课题3血红蛋白的提取和分离
蛋白质分离的原理和方法
[自读教材·夯基础]
1．蛋白质分离的理论依据
2．分离的方法
(1)凝胶色谱法：
①概念：也称作分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
②凝胶
③原理：相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。
(2)电泳：
①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
②原理：在一定的pH下，多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③影响电泳速率的因素：
④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
3．缓冲溶液
(1)作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
[跟随名师·解疑难]
1．凝胶色谱法
(1)凝胶：是一些微小多孔的球体，内含许多贯穿的通道，具有多孔的凝胶，又称为分子筛。
(2)原理：
项目
相对分子质量大
相对分子质量小
直径大小
大于凝胶颗粒空隙直径，被排阻在外面
小于凝胶颗粒空隙直径，可以进入颗粒内部
运动方式
垂直向下移动
无规则扩散进入凝胶颗粒
运动速度
较快
较慢
运动路程
较短
较长
洗脱次序
先从凝胶柱洗脱出来
后从凝胶柱洗脱出来
2．电泳的常用方法
(1)琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小、形状不同而不同，从而得以分离。
(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳：
①凝胶形成：
②加入SDS的作用：使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，与各种蛋白质形成蛋白质 SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
[特别提醒] 测定蛋白质相对分子质量通常用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，原因是在一定浓度范围内聚丙烯酰胺对热稳定性强，可用检测仪直接测定。
实
验
操
作
[自读教材·夯基础]
1．样品处理
(1)红细胞的洗涤：
①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
②过程：
(2)血红蛋白的释放：
①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。
②过程：
(3)分离血红蛋白溶液混合液离心用滤纸过滤除去脂溶性沉淀层―→分液漏斗中静置片刻―→分离出下层红色透明液体。
2．粗分离——透析
(1)方法：将血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入一定量适宜浓度的磷酸缓冲液中，透析12
h。
(2)目的：将相对分子质量较小的杂质除去。
(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。
3．纯化
(1)通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。
(2)过程：
4．纯度鉴定
在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1．洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？
提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。
2．在血红蛋白释放的过程中加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？
提示：加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。细胞膜的主要成分中含磷脂，磷脂易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂以释放血红蛋白。
3．血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？
提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
[跟随名师·解疑难]
1．分离血红蛋白溶液的结果
2．样品处理、分离与纯化的目的不同
操作
目 的
红细胞洗涤
去除杂质，如血浆蛋白
血红蛋白释放
使红细胞破裂，释放血红蛋白
分离血红蛋白溶液
经过离心使血红蛋白与其他杂
质分离开透析的杂质
除去样品中相对分子质量较小
纯化
除去相对分子质量较大的蛋白质
3．实验结果分析与评价
(1)对血液样品处理后样品发生的变化：
①正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。
②分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。
②红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。
(2)判断装填的凝胶色谱柱成功与否：
①方法
(3)对分离效果的判断：
①若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。
②若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。
[特别提醒] 洗脱液的流速是影响分离效果的重要因素之一，如果样品出现浑浊、有沉淀，可离心或过滤后再加样，洗脱液应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。
凝胶电泳法原理分析
[例1]
右图表示对某蛋白质溶液进行SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果(相似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述错误的是( )
A．蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度完全取决于其所带净电荷多少
C．蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度基本取决于相对分子质量的大小
D．电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种
[解析] 蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其移动速度与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。
[答案] B
归纳拓展 蛋白质在凝胶色谱柱中行进的速度和途径主要与蛋白质分子的大小相关；在电场中的运动速度和方向除了与蛋白质的分子大小相关外，蛋白质的带电性质、电量、形状都影响其在电场中的运动方向和运动速度。
凝胶色谱法的原理与操作
[例2]
凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是__________，原因是___________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由________________________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是_____________________________________________________
____________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体________(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________________________。
(5)若选用SephadexG 75，则“G”表示____________________________，75表示____________________________。
[解析] 本题主要考查凝胶色谱法的原理和操作注意事项，可按以下思路进行分析作答。
(1)原理：由于不同蛋白质其相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。
(2)注意事项：①凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。②凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。③装填材料即交联葡聚糖凝胶的特点及表示方法。④样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶所用液体均是物质的量浓度为20
mmol/L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。
[答案] (1)a a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快 (2)尼龙网和尼龙纱 (3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 (4)相同 保持稳定 (5)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5
g
归纳拓展
凝胶色谱操作注意事项分析
(1)实验结果如果不理想，需要重做时，必须进行凝胶色谱柱的重新装填。一般情况下，凝胶不会与其他溶质发生任何作用，因此，在一次分离以后，稍加平衡就可以进行下一次的操作。平衡时，需用3倍柱体积的洗脱液过柱。
(2)如果实验操作中有一些杂质污染了色谱柱，可以用物质的量浓度为0.2
mol/L的氢氧化钠和物质的量浓度为0.5
mol/L的氯化钠混合液处理交联葡聚糖凝胶。
(3)如果凝胶长期不用，可以加入抑菌剂低温保存，使用时再进行充分的平衡。
[随堂基础巩固]
1．在使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为( )
解析：选B 蛋白质相对分子质量越大，越容易通过凝胶间隙而先被洗脱出来
，蛋白质相对分子质量越小越易进入凝胶内部而后被洗脱出来。
2．以下关于猪血红蛋白提纯的描述，错误的是( )
A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
解析：选D 相对分子质量越大的通过凝胶色谱柱的速度越快。
3．下列关于蛋白质的提取与分离的叙述，正确的是( )
A．在凝胶色谱柱内，分子质量较大的蛋白质路程较长，但移动速度较快
B．从凝胶色谱柱中最后分离出来的是分子质量较小的蛋白质
C．蛋白质的分离使用最多的方法是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法
D．分离血红蛋白溶液时，离心管的第三层是脂类物质
解析：选B 在凝胶色谱柱内，分子质量大的蛋白质不能进入凝胶内，路程短，移动速度快，而分子质量小的蛋白质会进入凝胶内，路程长，移动速度慢，最后洗脱出来的是分子质量较小的蛋白质；SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法是蛋白质纯度鉴定使用最多的方法；分离血红蛋白溶液时，离心管中将出现四层，其中第三层就是血红蛋白溶液，而不是脂类物质。
4．下列关于电泳的说法，错误的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动
C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少
D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小
解析：选C 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
5．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的功能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2。血红蛋白可以从猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液中提取和分离。请回答下列有关问题：
(1)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：________、________、________和______________。
(2)实验前取新鲜的血液，切记要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①加入柠檬酸钠的目的是___________________________________________。
②以上所述的过程即是样品处理，它包括________________________、________________________、分离和收集血红蛋白溶液。
