专题37 基因工程
讲考纲
考纲概要
考纲解读
高考真题
1．基因工程的原理及技术（Ⅱ）；2．基因工程的应用（Ⅱ）；3．蛋白质工程（Ⅰ）。
1．理解基因工程的原理及技术；2．理解基因工程在动物、植物及微生物方面的应用；3．了解蛋白质工程的基本原理。
1．2017北京卷（5）、2017新课标Ⅰ卷（38）、2017新课标Ⅲ卷（38）、2016江苏卷（33）、2016新课标Ⅲ卷（40）、2015重庆卷（6）、2016海南卷（31）2．2017新课标Ⅱ卷（38）、2016新课标Ⅰ卷（40）、2016天津卷（7）、2015福建卷（33）、2015四川卷（9）3．2015课标Ⅱ卷（40）
讲考点
考点一 基因工程的原理及技术
1．基因工程的概念
（1）供体：提供目的基因。
（2）操作环境：体外。
（3）操作水平：分子水平。
（4）原理：基因重组。
（5）受体：表达目的基因。
（6）本质：性状在受体体内的表达。
（7）优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。
2．DNA重组技术的基本工具
（1）限制性核酸内切酶（简称：限制酶）
①主要是从原核生物中分离纯化出来的。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
（2）DNA连接酶
①种类：按来源可分为E coli
DNA连接酶和T4DNA连接酶。
②作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③DNA连接酶和限制酶的关系
（3）载体
①种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
②质粒的特点：能自我复制；有一个至多个限制酶切割位点；有特殊的标记基因。
3．基因工程的操作过程
（1）基因工程的操作步骤
①获取目的基因—a.从基因文库中获取；b.利用PCR技术扩增c.通过化学方法人工合成。
②基因表达载体的构建—a.目的基因；b.启动子；c.终止子；d.标记基因。
③将目的基因导入受体细胞—a.植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法；b.动物：显微注射技术；c.微生物：感受态细胞法。
④目的基因的检测与鉴定—a.利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无；b.利用分子杂交技术检测目的基因的转录；
c.利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译；d.利用个体生物学水平的鉴定检测重组性状的表达。
【例1】（2017年北京卷，5）为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C（图1），拟将其与质粒（图2）重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是（ ）
A．用限制性核酸内切酶EcoRI和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
【答案】C
【跟踪训练1】下图是培育表达人乳铁蛋白的乳腺生物反应器的技术路线。图中tetR表示四环素抗性基因，ampR表示氨苄青霉素抗性基因，直线所示为BamH
I、HindⅢ、SmaⅠ三种限制酶的酶切位点。下列叙述错误的是（ ）
A．将人乳铁蛋白基因插入载体，需用HindⅢ和BamH
I限制酶同时酶切载体和人乳铁蛋白基因
B．筛选含有重组载体的受体细胞首先需要在含四环素的培养基上进行
C．能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是启动子等
D．进行②过程前，需要对早期胚胎进行性别鉴定
【答案】B
【解析】外源DNA分子上含有限制酶BamHⅠ、HindⅢ、SmaI的切割位点，其中限制酶SmaI的切割位点位于目的基因上，所以获取目的基因和构建基因表达载体时，应用限制酶HindⅢ和BamHⅠ，A正确；用限制酶HindⅢ和BamHⅠ切割质粒后，会破坏质粒上的四环素抗性基因，但不会破坏氨苄青霉素抗性基因，因此筛选含有重组载体的大肠杆菌首先需要在含氨苄青霉素的培养基上进行，B错误；能使人乳铁蛋白基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是启动子、终止子等，C正确；进行②胚胎移植前，需要对早期胚胎进行性别鉴定，D正确。
考点二 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
培育转基因植物和转基因动物，生产基因工程药物，进行基因治疗。
2．蛋白质工程
（1）概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因修饰或基因合成。
③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
④目的：满足人类的生产和生活的需求。
（2）操作过程：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）→基因表达→产生需要的蛋白质。
【例2】（2017年新课标Ⅱ卷，38）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是__________________________。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是__________________________。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是__________________________（答出两点即可）。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是__________________________。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是__________________________。
