专题2 微生物的培养与应用
知识系统构建
必背要语
1.实验室常用煮沸消毒法、巴氏消毒法和使用紫外线或化学药剂进行消毒，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。
2.微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。长期保存菌种可以采用甘油管藏法。
3.稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比实际活菌数目低。
4.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的选择培养基分离该细菌。
5.鉴定分解尿素的细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。
6.纤维素酶的作用是：纤维素纤维二糖葡萄糖。
7.刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
规律方法整合
整合一 常见的消毒灭菌方法比较
方法
操作过程
应用范围
煮沸消毒法
100 ℃煮沸5～6 min
日常生活中广泛使用
巴氏消毒法
在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温消毒的液体
化学药剂
消毒法
用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏水喷洒等
用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒，空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
紫外线
消毒法
30 W紫外灯照射30 min
接种室空间消毒
灼烧灭菌法
酒精灯火焰灼烧
微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或锥形瓶口等
干热灭菌法
干热灭菌箱160～170 ℃加热1～2 h
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸汽
灭菌法
100 kPa、121 ℃维持15～30 min
培养基及多种器材、物品
例1 下列有关微生物培养与应用的说法，正确的是( )
A.天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基
B.接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理
C.大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段
D.分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源
答案 C
解析 天然培养基是成分不明确的培养基，并不是不需加工配制的培养基；实验操作者的双手需进行消毒处理；分离分解尿素的细菌时，尿素是唯一氮源但不是唯一的碳源。
例2 微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，以防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是( )
①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢 ②接种操作要在酒精灯火焰附近进行 ③家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 ④培养基要进行高压蒸汽灭菌 ⑤加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
A.① B.②③ C.③④ D.③⑤
答案 D
解析 无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中的杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故③⑤操作错误。
整合二 微生物的纯化培养技术
1.技术流程
2.流程解读
(1)无菌技术：主要指消毒和灭菌，实验中对操作者和操作空间进行消毒，对实验用具和培养基进行灭菌。实验过程中严格遵循无菌技术。
(2)倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
(3)平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，培养后获得由单个菌体繁殖形成的菌落，从而实现菌种的纯化培养。
(4)稀释涂布平板法：先将菌液进行系列梯度稀释后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落，实现菌种的纯化培养。
易错易混 (1(自然界中多种微生物混杂在一起，研究菌种时需要将它们分离开来，微生物的纯化培养技术实现了菌种的分离。
(2(平板划线法操作简单，常用于微生物的分离；稀释涂布平板法操作复杂，稀释度足够高时，培养基上生长的菌落大都是由单个细菌形成的，除用于微生物的分离外，还可进行细菌的计数。
例3 1943年，曾获诺贝尔生理学或医学奖的美国科学家鲁里亚和德尔布吕克设计实验，研究大肠杆菌的抗噬菌体突变是发生在接触噬菌体之前还是之后。请阅读以下资料回答下列问题：
培养皿中培养基的基本配方：
配方
蛋白胨
乳糖
KH2PO4
水
琼脂
20%伊红水溶液
0.325%美蓝水溶液
pH
含量
10 g
10 g
2 g
1 000 mL
25 g
20 mL
20 mL
7.2～7.4
(1)在培养基中加噬菌体的作用是 ；加伊红与美蓝的目的是 。
(2)由于大肠杆菌的同化作用类型是 ，因此，在培养基中还加入了一些相应的物质，其中 是大肠杆菌生长的主要碳源， 是氮源。
(3)从生态学的角度看，噬菌体与大肠杆菌这两种生物之间的关系是 。
(4)该实验有两个假设：
假设一：大肠杆菌的抗噬菌体突变发生在大肠杆菌与噬菌体接触之前。
假设二：大肠杆菌的抗噬菌体突变发生在大肠杆菌与噬菌体接触之后。
你认为图中的实验结果支持上述哪个假设： ，如果另一个假设成立的话，实验结果应该是：
。
(5)在这个实验设计中，研究者根据培养皿中菌落数的差异推断，从而证明假设的成立。请你分析出现A4和A5实验结果的原因：
。
答案 (1)选择具有抗噬菌体突变的大肠杆菌 便于识别大肠杆菌菌落 (2)异养型 乳糖 蛋白胨 (3)寄生 (4)假设一 A、B两组所有培养基中菌落数没有显著差异 (5)抗噬菌体变异发生的时间A5比A4早，具有抗噬菌体突变的大肠杆菌数较多，培养皿中出现的菌落数就多
解析 噬菌体与大肠杆菌的关系为寄生，有些大肠杆菌对噬菌体具有抗性，利用加噬菌体的培养基将其筛选出来。伊红美蓝培养基用于特异性鉴别大肠杆菌，其在此培养基上的菌落呈深紫色。大肠杆菌的同化作用类型为异养型，所以培养基中加了乳糖等含碳有机物。由于生物的变异具有不定向性，且通过图示可以看出，将A试管中10 mL菌液先均分到50支试管中再培养24 h以后涂布到50个含噬菌体的平板上，菌落数有了明显差异，说明抗性发生了差异；B试管中10 mL菌液先一起培养24 h后再均分为50份分别涂布，结果各培养基菌落数相当，则说明假设一成立。若假设二成立，则A、B两组所有培养基中菌落数应无显著差异。通过培养基上菌落差异，可以推断出大肠杆菌抗噬菌体变异时间的早晚。A5菌落数为103，A4为7，说明A5变异时间早，经过大量的繁殖，具有抗性的个体远远多于A4。
整合三 有关分解尿素的细菌和纤维素分解菌的比较
1.对比分析尿素分解菌和纤维素分解菌的分离和鉴定
尿素分解菌的分离
纤维素分解菌的分离
原理
提供有利于目的菌株生长的条件(如营养、温度、pH等)，同时抑制其他微生物的生长，常用选择培养基筛选
过程
土壤取样→样品稀释→培养与观察
土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布于含刚果红(CR)鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落→进一步鉴定
鉴定
酚红指示剂(变红)
刚果红(产生透明圈)
培养基
选择培养基：固体培养基，尿素为唯一氮源
选择培养基：液体，富含纤维素
鉴别培养基：固体，加入刚果红
2.分解尿素的细菌和纤维素分解菌的分离流程比较
分离流程
分解尿素的细菌
纤维素分解菌
土壤取样
选择富含有机质的土壤
选择富含纤维素的环境
选择培养
不进行选择培养
液体选择培养基，增加纤维素分解菌的浓度
梯度稀释
梯度稀释到104、105、106倍
梯度稀释101～106倍
涂布平板
涂布到选择培养基
涂布到鉴别培养基
菌种鉴定
培养基中加入酚红指示剂
培养基中加入刚果红染色剂
例4 下列关于尿素分解菌和纤维素分解菌的分离的叙述中，错误的是( )
A.前者需要以尿素为唯一的氮源，后者需要以纤维素为唯一的碳源
B.尿素分解菌能产生脲酶，纤维素分解菌能产生纤维素酶
C.两个过程中都需要梯度稀释
D.刚果红染色法也可以用于鉴定尿素分解菌
答案 D
解析 两种细菌的分离都用到选择培养基，分离尿素分解菌的培养基以尿素为唯一氮源，分离纤维素分解菌的培养基以纤维素为唯一碳源，A正确；两种细菌分别产生脲酶和纤维素酶，B正确；由于在样品中细菌的浓度较大，所以都要进行梯度稀释，C正确；刚果红染色法仅能用于纤维素分解菌的鉴定，D错误。
热点考题集训
1.在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入10%NaCl溶液。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( )
A.金黄色葡萄球菌、硝化细菌、放线菌
B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C.霉菌、固氮细菌、金黄色葡萄球菌
D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
答案 C
解析 青霉素可以抑制细菌和放线菌，在添加青霉素的选择培养基上可以筛选分离真菌；在缺乏氮源的培养基上可以筛选分离固氮微生物；加入10%NaCl溶液的培养基可以筛选分离金黄色葡萄球菌，C项正确。
2.3个培养皿中分别加入10 mL不同成分的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36小时后，计数菌落数，结果如下表。下列选项不正确的是( )
培养皿
培养基成分
菌落数
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A.该实验采用的是固体平板培养基
B.该实验采用稀释涂布平板法接种
C.Ⅰ和Ⅱ对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子
D.Ⅱ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长需要糖类
答案 C
解析 培养基中添加了琼脂且能观察到菌落，因此本实验采用的是固体平板培养基，A项正确。对大肠杆菌进行菌落计数用的是稀释涂布平板法，B项正确。Ⅰ和Ⅱ对照，Ⅰ中菌落数比较少，说明生长因子能促进大肠杆菌的生长，C项不正确。Ⅱ和Ⅲ对照，缺少葡萄糖的培养基中大肠杆菌不能生长，说明大肠杆菌的生长需要糖类，D项正确。
3.平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法，下列描述正确的是( )
A.都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作
C.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D.都会在培养基表面形成单个菌落
答案 D
解析 平板划线法不需要进行梯度稀释，稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面。平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落。
4.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
答案 A
解析 要想分离尿素分解菌，应把尿素作为培养基中的唯一氮源。而B项中无氮源，C项中无碳源，D项中牛肉膏、蛋白胨都可以作为氮源。
5.淀粉酶可通过微生物发酵生产获得，生产菌株在含有淀粉的固体培养基上可释放淀粉酶分解淀粉，在菌落周围形成透明圈。为了提高酶的产量，研究人员欲利用诱变育种的方法获得能产生较多淀粉酶的菌株。下列实验步骤中不正确的是( )
A.将生产菌株分为两组，实验组用一定剂量的诱变剂处理，对照组不处理
B.制备含水、淀粉、氮源和无机盐等成分的固体培养基，并进行灭菌处理
C.把实验组的菌株接种于多个配制好的培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养
D.观察两组菌株的菌落周围是否出现透明圈，选出有透明圈的菌株即为所需菌株
答案 D
解析 利用诱变育种的方法获得能产生较多淀粉酶的菌株，需要设置对照实验，实验组用诱变剂处理，对照组不处理，从而选出淀粉酶产量高的菌株，A项正确；筛选菌株需要将菌种接种到固体培养基上，培养基需在接种前进行灭菌处理，B项正确；为保证实验结果可靠、可信，要进行重复实验，即将菌种接种在多个培养基上，C项正确；产淀粉酶的菌株在菌落周围都形成透明圈，而产量高的菌株形成的透明圈大，因此应选择透明圈大的菌株进行培养。
6.现有两种固体培养基，已知其配制时所加的成分和含量如下表，用这两种培养基分别去分离土壤中的两种微生物，你认为它们适于分离( )
成分
KH2PO4
MgSO4·7H2O
NaCl
CaSO4·2H2O
CaCO3
葡萄糖
纯淀粉
甲培养基
0.02%
0.02%
0.02%
0.01%
0.5%
0.5%
2%
乙培养基
0.02%
0.02%
0.02%
0.01%
0.5%
－
－
A.甲培养基适于分离自养型自生固氮菌；乙培养基适于分离异养型自生固氮菌
B.甲培养基适于分离异养型自生固氮菌；乙培养基适于分离自养型自生固氮菌
C.甲培养基适于分离酵母菌；乙培养基适于分离真菌
D.甲培养基适于分离自养型共生固氮菌；乙培养基适于分离异养型共生固氮菌
答案 B
解析 固氮菌中能独立生存的是自生固氮菌。甲培养基中含有有机碳源(葡萄糖和淀粉)，无氮源，由此推出该培养基适于分离异养型的自生固氮菌；乙培养基中不含碳源，也不含氮源，所以可用来分离自养型的自生固氮菌。
7.下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关的叙述中不正确的是( )
A.实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基
B.图中Ⅰ、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释
C.统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数
D.在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型
答案 B
解析 该实验的目的是从土壤中分离能分解对羟基苯甲酸的微生物，所以使用的培养基为选择培养基，A项正确。图中Ⅰ、Ⅱ过程为选择培养，目的是增大所分离的微生物的浓度，B项错误。⑤处的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是一个或多个活菌繁殖后形成一个菌落，C项正确。所分离的微生物利用现成的有机物生长繁殖，所以该微生物的同化作用类型为异养型，D项正确。
8.焦化厂活性污泥中富含难降解的有机物苯甲酰肼，是当前焦化行业环保治理的难题。某同学通过查阅资料发现可通过细菌生物降解方法处理焦化厂污染物。下列有关分析错误的是( )
A.配制以苯甲酰肼作为唯一碳源的选择培养基进行筛选
B.利用平板划线法可以对初步筛选出的目的菌进行纯化
C.逐步提高培养基中苯甲酰肼的浓度可以得到高效降解污染物的优质菌株
D.应该从农田土壤中筛选目的菌
答案 D
9.有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。
(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、 四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其目的是 。
(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是 。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有 。
(3)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是 ，该实验设计是否合理？为什么？ 。
