响，故可用__蛋白酶__处理达到粗提取DNA的目的；60～80
℃的高温会使大多数__蛋白质变性__，而DNA在80
℃以上才会变性，故可用60～80
℃的高温处理材料以达到粗提取DNA的目的；__洗涤剂__能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响，故可用该试剂来使细胞破裂，更好的提取DNA。
综上所述：不同浓度的__NaCl溶液__、__酒精__、__蛋白酶__、60～80
℃的__高温__及__洗涤剂__均可用来提取DNA。
2．DNA鉴定的原理
在__沸水浴__条件下，DNA遇二苯胺呈现__蓝色__，因此，__二苯胺__可以作为鉴定DNA的试剂。
原理总结：通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。
3．实验设计
(1)实验材料的选取：不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着__DNA含量高__、材料易得、便于提取的原则。
(2)破碎细胞，获取含DNA的滤液：如果选用鸡血作材料，可在鸡血细胞液中加入一定量__蒸馏水__(作用是__使血细胞大量吸水而涨裂__)，并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；如果用洋葱作材料，则要先切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐(洗涤剂能__瓦解细胞膜__；食盐能溶解__DNA__)；进行充分地搅拌和研磨(研磨能够__破碎细胞壁，使DNA更多地溶解在NaCl溶液中__)，过滤后收集研磨液。
(3)去除滤液中的杂质
最初获得的DNA滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯DNA。具体做法如下：
方案一：滤液＋NaCl(2
mol/L)→过滤除去杂质→加入蒸馏水使NaCl溶液浓度为0.14
mol/L→DNA析出→过滤得到过滤物→放到2
mol/L
NaCl溶液中再溶解出DNA→过滤含有DNA的NaCl溶液
方案二：滤液＋嫩肉粉(木瓜蛋白酶)→静置10～15
min→过滤获得DNA滤液
方案三：滤液→60～75
℃处理→过滤获得DNA滤液
方案一的原理是__DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同__；方案二的原理是__蛋白酶分解蛋白质，不分解DNA__；方案三的原理是__蛋白质和DNA的变性温度不同__。
(4)DNA的析出与鉴定。
滤液与__等体积的冷却酒精__混合均匀，静置2～3
min，析出的白色丝状物是__DNA__。
DNA的鉴定：试管2支，编号甲、乙→各加2
mol/L的__NaCl溶液__5
mL→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4
mL__二苯胺__，混合均匀→__沸水浴__5
min→观察颜色变化。
【命题角度分析】
角度一 考査DNA的粗提取与
鉴定的基本操作过程
【例3】图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述不正确的是(A)
图1
图2
A．图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B．图1中完成过滤之后保留滤液
C．图2中完成过滤之后弃去滤液
D．在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
【解析】A项，图1中加入蒸馏水的目的是使鸡血细胞吸水涨破，图2中加入蒸馏水的目的是调节盐溶液的浓度，使DNA析出。B项，图1中含有DNA的核物质位于滤液中，因此完成过滤后应保留滤液。C项，图2中析出的DNA在纱布上，因此完成过滤后应弃去滤液。D项，嫩肉粉中含有木瓜蛋白酶，能催化杂质蛋白分解。
角度二 考査DNA的粗提取与鉴定实验的应用
【例4】某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10
g。剪碎后分成两组，一组置于20
℃、另一组置于－20
℃条件下保存24
h。
DNA粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15
mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10
mL滤液，再加入20
mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2
mol/L的NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测：在上述试管中各加入4
mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5
min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表。
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20
℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20
℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题名称是__探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响__。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__DNA断裂__。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20
℃相比，相同实验材料在－20
℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：__等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多__。
②针对结论1，请提出合理的解释：__低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢__。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：__将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液__，然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
【解析】(1)该实验中把不同的材料在不同条件(温度)下处理，目的是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。(2)“缓缓地”搅拌是为了减少DNA断裂。(3)分析表格可得出结论：①相同材料在－20
℃条件下保存，DNA的提取量较多。原因可能是低温抑制了DNA酶的活性，DNA降解速度慢。②等质量的不同实验材料，在相同保存温度下，从蒜黄中提取的DNA最多。(4)依据氯仿的特性，可在第三步得到的溶液中加入氯仿，使蛋白质变性。
【知识拓展】
1．DNA粗提取与鉴定中不同试剂的用途及原理比较
试剂
浓度
用途
原理(“△”为实验的主要原理)
NaCl溶液
2
mol/L
__溶解DNA__
0.14
mol/L
__析出DNA__
2
mol/L
鉴定时的溶剂
DNA在NaCl溶液中的溶解度随溶液浓度的变化而改变，溶解度在2
mol/L时最__大__、在0.14
mol/L时最__小__
△
酒精
95%(体积分数)
除去__杂质__以提纯DNA
DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些物质可以溶于酒精
△
二苯胺
鉴定剂
DNA遇二苯胺(沸水浴)会变__蓝色__
△
柠檬酸钠
0.03
g/mL
抗凝剂
除去血液中的钙离子，防止血液__凝固__
2.DNA粗提取实验材料和方法的选择
(1)不同生物的组织中DNA含量不同
在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。
(2)材料不同所采用的提取方法不同
①植物组织：取材→研磨→过滤→沉淀。
②鸡血：制备鸡血细胞液→提取核DNA→溶解细胞核内DNA→析出并滤取DNA→DNA再溶解→提取较纯净的DNA。
【易错警示】DNA粗提取与鉴定实验的易错点。
(1)本实验不能用哺乳动物成熟红细胞作实验材料，原因是哺乳动物成熟红细胞无细胞核。可选用鸡血细胞作材料。
(2)实验中两次使用蒸馏水，第一次的目的是使成熟的鸡血细胞涨破放出DNA，第二次的目的是稀释NaCl溶液，使DNA从溶液中析出。
【随堂练习】
1．DNA的粗提取与鉴定实验中有三次过滤：
(1)过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
(2)过滤含粘稠物的0.14
mol/L
NaCl溶液
(3)过滤溶解有DNA的2
mol/L
NaCl溶液
以上三次过滤分别为了获得(A)
A．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
B．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液
C．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布上的DNA
D．含较纯的DNA滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液
【解析】用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤只能得到含DNA和其他物质如蛋白质的滤液，这种滤液必须经过实验中其他步骤相继处理，方能得到较纯的DNA。DNA在0.14
mol/L
NaCl溶液中溶解度最低，成丝状粘稠物，可经过滤留在纱布上。
2．下图是某种动物蛋白质工程示意图，请据图回答下列问题：
(1)目前，蛋白质工程中难度最大的是图中编号__①__所示的过程，实现③过程的依据有__氨基酸与密码子的对应关系；mRNA与DNA间的碱基互补配对原则__。
(2)在⑤过程中，__T4__DNA__连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。
(3)为获得较多的受精卵进行研究，⑥过程需用激素做__超数排卵__处理。若⑥过程所得的卵母细胞是从屠宰母畜的卵巢中获得的，则体外受精前的⑧过程表示在体外人工培养卵母细胞到__减数第二次分裂中__期。
(4)为提高培育成功率，进行⑩过程之前，需对胚胎进行质量检查，应取部分滋养层细胞，以__目的基因__为探针进行DNA分子杂交检测。对受体动物需要用特定的激素进行__同期发情__处理。