【答案】（1）嫩叶组织细胞易破碎
防止RNA降解
（2）在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA
（3）目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子
（4）磷酸二酯键
（5）目的基因的转录或翻译异常
【解析】（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是嫩叶组织细胞易破碎。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是防止RNA降解。
（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA。
（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是目的基因无复制原点、目的基因无表达所需启动子。
（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是磷酸二酯键。
（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是目的基因的转录或翻译异常。
【跟踪训练2】下列关于基因工程的叙述中错误的是（ ）
A．基因工程技术的成熟使人类可以定向改造生物的性状，培育新的生物品种
B．基因工程技术是唯一能冲破远源杂交不亲和障碍培育生物新品种的方法
C．基因工程的实施需要限制酶、DNA连接酶和运载体等基本工具
D．利用微生物生产人的胰岛素、某些单克隆抗体等必须先利用基因工程获得工程菌
【答案】B
讲方法
1．基因表达载体中启动子、终止子的来源
（1）如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，目的基因中已含有启动子、终止子。在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子，
（2）如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。因此，在构建基因表达载体时，需要在与质粒结合之前，在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。
2．与DNA相关的五种酶的比较
名称
作用部位
作用结果
限制酶
磷酸二酯键
将DNA切成两个片段
DNA连接酶
磷酸二酯键
将两个DNA片段连接为一个DNA分子
DNA聚合酶
磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端
DNA（水解）酶
磷酸二酯键
将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸
解旋酶
碱基对之间的氢键
将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链
3．选择限制酶的方法
（1）根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶（但要确保质粒上也有这两种酶的切点）。
（2）根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
4．蛋白质工程与基因工程
项目区别与联系
蛋白质工程
基因工程
区别
过程
预期蛋白质功能→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列
获取目的基因→构建基因表达载体→将目的基因导入受体细胞→目的基因的检测与鉴定
实质
定向改造或生产人类所需的蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品
结果
可生产自然界没有的蛋白质
只能生产自然界已有的蛋白质
联系
①蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造
讲易错
1．载体和膜载体
基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是质粒或动植物病毒等，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。
2．基因工程误区警示：
（1）一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
（2）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。
（3）标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因（表达产物为带颜色的物质）等。
（4）受体细胞常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物（大肠杆菌、酵母菌）等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌（需内质网、高尔基体的加工、分泌）；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。
（5）基因表达载体中，启动子（DNA片段）≠起始密码子（RNA）；终止子（DNA片段）≠终止密码子（RNA）。基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。专题37 基因工程
真题回放
1．（2015年广东卷，25）图9为培育转基因山羊生产人β-酪蛋白的流程图。
下列叙述正确的是（ ）
A．过程①所用的人β-酪蛋白基因可从人cDNA文库中获得
B．过程②可选用囊胚期或原肠胚期的胚胎进行移植
C．过程③可使用胚胎分割技术扩大转基因山羊群体
D．过程④人β-
酪蛋白基因在细胞质内进行转录、翻译
【答案】AC