答案 (1)氮源和无机盐 使能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖 (2)接种环 ①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始
(3)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 不合理，缺少空白对照
解析 (1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，该实验的目的是探索其降解机制，因此，需要从土壤中分离出有降解苯磺隆能力的微生物，故选择培养时为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。
(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。划线的平板培养后，发现第一划线区域的划线上不间断地长满了菌落，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，而其他划线上有菌落。造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域第一条线时未从第一区域末端开始。
(3)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件相同的空白对照。
10.2015年与我国女科学家屠呦呦平分诺贝尔生理学或医学奖的是爱尔兰科学家威廉·坎贝尔和日本药物科学博士大村智，他们二人的贡献是发现了一种新的药物，名为阿维菌素，其衍生产品降低了河盲症和淋巴丝虫病的发病率，同时还能有效对抗其他寄生虫病，治疗效果显著。大村智从土壤样品中分离链霉菌的新菌株，在实验室内通过成千上万链霉菌培养物筛选出一些较有发展前途的菌株，这就是阿维菌素的来源。请回答下列问题：
(1)制备链霉菌培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是 和灭菌，对培养基进行灭菌的常用方法是 。倒平板时要待平板冷凝后，将平板倒置，其主要原因是 。
(2)图①的接种方法是将聚集的菌种进行 后，分散到培养基的表面。在培养基上接种时接种环需通过灼烧灭菌，完成图中划线操作，共需要灼烧接种环 次。图②表示的是用 法接种培养后得到的结果。
(3)在纯化过程中，在固体培养基上划线分离后，经培养，在划线的末端出现 ，表明目的菌已分离纯化。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液的 的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。
答案 (1)调节pH 高压蒸汽灭菌法 防止培养皿盖上的冷凝水珠落入培养基造成污染，并防止培养基水分过快地挥发
(2)逐步稀释 4 稀释涂布平板
(3)不连续单个菌落
(4)溶解氧 营养物质
第4课时 微生物的实验室培养(一)
[学习导航] 1.阅读教材P14“(一)培养基”，掌握培养基的作用、分类及营养成分。2.阅读教材P15“(二)无菌技术”，区分消毒和灭菌，掌握不同物品的灭菌方法。
[重难点击] 1.了解培养基的基本知识。2.学会无菌操作的基本知识。
一、培养基
1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.种类
3.成分
(1)主要成分：水、碳源、氮源、无机盐。
(2)其他成分：还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
(3)填表完成牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
培养基组分
提供的主要营养
牛肉膏
碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨
碳源、氮源和维生素
NaCl
无机盐
H2O
氢元素、氧元素
(4)某些微生物生长还需要特殊的条件，填表完成培养下列微生物时所需要的特殊条件
培养的微生物
需要满足的其他要求
乳酸杆菌
培养基中添加维生素
霉菌
将pH调至酸性
细菌
将pH调至中性或微碱性
厌氧微生物
需要提供无氧条件
1.培养基的成分与作用
(1)试根据微生物的同化作用类型将微生物进行分类。
答案 分为自养型微生物和异养型微生物。
(2)试从碳源和氮源的角度分析不同类型的微生物所需的培养基成分的特点。
自养型微生物
异养型微生物
碳源
CO2、NaHCO3等无机物
糖类等有机物
氮源
NH3、硝酸盐等无机物
尿素、蛋白质等有机物
2.牛肉膏蛋白胨培养基
(1)牛肉膏蛋白胨培养基中提供碳源和氮源的物质各是什么？
答案 牛肉膏和蛋白胨都可以为微生物提供碳源和氮源。
(2)牛肉膏蛋白胨培养基中主要提供碳源和主要提供氮源的物质各是什么？
答案 主要提供碳源的是牛肉膏，主要提供氮源的是蛋白胨。
归纳总结 培养基的成分及功能
营养要素
含义
作用
主要来源
碳源
凡能提供所需碳元素的物质
构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质
无机碳源：CO2、NaHCO3等；
有机碳源：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等
氮源
凡能提供所需氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机氮源：NH3、铵盐、硝酸盐等；
有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子(特殊营养物质)
生长必不可少的微量有机物
酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高
不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
培养基、大气、代谢产物等
无机盐
为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素
细胞内的组成成分；生理调节物质；某些化能自养菌的能源；酶的激活剂
培养基、大气等环境
1.下列关于培养基的说法正确的是( )
A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B.培养基只有两类：液体培养基和固体培养基
C.除水以外的无机物只能提供无机盐
D.无机氮源不可能提供能量
答案 A
解析 根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。
方法链接 培养基的种类
分类标准
培养基种类
培养基特点
作用
物理性质
固体培养基
外观固态
微生物的分离、计数等
半固体培养基
容器放倒不致流出，剧烈振动则破散
观察微生物的运动、鉴定菌种等
液体培养基
呈液态
常用于工业生产
功能
选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长
选择、分离
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴定
成分
天然培养基
化学成分还不清楚
工业上大规模的微生物发酵生产
来源
合成培养基
化学成分完全了解
在实验室用来对微生物分析
2.下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是( )
原料
①
②
③
④
蛋白胨/g
10
10
10
10
乳糖/g
5
5
5
5
蔗糖/g
5
5
5
5
KH2PO4/g
2
2
2
2
伊红/g
0.4
美蓝/g
0.065
琼脂/g
10
20
NaCl/g
20
蒸馏水/mL
1 000
1 000
1 000
1 000
A.①③ B.②① C.②④ D.③①
答案 D
解析 在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。
一题多变
(1)表格中的蛋白胨主要为微生物提供何种营养成分？
答案 主要为微生物提供碳源、氮源和维生素。
(2)乳糖和蔗糖在培养基中的作用是什么？
答案 可以为微生物提供碳源和能源。
(3)如果用培养基培养某种自养微生物，则该配方中的哪种物质可以去除？
答案 乳糖和蔗糖。
题后总结 有关培养基营养物质的四点提醒
(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。
②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。
(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源、能源。
(3)微生物需要补充生长因子，是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
(4)微生物需要量最大的是碳源。能合成含碳有机物的是自养型，反之则为异养型。
二、无菌技术
1.目的：获得纯净培养物。
2.关键：防止外来杂菌的入侵。
3.两种无菌技术的比较
比较项目
消 毒
灭 菌
作用强度
较为温和的理化因素
强烈的理化因素
作用程度
杀死物体表面或内部的部分微生物
杀死物体内外的所有的微生物
芽孢和孢子
一般不能杀灭
能杀灭
适用对象
操作空间、活体生物材料、操作者衣着和双手
操作工具、玻璃器皿、培养基等
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法
灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法
1.“无菌操作”与人们的生活休戚相关，无时无处不在。在日常生活、生产实践、自身健康防护中，有哪些“无菌操作”的例子？
答案 日常生活、生产实践、自身健康防护中“无菌操作”的例子分别有：(1)被褥、鞋袜要常晒；肉制品储存时用盐腌等。(2)家畜阉割后，要在其伤口处涂抹一些酒精或白酒；初冬杨树树干涂刷生石灰水等。(3)打针时，注射部位要用酒精棉球擦洗，一般要在其伤口处涂抹一些碘酒。
2.消毒和灭菌的原理是什么？消毒和灭菌都能杀死所有的微生物吗？是否适用于所有的生物和物品？
答案 (1)都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。
(2)灭菌可杀死处理材料中的全部微生物(包括芽孢和孢子)，而消毒仅能杀死物体表面或内部的部分微生物(一般不包括芽孢和孢子)。(3)不是，无菌技术既要考虑效果，又要考虑操作对象的承受能力。例如，活体生物材料、操作者的双手等只能消毒，而不能灭菌。
3.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
答案 还能有效避免污染环境以及操作者自身被微生物感染。
4.无论是接种微生物还是制备培养基中的倒平板，都要在酒精灯火焰附近进行，请简述理由。
答案 在酒精灯火焰附近进行接种或倒平板，目的是造成一个无菌环境，避免操作过程中受到杂菌的污染。
3.高温灭菌的原理是( )
A.每种微生物生长的最适温度是一定的
B.微生物对于高温环境不适应
C.高温破坏了微生物细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动
D.高温降低了环境中氧的浓度
答案 C
解析 高温的致死作用主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子物质发生不可逆转的变性。
4.培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是( )
①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥
C.⑥②③④①⑤ D.③④②①⑥⑤
答案 A
解析 培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；对空气可用紫外线消毒；为了不破坏牛奶的营养成分，可采用巴氏消毒法对其进行消毒。
一题多变
(1)接种环灼烧灭菌后为什么不能立即接触菌液？
答案 因为刚刚灼烧后的接种环温度较高，马上接触菌液会将菌种杀死。
(2)选择无菌操作方法的依据除了无菌操作的目的外还有什么？
答案 还要依据无菌操作的对象。
特别提醒 (1)酒精消毒液中酒精浓度对效果的影响：70%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。
(2)无菌技术措施的选择原则
①考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
1.不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列对一种以CO2为唯一碳源的自养型微生物营养的描述中，不正确的是( )
A.氮源物质为该微生物提供必要的氮元素
B.碳源物质也是该微生物的能源物质
C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D.水是该微生物的营养要素之一
答案 B
解析 该微生物以CO2为唯一碳源，但CO2不能为微生物提供能量，不属于能源物质。
2.自养微生物与异养微生物的培养基的主要差别是( )
A.碳源 B.氮源 C.无机盐 D.生长因子
答案 A
解析 自养微生物能够利用二氧化碳和水合成有机物，不利用现成的含碳有机物；而异养微生物只能利用现成的含碳有机物，所以它们的主要区别是碳源不同。
3.下列关于灭菌和消毒的理解，不正确的是( )
A.灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B.消毒和灭菌实质是相同的
C.接种环用灼烧法灭菌
D.常用的灭菌方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法
答案 B
解析 灭菌与消毒是两个概念。灭菌的原理是使蛋白质凝固变性，含水分较多者，其凝固所需温度较低。灭菌时要根据不同的材料选用不同的灭菌方法，如接种环用火焰灼烧法，培养基用高压蒸汽灭菌法，还有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法等。消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
4.不同的微生物对营养物质的需求各不相同，但一般都需要水、碳源、氮源和无机盐。下列有关微生物所需营养物质的描述，正确的是( )
A.氮源物质只能为该微生物提供必要的氮元素
B.有些碳源也可以给微生物的生长提供能源
C.无机盐是微生物不可缺少的营养物质，所以无机盐越多越好
D.固体培养基中不含水分
答案 B
解析 含氮的有机物既可给微生物提供氮元素，也可给微生物提供能源。含碳的有机物既可给微生物提供碳元素，也可给微生物提供能源。微生物生长需要无机盐，但不是越多越好，过多会导致培养基渗透压过高，使微生物因失水过多而不能生存。固体培养基中也含有水分，因为含有凝固剂琼脂，所以呈固态。
5.下列实验材料和用具的无菌操作中，适合使用消毒方法的是 ，适合使用灭菌方法的是 。
①培养基 ②外植体 ③操作者双手 ④锥形瓶 ⑤接种环 ⑥牛奶 ⑦工作台 ⑧培养皿
答案 ②③⑥⑦ ①④⑤⑧
课时作业
[学考达标]
1.关于微生物的营养，下列说法正确的是( )
A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源
B.凡是碳源都能提供能量
C.除水以外的无机物仅提供无机盐
D.无机氮源也可能提供能量
答案 D
解析 对一些微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源。CO2是光能自养细菌的碳源，但不能提供能量。CO2和N2是无机物，也是微生物的碳源和氮源。硝化细菌所利用的氮源是无机氮源氨，同时氨也为硝化细菌提供用以化能合成作用的能源。
2.下列关于培养基的说法，正确的是( )
A.为微生物的生长繁殖提供营养基质的是固体培养基
B.培养基只有两类：液体培养基和半固体培养基
C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的菌落
答案 D
解析 培养基是微生物生长繁殖的营养基质，根据培养基的物理性质不同，可将培养基分成固体培养基、液体培养基和半固体培养基；液体培养基不加凝固剂。
3.下表是对四种生物的能源、碳源、氮源、新陈代谢类型的描述，正确的一组是( )
选项
项目
硝化细菌
乳酸菌
根瘤菌
衣藻
A
能源
NH3
乳酸
N2
光能
B
碳源
CO2
糖类等
糖类等
CO2
C
氮源
NH3
N2
N2
NO
D
代谢类型
自养需氧型
异养厌氧型
自养需氧型
自养需氧型
答案 B
解析 从能源来看，乳酸菌需糖类等有机物供能；从氮源来看，乳酸菌需要NH、NO；从代谢类型来看，根瘤菌为异养需氧型；从碳源来看，硝化细菌与衣藻需CO2，乳酸菌和根瘤菌需糖类等有机物。
4.下列选项中不含有微生物的是( )
A.洗干净的脸上 B.洗完澡后的皮肤
C.刷完牙后的口腔 D.灼烧之后的接种环
答案 D
解析 用清水洗脸、洗澡、刷牙只是起清洁作用，达不到灭菌效果，只有灼烧过的接种环才是真正无菌的。