(3)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是__________________________________________________
__________________________。
②透析的原理是__________________________________________________。
(4)纯度鉴定时最常用的方法是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
①样品纯化的目的是_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
②血红蛋白有什么特点？_______________________________________________。
这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：本题主要考查蛋白质提取和分离的相关知识，具体分析如下：
答案：(1)样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定
(2)①防止血液的凝固 ②红细胞的洗涤 血红蛋白的释放 (3)①除去相对分子质量较小的杂质 ②透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内
(4)①通过凝胶色谱法将相对分子质量与血红蛋白不同的杂质蛋白除去 ②血红蛋白呈现红色 在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断什么时期应该收集洗脱液；同时通过观察颜色使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
[课时跟踪检测]
(满分50分 时间25分钟)
一、选择题(每小题3分，共24分)
1．下列有关“血红蛋白的提取和分离”的相关叙述中，正确的是( )
A．用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白
B．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质
C．血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂
D．血红蛋白的提取和分离一般分为样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定
解析：选D A项是用生理盐水洗涤；B项中的血红蛋白质为大分子，透析的目的是为了除去小分子物质；C项的目的是使细胞破裂释放出血红蛋白。
2．下列说法错误的是( )
A．在释放红细胞中的血红蛋白时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40%体积的甲苯，充分搅拌10
min，红细胞破裂释放出血红蛋白
B．血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体
C．血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物
D．血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液
解析：选B 血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为无色透明的甲苯层。
3．在蛋白质的提取和分离中，下列关于对样品处理过程的分析，无误的是( )
A．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐
B．洗涤时离心速度过低，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果
C．洗涤过程选用0.1%的生理盐水
D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质
解析：选D 洗涤红细胞的目的是去除血浆中的杂蛋白；洗涤时离心速度过大，时间过长，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程选用0.9%的生理盐水。
4．细胞破碎后，各种蛋白质就会释放出来，再根据蛋白质的不同特性进行提取。下列关于蛋白质抽提的措施中，错误的是( )
A．酸性蛋白质可用稀碱性溶液抽提
B．水溶性蛋白质可用透析液(中性缓冲液)抽提
C．脂溶性蛋白质可用有机溶剂抽提
D．碱性蛋白质可用强酸性溶液抽提
解析：选D 抽提蛋白质的基本原理是根据蛋白质的理化性质，加入不同的试剂后，使蛋白质溶于试剂中而抽提蛋白质。强酸、强碱都会使蛋白质变性而沉淀。
5．以下关于血红蛋白提取和分离的过程及原理的叙述，正确的是( )
A．红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的蒸馏水，重复洗涤3次
B．将血红蛋白溶液放在质量分数为0.9%的NaCl溶液中透析12
h
C．凝胶装填在色谱柱内要均匀，不能有气泡存在
D．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢
解析：选C 红细胞洗涤过程中要加入5倍体积的生理盐水，重复洗涤3次目的是除去杂蛋白。透析时使用物质的量浓度为20
mmol/L的磷酸缓冲液，而不是用0.9%的NaCl溶液。蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的在凝胶外部移动，移动速度快。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
6．取1
mL血红蛋白溶液装入透析袋中进行透析，下列相关说法错误的是( )
A．透析液为300
mL
20
mmol/L的磷酸缓冲液
B．透析时间至少为1～2
h，时间过长血红蛋白也会渗漏出去
C．除去了相对分子质量较小的杂质，实现了样品的粗分离
D．透析也可用于更换样品的缓冲液
解析：选B 透析过程除去了相对分子质量较小的杂质，实现了粗分离过程，也用于更换样品的缓冲液；透析时烧杯中加入300
mL
20
mmol/L的磷酸缓冲液，透析时间为12
h，让小分子杂质与血红蛋白充分分离。
7．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是( )
①防止血红蛋白被氧气氧化
②血红蛋白是一种碱性物质，需要酸进行中和
③防止色谱柱内产生气泡，影响洗脱效果
④让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
A．①②
B．②③
C．②④
D．③④
解析：选D 在血红蛋白的提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是防止色谱柱内产生气泡，影响洗脱效果，同时也为了让血红蛋白保持在体内所处的环境，以维持其结构和功能。
8．下图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述错误的是( )
A．首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较大的杂质
B．图乙装置的试管中收集到的液体中最先得到的是相对分子质量较大的蛋白质
C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5
mL，连续收集
D．图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动
解析：选A 用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。
二、非选择题(共26分)
9．(10分)PCR技术可扩增DNA分子，电泳技术是将待测样品放在光滑的凝胶薄膜上，并加上直流电场，可利用分子带电荷不同分离和分析氨基酸和多核苷酸片段等有机物。这两项技术综合应用于现代刑侦，可以获得最可靠的证据。下图是一次寻找嫌犯的测试结果：图甲是把遗迹中含有21个氨基酸的多肽进行水解，将氨基酸混合物进行电泳的结果；图乙是通过提取罪犯B遗迹DNA和四位嫌犯的DNA进行扩增，并采用特定限制酶处理后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱。
(1)在同一电场下，由于蛋白质或DNA的________以及________、________不同而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品的分离。
(2)由图甲得知，多肽由________种氨基酸组成；由图乙可知B最可能的对象是________。
解析：(1)在同一电场下，由于各种分子的带电性质及分子本身大小、形状不同，而产生不同的迁移方向或速度，从而实现样品中各种分子的分离。(2)不同种类氨基酸所带电荷不同，在电场力的作用下会做定向移动。同种氨基酸在匀强电场中的运动方向和移动距离相同，所以七条带则表明21个氨基酸的多肽分解形成7种氨基酸。同理，不同的DNA片段的带电荷的数量及链的长短不同，电泳时也可以将样品分成不同组分的条带，比较条带的异同程度，可以鉴别出罪犯为F2。
答案：(1)带电性质 本身大小 形状 (2)7 F2
10．(16分)红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2。我们可以选用猪、牛、羊或其他哺乳动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。根据材料回答下列问题：
(1)实验前取新鲜血液，要在采血器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，立即进行离心，收集血红蛋白溶液。加入柠檬酸钠的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)在对样品进行处理时，主要包括________、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。透析的原理是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白的分离(如图1)，他在操作中加样的正确顺序是________。
(4)图2、图3分别是同学甲、乙利用同一种样品分离得到的结果，则图3中与图2中蛋白质P对应的是______________。
解析：(1)加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。(2)对样品的处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液、透析等步骤。其中透析的原理是小分子可以自由通过透析袋(半透膜)，而大分子不能通过。(3)正确的加样顺序可依据样品在色谱柱及凝胶层中的渗入量进行分析，可以得出是④①②③。(4)SDS凝胶电泳装置是垂直的装置，此种电泳方法主要取决于蛋白质相对分子质量的大小，与电荷无关，同时加样在“－”极，通电后，样品蛋白质向“＋”极移动，相对分子量小的，移动距离大，因此从图2的电泳结果分析，P比N、M移向“＋”距离大，说明P的相对分子质量比较小，因此洗脱出来的时间比较长，符合图3中的丙。
答案：(1)防止血液凝固 (2)红细胞的洗涤 小分子可以自由通过透析袋(半透膜)，而大分子不能通过 (3)④①②③ (4)丙
1．透析法分离蛋白质的目的是除去小分子杂质。
2．利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。
3．在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。
4．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移速率完全取决于分子的大小。
5．蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。
6．在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段
PCR扩增的原理和过程
[自读教材·夯基础]
1．细胞内DNA复制的条件
原料
4种脱氧核苷酸
模板
2条DNA母链
酶
解旋酶和DNA聚合酶
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
2．PCR扩增的原理及条件
(1)PCR技术：即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在短时间内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)引物：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。
(3)扩增方向：总是从子链的5′端向3′端延伸。
(4)原理：DNA的热变性原理，即：
双链DNA单链DNA
(5)条件
3．PCR的反应过程
(1)过程：
(2)结果：DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
1．DNA复制时为什么需要引物？
提示：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。
2．PCR扩增DNA过程中是否还需要解旋酶？
提示：不需要。
3．PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分？