2．（2015年北京卷，5）在应用农杆菌侵染植物叶片获得转基因植株的常规实验步骤中，不需要的是（ ）
A．用携带目的基因的农杆菌侵染植物细胞
B．用选择培养基筛法导入目的基因的细胞
C．用聚乙二醇诱导转基因细胞的原生物质融合
D．用适当比例的生长素和细胞分裂素诱导愈伤组织生芽
【答案】C
【解析】农杆菌侵染细菌是基因工程中常常用到的把目的基因导入植物细胞的方法，A正确；目的基因是否导入了细胞，需要在选择培养基上进行筛选，B正确；在农杆菌侵染植物细胞的过程中并没有涉及原生质体的融合，C错误；在植物细胞组织培养的过程中，需要调整培养基中生长素和细胞分裂素的比例，来达到对其脱分化和再分化的控制，D正确。
3．（2015年重庆卷，6）下列有关人胰岛素基因表达载体的叙述，正确的是（ ）
A．表达载体中的胰岛素基因可通过人肝细胞mRNA反转录获得
B．表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原（起）点
C．借助抗生素抗性基因可将含胰岛素基因的受体细胞筛选出来
D．启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用
【答案】C
4．（2017年新课标Ⅰ卷，38）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。回答下列问题：
（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________。
（2）若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用_______________作为载体，其原因是_____________________。
（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有_________________（答出两点即可）等优点。
（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是___________________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_________________________。
【答案】（1）基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
（2）噬菌体噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
（3）繁殖快、容易培养
（4）蛋白A的抗体
（5）DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
（3）大肠杆菌作为受体菌具有繁殖周期短、易培养。
（4）检测目的基因是否表达通常用抗原－抗体杂交技术。
（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，证明了生物的遗传物质是DNA，还为基因工程理论的建立提供了启示，这一启示是DNA可以从一种生物转移到另一种生物个体。
5．（2017年新课标Ⅲ卷，38）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
（1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_____________________________________。
（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为_____________________，加入了________________作为合成DNA的原料。
（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2
可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是__________________。
②仅根据图、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少______________（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
【答案】（1）编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子
（2）模板 dNTP
（3）①进行细胞传代培养 维持培养液是的pH
②C
6．（2016年新课标Ⅲ卷，40）图（a）中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR
I、BamH
I和Sau3A
I三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图（b）为某种表达载体示意图（载体上的EcoR
I、Sau3A
I的切点是唯一的）。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
（1）经BamH
I酶切割得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
（2）若某人利用图（b）所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图（c）所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有_________，不能表达的原因是____________。
（3）DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有____________和____________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
【答案】（1）Sau3AⅠ两种梅切割后产生的片段具有相同的黏性末端