5.将配制好的培养基进行灭菌，应用的是( )
A.灼烧灭菌 B.高压蒸汽灭菌 C.干热灭菌 D.煮沸灭菌
答案 B
6.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌、酒精擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法依次用于杀死哪些部位的杂菌( )
A.接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环
C.培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅
答案 C
解析 高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌；用酒精擦拭双手是消毒的一种方法；火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
[高考提能]
7.在微生物的实验室培养中，下列各项操作不需要在无菌条件下进行的是( )
A.配制培养基 B.倒平板 C.接种 D.培养
答案 A
解析 配制培养基时不需要无菌操作，因为配制好的培养基需要进行高压蒸汽灭菌。
8.甲、乙、丙为三种微生物，下表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是( )
培养基
粉状硫10 g
K2HPO44 g
FeSO40.5 g
蔗糖10 g
(NH4)2SO40.4 g
H2O
100 mL
MgSO49.25 g
CaCl20.5 g
Ⅰ
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
Ⅱ
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
Ⅲ
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
注：“＋”表示培养基中加入了这种物质，“－”表示培养基中没有加入这种物质。
A.甲、乙、丙都是异养微生物
B.甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物
C.甲是异养微生物，乙是固氮微生物，丙是自养微生物
D.甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物
答案 D
解析 Ⅰ是无氮培养基，只有能固氮的微生物才能在其上繁殖；Ⅱ是不含有机碳源的培养基，只有自养微生物才能在其上繁殖。
9.牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂这一理想的凝固剂，下列关于琼脂的说法不正确的是( )
A.不被所培养的微生物分解利用，对所培养的微生物无毒害作用
B.在微生物生长温度范围内保持固体状态
C.琼脂凝固点低，利于微生物的生长
D.琼脂在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强
答案 C
解析 琼脂作为一种理想的凝固剂，是由其性质决定的，琼脂不会被微生物利用且对微生物无毒害作用，在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强。琼脂在98 ℃以上可溶解于水，在45 ℃以下凝固，所以在微生物生长温度范围内保持固体状态。
10.下列关于无菌操作的叙述，错误的是( )
A.对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B.将用于微生物培养的培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
答案 A
解析 对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒而不是灭菌。
11.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法：
(1)培养细菌用的培养基；
(2)玻璃棒、试管、烧瓶和吸管；
(3)实验操作者的双手。
判断：
(1) ；
(2) ；
(3) 。
答案 (1)需要灭菌；用高压蒸汽灭菌锅灭菌 (2)需要灭菌；干热灭菌箱灭菌 (3)需要消毒；用75%酒精擦拭双手
12.为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制的培养基的配方如下，请分析回答下列问题：
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
伊红
美蓝
蒸馏水
10 g
5 g
5 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL
将培养基pH调至7.2
(1)该培养基所含碳源有 ，其功能是 。
(2)该培养基所含氮源有 ，其功能是 。
(3)该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质是 。
(4)该细菌在同化作用上的代谢类型是 型。
(5)该培养基可用来鉴别哪种细菌( )
A.霉菌 B.酵母菌 C.大肠杆菌 D.乳酸菌
答案 (1)乳糖、蔗糖、蛋白胨 主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物
(2)蛋白胨 主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
(3)水、无机盐(或K2HPO4)
(4)异养 (5)C
解析 根据培养基的配方，该培养基培养异养微生物，含C、H、O、N的蛋白胨既是碳源，又是氮源。培养微生物需碳源、氮源、水、无机盐、生长因子等营养物质。伊红美蓝培养基可用来鉴定是否含有大肠杆菌。
13.分析有关微生物的资料，回答下列问题。
1982年澳大利亚学者从胃活检组织中分离出幽门螺杆菌。
(1)幽门螺杆菌的遗传物质集中分布的区域称为 。
(2)上图4支试管分别代表4种微生物在半固体培养基(琼脂含量3.5 g/L)中的生长状态，其中②号试管代表幽门螺杆菌的生长状态，由图判断，该菌在 的条件下不能生长。产甲烷细菌的生长状态最可能由试管 代表。
(3)下表是某培养基的配方。
成分
葡萄糖
KH2PO4
MgSO4
NaCl
CaSO4
CaCO3
琼脂
蒸馏水
含量
10 g
0.2 g
0.2 g
0.2 g
0.2 g
5 g
3.5 g
1 L
将幽门螺杆菌接种到pH适宜的该培养基中，置于37 ℃下培养一段时间后，在该培养基中幽门螺杆菌的数目比刚接种时 ，主要原因是 。
(4)幽门螺杆菌形态如下图所示，该菌在人体中可引起胃溃疡等胃部疾病。幽门螺杆菌生长的最适pH为6～7，人体胃腔内pH在1～2之间，但胃黏膜的黏液层靠近上皮细胞侧pH为7.4左右。若幽门螺杆菌随食物进入胃腔，结合其结构特点以及能导致胃溃疡的特性，推测该菌在胃内如何存活？
。
答案 (1)拟核(核区) (2)氧气浓度过高或过低 ③
(3)少 缺少氮源(缺少氮源和生长因子)
(4)幽门螺杆菌进入胃腔后，首先依靠鞭毛运动到pH较高处缓冲，然后分泌蛋白中和胃酸，提高pH，以便继续生存和繁殖
解析 (1)幽门螺杆菌为原核生物，没有以核膜为界限的细胞核，遗传物质集中在拟核。(2)幽门螺杆菌生活在半固体培养基的中部，说明它不能生活在氧气浓度过高或过低的地方；产甲烷菌为厌氧型细菌，应生活在半固体培养基的底部。(3)培养基中缺乏氮源，幽门螺杆菌不能正常生活，数量会减少。(4)幽门螺杆菌进入胃腔后，可以先依靠鞭毛运动到pH较高处缓冲，然后分泌蛋白中和胃酸，提高pH，以便继续生存和繁殖。
[真题体验]
14.(2014·大纲，4)某同学在①、②、③三种条件下培养大肠杆菌，这三种条件是：
①以葡萄糖为碳源的培养基，不断补充培养基，及时去除代谢产物 ②以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物 ③以葡萄糖和乳糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物
根据培养结果绘制的一段时间内菌体数的对数随时间变化的趋势图如下：
假设三种培养基中初始总糖量相等，则①、②、③三种条件依次对应的趋势图是( )
A.甲、乙、丙 B.乙、丙、甲
C.丙、甲、乙 D.丙、乙、甲
答案 C
解析 ①以葡萄糖为碳源的培养基，不断补充培养基，及时去除代谢产物，随着时间的延长、菌体数不断增加，对应图丙。②以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养
基，不去除代谢产物，随着营养物质的消耗和次级代谢产物的积累，大肠杆菌的生长环境不断恶化，生存阻力增大，因此种群增长到达稳定期后会进入衰亡期，对应图甲。③培养基中含有葡萄糖和乳糖，大肠杆菌先利用葡萄糖，葡萄糖消耗完后，大肠杆菌会经过短期的调整，诱导合成β-半乳糖苷酶等，分解利用乳糖，随着时间的延长，营养物质消耗完，生存阻力增大，最终衰亡，对应图乙。
15.(经典高考题)在自制酸奶的过程中，除了高温加热以外，其他灭菌方法还有( )
A.紫外线照射 B.真空包装
C.用保鲜膜密闭 D.添加防腐剂
答案 A
第5课时 微生物的实验室培养(二)
[学习导航] 1.通过阅读教材P16～17“(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基”，掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。2.结合教材P18～19“(二)纯化大肠杆菌”，理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。
[重难点击] 1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。
一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的该培养基。
1.牛肉膏蛋白胨培养基的成分及各成分提供的营养
培养基组分
提供的主要营养物质
牛肉膏5.0 g
碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨10.0 g
碳源、氮源和维生素
NaCl 5.0 g
无机盐
蒸馏水定容至1 000 mL
氢元素、氧元素
2.制备步骤
(1)培养基的配制
计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100 mL培养基时各成分的用量
↓
称量
↓
溶化
↓
调节pH：1 moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4 ～7.6
↓
分装：趁热分装到洁净锥形瓶中
↓
加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水
↓
包扎：外包牛皮纸，且挂标签
(2)灭菌
(3)倒平板
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。
②右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
③用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
1.填表比较溶化时两次使用玻棒搅拌的目的
操作
搅拌的目的
往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠后用玻棒搅拌
促使蛋白胨和氯化钠溶解
加入琼脂，加热使其熔化的过程中使用玻棒搅拌
防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
2.倒平板时的注意事项
(1)培养基灭菌后，需要冷却至50 ℃左右时，才能倒平板的原因是什么？你用什么办法来估计培养基的温度？
答案 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
(2)分析下图，回答①、②问题：
①为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答案 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
②从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
(3)怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？
答案 未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
1.某学校开展大肠杆菌培养活动，首先对实验室进行清扫和消毒处理，然后准备各种原料和用具。请回答下列问题：
(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料： 。
(2)微生物在生长过程中对各种成分需求量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停 ，防止 。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌。灭菌完毕后拔掉电源，待压力表的压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨、蒸馏水、NaCl、琼脂
(2)比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂 (3)高压蒸汽灭菌锅 废弃
2.制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是( )
①待培养基冷却至40 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板 ②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞 ③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰 ④用左手的拇指和食指完全打开皿盖 ⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 ⑥等待平板冷却5～10 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
A.①③④⑤ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
问题导析 (1)培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 ℃以下凝固。
(2)倒平板的过程要在酒精灯火焰附近进行。
答案 C
解析 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上可溶解于水，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(大约需5～10 min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
一题多变
倒平板的过程需要进行无菌操作，在培养基的制备过程中，还有哪些环节需要进行无菌操作？
答案 要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。
二、微生物的分离与纯化技术
1.纯化大肠杆菌
(1)平板划线法
①原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②步骤
接种环灭菌：将接种环放在酒精灯火焰上灼烧直至烧红
↓
取菌种
↓
↓
培养：将平板倒置，放入培养箱中培养
(2(稀释涂布平板法
①原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
②步骤
Ⅰ.系列稀释操作
a.编号为101～106试管中分别盛有9 mL水。
b.用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。
c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。
注意 移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。
Ⅱ.涂布平板操作
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
↓
取菌液：取少量菌液滴加到培养基表面
↓
涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，
冷却8～10 s
↓
涂布平板：用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，
使菌液分布均匀
2.菌种保藏
比较项目
临时保藏
甘油管藏
适用范围
频繁使用的菌种
长期保存的菌种
培养基
固体斜面培养基