提示：因为缓冲液为DNA的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。
4．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？
提示：预变性的目的是增加大模板DNA彻底变性的概率。
5．利用PCR技术扩增1个DNA分子n次，所得DNA分子中，不含引物的脱氧核苷酸链所占的比例是多少？含引物的DNA分子所占的比例是多少？
提示：1/2n；100%。
[跟随名师·解疑难]
1．细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR技术)的比较
项目
细胞内DNA复制
PCR
不同点
解旋
解旋酶，边解旋边复制
80～100
℃高温解旋，双链完全分开
酶
DNA解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶
TaqDNA聚合酶
引物
RNA
DNA或RNA
温度
体内温和条件
高温
子链合成
一条链连续(先导链)，另一条链不连续，先合成片段，再由DNA连接酶连接(滞后链)
两条子链均连续合成
相同点
①提供DNA模板②四种脱氧核苷酸作原料③子链延伸的方向都是从5′端到3′端
2．PCR反应过程
(1)变性：当温度上升到90
℃以上时，双链DNA解聚为单链，如图：
(2)复性：系统温度下降至50
℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：
(3)延伸：当系统温度上升至72
℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、G、C)在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：
[特别提醒]PCR反应的结果
①PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。
②两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。
实验操作及DNA含量的测定
[自读教材·夯基础]
1．实验操作程序
2．DNA含量的测定
(1)原理：利用DNA在260_nm的紫外线波段的吸收峰曲线来测定相应含量。
(2)计算公式：DNA含量(μg/mL)＝50×(260
nm的读数)×稀释倍数。
[跟随名师·解疑难]
1．实验操作注意事项
(1)为避免外源DNA等因素的污染，实验中使用的一些用具在使用前必须进行高压灭菌。
(2)所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20
℃储存。
(3)在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换。所有成分都加入后，通过手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀。
2．结果分析与评价
DNA在260
nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定，以判断DNA片段的扩增是否成功。具体方法如下：
(1)稀释：取2
μL
PCR反应液，加入98
μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。
(2)对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260
nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。
(3)测定：取DNA稀释液100
μL至比色杯中，测定260
nm处的光吸收值。
(4)计算：检测DNA片段的扩增情况，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，计算公式为：
DNA含量(μg/mL)＝50×(260
nm的读数)×稀释倍数
如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
[特别提醒] 公式中的50代表在波长260
nm紫外波段照射下，吸收峰为1时，DNA含量为50
μg/mL。
PCR技术的原理
[例1]
多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：95
℃下变性(使模板DNA解旋)→55
℃下复性(引物与DNA模板链结合)→72
℃下延伸(形成新的脱氧核苷酸链)。下列有关PCR过程的叙述中错误的是( )
A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，生物体内复制时是通过解旋酶实现的
B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成的
C．延伸过程中需要DNA聚合酶和四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
[解析] 变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，体内复制时借助解旋酶来实现；借助碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；延伸时是形成新的DNA分子，需要以脱氧核苷酸为原料；PCR过程的温度高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温DNA聚合酶。
[答案] C
归纳拓展
(1)DNA母链的3′端对应着子链的5′端，即DNA的两条链是反向平行的。
(2)解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶与DNA连接酶都是催化形成磷酸二酯键的。
(3)DNA聚合酶是将单个核苷酸加到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
PCR反应过程及产物
[例2]
在遗传病及刑侦破案中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题：
a链
5′－G－G……T－C－3′ 5′－G－G－OH(引物Ⅰ)
b链3′－C－C……A－G－5′ (引物Ⅱ)
95
℃↓
5′－G－G……T－C－3′ 3′－C－C……A－G－5′
55
℃↓
5′－G－G……T－C－3′ 3′－C－C……A－G－5′
5′－G－G－OH
72
℃↓
________________
________________
(1)在相应的横线上写出引物Ⅱ，并在复性这一步骤中将引物Ⅱ置于合适的位置。
(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的DNA分子。
(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32P标记，请分析循环一次后生成的DNA分子的特点是______；循环n次后生成的DNA分子中不含放射性的单链占总单链的比例为______。
[解析] (1)DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，引物就提供了3′端。子链延伸方向为5′→3′，引物Ⅰ与b链部分碱基互补，引物Ⅱ则与a链部分碱基互补，且连接到a链的3′端，故引物Ⅱ的结构为5′－G－A－OH，复性结果为：
HO－A－G－5′
5′－G－G……T－C－3′。
(2)经过一次循环后，产生的两个DNA分子分别含有引物Ⅰ和引物Ⅱ。(3)由于作为原料的四种脱氧核苷酸被32P标记，所以新合成的子链均含有放射性，一次循环后的两个DNA各有一条链含32P，若复制n次，产生子链共2n×2，其中只有亲本的两条母链不含32P，则其所占比例为2/(2n·2)＝1/2n。
[答案] (1)5′－G－A－OH
a链5′－G－G……T－C－3′
HO－A－G－5′
(2)5′－G－G……T－C－3′ 3′－C－C……A－G－5′
3′－C－C……A－G－5′ 5′－G－G……T－C－3′
(3)每个DNA分子各有一条链含32P标记 1/2n
[随堂基础巩固]
1．下列说法错误的是( )
A．一条DNA母链只有一个3′端，即羟基末端
B．DNA的两个3′端位于相反的两端
C．Taq
DNA聚合酶只能与引物的3′端结合并延伸子链
D．DNA的合成方向是从子链3′端向5′端延伸的
解析：选D 我们通常将DNA单链的羟基(—OH)末端称为3′端，而磷酸基团的末端称为5′端，一个DNA分子有两个3′端和两个5′端，它们分别位于DNA分子的两端，即每一端都有一个3′端和一个5′端。Taq
DNA聚合酶只能与引物的3′端结合并开始延伸DNA链，即子链总是从5′端向3′端延伸。
2．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是( )
A．92
℃、50
℃、72
℃
B．72
℃、50
℃、92
℃
C．50
℃、92
℃、72
℃
D．80
℃、50
℃、72
℃
解析：选A 当温度上升到90
℃(90～96
℃)以上时，双链DNA解聚为单链，称之为变性；当温度下降到50
℃(40～60
℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度上升到72
℃左右(70～75
℃)时，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq
DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，称为延伸。
3．使用PCR仪的具体实验操作顺序应为( )
①设计好PCR仪的循环程序
②按配方准备好各组分
③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分
④进行PCR反应
⑤离心使反应液集中在离心管底部
A．②③⑤④①
D．①⑤③②④
C．②③⑤①④
D．④②⑤③①
解析：选C PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)―→移液―→混合―→离心―→反应。因PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。
4．下列对操作过程的叙述，错误的是( )
A．PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B．PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20
℃储存
C．PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的吸液枪头都必须更换
解析：选C 为了防止外源DNA等因素的污染，PCR反应中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；所用的缓冲液及酶应分装成小份保存，并使用一次性吸液枪头，即A、B、D均正确。在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，故C错误。
5．PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答问题：
(1)A过程高温使DNA变性解聚，对该过程原理的叙述，正确的是________。
A．该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B．该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C．该过程不需要解旋酶的作用
D．该过程与人体细胞的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是________________。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以________加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：______________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94
℃―→55
℃―→72
℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占_____。
解析：PCR技术用高温使DNA两条链解开，该过程不需要解旋酶的作用。C过程是链的延伸，需要DNA聚合酶参与；PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行等。循环3次共形成8个DNA分子，其中两个DNA分子含15N标记，占总数的25%。
答案：(1)C (2)DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、同时要控制好温度 (3)25%
[课时跟踪检测]
(满分50分 时间25分钟)
一、选择题(每小题3分，共24分)
1．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．PCR技术利用的是碱基互补配对原则
B．PCR技术可用于基因诊断，判断亲缘关系等
C．PCR技术需在体内进行
D．PCR技术可分为变性、复性、延伸三个阶段
解析：选C PCR技术是聚合酶链式反应的简称，是在体外快速大量复制DNA片段的一种新技术。
2．PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将( )