（2）甲和丙甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录
（3）E coliDNA连接酶
T4DNA连接酶
T4DNA连接酶
灯，使转录在所需要的地方停止下来。在基因表达载体中，启动子应位于目的基因的首端，终止子应位于目的基因的尾端，这样目的基因才能表达。而图甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，两者目的基因均不能转录，所以都不能表达目的基因的产物。
（3）常见DNA连接酶的有E coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是T4DNA连接酶。
7．（2016年新课标Ⅰ卷，40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有______________（答出两点即可）。而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________；并且______________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是_____________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有是_____________的固体培养基。
（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于_____________
【答案】（1）能够自我复制、具有标记基因、具有一个至多个限制酶切割位点（答出两点即可）
（2）二者均不含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都不能生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒（或答含有重组质粒）二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
（3）受体细胞
能区分的；含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的细胞，因二者都含氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上都能生长，因此也是不能区分的。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有四环素的固体培养基；因目的基因插入后，导致四环素抗性基因（tetr）失活，含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌在该培养基中不能生长，而含有质粒载体的则能正常生长。
（3）噬菌体是专门寄生在细菌细胞中的病毒，在侵染细菌时，噬菌体的DNA进入到细菌细胞中，而蛋白质外壳仍留在细胞外；在噬菌体的DNA的指导下，利用细菌细胞中的物质来合成噬菌体的组成成分，据此可推知：基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
8．（2016年天津卷，7）人血清白蛋白（HSA）具有重要的医用价值，只能从血浆中制备。下图是以基因工程技术获取重组HSA（rHSA）的两条途径。
（1）获取HSA基因，首先需采集人的血液，提取_____________合成总cDNA，然后以cDNA为模板，采用PCR技术扩增HSA基因。下图中箭头表示一条引物结合模板的位置及扩增方向，请用箭头在方框内标出标出另一条引物的位置及扩增方向。
（2）启动子通常具有物种及组织特异性，构建在水稻胚乳细胞内特异表达rHSA的载体，需要选择的启动子是_____________（填写字母，单选）。
A.人血细胞启动子
B.水稻胚乳细胞启动子
C.大肠杆菌启动子
D.农杆菌启动子
（3）利用农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，需添加酚类物质，其目的是__________________________。
（4）人体合成的初始HSA多肽，需要经过膜系统加工形成正确的空间结构才能有活性。与途径II相比，选择途径I获取rHSA的优势是_______________________________________。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与_________________的生物学功能一致。
【答案】（1）总RNA
（或mRNA）
（2）B
（3）吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因成功转化
（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工
（5）HAS
（3）农杆菌转化水稻受体细胞的过程中，酚类物质可以吸引农杆菌移向水稻受体细胞，有利于目的基因的转移。
（4）水稻是真核生物，具有膜系统，能对初始rHSA多肽进行高效加工，而大肠杆菌是原核生物，细胞中不具有膜结构的细胞器。
（5）为证明rHSA具有医用价值，须确认rHSA与天然的HSA生物学功能一致。
模拟演练
1．（江苏省如皋市2018届高三上学期开学考试生物试题）基因工程的核心步骤必须用到的工具酶有（ ）
A．限制酶、DNA聚合酶
B．DNA聚合酶、DNA连接酶
C．限制酶、DNA连接酶
D．Taq、RNA聚合酶
【答案】C
【解析】基因工程的核心步骤是构建基因表达载体，需要用同一种限制酶将目的基因和运载体进行切割，使得它们露出相同的黏性末端，再用DNA连接酶将目的基因与运载体连接起来，构成重组质粒，故选C。
2．（辽宁省六校协作体2016-2017学年高三上学期期中考试生物试题）下列关于蛋白质工程及其应用的说法，正确的是（ ）
A．蛋白质工程能定向改造蛋白质分子结构，使之更加符合人类需要
B．蛋白质工程的实质是通过改变氨基酸的结构改变蛋白质的功能