液体培养基
保藏温度
4 ℃
－20 ℃
具体方法
接种到固体斜面培养基上→适宜温度下培养→4 ℃冰箱中保藏
甘油瓶中装入甘油后灭菌→将菌液转移至甘油瓶中→混匀后冷冻箱中保存
1.平板划线操作注意事项
(1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
答案 ①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。②划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。③接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。④划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。
(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。
(3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答案 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答案 划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。
(6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？
答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。
2.稀释涂布平板操作注意事项
(1)涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想将菌液滴加到培养基上时应如何进行无菌操作？
答案 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火焰附近等。
(2)操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？
答案 培养未接种培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。
归纳总结 两种接种方法比较
平板划线法
稀释涂布平板法
用途
一般用于菌种的纯化
一般用于筛选菌株
优点
可对混合菌进行分离
可以计数
缺点
不能计数
较麻烦，平板干燥效果不好；若菌液浓度大则长不出单菌落
培养结果
3.稀释涂布平板法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是( )
A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
答案 C
解析 稀释涂布平板法要先将菌液进行一系列的梯度稀释，A项正确；只有在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，故而要将不同稀释度的菌液分别涂布平板，B项正确、C项错误；在稀释涂布过程中，为防止杂菌污染，要对培养基和涂布器等进行严格灭菌处理，D项正确。
一题多变
(1)B项中不同稀释度的菌液一般涂布几个平板为宜？
答案 为保证结果准确，每个稀释度的菌液一般涂布3个平板，并对结果取平均值。
(2)如何证明该接种过程是成功的？
答案 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入适宜温度的恒温箱中，培养12 h和24 h后，观察培养基上的菌落情况，若未接种的培养基上无菌落生长，则证明操作是成功的；否则不成功。
(3)题中如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落，原因可能是什么？
答案 可能是稀释度不够，聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。
(4)如果不进行D项操作，培养基上的菌落可能有哪些变化？
答案 菌落种类和数目增多。
4.图甲是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙是平板划线法操作结果。
下列叙述中，错误的是( )
A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液
B.对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求
D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
问题导析 (1)对菌液进行稀释时，菌液中菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要越高，菌体的浓度低时，则稀释的倍数不必太高。
(2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要冷却后才能接触菌种。
(3)平板划线法的多次划线中，菌体越来越少，即不同划线处的菌体数目不同，所以形成的菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成的。
答案 C
解析 灼烧后的接种环如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确；稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确；平板划线法中一般最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。
一题多变
稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？
答案 决定稀释倍数及划线次数的因素是菌液的浓度，如果菌液的浓度较高则需要高倍数的稀释，所划线次数也要较多，否则就可以低倍稀释或减少划线次数。
拓展提升 两种接种方法中，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数的原因
只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平板法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成的，即一个肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落，可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。而平板划线法中除了最后一次划线末端处的菌落是由单一的细菌繁殖而成的，其他每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适合用于细菌的计数。
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( )
A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
答案 C
解析 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。
2.平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是( )
A.接种时再拿起来方便
B.在皿底上标记日期等方便
C.正着放置容易破碎
D.防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
答案 D
解析 平板倒置主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
3.如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5。下列操作方法正确的是( )
A.操作前不用进行任何处理
B.划线操作必须在火焰上进行
C.在5区域中才可以得到所需菌落
D.在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌
答案 D
解析 划线之前应对接种环灭菌；划线操作在酒精灯火焰旁进行；从1区域至5区域菌落密度越来越小，可能会在3、4、5区域得到所需菌落。
4.分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述错误的是( )
A.均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面
B.获得的每个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群
C.都应在火焰附近进行操作，以防止杂菌污染
D.稀释分散菌种的原理不同，均能达到分离纯化大肠杆菌的目的
答案 B
解析 用稀释涂布平板法时，如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成的。平板划线中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求。
5.下表是从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答下面的问题。
试剂
用量
试剂
用量
牛肉膏/g
5
琼脂/g
20
蛋白胨/g
10
水/mL
1 000
NaCl/g
5
—
—
(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、 和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是 。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行 处理。
(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是 和 。
(3)假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举两项)
。
答案 (1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 (2)平板划线法 稀释涂布平板法 (3)稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌又接着划第二次；培养过程灭菌不严格，受到微生物的污染
解析 (1)培养微生物的培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。牛肉膏、蛋白胨既是碳源又是氮源；培养基在接种前必须灭菌处理。
(2)微生物的接种方法包括平板划线法和稀释涂布平板法两种。
(3)多种因素都会导致接种的菌种密度较大，没有形成单一的菌落。
课时作业
[学考达标]
1.下列关于倒平板叙述，错误的是( )
A.右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近
B.倒平板整个过程应在火焰旁进行
C.完全打开培养皿皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖
D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置
答案 C
解析 C项应是用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全打开，以防杂菌污染。
2.下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是( )
A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上的菌种
C.在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D.划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
答案 C
解析 在第二区域内划线时，接种环上的菌种来源于第一次划线的末端。
3.下列依次表示倒平板、接种的位置以及平板划线法接种的路径的示意图，其中错误的是( )
答案 D
解析 平板划线法除第一次划线外，以后的每一次划线都从上一次划线的末端开始。
4.涂布平板操作需要用到( )
A.接种环、滴管、酒精灯
B.接种环、移液管、酒精灯
C.涂布器、移液管、酒精灯
D.涂布器、接种环、酒精灯
答案 C
5.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱的目的是( )
A.对比观察培养基有没有被微生物利用
B.对比分析培养基上是否生有杂菌
C.没必要放入未接种的培养基
D.为了下次接种时再使用
答案 B
6.获得纯净培养物的关键是( )
A.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌
B.接种纯种细菌
C.适宜环境条件下培养
D.防止外来杂菌的入侵
答案 D
[高考提能]
7.如图为纯化大肠杆菌的一个操作环节，下列相关叙述中，错误的是( )
A.该操作步骤是接种，方法是平板划线法
B.除第一次划线外，以后的每一次划线的起点是上一次划线的末端
C.图中细菌密度最小的是5处
D.该接种方法适用于细菌的计数
答案 D
解析 图中所示的纯化方法是平板划线法，该方法要求连续划线多次，直到最后一次划线的末端细菌呈单个存在，所以该方法仅用于纯化大肠杆菌但不适用于细菌的计数。
8.做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是( )
A.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
答案 D
解析 A项错，高压灭菌加热结束后，让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物；B项错，倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖；C项错，灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种；D项对，在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
9.为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是( )
A.对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法
B.临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上
C.临时保藏的菌种容易被污染或产生变异
D.对于需要长期保存的菌种，可以采用低温－4 ℃保藏的方法
答案 D
解析 对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在3 mL甘油瓶中加入1 mL甘油后灭菌，将1 mL菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。
10.平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。下列相关叙述中错误的是( )
A.平板划线法要求要连续多次划线，且除了第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的终点
B.除了第一次划线需要将接种环灼烧灭菌外，以后的划线可以不用灭菌
C.如果菌液本来浓度不高，则可以适当降低稀释倍数
D.充分稀释和连续划线的目的都是为了使形成的菌落是由单一的细菌细胞繁殖而成
答案 B
解析 平板划线法需要连续划线的目的就是使得细菌的浓度降低，所以除了第一次划线外，以后的每次划线的起点都是上一次划线的终点，A正确；每一次划线前都要将接种环进行灼烧，将上次划线结束后残留的细菌杀死，使细菌尽快分散成单个，B错误；稀释倍数要随菌液的浓度而定，如果菌液的浓度太大，则需要更高的稀释倍数，否则就可以适当降低稀释的倍数，C正确；稀释涂布平板法中的充分稀释及平板划线法中的连续划线，目的都是为了保证菌落是由单一的细菌细胞繁殖而成的，D正确。
11.回答以下关于微生物的培养和发酵的问题：
(1)某中学生物兴趣小组在进行A细菌的培养过程中，发现了另一种B细菌，在B细菌周围A细菌的生长繁殖受到抑制，这有可能是B细菌产生了不利于(抑制)A细菌生存的物质。现在请你在以下实验的基础上，继续完成验证A细菌生长繁殖受到抑制的原因的实验过程：
(用序号、文字和箭头作答)。
(2)上图示培养基中加入了凝固剂(或琼脂)，致使该培养基属于 。培养微生物前，所用培养基一般需采用 法进行灭菌，接种微生物常用的方法有 和 ，其中后者也可用于微生物的计数。