A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸
D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链
解析：选B 当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA的子链。
3．在PCR扩增实验中，引物是很重要的。下列属于引物特点的是( )
①引物长度一般是80～100个碱基对(bp)为宜
②DNA聚合酶能从引物的5′端开始延伸DNA链
③引物是一小段DNA或RNA
④引物能与DNA母链的一段碱基序列互补配对
A．①②
B．③④
C．①③
D．②④
解析：选B 引物长度一般以20～30个碱基对(bp)为宜，包括引物Ⅰ和引物Ⅱ两种。引物太短或太长，都可能降低产物的特异性。引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对；DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链，当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。
4．在PCR扩增DNA的实验中，根据设计，一分子DNA经30次循环后，应得到约230个DNA分子，但结果只有约210个DNA分子。出现该现象的原因可能是( )
①循环次数不够
②Taq
DNA
聚合酶活力不够或其活性受到抑制
③引物不能与母链结合
④系统设计欠妥
A．①②③
D．①②④
C．①③④
D．②③④
解析：选B 解答本题应从PCR扩增过程的条件进行分析：
①循环次数过少，产物的量比预期的少；
②Taq
DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制，导致催化效率降低，得到的产物比预期的少；
③如果引物设计不合理，则无法进行扩增；
④PCR系统设置不妥，达不到预期的效果。
5．下列有关PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．聚合酶链式反应，是用DNA聚合酶在体外扩增DNA片段的技术
B．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C．PCR反应需在一定的缓冲溶液中进行，只需提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸即可
D．PCR一般经历三十多次循环，每次循环均分为变性、复性和延伸三个阶段
解析：选C PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。
6．右面为DNA变性和复性示意图，下列相关说法不正确的是( )
A．向右的过程为加热(80～100
℃)变性的过程
B．向左的过程是DNA双链缓慢降温复性
C．变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同
D．图中DNA片段共有2个游离的磷酸基、2个3′端
解析：选C DNA体外的变性同体内的解旋实质是相同的，都是使氢键断裂，DNA双螺旋打开，只是体内需解旋酶，体外是高温条件。
7．复性温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度冷却至40～60
℃，可使引物和模板发生结合。PCR的结果可不考虑原来解旋开的两个DNA模板链的重新结合，原因不包括( )
A．由于模板DNA比引物复杂得多
B．引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞
C．加入引物的量足够多而模板链数量少
D．模板链加热解旋已经变性不可能再次结合
解析：选D 复性的原理是碱基互补配对，解旋后DNA分子变成单链，碱基序列未发生改变，冷却后仍可以进行复性。
8.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物，两种引物及其与模板链的结合位置如图1所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图2所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )
图1
图2
A．2
D．4
C．6
D．8
解析：选D PCR技术扩增时，由两种引物决定所扩增的片段的特定序列，上一次循环的产物为下一次循环的模板。第一次循环形成①和②，第二次循环形成①②③④四个DNA，以此类推4次循环后共形成16个DNA，其中①②各一个，③④各三个，⑤共8个。
二、非选择题(共26分)
9．(13分)资料显示，近十年来，PCR(聚合酶链式反应)技术成为分子生物实验的一种常规手段，其原理是利用DNA半保留复制的特性，在试管中进行DNA的人工复制(如下图)，在很短的时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，使分子生物实验所需的遗传物质不再受限于活的生物体。请据图回答下列有关问题：
(1)加热至95℃的目的是使DNA样品的________键断裂，此过程在生物体细胞内是通过________酶的作用来完成的。
(2)新合成的DNA分子与模板DNA分子完全相同的原因是____________________和________________________________________________________________________。
(3)通过PCR技术使DNA分子大量复制时，若将一个用15N标记的模板DNA分子(第一代)放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制到第五代时，含15N标记的DNA分子单链数占全部DNA总单链数的比例为________。
(4)PCR技术不仅为遗传病的诊断带来了便利，而且改进了检测细菌和病毒的方法。若要检测一个人是否感染了艾滋病病毒，你认为可用PCR技术扩增他血液中的( )
A．白细胞DNA
D．病毒的蛋白质
C．血浆中的抗体
D．病毒的核酸
解析：通过PCR技术使DNA分子大量复制时，同样遵循碱基互补配对原则，其复制方式仍然是半保留复制；复制到第5代即复制了4次；检测一个人是否感染了艾滋病病毒，可以通过检测该人的血液中是否含有病毒核酸来判定。
答案：(1)氢 解旋 (2)DNA分子独特的双螺旋结构 复制过程中严格遵循碱基互补配对原则
(3) (4)D
10．(13分)请回答PCR技术方面的有关问题：
(1)利用
PCR
技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如下图所示)。图中引物为单链
DNA
片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物
A
的
DNA
片段所占的比例为________。
②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的
DNA
片段。
(2)设计引物是
PCR
技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物(只标注了部分碱基序列)都不合理(如下图)，请分别说明理由。
①第
1
组：_________________________________________________________；
②第
2
组：_________________________________________________________。
(3)PCR
反应体系中含有热稳定
DNA
聚合酶，下面的表达式不能正确反映
DNA
聚合酶的功能，这是因为___________________________________________________。
解析：(1)①依据图解特点，第四轮循环产物中可以得到16个DNA分子，其中有15个含引物A的单链，以及一个不含引物A的模板链。②从图解原DNA与引物A、B的比例关系分析，经三次复制后开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)比较第一组引物的碱基顺序，可以发现引物Ⅰ与引物Ⅱ有两对碱基能发生互补配对形成局部双链结构而失效；而第二组引物中，引物Ⅰ′折叠后会发生碱基互补配对而导致失效。(3)在PCR反应体系中，引物首先与模板DNA单链互补配对形成局部双链DNA片段，然后在DNA聚合酶的作用下将单个脱氧核苷酸依次连接到引物链上。
答案：(1)① ②三
(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
1．DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。
2．DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
3．PCR反应需要DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶等条件。
4．PCR原理：DNA热变性的原理。
5．PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。
6．PCR扩增DNA片段可以使目的片段呈指数增长。课题1DNA的粗提取与鉴定
DNA粗提取、分离与鉴定的原理
[自读教材·夯基础]
1．思路与方法
(1)思路：选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
(2)方法：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2．提取DNA的原理
(1)DNA的溶解性：
①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离的目的。
②DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质则溶于其中，利用这一原理可以将DNA与蛋白质进一步分离。
(2)DNA的耐受性：
①蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
②大多数蛋白质不能忍受60～80
℃的高温而发生变性，而DNA在80_℃以上才会变性。
③洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
3．DNA的鉴定
DNA＋二苯胺蓝色
根据教材P54图5 1“DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线”，思考下列问题：
(1)描述DNA在NaCl溶液中溶解度的变化情况。
提示：在物质的量浓度为0.14
mol/L的NaCl溶液中，DNA的溶解度最小。在NaCl溶液浓度低于0.14
mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。
(2)如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？
提示：用物质的量浓度高于或低于0.14
mol/L的NaCl溶液可溶解DNA，用物质的量浓度为0.14
mol/L的NaCl溶液可析出DNA。
[跟随名师·解疑难]
DNA的溶解度
溶解规律
2
mol/LNaCl溶液
0.14
mol/LNaCl溶液
DNA
溶解
析出
蛋白质
NaCl溶液浓度从2
mol/L降低的过程中，蛋白质溶解度逐渐增大
部分发生盐析沉淀
溶解
总结
①DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。在NaCl溶液浓度低于0.14
mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14
mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大②选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的
实验设计
[自读教材·夯基础]
1．过程
2.操作提示
(1)以血液为实验材料时，每100
mL血液中需要加入3
g柠檬酸钠，防止血液凝固。
(2)加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂絮状，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
(3)二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定效果。
1．可否选用哺乳动物成熟红细胞作实验材料？为什么？
提示：不可以。因为哺乳动物成熟红细胞无细胞核。
2．提取洋葱的DNA时，需在切碎的洋葱中加入一定量的洗涤剂和食盐，并进行充分的搅拌和研磨。请思考下列问题：
(1)加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
提示：洗涤剂能溶解细胞膜，释放出DNA；食盐有利于DNA的溶解。
(2)如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
提示：提取的DNA量少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺试剂鉴定结果不明显等。
3．提纯时，为什么要选用体积分数为95%的冷酒精？
提示：冷酒精提纯效果更好。
[跟随名师·解疑难]
1．实验材料的选取