C．当前限制蛋白质工程发展的关键因素是基因工程技术还不成熟
D．蛋白质工程技术中的操作对象是蛋白质或控制蛋白质合成的基因
【答案】A
3．．（河北省黄烨中学206-2017学年高三上学期第一次月考生物试卷）质粒是基因工程最常用的运载体，下列有关质粒的说法错误的是（ ）
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为运载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核（区）外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
【答案】A
4．（江苏省（中华中学、溧水高级中等六校2017届高三2月联考生物试题）下图表示利用细菌中抗虫基因培育抗虫玉米的过程，其中①～⑧表示操作步骤，a、b表示相关分子，c～e表示培养过程，其中d过程表示细菌与玉米细胞混合培养。下列有关叙述正确的是（ ）
A．图中需要用到限制酶的是步骤①②③
B．图中导入目的基因的是步骤④
C．步骤⑤的主要目的是扩增目的基因
D．脱分化和再分化的步骤分别是⑦和⑧
【答案】C
【解析】①表示目的基因的获取，需要用到限制酶，②切割质粒产生黏性末端的过程，也需要用到限制酶，而步骤③需要用DNA连接酶，A错误；图示将目的基因导入受体细胞（玉米细胞）的方法是农杆菌转化法，即图中步骤④⑤⑥，B错误；步骤⑤是通过农杆菌的繁殖来扩增目的基因，C正确；步骤⑦表示植物组织培养过程，包括脱分化和再分化两个过程；⑧表示植物的生长发育过程，D错误。
5．（江苏省泰安市长城中学2016-2017学年高三上学期月考生物试题）人外周血单核细胞能合成白介素2（IL～2）。该蛋白可增强机体免疫功能，但在体内易被降解。研究人员将IL－2基因与人血清白蛋白（HSA）基因拼接成一个融合基因，并在酵母菌中表达，获得具有IL－2生理功能、且不易降解的IL－2－HSA融合蛋白。其技术流程如图。请回答下列问题。
（1）培养人外周血单核细胞的适宜温度为________℃；图中②表示________过程。
（2）表达载体1中的位点________，应为限制酶BglⅡ的识别位点，才能成功构建表达载体2。
（3）表达载体2导入酵母菌后，融合基因转录出的mRNA中，与IL－2蛋白对应的碱基序列不能含有________（起始、终止）密码子，才能成功表达出IL－2－HSA融合蛋白。
（4）应用____________杂交技术可检测酵母菌是否表达出IL－2－HSA融合蛋白。
【答案】（1）37（或36.5±0.5） 反（或逆）转录
（2）a
（3）终止
（4）抗原—抗体
（3）mRNA中如果含有终止密码子，则会导致翻译终止，不能合成出目的蛋白。
（4）抗原、抗体的结合具有特异性，抗原—抗体杂交技术可以迅速检测出酵母菌是否表达出IL－2－HSA融合蛋白。
创新预测
1．下列关于基因工程中有关酶的叙述不正确的是（ ）
A．限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA
B．DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接
C．DNA聚合酶能够从引物末端延伸DNA或RNA
D．逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA
【答案】C
【解析】DNA聚合酶只能从引物末端延伸DNA而不能延伸RNA；限制酶水解相邻核苷酸间的化学键打断DNA；DNA连接酶可将末端碱基互补的两个DNA片段连接；逆转录酶以一条RNA为模板合成互补的DNA。
2．下面图1为某植物育种流程，图2表示利用农杆菌转化法获得某种转基因植物的部分操作步骤。下列相关叙述错误的是（ ）
A．图1子代Ⅰ与原种保持遗传稳定性，子代Ⅱ和子代Ⅲ选育原理相同
B．图1子代Ⅲ选育显性性状需自交多代，子代Ⅴ可能发生基因突变和染色体变异
C．图2中①过程的完成需要限制酶和DNA连接酶的参与
D．图2中⑥可与多个核糖体结合，并可以同时翻译出多种蛋白质
【答案】D
3．对基因进行编辑是生物学研究的重要手段，如图是对某生物B基因进行定点编辑的过程，该过程中用sgRNA可指引限制性核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点，相关说法正确的是（ ）
A．通过破坏B基因后生物体的功能变化可推测B基因的功能
B．基因定点编辑前需要设计与靶基因全部序列完全配对的sgRNA
C．限制性核酸内切酶09可断裂核糖核苷酸之间的化学键
D．被编辑后的B基因由于不能转录而无法表达相关蛋白质
【答案】A
【解析】用sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点并进行切割，进而将基因Ⅱ切除，连接基因Ⅰ和Ⅲ，形成新的B基因。A、通过破坏B基因后生物体的功能变化可推测B基因的功能，A正确；sgRNA可指引核酸内切酶Cas9结合到特定的切割位点，因此基因定点编辑前需要设计与被切割基因两端碱基序列配对的sgRNA，B错误；核酸内切酶Cas9可断裂脱氧核糖核苷酸之间的化学键--磷酸二酯键，C错误；被编辑后的B基因仍能进行转录，D错误。
4．玫瑰有5000多年的人工栽培历史，迄今已培育出2500多个品种。玫瑰没有生成蓝色翠雀花素所需的“黄酮类化合物3，5—氢氧化酶”的基因，因此蓝玫瑰被认为是不可能培育成功的。但日本科研人员将蓝三叶草中的蓝色素基因植入普通玫瑰而成功培育出了蓝玫瑰，这株玫瑰的花瓣中所含的色素为蓝色。下列有关叙述正确的是（ ）
A．蓝色翠雀花素分布于蓝玫瑰花瓣细胞的液泡和叶绿体中
B．培育蓝玫瑰用到的工具酶是限制性内切酶和DNA连接酶
C．蓝色素基因在所有玫瑰细胞中都能控制合成蓝色翠雀花素
D．蓝玫瑰的培育成功意味着人类创造了一个新的物种
【答案】B
5．白细胞介素是一类淋巴因子。研究人员将人白细胞介素的基因导入到酵母细胞中，使其分泌出有活性的白细胞介素。
（1）为增加白细胞介素基因的数量，可使用_____________________技术，但前提是必须知道基因的已知序列，目的是__________________________________________。