答案 (1)④去除步骤③中培养皿里的B细菌并保留培养基→⑤再接种A细菌→⑥培养一段时间→⑦观察A细菌的生长情况(答案合理即可) (2)固体培养基 高压蒸汽灭菌 平板划线法 稀释涂布平板法(后两空答案顺序不可颠倒)
解析 (1)在去除B细菌的培养基上再接种A细菌，可根据A细菌的生长情况来验证是否是B细菌产生了不利于A细菌生存的物质。(2)固体培养基中一般需加入琼脂。一般培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法，接种微生物的常用方法为平板划线法和稀释涂布平板法，其中只有稀释涂布平板法可用于微生物的计数。
12.在生物技术上常利用大肠杆菌制成“工程菌”。某生物小组的同学，利用实验室提供的大肠杆菌品系及其他必要材料，对该品系大肠杆菌进行了培养。请分析回答下列问题：
(1)微生物在生长过程中对各种成分的需求量不同，故制备培养基时各成分要有合适的 。培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为微生物提供 。
(2)配制培养基时，各种成分在溶化后分装前必须调节 ，接种前要进行 处理。
(3)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。
(4)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，应将平板 放置，这样做的目的是防止皿盖上的水珠落入 而造成污染。
(5)甲同学采用平板划线法接种，获得单个菌落后继续筛选，在每次划线之前都要灼烧 ，他这样做的目的是 。
在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ ，为什么？
。
(6)实验结束时，使用过的培养基应进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是 。
答案 (1)浓度和比例 氮源(和碳源)、碳源
(2)pH 灭菌
(3)高压蒸汽灭菌
(4)倒过来 培养基
(5)接种环 杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
需要 防止接种环上残留的菌种对环境造成污染或感染操作者
(6)防止污染环境
解析 (1)培养基中各成分要有合适的浓度和比例，保证微生物有充足的营养，又不会因外界浓度过大而失水。淀粉提供碳源，而蛋白胨含C、N等元素，既能提供碳源，又能提供氮源。(2)各种成分溶化后分装前要调节pH，接种前对培养基灭菌，防止杂菌污染。(3)培养基灭菌用高压蒸汽灭菌法。(4)倒平板时，平板冷凝后应倒置，否则皿盖上的水珠会落入培养基造成污染。(5)每次划线前都要灼烧接种环，将上次划线残留的菌种杀死，使细菌尽快分散成单个。操作结束后灼烧接种环是为了防止残留的菌种污染环境或感染操作者。(6)使用过的培养基要彻底灭菌后再倒掉，否则培养基中的微生物会污染环境。
13.饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，并且影响其对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以被动物吸收利用的磷酸盐等。如图是科研人员从作物根部土壤中分离产生植酸酶的菌株的过程示意图。请分析作答：
(1)培养基中除了添加植酸钙以外，应含有 、 、水、无机盐等基本营养物质。
(2)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行 处理，其中，培养基的制备过程中灭菌之前要进行 。
(3)接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成 。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的 就能大致推测出样品中的活菌数。
(4)由于植酸钙不溶解，使培养基形成白色浑浊状态。产生植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产生植酸酶。实验结果显示A～E五种菌株中， 是产生植酸酶的理想菌株。
(5)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行 。
答案 (1)碳源 氮源 (2)灭菌 调pH (3)单个菌落 菌落数 (4)E (5)扩大培养
解析 (1)从土壤中分离培养产生植酸酶的菌株的过程中，培养基中加入植酸钙，以筛选所需要的微生物，此外还要有充足的碳源和氮源等营养物质。(2)实验的灭菌方法一般有：灼烧灭菌(接种环、接种针或其他金属用具)、干热灭菌(玻璃器皿和金属用具等)、高压蒸汽灭菌(培养基)。其中，培养基的制备过程中灭菌之前要调pH。(3)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。(4)根据题干提供的信息，E的周围形成的透明区域最大，是产生植酸酶的理想菌株。(5)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行扩大培养。
[真题体验]
14.(2016·全国乙，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于 。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是 。
(2)步骤③中，实验组的操作是 。
(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了 现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法 (填“正确”或“不正确”)。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂
(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
(3)污染 不正确
第6课时 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
[学习导航] 1.通过分析具体培养基的配方，归纳选择培养基的选择作用，理解筛选微生物的原理。2.结合实验设计，分析微生物数量测定实验中产生偏差的原因及解决措施，学会微生物的计数方法，并对培养结果进行分析和评价。
[重难点击] 1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。
一、研究培养基对微生物的选择作用
1.筛选菌株
(1)自然界中目的菌株的筛选
①原理：根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
②实例：能产生耐高温的Taq DNA聚合酶的Taq细菌就是从热泉中筛选出来的。
(2)实验室中目的菌株的筛选
①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
②实例：从土壤中筛选能分解尿素的细菌。
③方法：利用选择培养基进行微生物的筛选。
2.选择培养基
(1)概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(2)举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源，按物理性质归类为固体培养基。
1.筛选分解尿素的细菌的选择培养基
下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：
KH2PO4
1.4 g
Na2HPO4
2.1 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
葡萄糖
10.0 g
尿素
1.0 g
琼脂
15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
答案 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
答案 该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
答案 分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源。
2.设计对照实验
(1)如何设计对照实验验证该选择培养基的确筛选到了能分解尿素的细菌？
答案 增设牛肉膏蛋白胨基础培养基并进行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则说明选择培养基的确起到了筛选能分解尿素的细菌的作用。
(2)如何设计对照实验验证所用的选择培养基没有受到污染？
答案 设置一个未涂布平板的能筛选分解尿素的细菌的选择培养基。
归纳总结 选择培养基的分类
(1(利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。
(2(利用化学物质进行的选择培养：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制某些微生物的生长，同时选择所需的微生物。
(3(利用培养条件进行的选择培养：改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等(，筛选特定微生物。
1.下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是( )
A.用全营养牛肉膏蛋白胨培养基筛选大肠杆菌
B.用高NaCl的培养基筛选抗盐突变菌株
C.含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株
D.利用高温条件筛选耐热的Taq细菌
答案 A
解析 全营养牛肉膏蛋白胨培养基常用于大肠杆菌的培养，该培养基对微生物无选择作用，A项错误。抗盐突变菌株具有耐高盐的能力，因此可以利用高NaCl的选择培养基进行选择培养，B项正确。分解尿素的菌株会分解尿素形成氨，使培养基pH升高，因此可以利用含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株，C项正确。利用高温条件可以筛选耐热的Taq细菌，D项正确。
2.下表是微生物培养基的成分。下列有关说法错误的是( )
编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量/g
0.4
4.0
0.5
0.5
100 mL
A.此培养基可用来培养自养型微生物
B.此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源
C.若除去①，此培养基可培养圆褐固氮菌
D.培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源和生长因子
答案 C
解析 由题知，该培养基成分中含有水、无机盐、氮源，但不含含碳有机物，可用来培养自养型微生物，选项A、B均对；圆褐固氮菌同化类型为异养型，培养基中必须存在含碳有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌，C错。
技巧链接 选择培养基的常见类型
(1)分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。
(2)常见的选择培养基
①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
③无氮源培养基可以分离固氮微生物。
④以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。
⑤将培养基放在高温环境中培养，可以分离耐高温的微生物。
二、进行微生物数量的测定
1.统计菌落数目
(1)方法：活菌计数法、显微镜直接计数法。
(2)统计依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(3)操作
①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
②为保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③统计的菌落数往往比活菌实际数目低。
(4)计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
2.设置对照
(1)对照实验：是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如，为了确认培养基是否被杂菌污染，需以不进行接种的培养基培养作为空白对照。
3.实验操作流程
(1)土壤取样
①取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
②土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿。
③取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品稀释
①稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。
②稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。
(3)微生物的培养与观察
①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
②观察
a.观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b.菌落的特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。
(4)菌种鉴定
①原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。
②方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
4.操作提示
(1)无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。
下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答下列问题。
1.试写出分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程
答案 土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。
2.统计菌落数目
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
答案 不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
答案 不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。
(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板
稀释度
平板1
平板2
平板3
104
320
360
356
105
212
234
287
106
21
23
18
答案 105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。
(4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？
答案 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
3.对照实验设计的分析
分析教材P22“设置对照”中的实例，探讨下列问题：
(1)在A同学确定自己操作无误的情况下，A同学得出的菌落数多于其他同学的原因可能有哪两种？
答案 可能是他选择的土壤样品不同于其他同学；也可能是培养基受到了污染或操作失误。
(2)如何设计对照实验帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？
答案 ①其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题；②将A同学配制的培养基在不加土样的情况下培养作为空白对照，以判断培养基是否受到污染。
4.微生物数量测定的实验设计
(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
答案 土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。
(2)本实验中应如何统计培养基上生长的菌落数？
答案 每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
(3)实验中的无菌操作主要有哪些？
答案 ①培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。②称取土壤要在火焰旁进行。③稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。