(1)鸡血适宜作为实验材料的两个原因：一是因为鸡血细胞核中的DNA含量丰富，材料易得；二是因为鸡血细胞易吸水涨破。
(2)材料的处理(以鸡血为例)：
2．实验过程中的几点注意事项
(1)两次使用蒸馏水的作用：第一次用蒸馏水是使鸡血细胞吸水涨破，提取核DNA；第二次用蒸馏水稀释NaCl溶液，使DNA析出。
(2)实验中三次过滤操作的比较：
次数
过滤液
过滤后
纱布上
滤液中
1
加蒸馏水的细胞滤液
细胞膜、核膜、糖类、蛋白质等
含杂质的DNA
2
浓度为2
mol/L的NaCl溶液
不溶于2
mol/L
NaCl溶液的杂质
含杂质较少的DNA
3
浓度为0.14
mol/L的NaCl溶液
DNA
溶于0.14
mol/L
NaCl溶液的杂质
(3)用玻璃棒搅拌时，动作要缓慢且沿同一方向进行，目的是防止DNA被破坏。
(4)实验过程中最好使用塑料烧杯和试管，可减少提取过程中DNA的损失。
3．结果分析及评价
(1)现象是否明显及可能原因：
若实验结果不明显，可能的原因是：
①材料中核物质没有充分释放出来，如研磨不充分或蒸馏水的量不够。
②加入酒精后摇动或搅拌时过猛，DNA被破坏。
③二苯胺最好现配现用，否则二苯胺变成浅蓝色，影响鉴定效果。
④析出含DNA的黏稠物时，蒸馏水要沿烧杯内壁慢慢地加入，不能一次快速加入，否则会影响实验结果。
⑤实验中有多次搅拌，但是其目的及操作方法是不同的，要注意区分，否则也会影响结果。
(2)分析DNA中的杂质：
本实验提取的DNA粗制品中有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。
DNA粗提取与鉴定的原理
[例1]
关于“DNA的粗提取与鉴定”的实验，该实验依据的实验原理不是( )
A．DNA在NaCl溶液中的溶解度，随着NaCl溶液浓度的不同而不同
B．利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA
C．DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于某些有机溶剂
D．在沸水中DNA遇二苯胺会出现蓝色反应
[解析] 本实验依据的原理是A、B、D项三个方面。必须明确的是NaCl的浓度为0.14
mol/L时，DNA的溶解度最小，具体操作时用2
mol/L的NaCl溶液，再加水稀释至黏稠物(主要是DNA)不再增多时，此时该溶液浓度即为0.14
mol/L。C项是DNA的性质，不能作为该实验的原理。
[答案] C
归纳拓展
DNA鉴定的其他方法
(1)甲基绿染色法：DNA＋甲基绿染液―→绿色。
(2)紫外灯照射法：用蒸馏水配制质量分数为0.05%的溴化乙啶(EB)溶液，将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260
nm)下照射(暗室中)，可呈现橙红色的荧光(DNA的紫外吸收高峰在260
nm处)。
(3)电泳法：此方法适合鉴定纯度较高的DNA。
DNA粗提取的实验分析
[例2] 某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：
称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10
g。剪碎后分成两组，一组置于20
℃，另一组置于－20
℃条件下保存24
h。
DNA粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15
mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10
mL滤液，再加入20
mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的2
mol/L
NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测：
在上述试管中各加入4
mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5
min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表：
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20
℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20
℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验的课题名称是__________________________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__________________。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20
℃相比，相同实验材料在－20
℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：____________________________________________________________。
②针对结论1，请提出合理的解释：________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高DNA纯度，依据氯仿的特性，在DNA粗提取第三步的基础上继续操作的步骤是：__________________________________________________________________，
然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
[解析] 如果DNA断裂，就不容易被提取出来；温度主要是通过影响酶的活性来影响生理过程。粗提取得到的DNA中含有少量的蛋白质，可以通过氯仿的特殊功能来去除蛋白质，提高DNA纯度。
[答案] (1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响 (2)DNA断裂
(3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄提取的DNA量最多
②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢
(4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
归纳拓展
实验过程中3次加氯化钠溶液的作用
第一次加氯化钠溶液后，必须充分晃动烧杯，使二者混合均匀，加速染色质中DNA与蛋白质分离，使DNA充分游离并溶解在氯化钠溶液中。第二次加氯化钠溶液也是为了DNA的再溶解，这时溶液中的蛋白质含量已很少。第三次加氯化钠溶液还是为溶解DNA。
[随堂基础巩固]
1．下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B．DNA既溶于2
mol/L
NaCl溶液也溶于蒸馏水
C．向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D．DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
解析：选C 原则上含DNA的生物材料都可用来提取DNA，只是选用DNA含量高的生物组织，成功的可能性更大；DNA在2
mol/L
NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大；向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，但在蒸馏水中不会析出DNA；DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后溶液变蓝。
2．在进行DNA的粗提取实验中，若选择的是植物细胞，在破碎细胞时，加入一定量的洗涤剂和食盐，则加入洗涤剂与食盐的目的分别是( )
①有利于DNA溶解 ②分离DNA和蛋白质
③溶解蛋白质 ④溶解细胞膜
A．①②
B．④①
C．②③
D．④②
解析：选B 洗涤剂是一种离子去垢剂，可以溶解细胞膜，有利于细胞内含物(DNA)的释放；食盐的主要成分是NaCl，可以加速核蛋白解聚，游离出DNA分子，并使DNA分子充分溶解于NaCl溶液中。
3．与析出DNA黏稠物有关的叙述，错误的是( )
A．操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度
B．在操作时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整
C．加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出
D．当丝状黏稠物不再增加时，此时NaCl溶液的浓度相当于0.14
mol/L
解析：选C 向含有DNA的溶液中加入蒸馏水后，NaCl溶液的浓度会变小，当NaCl溶液的浓度为0.14
mol/L时，DNA的溶解度最小而被析出，而蛋白质的溶解度是增大的，不会析出。
4．在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，操作正确的是( )
A．取制备好的鸡血细胞液5～10
mL注入烧杯中，迅速加入浓度为0.14
mol/L的NaCl溶液20
mL，同时用玻璃棒沿同一方向快速搅拌5
min，可使鸡血细胞破裂，释放出DNA
B．整个DNA提取过程中，两次加蒸馏水的目的都是为了降低溶液中NaCl的浓度，使DNA分子的溶解度达到最低，析出DNA分子
C．整个DNA提取操作中，两次加入2
mol/L的NaCl溶液，目的都是使DNA尽可能多地溶解在NaCl溶液中
D．DNA鉴定操作中，只要向溶有DNA的NaCl溶液中加入4
mL的二苯胺试剂，即可出现蓝色
解析：选C 取制备好的鸡血细胞液注入烧杯中，迅速加入蒸馏水并用玻璃棒沿同一方向搅拌，使鸡血细胞破裂，将DNA释放出来；整个DNA提取过程中，两次使用蒸馏水，第一次是使鸡血细胞吸水涨破，释放DNA，第二次是用来稀释NaCl溶液，使DNA析出；在DNA鉴定操作中，DNA遇二苯胺试剂呈蓝色需在沸水浴条件下完成。
5．下面为“DNA的粗提取与鉴定”实验的一些重要操作示意图，据图回答下列有关该实验的问题：
(1)正确的操作顺序是__________________________________________________。
(2)上图C、E步骤都加入蒸馏水，但其目的不同，分别是__________________和________________________________________________________________________。
(3)上图A步骤中所用酒精必须是经过________才能使用，该步骤的目的是________________________________________________________________________。
(4)为鉴定A中所得到的丝状物的主要成分为DNA，可滴加________试剂，沸水浴，如果出现________，则该丝状物的主要成分为DNA。
解析：熟记DNA提取和鉴定的步骤，并了解蒸馏水和酒精的作用是解答本题的关键。两次加入蒸馏水的作用：第一次是使鸡血细胞吸水涨破，DNA从细胞中释放出来进入滤液；第二次是使溶解于物质的量浓度为2
mol/L的NaCl溶液中的DNA析出，与杂质分离。本题还涉及DNA的鉴定，DNA可在沸水浴条件下与二苯胺试剂作用，被染成蓝色。
答案：(1)C→B→E→D→A (2)加速血细胞的破裂 降低NaCl溶液的浓度，使DNA析出 (3)充分冷却 提取含杂质少的DNA (4)二苯胺 蓝色
[课时跟踪检测]
(满分50分 时间25分钟)
一、选择题(每小题3分，共24分)
1．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品分别是( )
①0.1
g/mL的柠檬酸钠溶液 ②2.00
mol/L的NaCl溶液 ③0.14
mol/L的NaCl溶液 ④体积分数为95%的冷酒精溶液
A．①③
B．②③
C．②④
D．③④
解析：选D 在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA时所用试剂为0.14
mol/L的NaCl溶液，此浓度下DNA的溶解度最低；由于DNA不溶于酒精，而某些蛋白质可溶于酒精，因此可用体积分数为95%的冷酒精获取较纯净的DNA。
2．下列关于“DNA的粗提取和鉴定”实验依据原理的叙述，错误的是( )
A．利用DNA不溶于酒精溶液，而蛋白质能溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离
B．利用高温能使蛋白质变性，却对DNA没有影响的特性，可将DNA与蛋白质分离
C．利用DNA和蛋白质在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，可将DNA与蛋白质分离
D．在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离
解析：选B 高温能使蛋白质、DNA变性，蛋白质在60～80
℃发生变性，而DNA在80
℃以上才变性。
3．在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，下列相关叙述正确的是( )
A．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14
mol/L，滤去析出物
B．调节NaCl溶液浓度或加入木瓜酶，都可以去除部分杂质