（2）在重组载体导入酵母菌细胞之前，需用_____________________处理酵母菌，白细胞介素基因进入酵母菌细胞内，并且在其细胞内维持稳定和表达的过程，称为_____________________。在表达过程中，启动子需与_____________________识别和结合，从而驱动转录过程。
（3）在体液免疫过程中，白细胞介素是由_____________________细胞分泌的，为了能成功表达出白细胞介素，不使用细菌，而使用酵母细胞作为受体细胞，可能原因是_____________________。
（4）在分泌型表达载体和白细胞介素基因所在的DNA分子上均有多个限制酶的酶切位点，图示过程获得有效表达的重组栽体使用了EcoRl和EcoR52两种限制酶，比使用单一的限制酶，其优点是____________。
【答案】（1）PCR 设计引物
（2）Ca2+ 转化 RNA聚合酶
（3）T淋巴 细菌细胞中无内质网和高尔基体等加工白细胞介素的细胞器
（4）防止目的基因、表达载体发生自身环化或者防止目的基因反向接入到分泌型表达载体中
（3）在体液免疫过程中，白细胞介素是由T淋巴细胞分泌的；由于细菌属于原核生物，细胞中无内质网和高尔基体等加工白细胞介素的细胞器，因此为了能成功表达出白细胞介素，不使用细菌，而使用酵母细胞作为受体细胞。
（4）在分泌型表达载体和白细胞介素基因所在的DNA分子上均有多个限制酶的酶切位点，图示过程获得有效表达的重组栽体使用了EcoRl和EcoR52两种限制酶，比使用单一的限制酶，其优点是防止目的基因、表达载体发生自身环化或者防止目的基因反向接入到分泌型表达载体中。专题37 基因工程
一、选择题（10小题，每小题5分，共50分）
1．质粒是基因工程最常用的运载体，下列有关质粒的说法错误的是（ ）
A．质粒不仅存在于细菌中，某些病毒也具有
B．质粒作为运载体时，应具有标记基因和多个限制酶切点
C．质粒为小型环状DNA分子，存在于拟核（区）外的细胞质基质中
D．质粒能够在宿主细胞中稳定保存，并在宿主细胞内复制
【答案】A
2．下图为利用转基因技术将控制人α－抗胰蛋白酶基因导入受体细胞，最终培育出能在乳腺细胞表达人α－抗胰蛋白酶的转基因羊的过程简图，图中GEP基因为绿色荧光蛋白基因。下列相关叙述错误的是（ ）
A．α—抗胰蛋白酶基因和GEP基因的基本组成单位相同
B．GEP基因可作为标记基因
C．图中受体细胞为羊的乳腺细胞
D．可用显微注射法将重组质粒导入受体细胞
【答案】C
【解析】α—抗胰蛋白酶基因和GEP基因的基本组成单位均是脱氧核苷酸，A项正确；GEP基因可作为标记基因，用于检测目的基因是否进入受体细胞，B项正确；培育转基因动物应把基因表达载体转入受精卵，C项错误；可用显微注射法将重组质粒导入受体细胞，D项正确。
3．第三代疫苗——DNA疫苗是指将编码保护性抗原蛋白的基因插入到适宜的质粒中得到的重组DNA分子，将其导入人体内，在人体细胞内表达的产物可直接诱导机体免疫反应，且可持续一段时间。下列有关DNA疫苗的叙述，正确的是（ ）
A．表达产物不是抗原
B．DNA疫苗生产过程不需要DNA解旋酶和限制酶
C．抗原基因在体内表达时不需要RNA聚合酶
D．DNA疫苗的特异性与碱基种类无关
【答案】D
4．下图是利用基因工程技术生产可食用疫苗的部分过程，其中PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ为四种限制性核酸内切酶。下列有关说法中正确的是（ ）
A．图示过程是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶均来自原核生物
B．图示中构建基因表达载体时，需要用到一种限制性核酸内切酶
C．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
D．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
【答案】D
【解析】图示表示基因表达载体的构建过程，这是基因工程的核心步骤，所需的限制性核酸内切酶一般来自原核生物，A错误；此表达载体构建时需要用到EcoRⅠ、PstⅠ限制性核酸内切酶，B错误；限制酶具有特异性，即一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列并在特定的位点切割，C错误；抗卡那霉素基因作为标记基因，主要作用是筛选含有目的基因的受体细胞，D正确。
5．根据某基因上游和下游的碱基序列，设计合成了用于该基因PCR的两段引物（单链
DNA）。引物与该基因变性DNA（单链DNA）结合为双链DNA的过程称为复性。下图是两引物的Tm（引物熔解温度，即50%的引物与其互补序列形成双链DNA分子时的温度）测定结果，下列叙述错误的是（ ）
A．通常引物1和引物2不能有碱基互补配对关系
B．两引物分别是子链延伸的起点，并可以反复利用
C．若两引物的脱氧核苷酸数相同，推测引物2的GC含量较高
D．复性所需温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度等因素
【答案】B
6．下列关于目的基因的获取的叙述，正确的是（ ）
A．其有调控作用的DNA片段不能是目的基因
B．通过人工合成法合成未知序列的目的基因
C．从基因文库中只能获取原核生物的基因
D．利用PCR技术扩增目的基因时需要引物协肋
【答案】D
【解析】目的基因是指编码蛋白质的结构基因，可以是具有调控作用的基因，A错误；目的基因可以从自然界中已有的物种中分离出来，也可以通过人工合成法合成已知序列的目的基因，B错误；从基因文库中可以获取原核生物的基因，也可以获得真核生物的基因，C错误；利用PCR技术扩增目的基因时需要两种不同的引物协肋，D正确。
7．抗菌肽对治疗癌症有一定的作用，下图表示抗菌肽合成过程。相关说法正确的是（ ）
A．用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶
B．基因表达载体包含起始密码和终止密码
C．用显微注射法导入基因表达载体