归纳总结 分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1(在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2(样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀释液。
(3(为排除非测试因素(培养基(的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。
(4(每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。
3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是( )
A.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为5号的10倍
B.5号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7×108个
C.在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀
D.某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目高
答案 C
4.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
(1)实验步骤
①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
②为了得到更加准确的结果，应选用 法接种样品。
③适宜温度下培养。
(2)结果分析
①测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是 。
A.一个平板，统计的菌落数是230
B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240
C.三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289
D.四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240
②一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL) 。
③用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量 (填“多”或“少”)，因为
。
问题导析 (1)因为题中操作的目的是对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是稀释涂布平板法。
(2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成30～300个菌落。
(3)所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显多于或少于其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应重做或舍弃。
答案 (1)②稀释涂布平板 (2)①D ②1.06×109个
③多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
解析 (1)若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(2)①应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。②212÷0.2×106＝1.06×109(个)。③因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
一题多变
(1)如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中测定的数值高还是低？为什么？
答案 低。因为稀释倍数太低，则大部分菌落是由多个细菌繁殖而成，所以测定的菌落的数值要偏低。
(2)第(2)问第①小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。
答案 ①培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；②接种过程中由于操作不当感染了杂菌；③取菌液时没有摇晃，导致所取菌液中细菌个体浓度偏大等。
技巧链接 用稀释涂布平板法计数微生物的方法
(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30～300之间的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。
1.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为( )
A.伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基
B.含青霉素的培养基、含氨的无机培养基
C.含氨的无机培养基、含青霉素的培养基
D.含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基
答案 B
解析 酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素能够抑制细菌生长，但不能够抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。
2.下列操作步骤顺序正确的是( )
①土壤取样 ②称取10 g土样，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A.①→②→③→④ B.①→③→②→④
C.①→②→④→③ D.①→④→②→③
答案 C
3.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是( )
A.筛选出能分解尿素的细菌
B.对分离的菌种作进一步鉴定
C.作细菌的营养成分
D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素
答案 B
解析 筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基，目的是对要分离的菌种作进一步的鉴定。
4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是( )
A.将土壤用无菌水稀释，制备103～106倍的土壤稀释液
B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上
C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌
D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株
答案 C
解析 用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌。
5.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答下列问题：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
10.0 g
1.0 g
15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。
(1)此培养基 (填“能”或“不能”)用于植物组织培养，理由是 。
(2)培养基中加入尿素的目的是 ，这种培养基属于 培养基。
(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的 和 ，实验需要振荡培养，原因是 。
(4)图中将细菌转到固体培养基上时，可采用 或 在含尿素的培养基上接种，获得单菌落后继续筛选。初步筛选出来的菌种还需要用生化的方法作进一步的鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成 色，则可准确说明该菌种能够分解尿素。
(5)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是 ，需要消毒的是 。(填序号)
①培养细菌用的培养基与培养皿 ②玻棒、试管、锥形瓶和吸管 ③实验操作者的双手
(6)实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后，才能倒掉。
答案 (1)不能 缺少植物激素(或缺少植物需要的一些营养成分) (2)筛选目的菌 选择 (3)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 (4)平板划线法 稀释涂布平板法 酚红 红 (5)①② ③ (6)灭菌
解析 (1)植物组织培养的培养基中需要含有氮、磷、钾及锌、铜、钼、铁等元素，需要蔗糖为植物细胞提供能量，还需要细胞分裂素和生长素等植物激素。(2)该培养基中尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长，属于选择培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型微生物，所以在培养过程中需振荡。(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养利用尿素的细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，由此可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)微生物培养时，一切环境、物质、用具、器材都要消毒或灭菌。(6)为避免实验后培养基中的微生物污染环境，使用过的培养基必须经过灭菌处理后才能丢弃。
课时作业
[学考达标]
1.在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或者阻止其他种类微生物生长的培养基称做( )
A.鉴别培养基 B.加富培养基
C.选择培养基 D.基础培养基
答案 C
解析 选择培养基可选择目标微生物，同时抑制或杀死其他微生物。
2.可以分离并鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂
D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
答案 A
解析 尿素在尿素分解菌的作用下分解产生氨和CO2，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，酚红指示剂变红。
3.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A.①③⑤⑦ B.②④⑥⑧
C.①③⑤⑧ D.①④⑥⑦
答案 C
4.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A一个细菌、液体培养基
B.许多细菌、液体培养基
C.一个细菌、固体培养基
D.许多细菌、固体培养基
答案 C
解析 在液体培养基中生活的细菌，无论是一个还是许多，肉眼都是看不见的。在固体培养基上生活的细菌，当数目较少时也是看不见的。当固体培养基上有许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。如果有许多细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态，因为这些细菌不可能是同一种细菌，也不可能在培养基的同一个点上。
5.下列关于土壤取样的叙述，错误的是( )
A.土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤
B.先铲去表层土，选取距地表3～8 cm左右的土壤层
C.取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D.应在火焰旁称取土壤
答案 C
解析 土壤取样过程中，为防止杂菌污染，取样用的小铁铲和信封在使用前必须灭菌。
6.某同学对101、102、103倍稀释液中的细菌进行计数，平均菌落数分别为2 760、295和16，则样品中菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)( )
A.2.76×104个/mL B.2.95×105个/mL
C.4.6×104个/mL D.3.775×104个/mL
答案 B
解析 为保证结果准确，一般选择菌落数在30～300间的平板进行计数，因此只有295符合要求，其稀释倍数为102，所用稀释液体积为0.1 mL，套入计算公式得样品中菌落总数为2.95×105个/mL。
[高考提能]
7.在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”课题中，以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是( )
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②从土壤中分离出能够分解氨的细菌 ③统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌 ④统计所取土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌
A.①③ B.②④ C.①② D.③④
答案 A
解析 从土壤中分离分解尿素的细菌并对其计数，统计的是每克土壤样品中含多少分解尿素的细菌，用公式“每克样品中菌株数＝(C/V)×M”进行推测，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
8.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的正确方法是( )
A.打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上
B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点
C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
D.略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
答案 D
解析 接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，用未冷却的接种环沾取稀泥浆会杀灭菌种。
9.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是( )
A.链霉素能阻止结核杆菌的生长
B.链霉素对结核杆菌比对霍乱菌更有效
C.链霉素对结核杆菌比对伤寒菌更有效
D.链霉素可以用于治疗伤寒病人
答案 D
解析 从图中可以看出，这是含有链霉素的选择培养基，接种的三种细菌中，霍乱菌和结核杆菌都可以被杀灭，并且链霉素对结核杆菌杀灭的有效程度大于对霍乱菌的有效程度，而伤寒菌照常生长不受影响，所以选项D错误。
10.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨固体培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养
D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
答案 D
解析 检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，A项正确；取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于不同的平板上，B项正确；接种后要将培养皿倒置，置于37 ℃恒温培养，C项正确；在确定对照组无菌后，应选择菌落数在30～300之间的平板进行计数，D项错误。
11.广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗→榨汁(蔗糖)―→酵母发酵→蒸馏→成品(燃料酒精)。
(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。
步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意 和 ，加琼脂后灭菌，制成固体平板。
步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。
步骤4：根据 ，筛选出突变菌。