【解析】(1)蛋白质工程中最难的是设计预期的蛋白质结构。由设计好的蛋白质氨基酸序列根据翻译中密码子与氨基酸的关系推算出mRNA，再通过mRNA与DNA间的碱基互补配对原则逆推出相应的脱氧核苷酸序列。(2)T4
DNA连接酶既可以连接黏性末端又可以连接平末端。(3)为获得较多的受精卵进行研究，⑥过程需用促性腺激素做超数排卵处理。只有处于减数第二次分裂中期的卵母细胞才能受精。(4)取部分滋养层细胞，以目的基因为探针进行DNA分子杂交检测，目的是看受体细胞是否导入目的基因，从而提高培育成功率。胚胎工程中供体与受体必须进行同期发情处理，这样移植的胚胎才会被受体动物接受。
3．回答下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的问题。下面为该实验过程中的一些重要操作示意图。
(1)正确的操作顺序是__C→B→E→D→A__。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是__加速血细胞的破裂__和__降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出__。
(3)上图A步骤中所用酒精溶液必须经过__充分冷却__才能使用，该步骤的目的是__提取含杂质较少(或较纯净)的DNA__。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可滴加__二苯胺__试剂后沸水浴，如果出现__蓝色__则证明该丝状物的主要成分为DNA。
【解析】DNA粗提取的过程为：鸡血细胞加蒸馏水，破裂后过滤→加2
mol/L
NaCl溶液→过滤除去不溶的杂质→加蒸馏水，析出含DNA的黏稠物→过滤→黏稠物溶解在2
mol/L
NaCl溶液中→过滤→体积分数为95%的冷却的酒精溶液进一步提纯。所以根据图示及以上分析，正确的操作顺序为C→B→E→D→A。图C步骤中往鸡血细胞中加蒸馏水，目的是使鸡血细胞吸水破裂，并释放核物质。图E步骤中往DNA浓NaCl溶液中加蒸馏水，目的是降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出。图A步骤中往浓NaCl溶液中加入95%酒精溶液，目的是利用DNA不溶于酒精的特点析出DNA，以提取含杂质较少的DNA，由于DNA在冷却的酒精溶液中溶解度更低，因此需将酒精冷却后使用。DNA在NaCl溶液中的溶解规律如图所示。在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺后呈现蓝色。
考
点
集
训 【P306】
课时练习四十六
一、选择题(每小题只有一个正确选项)
1．采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的作法正确的是(C)
①将毒素蛋白注射到棉受精卵中
②将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中
③将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组导入细菌，用该细菌感染棉花体细胞，再进行组织培养
④将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，注射到棉花子房，并进入受精卵
A．①②
B．②③
C．③④
D．④①
【解析】①将毒素蛋白直接注射到棉花受精卵中，没有获得目的基因，子代细胞不会有抗虫性状，①错误；②将编码毒素蛋白的DNA序列，直接注射到棉花受精卵中而没有将目的基因与运载体结合，这样目的基因是不会被保留下来的，很容易被水解掉，②错误；③在植物细胞基因工程中，利用农杆菌转化法将目的基因导入受体细胞，然后通过植物组织培养技术将植物细胞培养成完整植株，③正确；④在植物细胞基因工程中，可以利用花粉管通道法将目的基因导入受精卵中，然后发育为转基因植株，④正确。
2．人们常用DNA进行亲子鉴定。其原理是：从被测试者的血滴或口腔上皮提取DNA，用限制酶将DNA样本切成特定的小片段，放进凝胶内，用电泳推动DNA小片段分离，再使用特别的DNA“探针”去寻找特定的目的基因。DNA“探针”与相应的基因凝聚在一起，然后，利用特别的染料在X光下，便会显示由DNA探针凝聚于一起的黑色条码。被测试者这种肉眼可见的条码很特别，一半与母亲的吻合，一半与父亲的吻合。反复几次过程，每一种探针用于寻找DNA的不同部位形成独特的条码，用几组不同的探针，可得到超过99.9%的父系分辨率。请问，DNA“探针”是指(D)
A．某一个完整的目的基因
B．目的基因片段的特定DNA
C．与目的基因相同的特定双链DNA
D．与目的基因互补的特定单链DNA
【解析】DNA“探针”是指与目的基因互补的特定单链DNA，不是一个完整的目的基因，A项错误，D项正确；DNA“探针”不是目的基因片段的特定DNA，B项错误；DNA“探针”是单链DNA，C项错误。
3．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成了表达的是(A)
A．酵母菌细胞中提取到人的干扰素
B．棉花细胞中检测到载体上的标记基因
C．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的基因
D．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA
【解析】酵母菌细胞中提取到人干扰素蛋白，说明目的基因已经在受体细胞中完成了表达，A正确；棉花细胞中检测到细菌抗虫基因，说明目的基因已经成功导入受体细胞，但不能说明目的基因在受体细胞中已经完成表达，B错误；山羊乳腺细胞中检测到人生长激素的基因，说明目的基因已经成功导入受体细胞，但不能说明目的基因在受体细胞中已经完成表达，C错误；大肠杆菌中检测到人胰岛素基因及其mRNA，说明目的基因已经成功导入受体细胞并转录，但不能说明目的基因完成了表达过程，D错误。
4．运用现代生物技术的育种方法，将抗菜青虫的Bt基因转移到优质油菜中，培育出转基因抗虫的油菜品种，这一品种在生长过程中能产生特异的杀虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，能大大减轻菜青虫对油菜的危害，提高油菜产量，减少农药使用，保护农业生态环境。根据以上信息，下列叙述正确的是(C)
A．Bt基因的化学成分是蛋白质
B．Bt基因中有菜青虫的遗传物质
C．转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于含有Bt基因
D．转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是无机物
【解析】基因是有遗传效应的DNA片段，所以Bt基因的化学成分不是蛋白质，A项错误；由题意可知，将抗菜青虫的Bt基因转移到油菜中，培育出的转基因抗虫油菜对菜青虫有毒杀作用，表明Bt基因不是来源于菜青虫，B项错误；基因控制生物的性状，将抗菜青虫的Bt基因转移到油菜中，培育出的转基因抗虫油菜能产生特异的杀虫蛋白，对菜青虫有显著抗性，表明转基因抗虫油菜能产生杀虫蛋白是由于具有Bt基因，C项正确；转基因抗虫油菜产生的杀虫蛋白是一种有机物，而不是无机物，D项错误。
5．下列关于基因工程的应用，说法错误的是(A)
A．我国转基因抗虫棉是转入了植物凝集素基因培育出来的
B．植物基因工程技术可用于提高农作物的抗逆能力
C．提高农作物的抗盐碱和抗干旱能力，与调节渗透压的基因有关
D．基因治疗是把正常基因导入病人体内从而达到治疗疾病的效果
【解析】我国转基因抗虫棉是转入了苏云金芽孢杆菌的Bt毒蛋白基因培育出来的，A错误；植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面，B正确；提高农作物的抗盐碱和抗干旱能力，与调节渗透压的基因有关，C正确；基因治疗是把正常基因导入病人体内从而达到治疗疾病的效果，D正确。
6．下列有关基因工程与蛋白质工程的叙述，正确的是(A)
A．蛋白质工程可合成自然界原本不存在的蛋白质
B．蛋白质工程完全不同于基因工程
C．基因工程需对基因进行操作，蛋白质工程不需对基因进行操作
D．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平操作
【解析】基因工程合成的蛋白质是自然界中已经有的蛋白质，而蛋白质工程可合成自然界原本不存在的蛋白质，A正确；蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，B错误；基因工程和蛋白质工程都需对基因进行操作，C错误；基因工程和蛋白质工程的操作对象都是基因，都属于分子水平上的操作，D错误。
7．下列关于蛋白质工程的说法，错误的是(C)
A．蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程
B．实施蛋白质工程的基本途径必须从预期蛋白质功能出发
C．蛋白质工程实施过程中可对关键氨基酸直接置换或增删
D．蛋白质工程是一项难度很大的工程
【解析】蛋白质工程中真正的操作对象仍然是基因，即对基因的修饰或原有基因的改造，不是对蛋白质的结构或者氨基酸的结构进行改造，所以C错误。
8．既然蛋白质工程可以改造生物的蛋白质，当然这里所说的生物也包括大熊猫。因此我们可以通过改造大熊猫体内的某些蛋白质，使大熊猫的生命活动更加适应环境。推测以下关于改造大熊猫体内某蛋白质的说法错误的是(D)
A．改造后的蛋白质有可能成为一种新抗原，使大熊猫产生免疫反应，因此应慎重施行
B．改造蛋白质根本上是通过改造基因来实现的
C．改造蛋白质后的大熊猫和现在的大熊猫仍是一个物种
D．改造蛋白质后的大熊猫的后代不具有改造的蛋白质
【解析】改造后的蛋白质具备抗原的特性，因此对高等动物(特别是人)应慎重进行改造；改造某种蛋白质后的生物和未改造的生物差别若仅是一个或几个蛋白质，不一定引起生殖隔离，因此可能仍属同一物种；改造蛋白质通过改造基因进行，若在受精卵时期进行改造，则可遗传给后代；而若像基因治疗一样，对成体进行改造，则不能遗传，其后代无改造的蛋白质。
9．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将提取获得的含DNA黏稠物(还含有较多杂质)分别处理如下，其中含DNA少的是(B)
第一，放入0.14
mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液①和黏稠物②；
第二，放入2
mol/L的氯化钠溶液中，搅拌后过滤，得滤液③和黏稠物④；
第三，放入冷却的95%的酒精溶液中，搅拌后过滤，得滤液⑤和黏稠物⑥。
A．①③⑤
B．①④⑤
C．②④⑥
D．②③⑤
【解析】在不同浓度的氯化钠溶液中DNA的溶解度不同。在0.14
mol/L的氯化钠溶液中溶解度最小，DNA析出，呈丝状物，过滤后存在于黏稠物中；在2