D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质
【答案】A
【解析】PCR技术中采用的是高温变性，因此用PCR克隆目的基因不需要DNA解旋酶，A正确；基因表达载体包含启动子和终止子，而起始密码和终止密码在mRNA上，B错误；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法，C错误；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质，D错误。
8．科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶主要蛋白。以下有关基因工程的叙述，不正确的是（ ）
A．基因工程至少需要两种工具酶，即限制性核酸内切酶和DNA酶
B．作为目的基因的载体，要有一至多个限制酶切割位点，并能在宿主细胞中正常复制
C．将目的基因导人不同类型宿主细胞的方法会有所不同
D．目的基因会因需求不同而不同，载体也会根据实际需要而有所不同
【答案】A
9．科研人员先分别PCR扩增尿酸酶基因和原核生物胞外蛋白信号肽基因（编码的肽链能引导新合成的蛋白质转移、分泌），再将它们拼接形成融合基因，并导入大肠杆菌生产尿酸酶。相关叙述正确的是（ ）
A．扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两类基因的拼接方向
B．构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外
C．融合基因导入大肠杆菌前需构建基因表达载体，以保证目的基因正常表达和遗传
D．在导入融合基因前，应先用NaCl处理大肠杆菌，使其变为感受态细胞
【答案】ABC
【解析】扩增两类基因时可以通过设计引物来控制两类基因的拼接方向，A项正确；构建融合基因的目的是使大肠杆菌能合成尿酸酶并分泌到细胞外，B项正确；融合基因导入大肠杆菌前需构建基因表达载体，以保证目的基因正常表达和遗传，C项正确；在导入融合基因前，应先用CaCl处理大肠杆菌，使其变为感受态细胞，D项错误。
10．小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因（目的基因）后再重组表达．下列相关叙述正确的是（ ）
A．设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B．用PCR方法扩增目的基因时必须知道基因的全部序列
C．PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D．一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
【答案】D
二、非选择题（5小题，共50分）
11．干扰素基因缺失的个体免疫力严重下降。科学家利用胚胎干细胞（ES细胞）对干扰素基因缺失的患者进行基因治疗。请回答下列问题：
（1）胚胎干细胞可由囊胚的_______细胞分离培养获得，在饲养层细胞上能够维持_________的状态。
（2）利用PCR技术扩增干扰素基因时，需在______________________酶的作用下进行。PCR技术主要利用了______________的原理。
（3）将经过修饰的腺病毒与干扰素基因重组形成的_______________转移到ES细胞中，筛选出成功转移的细胞进行扩增培养。对改造后的ES细胞进行培养的过程中，为了防止污染，可在培养基中添加一定量的______________________。
（4）有人得到如图所示的含有目的基因的表达载体，但其不能在宿主细胞中表达目的基因产物，分析目的基因不能表达的原因是__________________。
（5）由于干扰素很难在体外保存，为解决这一问题，可利用蛋白质工程对干扰素进行改造，基本途径是：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质的结构→推测应有的____________→找到对应的脱氧核苷酸序列。
【答案】（1）内细胞团 不分化
（2）耐高温DNA聚合（或Taq或热稳定DNA聚合） DNA双链复制
（3）基因表达载体 抗生素
（4）目的基因插入在终止子的下游，目的基因不能被转录
（5）氨基酸序列
（4）根据以上分析已知，由于目的基因插入在终止子的下游，目的基因不能被转录。
（5）蛋白质工程属于第二代基因工程，其基本途径是：预期蛋白质功能→设计预期蛋白质的结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列。
12．科学家尝试使用Cre/loxP位点特异性重组系统，在检测目的基因导入成功后，删除转基因烟草细胞内的抗除草剂基因。其技术过程如下（图中的■代表基因前的启动子），据图回答：
（1）loxP是一种只有34个碱基对构成的小型DNA片段，是有两个13个喊基对反向重复序列和中间间隔的8个碱基对序列共同组成，自身不会表达，插入质粒后也不影响原有基因的表达，其碱基序列如下：
Cre酶能特异性地识别此序列并在箭头处切开loxP，其功能类似于基因工程中的_____________酶。从遗传学角度分析，Cre酶改变质粒产生的结果相当于可遗传变异中的_____________。
（2）将重组质粒导入到植物细胞中最常用的方法是_______________________。基因表达载体的基本元素有_____________、_____________、_____________和_____________。作为标记基因，抗除草剂基因用于检测目的基因是否导入成功的原因是_____________。
（3）经检测成功后，抗除草剂基因己没有用途，继续留在植物体内可能会造成的安全问题是________。经Cre酶处理后，质粒中的两个loxP序列分别被切开后，可得到如上图右侧的这两个DNA分子。由于_____的原因，抗除草剂基因不再表达，之后会在培养过程中消失。
【答案】（1）限制酶 基因重组
（2）农杆菌转化法 启动子 目的基因 终止子 标记基因 抗除草剂基因和目的基因在同一个质粒上