(2)上述步骤2、3和4的依据分别是
。
答案 (1)添加高浓度蔗糖(葡萄糖) 调低pH 是否能在选择培养基上生长 (2)提供高糖和酸性的筛选环境；获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性
解析 (1)要筛选耐高糖和耐酸的菌种，培养基中必须加入高浓度蔗糖和调低pH，能在选择培养基上生长的即为所需菌种。(2)步骤2是给其提供高糖或酸性的筛选环境；步骤3是为了获得单菌落；步骤4是根据能生长的菌株具有耐高糖和耐酸的特性筛选出突变菌。
12.请回答下列有关微生物的问题：
(1)微生物的分布：微生物主要分布在富含 的土壤表层；不同微生物对pH的要求不同，细菌常生活在酸碱度 的潮湿土壤中。
(2)微生物的消毒和灭菌：在微生物培养中，对培养基常用 法进行灭菌。如果要检测灭菌是否彻底，可以采用的方法是
。
(3)微生物的应用：在葡萄酒的自然发酵过程中，运用吸附在葡萄皮上的野生酵母菌发酵产生酒精，请写出该过程的化学反应式： 。
在果醋制作时，运用醋酸菌在 和糖源充足的条件下，将糖分解成醋酸。
(4)微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是 和 。
(5)微生物的鉴定：为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素为唯一氮源的 (选择、鉴别)培养基中加入 指示剂，如果存在尿素分解菌，则指示剂将变 色。
答案 (1)有机质 接近中性 (2)高压蒸汽灭菌 将灭过菌的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生 (3)C6H12O62C2H5OH＋2CO2 有氧 (4)平板划线法 稀释涂布平板法 (5)选择 酚红 红
解析 (1)微生物主要分布在有机质丰富的土壤表层，细菌常生活在酸碱度接近中性的潮湿土壤中。(2)对培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；可通过在适宜的温度下放置灭过菌的培养基，看其是否有菌落产生来确定培养基灭菌是否彻底。(3)醋酸菌为需氧型微生物。(4)最常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(5)用选择培养基筛选目的菌——尿素分解菌，加入酚红指示剂，若存在尿素分解菌，指示剂将变红色。
[真题体验]
13.(2016·四川，10)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。请据图回答下列问题：
(1)图中选择培养基应以 为唯一氮源；鉴别培养基还需添加 作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成 色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是 ，每克土壤样品中的细菌数量为 ×108个；与血细胞计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较 。
(3)现有一菌株产生的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示的位置增加了70个核苷酸，使图乙序列出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为 ，突变基因表达的蛋白质含 个氨基酸。
答案 (1)尿素 酚红 红
(2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115
14.(2015·浙江自选模块，17节选)某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，对该酶菌株进行筛选，其流程如下图所示。
→→→→→
请回答下列问题：
(1)土壤悬液首先经80 ℃处理15分钟，其目的是筛选出 。
(2)在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行 ，然后涂布于含有植酸钠的固体培养基上。培养后观察到 ，其周围出现透明水解圈，圈的直径大小与 强弱相关。
(3)筛选获得的菌株经鉴定后，将优良菌株进行液体扩大培养。培养时需要振荡，其主要目的是 。液体培养基与固体培养基相比，不含有的成分是 。
答案 (1)耐高温菌株 (2)稀释 单菌落 植酸酶的活性 (3)供氧 琼脂
解析 (1)土壤悬液首先经80 ℃处理15分钟，杀死不耐高温的菌株，筛选出耐高温菌株。(2)将处理过的土壤悬液在无菌条件下稀释，降低细菌浓度，以便得到相互分离的单菌落。用含有植酸钠的培养基培养细菌，植酸酶活性高的菌株分解植酸钠多，其周围出现较大的透明水解圈。(3)菌株的扩大培养一般用液体培养基，它与固体培养基成分基本相同，但不含琼脂。用液体培养基培养优良菌株时，需要振荡，以便使液体培养基底部有较高的含氧量，有利于细菌生长繁殖。
第7课时 分解纤维素的微生物的分离
[学习导航] 1.结合教材P27“基础知识”，掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。2.阅读教材P28“实验设计”，理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。3.阅读教材P30“课题延伸”，掌握纤维素酶的测定方法。
[重难点击] 1.简述纤维素酶的种类及作用。2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。3.分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理。
一、纤维素分解菌的筛选
1.纤维素与纤维素酶
(1)纤维素：下图所示为纤维素的结构式。
①基本组成单位：葡萄糖。
②分布：主要分布在植物根、茎、叶等器官的细胞壁。
(2)纤维素酶
①组成：是一种复合酶，至少包括三种酶，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。
②作用：
2.纤维素分解菌的筛选
(1)方法：刚果红染色法。
①方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。
②方法二：在倒平板时就加入刚果红。
(2)原理
纤维素＋刚果红→红色复合物
↓纤维素酶
纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物
↓
以纤维素分解菌为中心的透明圈
1.纤维素酶
(1)纤维素酶是如何将纤维素分解的？
答案 纤维素酶中的C1酶、CX酶使纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
(2)如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？
答案 设计对照实验。取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。
2.纤维素分解菌的获得
(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
答案 筛选目的菌株应该到有利于目的菌株生长的环境中寻找。
(2)为什么将滤纸埋在土壤中可以提取到目的菌？
答案 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。
3.分析教材P29“纤维素分解菌的选择培养基配方”，回答下列问题：
(1)此配方是液体培养基还是固体培养基？为什么选择此类培养基？
答案 液体培养基，因为配方中无凝固剂。液体培养基与微生物的接触更密切，微生物更容易从培养基中获得营养物质，因此可以快速增加微生物的浓度。
(2)这个选择培养基对微生物是否具有选择作用？怎样设计对照实验证明你的观点？
答案 有选择作用。本配方中富含纤维素，更适合能够分解纤维素的微生物大量繁殖。对照实验可以用牛肉膏蛋白胨培养基培养微生物。若选择培养基上微生物数量明显少于牛肉膏蛋白胨培养基上微生物的数量，则说明培养基起到了选择作用。
归纳总结 纤维素分解菌的富集培养
(1(培养基特点：纤维素分解菌的选择培养用的是富含纤维素的培养基，而不是以纤维素为唯一碳源的培养基。
(2(培养结果：由于培养基中加入了酵母膏和水解酪素等，因此培养基上除得到大量的纤维素分解菌外，也有其他微生物的存在。
(3(进一步筛选：需根据微生物的菌落特点继续进行鉴别培养以筛选到纤维素分解菌。
(4(选择培养的实质：纤维素分解菌的选择培养实质是富集培养，以便得到大量的目的微生物。
1.下列关于纤维素酶的叙述中，错误的是( )
A.纤维素酶只有一种，只能将纤维素分解为葡萄糖
B.纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分
C.纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质
D.分解纤维素的细菌、真菌和放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的
答案 A
解析 纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分——C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和CX酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。
一题多变
(1)上题中分解纤维素的细菌能否在不含纤维素但富含其他有机物的环境中生存？为什么？
答案 能。纤维素分解菌分解纤维素只是为了利用纤维素作为碳源，其他有机物若可提供碳源，也可以生存。
(2)题中纤维素酶也在微生物细胞内分解纤维素吗？为什么？
答案 不在细胞中分解纤维素。多数细胞不能直接吸收纤维素，一般来说，纤维素酶都是分泌到细胞外分解纤维素的。
2.分析下表培养基的配方，请回答下面的问题。
纤维素分解菌的选择培养基：
组分
含量
纤维素粉
5 g
NaNO3
1 g
Na2HPO4·7H2O
1.2 g
KH2PO4
0.9 g
MgSO4·7H2O
0.5 g
KCl
0.5 g
酵母膏
0.5 g
水解酪素
0.5 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。
(1)此培养基配方中为微生物提供碳源的主要是 、氮源是 。
(2)此配方为 培养基(根据物理状态)配方。
(3)此培养基选择出的微生物主要是 。
问题导析 (1)该培养基中纤维素是主要的碳源，所以可以用于筛选纤维素分解菌。
(2)由于该培养基中没有加入琼脂，所以为液体培养基。液体培养基中微生物与营养成分的接触更充分，可以提高微生物的代谢效率。
答案 (1)纤维素粉 NaNO3、酵母膏、水解酪素 (2)液体 (3)纤维素分解菌
解析 该培养基的主要碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏、水解酪素。因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。因该培养基仅以纤维素粉为主要碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。
一题多变
(1)从土壤中分离纤维素分解菌时，哪种情况下可以省略选择培养？
答案 当土壤中纤维素分解菌的浓度很高时，可以省略选择培养这一步骤。
(2)本题中的培养基配方中的酵母膏可以为微生物提供什么成分？
答案 可以提供碳源、氮源和生长因子。
(3)该培养基中纤维素是否为唯一的碳源？
答案 不是，纤维素是主要的碳源，另外，酵母膏和水解酪素也可以提供少量的碳源。
二、尝试从土壤中分离出分解纤维素的微生物
1.实验流程
土壤取样：选择富含纤维素的环境
↓
选择培养：用富含纤维素的选择培养基扩大培养
↓
梯度稀释：依次稀释101～106倍
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落
2.实验操作注意事项
(1)土壤取样时要选择富含纤维素的环境。
(2)选择培养的方法：用富含纤维素的选择培养基。
目的：增加纤维素分解菌的浓度。
(3)梯度稀释的目的：能获得单个菌落。
(4)涂布平板时要选择鉴别纤维素分解菌的培养基。
(5)挑选产生透明圈的菌落。
3.菌种的进一步鉴定
(1)鉴定原理：为确定透明圈内的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验。
(2)发酵方法：有液体发酵和固体发酵两种。
(3)纤维素酶的测定方法：一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
1.鉴别纤维素分解菌的培养基
(1)鉴别纤维素分解菌时需在培养基中添加什么物质？
答案 刚果红染色剂。
(2)鉴别培养基和选择培养基在目的和物理性质方面的区别是什么？
答案 ①鉴别培养基是在培养基中加入某些特定的作用底物和指示剂，观察微生物生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别微生物；选择培养基是在培养基中加入某些物质，以促进目的菌的生长繁殖，同时抑制其他杂菌的生长繁殖。
②选择培养的培养基中没有加入琼脂，所以属于液体培养基，而鉴别培养基一般为固体培养基。
2.鉴别方法——刚果红染色法
从显色结果上看，两种刚果红染色法中哪种染色法更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌？
答案 方法一更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌。即先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，所显示的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二中有些微生物具有降解色素的能力，它们在生长过程中会降解刚果红，也会使培养基上形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
3.透明圈的形成
(1)对分离的纤维素分解菌作进一步的鉴定的原因是什么？
答案 产生透明圈的菌落可能是能产生纤维素酶的微生物，也可能是能降解刚果红的菌种，所以需要进一步鉴定。
(2)简要概述筛选纤维素分解菌时透明圈是如何形成的。
答案 纤维素分解菌分解纤维素产生的纤维二糖和葡萄糖，不能与刚果红形成红色复合物，而出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
(3)向含有分解尿素的细菌的培养基中加入酚红指示剂，会出现类似的圈吗？
答案 分解尿素的细菌能够将尿素分解成氨，加入酚红指示剂后会变红，也会形成以尿素分解菌为中心的红色的圈。
归纳总结 两种刚果红染色法的比较
比较项目
方法一
方法二
先培养微生物，再加入刚果红
在倒平板时加入刚果红
优点
显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
操作简单，不存在菌落混杂
缺点
操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂
有些微生物会降解刚果红，形成透明圈，与纤维素分解菌相混
3.下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是( )
A.刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入
B.刚果红可以在菌落形成后加入
C.刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌
D.在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌
答案 C
解析 刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。
4.研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物，请就如何从土壤中获得纤维素分解菌回答以下问题：
(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和 酶。
(2)若获得纯净的菌株，常采用平板划线法进行接种，此过程所用的接种工具是 ，操作时采用 灭菌的方法。
(3)刚果红可以与纤维素等多糖形成红色复合物，但并不与 和 发生这种反应。常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在 时就加入刚果红。
(4)如果观察到产生 的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行 的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的 进行定量的测定。