mol/L的氯化钠溶液中溶解度最大，所以DNA呈溶解状态，过滤后存在于滤液中；酒精溶液可使DNA分子凝集，因此，在冷却的95%的酒精溶液中DNA凝集，呈丝状物，过滤后，存在于黏稠物中。
10．对乙型肝炎病毒基因组的DNA测序得知该病毒的核心蛋白和表面抗原蛋白的氨基酸序列。下图是应用生物工程生产乙肝疫苗的示意图，据图分析下列叙述不正确的是(C)
乙肝病毒有关基因细菌大量生产疫苗
A．生产乙肝疫苗的过程也达到了定向改造细菌的目的
B．选用细菌作为受体细胞是因为其代谢旺盛繁殖快
C．用于生产疫苗的目的基因编码病毒的核心蛋白
D．在②过程中需要限制性核酸内切酶和DNA连接酶
【解析】生产乙肝疫苗的过程是利用基因工程技术获得的，基因工程是定向改造生物的遗传特性，A正确；选用细菌作为受体细胞的原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，B正确；病毒的抗原性是由表面抗原蛋白决定的，故生产疫苗的目的基因可编码表面抗原蛋白，C错误；②过程中将目的基因导入受体细胞，需用限制性核酸内切酶和DNA连接酶处理使目的基因和运载体结合形成重组DNA分子，D项正确。
11．胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，要经过较长的时间才能进入血液，而进入血液的胰岛素又容易分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图推断下列说法不正确的是(B)
A．图中构建新的胰岛素模型的主要依据是蛋白质的预期功能
B．通过人工合成形成的新基因应与原基因结合后转移到大肠杆菌等受体细胞中才能得到准确表达
C．利用大肠杆菌生产速效胰岛素，用到了蛋白质工程和基因工程等
D．图中合成出新的胰岛素基因最关键的一步是构建新的胰岛素模型
【解析】蛋白质工程的目标是：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是蛋白质的预期功能，A项正确；通过人工合成形成的新基因，应与载体构建基因表达载体，之后再导入受体细胞中使之得以表达，B项错误；利用蛋白质工程生产自然界原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，即目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程来生产基因产物，并且在生产过程中要借助工程菌，还需要进行发酵，C项正确；蛋白质工程的过程：预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列(基因)，所以图中合成出新的胰岛素基因最关键的一步是构建新的胰岛素模型，D项正确。
二、非选择题
12．科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。操作过程如图，请根据图回答问题：
(1)人的基因之所以能与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是__人的基因与大肠杆菌DNA的组成成分相同，结构相同，并且具有相同的黏性末端__。
(2)过程(1)表示的是采取__反转录法(逆转录法)__的方法来获取目的基因。
(3)图中(3)过程用人工方法，使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒__侵染__细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用__Ca2＋__处理，使细胞处于能吸收周围环境中的DNA分子的生理状态，这种细胞称为__感受态__细胞，再将__基因表达载体__溶于缓冲液中与该种细胞混合，在一定的温度下完成转化。
(4)大肠杆菌B可能导入了质粒或重组质粒，也可能没有质粒导入其中。筛选出含质粒或重组质粒的细菌可采用的方法是__将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的，说明已导入了质粒A或重组质粒，反之则没有导入__，理由是：__因为普通质粒A和重组质粒上都有抗氨苄青霉素基因__。
(5)如果把已经导入了普通质粒A或重组质粒的大肠杆菌，放在含有四环素的培养基上培养，发生的现象是__有的能生长，有的不能生长__，原理是__导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有四环素抗性基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在四环素抗性基因中，破坏了其结构和功能__。
13．HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：
(1)用基因工程方法制备HIV的某蛋白(目的蛋白)时，可先提取HIV中的__RNA__，以其作为模板，在__逆转录酶__的作用下合成__cDNA(或DNA)__，获取该目的蛋白的基因，构建基因表达载体，随后导入受体细胞。
(2)从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的相应分泌蛋白是__抗体__，该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是__抗原—抗体特异性结合__。
(3)已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分__T(或T淋巴)__细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。