（3）抗除草剂基因可能转移到杂草中 抗除草剂基因前没有了启动子
（1）Cre酶可以切割3，5-磷酸二酯键，将DNA分子切割成若干片段，功能类似于限制性核酸内切酶（限制酶）。Cre酶改变质粒的方式是将DNA链断裂，再重新组合连接，形成新的DNA分子，相当于基因重组。
（2）将重组质粒导入细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法等，其中导入到植物细胞最常用的方法是农杆菌转化法。基因表达载体的基本组成部件（元素）有启动子、目的基因、终止子和标记基因。抗除草剂基因可以作为标记基因，检测目的基因是否导入成功，是因为抗除草剂基因与目的基因在同一个质粒上，两者一起表达。如果表现出抗除草剂性状，则说明目的基因成功导入。
（3）抗除草剂基因如果留在植物体内，可能传播、重组到杂草DNA中，导致杂草抗除草剂，难以清除。由图可知，质粒二中缺少启动子，抗除草剂基因无法正常表达。
13．近30年来，我国患糖尿病的人数的增长极为迅速，这不仅与人们不健康的生活方式有关，也与患者体内胰岛素的缺乏有关。生产速效胰岛素以及利用转基因技术实现胰岛素的批量生产就成为了目前糖尿病治疗的新思路，请回答下列相关问题：
（1）速效胰岛素是科学家将胰岛素B链的第28个和第29个氨基酸调换顺序后获得的。该过程中，需要对__________（填“胰岛素”“胰岛素基因”或“胰岛”）进行定向改造。
（2）利用基因工程技术实现胰岛素的批量生产的过程中，关键操作环节是____________________。
（3）对于胰岛素基因的获取，一是通过提取____________细胞中的胰岛素mRNA，经过__________过程合成，之后通过________技术大量扩增；二是通过分析胰岛素的________序列，进行人工合成。
（4）为了将改造后的分子顺利导入大肠杆菌体内，一般需要用____________处理大肠杆菌，使之成为________细胞。
【答案】（1）胰岛素基因
（2）基因表达载体的构建
（3）胰岛B 反转录 PCR 氨基酸
（4）CaCl2 感受态
（3）对于胰岛素基因（目的基因）的获取，一是通过提取胰岛B细胞中的胰岛素mRNA，经过反转录过程合成，之后通过PCR技术大量扩增；二是通过分析胰岛素的氨基酸序列，进行人工合成。
（4）为了将改造后的分子顺利导入大肠杆菌体内，一般需要用CaCl2处理大肠杆菌，使之成为感受态细胞，易于吸收目的基因。
14．黄曲霉毒素B1
（AFB1）存在于被黄曲霉菌污染的饲料中，它可以通过食物链进入动物体内并蓄积，引起瘤变。某些微生物能合成AFB1解毒酶。将该酶添加在饲料中可以降解AFB1，清除其毒性。下图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程图。
请回答：
（1）基因工程常见的运载工具（体）有___________________。将目的基因导入酵母细胞，最常用的化学方法是______________。
（2）酵母细胞导入AFB1解毒酶基因后，采用______________技术，检测到AFB1解毒酶基因存在酵母细胞内。实验发现酵母菌中没有检测到合成的AFB1解毒酶，分析原因可能是______________。
（3）采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是:从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的__________________________________。
（4）生态工程需遵循其基本原理，系统整体性原理强调各组分之间要有______________，只有这样地才能顺利完成能量、物质、信息等的转换和流通，并且实现___________________。
【答案】（1）质粒、噬菌体衍生物、动植物病毒 CaCl2处理
（2）DNA分子杂交技术 酵母细胞中AFB1解毒酶基因没有表达（或没有转录和翻译）
（3）脱氧核苷酸序列
（4）适当的比例 总体功能大于部分之和的效果（或“1+1>2”）
（3）采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列。
（4）生态系统的系统整体性原理强调各组分之间要有适当的比例，只有这样地才能顺利完成能量、物质、信息等的转换和流通，并且实现总体功能大于部分之和的效果。
15．内皮素（ET）是一种含21个氨基酸的多肽，与高血压、糖尿病、癌症等有着密切联系。研究发现内皮素功能异常与内皮素主要受体ETA有关，科研人员通过构建表达载体，实现了ETA基因在细胞中高效表达。其过程如下（图中SNAP基因是一种荧光蛋白基因，限制酶ApaⅠ的识别序列为CCC＇GGG，限制酶XhoI的识别序列为C＇TCGAG）。据图回答下列问题：
（1）图中ETA基因能够在大肠杆菌细胞内表达的原因是____________。
（2）过程①中需要用___________酶处理，过程③中，用两种限制酶切割，获得不同的黏性末端，其主要目的是____________。
（3）图中的基因表达载体至少还缺少__________，鉴定ETA基因是否导入受体细胞需要用放射性同位素或荧光分子标记的____________作探针。
（4）已知荧光显微镜可以通过检测荧光的强度来判断SNAP基因是否表达及表达量。因此，利用SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，目的是__________________________________。
【答案】（1）所有生物共用一套遗传密码
（2）逆转录 使目的基因定向连接到载体上（避免目的基因及载体的任意连接）
（3）终止子 ETA基因
（4）检测ETA基因能否表达及表达量
（3）图中重组质粒即基因表达载体的组成包括：ETA基因（目的基因）、氨苄青霉素抗性基因（标记基因）、启动子，因此至少还缺少终止子。鉴定ETA基因是否导入受体细胞需要用放射性同位素或荧光分子标记的ETA基因作探针。
（4）
SNAP基因的表达产物是一种荧光蛋白，因此将SNAP基因与ETA基因结合构成融合基因，其目的是有利于检测ETA基因能否表达及表达量。