答案 (1)葡萄糖苷 (2)接种环 灼烧 (3)纤维二糖
葡萄糖 倒平板 (4)透明圈 发酵产纤维素酶 葡萄糖
解析 (1)纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。(2)常用的接种工具是接种环，操作时采用灼烧的方法灭菌。(3)刚果红不与纤维二糖和葡萄糖发生反应。(4)刚果红与纤维素反应呈红色，纤维素分解菌产生的纤维素酶会将纤维素分解而不能与刚果红染液反应呈红色，在菌落周围会出现透明圈。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
易错易混 关于纤维素分解菌筛选的三个易错警示
(1)纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素，其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
(2)在纤维素分解菌的选择培养基中生长的不只有纤维素分解菌。因此，选择培养后要进行鉴别培养，才能获得纤维素分解菌。
(3)出现透明圈的菌落也不一定是纤维素分解菌。
1.加工橘子罐头，采用酸碱处理脱去中果皮(橘络)，会产生严重污染。目前使用酶解法去除橘络，可减少污染。下列生长在特定环境中的4类微生物，不能产生所用酶的是( )
A.生长在麦麸上的黑曲霉
B.生长在酸奶中的乳酸菌
C.生长在棉籽壳上的平菇
D.生长在木屑上的木霉
答案 B
2.当纤维素被纤维素酶分解后，会在培养基中出现一些透明圈，这些透明圈是( )
A.刚果红与纤维素形成的复合物
B.纤维素分解后的葡萄糖
C.由纤维素酶聚集在一起形成的
D.以纤维素分解菌为中心形成的
答案 D
解析 刚果红与纤维素反应形成红色复合物，当有纤维素分解菌生长时，菌落周围的纤维素被分解，形成透明圈。
3.在分解纤维素的微生物的分离实验中，为了判断选择培养基是否起到了对纤维素分解菌的选择作用，需要设置的对照是( )
A.未接种的只有纤维素为唯一碳源的培养基
B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D.接种了的只有纤维素为唯一碳源的培养基
答案 C
4.通过分离分解纤维素的微生物实验，对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离提纯的第一步，还需要进行( )
A.发酵产纤维素酶的实验
B.提取纤维二糖的实验
C.浓缩纤维素分解菌的实验
D.提取葡萄糖的实验
答案 A
解析 为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后产生的葡萄糖进行定量测定。
5.下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答下面有关问题：
→→→
(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明 。
(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的选择培养基，成分如下，整个实验过程严格执行无菌操作。
组分
含量/g
纤维素粉
5
NaNO3
1
Na2HPO4·7H2O
1.2
KH2PO4
0.9
MgSO4·7H2O
0.5
KCl
0.5
酵母膏、水解酪素
适量
如果将其中的纤维素粉换成 ，菌落数 ，即可说明选择培养基的作用。
(3)本实验宜采用 法而不使用平板划线法，原因是该法可以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数。
答案 (1)根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
(2)葡萄糖 明显多于选择培养基上的菌落数
(3)稀释涂布平板
解析 (1)选择菌种是分离、纯化、扩大培养细菌的前提和基础，其基本原理就是根据菌株对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。(2)纤维素分解菌的培养，必须在以纤维素为主要碳源的培养基上进行。要想说明选择培养基的作用，需设立对照实验：将纤维素粉换成葡萄糖，进行菌落数比较，可见后者菌落数较多，说明以葡萄糖为碳源的培养基与以纤维素为碳源的培养基在微生物培养中的作用不同。(3)由题意知，本实验不仅要分离出土壤中的纤维素分解菌，同时还要统计每克土壤样品中的纤维素分解菌的细菌数，因此不能用平板划线法接种，而要用稀释涂布平板法接种。因为前者无法统计出每克样品中细菌数。
课时作业
[学考达标]
1.下列有关分解纤维素的微生物的分离的叙述，不正确的是( )
A.纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵
B.对分解纤维素的微生物进行了初步筛选后，无需再进行其他实验
C.纤维素酶的测定方法，一般是对所产生的葡萄糖进行定量的测定
D.纤维素酶是一种复合酶
答案 B
解析 初步筛选只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。
2.两种刚果红染色法的结果是( )
A.均会出现透明圈
B.均不会出现透明圈
C.方法一出现，方法二不出现
D.方法一不出现，方法二出现
答案 A
解析 两种刚果红染色法都会出现透明圈，但方法一在加入刚果红溶液时会造成菌落混杂，而先加入刚果红的方法则可能出现假阳性反应。
3.从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计，下列流程正确的是( )
A.土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→挑选菌落
B.土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落
C.土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落
D.土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落
答案 B
解析 实验的正确流程是“土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落”，其中选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，因此需要在稀释涂布平板之前进行，最后根据菌落的特征挑选纤维素分解菌。
4.在对纤维素分解菌进行选择培养时，用液体培养基的目的是( )
A.用液体培养基可获得大量菌体
B.纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长
C.用液体培养基可以使菌体充分利用培养基中的营养物质
D.用液体培养基可获得高纯度的纤维素分解菌
答案 A
解析 使用液体选择培养基培养纤维素分解菌，一方面可以获得大量纤维素分解菌，另一方面便于稀释涂布平板。
5.在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，一般先进行选择培养，其主要目的是( )
A.完全除去其他微生物
B.没有意义，去掉这一步更好
C.增加纤维素分解菌的浓度
D.使纤维素分解菌充分长大
答案 C
解析 如果在所采集的土样中纤维素分解菌含量较少，稀释涂布到鉴别培养基上后形成的菌落数就更少，不利于挑选所需菌落。通过选择培养可以增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
6.分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是( )
A.经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B.选择培养这一步可省略，但获得的纤维素分解菌较少
C.样品经稀释培养后，用刚果红染色
D.对照组可将同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
答案 A
解析 分离土壤中的纤维素分解菌，需先进行选择培养，增大纤维素分解菌的浓度，然后再经过梯度稀释，将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。
[高考提能]
7.下列有关培养基和菌种鉴定的叙述，不正确的是( )
A.根据培养基的物理状态可将其分为液体培养基和固体培养基
B.可利用固体培养基上菌落的特征来判断和鉴别细菌的类型
C.利用刚果红培养基上是否形成透明圈来筛选纤维素分解菌
D.在无氮培养基中加入酚红指示剂鉴定尿素分解菌
答案 D
解析 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂鉴定尿素分解菌。
8.在纤维素分解菌的鉴定实验中，纤维素酶的测定方法一般是( )
A.对纤维素进行定量测定
B.对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定
C.对纤维素酶分解纤维素后所产生的纤维二糖进行定量测定
D.对纤维素分解菌进行定量测定
答案 B
解析 纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
9.不能够与刚果红反应生成红色复合物的是( )
A.纤维二糖 B.纤维素
C.CMC－Na D.淀粉
答案 A
解析 刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但不与纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖等发生反应。
10.分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是( )
①稀释倒平板法 ②稀释涂布平板法 ③单菌落挑取法 ④选择培养
A.①② B.②③④
C.②③ D.①③④
答案 B
解析 要获得纤维素分解菌，需从取样的土壤中选择分离出样品，然后用稀释涂布平板法将样品接种到鉴别培养基上经筛选获得目的菌，再用单菌落挑取法接种到纤维素分解菌的选择培养基上，最终获得培养物。
11.某微生物培养基的配方如下：NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，(CH2O)30 g，H2O 1 000 mL，青霉素0.1万单位。请回答下列问题：
(1)依物理性质，该培养基属于 培养基。
(2)该培养基中的碳源是 。不论何种培养基，在各成分都溶化后分装前，要进行的是调整pH和 ，倒平板时，一般需冷却至 左右，在 附近操作。
(3)若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去的物质是 ，应加入的碳源是 ，为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入 染料，与纤维素可形成 色复合物，若产生 ，则证明有纤维素分解菌存在。
答案 (1)液体 (2)(CH2O) 灭菌 50 ℃ 酒精灯火焰 (3)(CH2O) 纤维素粉 刚果红 红 透明圈
解析 (1)培养基按物理性质可分为液体培养基和固体培养基等，分析该培养基的成分，该培养基没有添加琼脂，应为液体培养基。(2)其碳源应为(CH2O)，配制培养基时，各成分溶化后要调节pH和灭菌后再分装。倒平板时，培养基应冷却到50 ℃左右，并且在酒精灯火焰附近进行。(3)由于纤维素分解菌能以纤维素为碳源，其他微生物不能，因此若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去(CH2O)添加纤维素粉。检测纤维素分解菌常用的方法是刚果红染色法。
12.某同学为了从土壤中分离得到纤维素分解菌，进行了以下操作。
第一步：土壤取样。用小铁铲和普通信封将土取回，然后倒入一烧瓶中，加蒸馏水稀释，塞好棉塞。
第二步：制备培养基。
成分
含量
纤维素粉
5 g
NaNO3
1 g
Na2HPO4·7H2O
1.2 g
KH2PO4
0.9 g
MgSO4·7H2O
0.5 g
KCl
0.5 g
酵母膏
0.5 g
水解酪素
0.5 g
待上述物质溶解后加蒸馏水定容到1 000 mL
第三步：菌悬液涂布平板。用接种环取少量土壤稀释溶液在以上培养基表层涂布。
第四步：培养观察。把接种好的培养皿放到35 ℃的恒温箱中培养1～2 d，观察并记录菌落的生长情况。
根据以上实验操作，完成下列题目：
(1)找出该同学明显的错误操作并改正。
。
(2)要想增加该实验的说服力，还应该怎么做？
。
答案 (1)第一步：取样工具应提前灭菌；不能用蒸馏水，应用无菌水；土壤取回后的操作应在火焰旁进行。第二步：培养基制备好后应灭菌。第三步：接种应在无菌条件下进行，应用灭菌的吸管或移液器取样品
(2)一是设置对照实验，再配制一组无纤维素粉的培养基，接种该土壤样品培养观察。二是最后要对该微生物进行鉴定，用刚果红染色法鉴定该微生物的菌落，看周围是否出现透明圈
解析 从土壤中分离微生物一般的流程是：土壤取样→选择培养→梯度稀释→菌悬液涂布平板→挑选出单个菌落。该实验步骤不完整，且在前三步操作中都没有进行无菌操作，因而无法说明分解纤维素的微生物一定来自土壤。要想增强实验的说服力，设置对照实验必不可少。
13.一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。现有1 L土壤浸出液，用无菌吸管吸取1 mL至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释至103倍。各取0.1 mL已稀释103倍的稀释液分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液样品中菌体数为 。
(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从用途方面来看，上述培养基的特点是 。
(3)接种技术的核心是 。接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步 ，培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是 或有氧条件抑制了这些细菌的生长。
(4)在培养基上形成的菌落中，无透明圈菌落利用的氮源主要是 ，有透明圈菌落利用的氮源主要是 ，据此可筛选出目的菌。实验结果如下图所示，A～E五种菌株中， 是最理想的菌株。
答案 (1)5.6×108
(2)在无氮培养基中添加了该除草剂
(3)防止杂菌污染，保证培养物的纯度 稀释分散到培养基的表面 培养基中缺少这些细菌可利用的氮源
(4)氮气 该除草剂 E
解析 (1)根据稀释涂布平板法对微生物计数的计算公式：每毫升原土壤浸出液样品中菌体数＝(C÷V)×M＝56÷0.1×103＝5.6×105，则每升原土壤浸出液样品中菌体数为5.6×108。(2)该除草剂是含氮元素的有机物，可以为微生物提供氮源，因此选育能降解该除草剂的细菌应以该除草剂为唯一氮源(无氮培养基中添加了该除草剂)的培养基作为选择培养基。(3)微生物接种技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。平板划线法接种是通过连续划线将微生物稀释分散到培养基的表面，以获得单细胞菌落。由于培养基以该除草剂为唯一氮源，因此不能降解该除草剂的微生物将不能生长。(4)有些自生固氮微生物可以利用大气中的氮气作为氮源，可以在无氮培养基上生长，因此能固氮但不能降解该除草剂的微生物也能生长。但是由于固氮微生物不能降解该除草剂，因此菌落周围不出现透明圈。菌落周围有透明圈的微生物是能够降解该除草剂的微生物，并且降解该除草剂的能力越强，菌落周围出现的透明圈就越大。
[真题体验]
14.(2014·新课标Ⅰ，39)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将 分解成 。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成 色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的 。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲 (填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是 ；培养基乙 (填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是 。
答案 (1)纤维二糖 葡萄糖 (2)红 透明圈
(3)不能 液体培养基不能分离单菌落 不能 乙培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
解析 (1)纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，如下图：
。
(2)刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，且需以纤维素为唯一碳源。