C．将丝状物溶解在2
mol/L
NaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色
D．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同
解析：选B 在0.14
mol/L的NaCl溶液中DNA溶解度最低，DNA在析出物中，所以析出物不能丢弃；DNA鉴定时加入二苯胺试剂后还需经沸水浴才能出现蓝色；用菜花作为实验材料时需要先用洗涤剂溶解细胞膜。
4．若从植物细胞中提取DNA，发现实验效果不好，如看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定时不显示颜色反应等。其可能的原因是( )
①植物细胞中DNA含量低 ②研磨不充分
③过滤不充分 ④95%冷酒精的量过大
A．①②
B．③④
C．①④
D．②③
解析：选D 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少；过滤不充分，也会导致提取的DNA量过少；若用于沉淀DNA的酒精量过少，也会导致DNA的沉淀量少，都会影响实验效果。
5．用过滤的方法得到含DNA的氯化钠溶液后，还要用酒精处理，才可以得到较纯的DNA，这是因为( )
A．DNA易溶于酒精，而滤液中某些杂质不易溶于酒精
B．DNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精
C．DNA和滤液中其他成分更易溶于酒精
D．DNA和滤液中其他成分都不溶于酒精
解析：选B DNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精，利用这个特点可去除溶于酒精的杂质，得到较纯的DNA。
6．在DNA的粗提取实验过程中，对DNA提取量影响较小的是( )
A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，释放出DNA等核物质
B．搅拌时要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动
C．在析出DNA黏稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直至黏稠物不再增多
D．要用冷酒精沉淀DNA，甚至可将混合液再放入冰箱中冷却
解析：选B A项的做法是为了充分释放出核中的DNA分子，使进入滤液中的DNA尽量地多；C项是让DNA充分沉淀，保证DNA的提取量；D项的道理同C项。而B项的操作并不能使DNA增多或减少，但是要注意它影响DNA的长度。
7．将粗提取的DNA丝状物分别加入0.14
mol/L
NaCl溶液、2
mol/L
NaCl溶液、体积分数为95%的酒精溶液中，然后用放有纱布的漏斗过滤，分别得到滤液P、Q、R以及存留在纱布上的黏稠物p、q、r，其中由于含DNA少可以丢弃的是( )
A．P、Q、R
B．p、q、r
C．P、q、R
D．p、Q、r
解析：选C DNA在0.14
mol/L
NaCl溶液中溶解度最小，过滤后DNA在黏稠物p中，可以丢弃P；DNA在2
mol/L
NaCl溶液中溶解过滤后，DNA在滤液中，可以丢弃q；DNA不溶于体积分数为95%的酒精溶液，所以过滤后DNA在黏稠物r中，可以丢弃R。
8．下表是关于“DNA的粗提取与鉴定”实验中所使用的材料、操作及其作用的表述，正确的是( )
试剂
操作
作用
A
柠檬酸钠溶液
与鸡血混合
有利于血液凝固
B
蒸馏水
与鸡血混合
保持细胞形状
C
蒸馏水
加入到溶解有DNA的NaCl溶液中
析出DNA丝状物
D
冷却的酒精
加入到过滤后含DNA的NaCl溶液中
产生特定的颜色反应
解析：选C 在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，柠檬酸钠可以防止血液凝固；鸡血中加入蒸馏水可以使细胞膜和核膜破裂；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14
mol/L的NaCl溶液中溶解度最低，有利于DNA析出；DNA不溶于酒精，可以获得较纯的DNA；DNA遇二苯胺(沸水浴加热)被染成蓝色。
二、非选择题(共26分)
9．(12分)实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
试管步骤
A
B
1
加入2
mol/L的NaCl溶液5
mL
加入2
mol/L的NaCl溶液5
mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加入4
mL二苯胺试剂，混匀
加入4
mL二苯胺试剂，混匀
4
沸水浴5
min
沸水浴5
min
实验现象
①____________
②__________
实验结论
③______________________
(2)对B试管，完成1、2、3的操作步骤后溶液颜色如何变化？
________________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是______________，同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是______________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与________________________________________________________________________
________________有关。
解析：A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5
min，目的是加快颜色反应的速率；颜色的深浅程度主要取决于DNA的含量。
答案：(1)①溶液不变蓝色 ②溶液逐渐变蓝色 ③DNA在沸水浴中遇二苯胺会显蓝色 (2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速率 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
10．(14分)真核生物细胞内，大量DNA和蛋白质以及一些RNA等混杂在一起，难以分离。生物兴趣小组的同学为了获得纯度相对较高的DNA展开了实验探究。
(1)分离各种物质的基本思路是根据DNA和其他物质理化性质的不同而采取一定的方法，下图是从各种物质之间____________的差异角度开展研究：
①取鸡血细胞悬液10
mL，加蒸馏水20
mL，同时用玻璃棒__________(填“轻轻搅拌”或“快速搅拌”)。过滤，取滤液，转移到塑料材质的大烧杯中。
②沿大烧杯内壁持续、缓慢地加入饱和硫酸铵溶液，用玻棒沿一个方向______________(填“轻轻搅拌”或“快速搅拌”)，同时不断收集析出的物质。
下图是根据鸡血中几种物质的析出情况绘制的曲线，据图分析：
③如果只收集纤维蛋白，可采取的措施是________________________________________。
④DNA在饱和度约为________________的硫酸铵溶液中溶解度最小，与此同时析出的物质还有______________________。
(2)如果要进一步去掉其他杂质，尽可能提高获得的DNA纯度，可采取的两种办法有________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：分析曲线图可知，不同物质在不同浓度的硫酸铵中析出的相对量有所差别，即分离各种物质的基本思路是根据DNA与其他物质之间溶解度的差异角度开展研究：①此时应快速搅拌，以加速血细胞的破裂。②为了防止DNA絮状物的断裂，此时应用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，同时不断收集析出物。③由图中看出，硫酸溶液浓度为20%时，纤维蛋白开始析出；在浓度为30%时析出最快，超过30%后球蛋白也开始析出，因此，如果只收集纤维蛋白，应在硫酸铵溶液浓度达到30%之前收集析出物。④由图中看出，DNA在饱和度约为65%的硫酸铵溶液中的溶解度最小，与此同时析出的还有球蛋白和纤维蛋白，及少量的tRNA。
答案：(1)溶解度 ①快速搅拌 ②轻轻搅拌
③在硫酸铵浓度达到30%之前收集析出物
④65% 球蛋白、纤维蛋白(tRNA)
(2)将DNA与球蛋白的混合物加入到冷却酒精中，收集再次析出物；用嫩肉粉(木瓜蛋白酶)处理溶有DNA与蛋白质的溶液；将溶有DNA与蛋白质的溶液放在60～75
℃的恒温水浴箱中保温一段时间(答出两点即可)
1．DNA在物质的量浓度为0.14
mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。
2．DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可利用酒精将DNA和蛋白质分开。
3．DNA对蛋白酶、高温和洗涤剂有耐受性。
4．在加热条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。
5．哺乳动物成熟的红细胞不含细胞核，不能作为提取DNA的实验材料。若选取肝脏细胞或植物细胞，则必须充分研磨。
6．实验中加入柠檬酸钠的作用：作为抗凝剂，防止血液凝固。阶段质量检测(五) DNA和蛋白质技术
(B卷 能力素养提升)
(满分：100分 时间：40分钟)
一、选择题(每小题4分，共48分)
1．蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来，下列药品可达到上述同一目的的是( )
A．蒸馏水
B．NaCl溶液
C．NaOH溶液
D．盐酸
解析：选B 染色质中的主要成分是DNA和蛋白质，可以利用蛋白酶水解杂质蛋白质，从而使提取的DNA与蛋白质分开。DNA在2
mol/L
NaCl溶液中溶解度最高，而蛋白质则不能溶解在2
mol/L
NaCl溶液中，通过过滤除去不能溶解的杂质蛋白。由此可看出两种方法虽然原理不同，但目的是一样的。
2．下列关于蛋白质性质的叙述中，不会影响到蛋白质在凝胶电泳中运动速度的是( )
A．蛋白质分子的大小
B．蛋白质分子的密度
C．蛋白质分子的形状
D．蛋白质分子所带电荷量
解析：选B 电泳是利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3．下列有关PCR的描述错误的是( )
A．是一种酶促反应
B．引物决定了扩增的特异性
C．PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累(假设扩增效率为100%)
D．扩增对象是氨基酸序列
解析：选D PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它以极少量的DNA为模板，以四种脱氧核苷酸为原料，在引物作用下使DNA聚合酶从引物的3′端连接脱氧核苷酸，短时间内迅速复制上百万份的DNA拷贝。
4．下列关于血红蛋白的提取和分离操作的叙述，错误的是( )
A．色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡，必须重装
B．凝胶用自来水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液
C．为加快凝胶膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，逐渐升温至接近沸腾，通常只需1～2
h
D．在血红蛋白提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理，是让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
解析：选B 由于装填凝胶柱时用到的是商品凝胶，为干燥的颗粒，使用前需要用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，再用洗脱液进行充分洗涤平衡，使凝胶装填紧密，也可在沸水浴中加热膨胀，既可节约时间，也可除去凝胶中的微生物，排出胶粒内的空气。
5．DNA具有半保留复制的特性，但是在DNA分子复制的过程中需要一些引物，其主要原因是( )
A．可加快DNA的复制速度
B．引物可与DNA母链通过碱基互补配对结合
C．引物的5′端有助于DNA聚合酶延伸DNA链
D．DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链
解析：选D DNA的两条链是反向平行的，DNA聚合酶不能从5′端开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链，因此，DNA的复制需要引物。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，故DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
6．在蛋白质和DNA的混合液中，要想得到较纯的DNA，可采用的方法有( )
①向混合液中加入足量的蒸馏水 ②向混合液中加入DNA水解酶 ③向混合液中加入冷的95%的酒精 ④向混合液中加入蛋白酶
A．①②
B．③④
C．①③
D．②④
解析：选B DNA分子在冷的酒精中可析出，据此可将DNA和蛋白质分离；而蛋白酶则能将蛋白质水解成可溶性的多肽，从而将蛋白质与DNA分离。
7．PCR技术是在遗传实验室中常见的一种DNA片段进行体外扩增的方法，利用它能快速得到大量的目的基因或DNA分子片段。在PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是( )