(4)人的免疫系统有__监控和清除__癌细胞的功能。艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。
【解析】(1)HIV的遗传物质是RNA，所以要想获得相应的目的基因，应以HIV的RNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA(或DNA)。
(2)目的蛋白注入机体后相当于抗原。在抗原的刺激下，机体进行体液免疫，由浆细胞产生相应抗体(分泌蛋白)，由于该抗体能与目的蛋白(抗原)发生特异性结合，所以可通过抗体检测出有无目的蛋白，从而确定体内有无HIV。
(3)HIV主要攻击人体的T(或T淋巴)细胞，从而降低机体免疫系统的防卫功能。
(4)癌细胞在机体中属于抗原，人体的免疫系统能够监控和清除癌细胞。
14．下面是蛋白质工程操作的基本流程图。请回答下列问题：
(1)蛋白质工程是通过__基因修饰或基因合成__，对__现有蛋白质__进行改造，或制造一种__新的蛋白质__。
(2)图中③过程的主要依据是每种氨基酸都有其对应的__密码子__，后者位于__信使RNA__分子上，其上的核苷酸序列与基因中的脱氧核苷酸序列之间存在着__碱基互补配对__关系。
(3)蛋白质工程中在获得特定的目的基因后，需要通过__基因工程__技术来生产所需要的蛋白质。
(4)目前蛋白质工程成功的例子不多，主要原因是__对大多数蛋白质的高级结构了解还不够__。
【解析】本题考查蛋白质工程的基本原理和操作、蛋白质工程与基因工程的关系等。(1)蛋白质工程是指以蛋白质分子结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活需求。(2)蛋白质工程根据氨基酸序列推测相应的脱氧核苷酸序列，氨基酸与脱氧核苷酸之间的联系枢纽是信使RNA，信使RNA由DNA转录形成，而密码子是信使RNA上特定的能决定一个氨基酸的三个相邻的碱基序列。(3)蛋白质工程需要通过基因工程来实现。(4)由于人们现在对大多数蛋白质的高级结构了解还不够，这样就不能对相应基因进行有目的地改造或合成出相应的基因，这是蛋白质工程成功事例不多的主要原因。
15．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，A、B、C、D、E五个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均相同，而且正确，但实验结果却不同。
组别
实验材料
提取核物质时
加入的溶液
去除杂质时
加入的溶液
DNA鉴定时
加入的试剂
A
鸡血
蒸馏水
95%的酒精(25
℃)
二苯胺
B
菜花
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
双缩脲
C
人血浆
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
D
人血细胞
2mol/L的氯化钠
0.14mol/L的氯化钠
双缩脲
E
鸡血
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
(1)实验材料选择错误的组别是__C、D__，其原因是__人的血浆中没有细胞结构，成熟的红细胞中没有细胞核，选用这些材料得不到DNA或得到的DNA很少__。
(2)实验步骤(不包括实验材料)均正确，但得不到DNA的组别是__C__。
(3)沸水浴中试管颜色变蓝的组别是__A、E__；蓝色较淡的是__A__，其原因是__冷却的酒精对DNA的凝集效果较佳，该组使用的是25__℃的酒精__。
(4)B组实验不成功的最主要原因是__菜花细胞在蒸馏水中不能被破坏，得不到DNA(应采用研磨的方法)__。
【解析】(1)人的血浆中没有细胞结构，成熟的红细胞中没有细胞核，在这些材料中是不能得到DNA或得到的DNA很少。
(2)血细胞中有少量的白细胞，其中有DNA，所以只有C组人血浆中没有。
(3)冷酒精对DNA有较好的凝集效果。
(4)菜花细胞外有细胞壁起保护作用，在蒸馏水中不会破裂，所以不能得到DNA。
16．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管序号
A
B
1
加2
mol/L
NaCl溶液5
mL
加2
mol/L
NaCl溶液5
mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4
mL二苯胺，混匀
加4
mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5分钟
沸水浴5分钟
实现现象
__溶液不变蓝色__
__溶液逐渐变蓝色__
实验结论
__DNA在沸水浴的情况下____遇二苯胺会被染成蓝色__
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？
__溶液颜色基本不变__。
(3)在沸水浴中加热的目的是__加快颜色反应速度__，同时说明DNA对高温有较强的__耐受性__。
(4)A试管在实验中的作用是__对照__。
(5)B试管中溶液颜色的深浅主要与__加入试管中的DNA(丝状物)的多少__有关。
【解析】本题主要考查DNA分子的鉴定。A、B两试管形成对
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