A．反复洗涤
B．不被外源DNA污染
C．高压灭菌
D．在－20
℃保存
解析：选C 通过对PCR实验中所用仪器和试剂进行高压灭菌，可以避免外源DNA等因素的污染。
8．某同学用洋葱进行DNA粗提取和鉴定实验，操作错误的是
( )
A．加入洗涤剂后用力进行快速、充分的研磨
B．用蛋白酶纯化过滤后的研磨液中的DNA
C．加入酒精后用玻璃棒轻缓搅拌
D．加二苯胺试剂摇匀后沸水浴加热
解析：选A 加入洗涤剂后研磨动作要轻缓、柔和，否则容易产生许多泡沫，不利于后续步骤的操作，A项错误；蛋白酶能够分解蛋白质，因此能起到纯化DNA的目的，B项正确；加入酒精后用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免引起DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀，C项正确；DNA可与二苯胺试剂在沸水浴条件下呈蓝色，D项正确。
9．将经处理破裂后的红细胞混合液以2
000
r/min的速度离心10
min后，离心管中的溶液分为4层，从上到下的顺序依次是( )
A．血红蛋白、甲苯层、脂类物质层、沉淀层
B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂类物质层
C．脂类物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层
D．甲苯层、脂类物质层、血红蛋白、沉淀层
解析：选D 混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层是其他杂质的暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。
10．PCR又称多聚酶链式反应，现在已成为分子生物学实验室的一种常规手段，它可以在体外很短的时间内将DNA大量扩增。你认为下列符合在体外进行PCR反应条件的一组是( )
①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③合成引物 ④四种脱氧核苷酸 ⑤DNA聚合酶
⑥DNA解旋酶 ⑦限制性核酸内切酶 ⑧温控设备
A．①②③④⑤⑥
B．①②③④⑤⑥⑦⑧
C．③④⑤⑥⑧
D．①②③④⑤⑧
解析：选D 体外DNA扩增(PCR技术)是模拟生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制性核酸内切酶)，但需要耐高温的DNA聚合酶。
11．某考古学家在西伯利亚泰加林地区的冰中发现了一种冰冻的已灭绝的巨型动物的肌肉。他想了解该巨型动物的DNA与现今印度大象的DNA的相似性，于是做了如下检测工作，其中正确的操作步骤及顺序是( )
①降低温度，检测处理后的杂合DNA双链
②通过PCR技术扩增巨型动物和大象的DNA
③把巨型动物的DNA导入大象的细胞中
④在一定温度条件下，将巨型动物和大象的DNA水浴共热
A．②④①
B．②④③① C．③④① D．②④③
解析：选A PCR技术是分子生物学发展史上的一个里程碑，它大大简化了基因克隆的步骤，已广泛应用于生物学研究的各个领域。PCR反应通过变性、复性、延伸三个循环步骤，使目标DNA片段呈指数扩增。因此，PCR系统是一个极其灵敏的信号放大系统，能将极微弱甚至是单拷贝的基因信号检测出来。通过PCR技术扩增巨型动物和大象的DNA，然后利用DNA分子在高温时解螺旋的特点，将巨型动物和大象的DNA水浴共热，再降低温度，检测处理后的杂合DNA双链。
12．PCR技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，如图表示合成过程。下列说法错误的是( )
A．甲过程高温使DNA变性解旋，该过程不需要解旋酶的作用
B．丙过程用到的酶在高温下失活，因此在PCR扩增时需要再添加
C．如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94
℃～55
℃～72
℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占25%
D．PCR中由碱基错配引起的变异属于基因突变
解析：选B 丙过程用到的酶是Taq
DNA聚合酶，其特点是耐高温。
二、非选择题(共52分)
13．(20分)CTAB法是一种从高等真核生物细胞中制备基因组DNA(总DNA)的技术。CTAB能跟核酸形成复合物，在高盐溶液(＞0.7
mol/L的NaCl溶液)中可溶并且稳定存在，当降低溶液中盐的浓度(＜0.3
mol/L的NaCl溶液)时，CTAB－核酸的复合物就会因溶解度降低而沉淀，再用70%酒精浸泡可洗脱掉CTAB；氯仿能使蛋白质发生变性而沉淀。提取和检测水稻基因组DNA的操作步骤如下：
①在50
mL离心管中加入20
mL的CTAB抽提缓冲液(主要成分是1.4
mol/L的NaCl、2%的CTAB)，于65
℃水浴中预热；
②将20
g新鲜的水稻幼嫩叶片剪成小段后放于研钵中，用液氮速冻并研磨成粉末，加入上述离心管中，于65
℃水浴中保温30
min；
③取出离心管，冷却至室温，加入20
mL的氯仿，轻轻混匀20
min；
④在室温下以12
000
r/min的转速离心10～20
min；
⑤将上清液移入另一个离心管中，加入2/3体积的经冷却的异丙醇，用玻璃棒轻轻搅动，小心取出聚集于玻璃棒上的CTAB－核酸的复合物沉淀；
⑥将沉淀移入另一个离心管中，加入70%酒精洗涤，重复洗涤1～2次；
⑦吹干酒精后，将DNA溶于适量的TE缓冲液中，在0.8%的琼脂糖凝胶上电泳分离并在核酸紫外检测仪上观察。
请回答下列问题：
(1)植物基因组DNA(总DNA)的提取通常采用机械研磨的方法。常温下研磨时，植物细胞匀浆中含有的多种酶会对DNA的提取产生不利影响。用液氮速冻，材料在研磨时易破碎，同时还能__________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)实验步骤③④的目的是________________________________________________________________________。
(3)实验步骤⑤中，玻璃棒上出现沉淀的主要原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)对DNA进行定性检测常用的试剂是____________。DNA在260
nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，利用核酸紫外检测仪可以进行________________________________________________________________________
______________________。
解析：低温下酶活性降低，由题干信息可知，氯仿能使蛋白质变性而沉淀，因此步骤③④的目的是去除溶液中的蛋白质。当盐浓度＜0.3
mol/L时，CTAB－核酸的复合物会沉淀。
答案：(1)降低细胞匀浆中酶的活性，避免对DNA的提取产生不利的影响
(2)去除溶液中的蛋白质(使蛋白质变性和沉淀)
(3)NaCl溶液的浓度＜0.3
mol/L，CTAB－核酸的复合物因溶解度降低而沉淀
(4)二苯胺 DNA含量的测定(或检测DNA)
14．(16分)PCR技术是把一DNA片段在体外酶的作用下，合成许许多多相同片段的一种方法，利用它能快速而特异性地扩增任何目的基因或DNA片段。它的基本过程如图所示：
注：图中短线表示每次扩增过程中需要的引物。每个引物约含20个核苷酸，并分别与两条单链DNA结合，其作用是引导合成DNA子链。
(1)PCR技术的原理是模拟生物体内________的过程。
(2)PCR扩增过程中需要对DNA片段进行高温处理，其目的是________________________________________________________________________，
此过程在生物体内称为________，需________酶的参与。
(3)假如引物都用3H标记，从理论上计算，所得DNA分子中含有3H标记的占________。
解析：由图可知高温变性的过程就是DNA在高温条件下解旋的过程，在生物体内则需要解旋酶催化才能进行；低温复性时两个DNA分子都需要引物。
答案：(1)DNA复制 (2)使DNA的两条链彼此分开 解旋 解旋 (3)100%
15．(16分)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有______功能。
(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是__________；乙装置中，C溶液的作用是________________________________________________________________________。
(3)甲装置用于________，目的是________________________________________________________________________。
用乙装置分离蛋白质的方法叫____________，是根据____________________分离蛋白质的有效方法。
(4)用乙装置分离血红蛋白时，待____________________________时，用试管收集流出液，每5
mL收集一管，连续收集。
解析：甲装置为透析过程，即对蛋白质的粗分离阶段，除去的是能通过透析袋的小分子物质。乙装置为凝胶色谱操作，可以将相对分子质量大小不同的蛋白质分离，血红蛋白呈红色，具有运输氧气的功能。
答案：(1)运输 (2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 (3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小 (4)红色的蛋白质接近色谱柱底端阶段质量检测(五) DNA和蛋白质技术
(A卷 学业水平达标)
(满分：100分 时间：40分钟)
一、选择题(每小题4分，共48分)
1．在血红蛋白的提取和分离实验中，下列操作正确的是( )
A．分离红细胞时需去除上层透明的黄色血浆
B．红细胞释放出血红蛋白时只需加入蒸馏水
C．分离血红蛋白溶液是低速短时间离心
D．洗脱时，待红色蛋白质下移即开始收集流出液
解析：选A 分离红细胞时要及时除去血浆蛋白，红细胞释放血红蛋白时需要加入蒸馏水和甲苯。分离血细胞时，要短时低速离心，即一般为500
r/min，离心2
min，否则白细胞会一同沉淀，达不到分离效果。分离血红蛋白时要高速长时间离心，以2
000
r/min的速度离心10
min。洗脱时待红色的蛋白质接近色谱柱底端时用试管收集流出液。
2．下列属于PCR技术条件的是( )
①单链的脱氧核苷酸序列引物 ②目的基因所在的DNA片段 ③脱氧核苷酸 ④核糖核苷酸
⑤DNA连接酶 ⑥DNA聚合酶 ⑦DNA限制性内切酶
A．①②③⑤
B．①②③⑥
C．①②③⑤⑦
D．①②④⑤⑦
解析：选B PCR技术需要DNA模板、分别与两条模板链相结合的两种引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶。
3．下列关于“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B．将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝
C．常温下菜花匀浆中有些酶类会影响DNA的提取
D．用玻棒缓慢搅拌滤液会导致DNA获得量减少
解析：选C 提取植物细胞中DNA时加入洗涤剂可瓦解植物细胞的细胞膜，利于DNA的释放，但不能增加DNA在NaCl溶液中的溶解度；含DNA的丝状物应先溶解在物质的量浓度为2
mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂在沸水浴条件下检测，冷却后观察变成蓝色；菜花匀浆中含有DNA水解酶，常温下其活性较高，可催化DNA水解从而影响DNA的提取；用玻璃棒缓慢搅拌滤液不会使DNA分子断裂，即不会减少DNA的提取量。
4．样品的加入和洗脱的操作错误的是( )
A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
D.用吸管小心地将1
mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
解析：选A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐。
5．关于DNA的实验，叙述正确的是( )
A．用兔的成熟红细胞可提取DNA
B．PCR的每个循环一般依次经过变性—延伸—复性三步
C．DNA溶液与二苯胺试剂混合，沸水浴后生成蓝色产物
D．用甲基绿对人的口腔上皮细胞染色，细胞核呈绿色，细胞质呈红色
解析：选C 兔属于哺乳动物，其成熟的红细胞中无细胞核，不适合作为提取DNA的材料。PCR技术的每个循环一般依次经过变性—复性—延伸三步。DNA溶液在沸水浴条件下，遇二苯胺呈蓝色。用甲基绿吡罗红混合染色剂对细胞进行染色时，细胞核(含DNA)呈绿色，细胞质(含RNA)呈红色，仅用甲基绿无法对细胞质进行染色。
6．下列关于有关实验的叙述正确的是( )
A．最先从凝胶色谱柱中分离出来的是相对分子质量较大的蛋白质分子
B．向初步纯化的DNA中加入二苯胺溶液，可直接观察到溶液呈蓝色
C．加酶洗衣粉中常用的酶制剂包括碱性脂肪酶、酸性蛋白酶等
D．装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应先关闭后打开
解析：选A 采用凝胶色谱法分离蛋白质时，最先从凝胶色谱柱中分离出来的是相对分子质量较大的蛋白质分子；用二苯胺鉴定DNA时需要水浴加热；加酶洗衣粉中常用的酶制剂是碱性脂肪酶、碱性蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶；装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应始终处于开启状态。
7．PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程常用的引物是人工合成的DNA单链
②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A．③④
B．①②
C．①③
D．②④
解析：选C PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同。第一，PCR过程常用的引物是人工合成的DNA单链，其长度通常为20～30个脱氧核苷酸。第二，PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
8．下列关于现代生物技术应用的叙述，正确的有( )
①在蛋白质的提取和分离实验中，凝胶色谱法可将不同相对分子质量的蛋白质分离出来 ②在PCR中，引物的结构和长度决定DNA子链从5′端向3′端延伸 ③在蛋白质的提取和分离实验中，透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质 ④在多聚酶链式反应中，TaqDNA聚合酶只能特异性地复制整个DNA的部分序列
A．1项
B．2项
C．3项
D．4项
解析：选C DNA复制时，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸，和引物的结构和长短没有关系，故②错误。
9．DNA的粗提取与鉴定实验中有三次过滤：
(1)过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液；
(2)过滤含黏稠物的0.14
mol/L
NaCl溶液；
(3)过滤溶解有DNA的2
mol/L
NaCl溶液。
以上三次过滤分别为了获得( )
A．含核物质的滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液
B．含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、含DNA的滤液
C．含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、纱布上的DNA
D．含较纯的DNA滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液
解析：选A 用蒸馏水稀释鸡血细胞液，使血细胞的细胞膜、核膜破裂，释放出核物质，此时过滤得到含核物质的滤液。第二次过滤是因DNA在0.14
mol/L
NaCl溶液中溶解度最小，DNA析出成丝状黏稠物，经过滤留在纱布上。第三次，是将第二次获得的黏稠物溶解在2
mol/L的NaCl溶液后，过滤除去杂质获得含DNA的滤液。
10．聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温复性及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。
下列关于PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
解析：选C PCR的原理就是DNA的复制，原料应该是脱氧核糖核苷酸而不是核糖核苷酸。
11．下列关于DNA的粗提取实验和血红蛋白的提取实验的叙述，正确的是( )
A．前者选择鸡血细胞作为材料较好，后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好
B．样品预处理时，前者静置1
d处理除去上清液；后者需要加入清水，反复低速短时间离心洗涤，至上清液无黄色
C．在DNA粗提取实验中，往2
mol/L
氯化钠溶液中加入蒸馏水析出DNA时，应该缓慢加入，直到出现黏稠物为止
D．洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等
解析：选A 鸡血细胞有细胞核，适于提取DNA；哺乳动物成熟红细胞无细胞核和众多细胞器，适用于提取血红蛋白。提取血红蛋白的实验中，洗涤红细胞时，不能加清水，应该加入生理盐水，否则细胞提早释放出血红蛋白与杂质混合，加大提取难度。DNA初次析出时，加蒸馏水至黏稠物不再增加为止。洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白，以利于血红蛋白的分离和纯化。
12.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、电荷的性质和数量情况如右图所示。下列有关蛋白质分离的叙述正确的是( )
A．将样品装入透析袋中透析12
h，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内
B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．若将样品以2
000
r/min的速度离心10
min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中
D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远
解析：选A 透析袋可使小分子物质透过，而大分子物质不能透过，丙的相对分子质量大于乙，若乙留在袋内，则丙一定也留在袋内，故A项正确。B选项中甲相对分子质量最小，在凝胶色谱柱中移动的速度应最慢。C选项戊沉淀，甲不一定沉淀。D选项利用分子大小的差异将其分离，故相距最远的应为丙和甲。
二、非选择题(共52分)
13．(18分)下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。
(1)图中实验材料A可以是________等，研磨前加入的B应该是________。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2
mol/L的NaCl溶液的目的是____________________，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是________________________________________________________________________。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2
mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如下表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液________。
1
B液中
搅拌研磨后过滤
滤液E
2
2
mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14
mol/L的NaCl溶液中
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的95%的酒精溶液中
搅拌后过滤
滤液H
(4)DNA鉴定的原理是_______________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)用洋葱、菜花等的破碎细胞作实验材料时，加入一定量的洗涤剂和食盐，洗涤剂可以溶解细胞膜，有利于DNA的释放，食盐主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。(2)在含有DNA的滤液中，加入2
mol/L的NaCl溶液，可以使DNA溶解而杂质析出；在滤液D中加入蒸馏水，当NaCl溶液浓度0.14
mol/L时，DNA溶解度最小而被析出。(3)在滤液E中，只是除去了部分杂质，则含DNA较多；在滤液F中，除去了较多的蛋白质等，则含DNA最多；在滤液G中，因DNA析出，则含DNA较少；在滤液H中，因DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精，则含DNA最少。(4)DNA遇二苯胺(沸水浴)会被染成蓝色。
答案：(1)洋葱(菜花等) 洗涤剂和食盐
(2)使DNA溶解 使DNA(溶解度下降而沉淀)析出 (3)H (4)在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色
14．(16分)PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个拷贝的分子生物学技术。PCR需要模板DNA、引物、脱氧核糖核苷酸和DNA聚合酶等条件。下图为模板DNA分子及2种引物，请回答相关问题：
(1)PCR的全称是________。PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度环境的不同，在PCR中先用95
℃高温处理的目的是________；而这一过程中在细胞内是通过_______实现的。
(2)在PCR技术中所需要的引物实质上是一种____________。请在图中绘出引物结合的位置。
(3)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。
(4)DNA子链复制的方向是________，这是由于___________________________。
解析：PCR技术又称多聚酶链式反应，在PCR中先用95
℃高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂，两条链解开，即使DNA分子变性。引物是一种单链DNA或RNA分子，它能与解开的DNA母链的3′端结合，为DNA聚合酶提供吸附位点，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是5′端到3′端。在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，即(2×210－2)＝211－2(个)。
答案：(1)多聚酶链式反应 使DNA变性(使DNA的两条链解开) 解旋酶的催化
(2)单链DNA或RNA分子
见右图
(3)211－2 (4)5′端到3′端 DNA聚合酶只能从引物的3′端拼接单个脱氧核苷酸分子
15．(18分)某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下：
试回答下列有关问题：
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________________________________________________________________________。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是__________________________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以________(写出一种方法)。
(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的____________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知，携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是________________
________________________________________________________________________________________________________________________________。
解析：(1)洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水；根据渗透作用原理，将红细胞置于低渗溶液中，红细胞会吸水涨破，释放出血红蛋白。(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去样品中的小分子杂质；可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等
方法缩短透析时间，能尽快达到理想的透析效果。(3)由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异，在电泳过程中产生了不同的迁移速度，实现各种分子的分离。(4)根据图示可知，镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白，原因是携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，分别控制合成两种不同的蛋白质。
答案：(1)生理盐水 渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破)
(2)除去小分子杂质 增加缓冲液的量或及时更换缓冲液 (3)带电性质以及分子大小、形状
(4)2 携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质
