专题1 传统发酵技术的应用
知识系统构建
必背要语
1.果酒制作中应先通气再密闭，而果醋的制作应始终在有氧条件下进行。
2.当氧气、糖源都充足时，醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸；当缺少糖源时，醋酸菌将乙醇变成乙醛，再将乙醛变成醋酸。
3.腐乳制作的主要菌种是毛霉，毛霉产生的蛋白酶能将蛋白质水解为小分子的肽和氨基酸，脂肪酶能将脂肪水解为甘油和脂肪酸。
4.加盐既可析出豆腐中的水分，又能抑制微生物的生长。
卤汤是由酒和香辛料配制而成的，既能防腐杀菌，又能调味。
5.测定亚硝酸盐的含量用比色法，即在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
6.在腌制泡菜过程中要保证乳酸菌所需的无氧环境。在发酵过程中，亚硝酸盐含量是先增加后减少。
规律方法整合
整合一 四种传统发酵技术的比较
项目
果酒制作
果醋制作
腐乳制作
泡菜制作
菌种
酵母菌
醋酸菌
毛霉
乳酸菌
菌种类别
真核生物
原核生物
真核生物
原核生物
菌种来源
葡萄皮上附着的野生酵母菌
空气中或人工接种
空气中的毛霉孢子
空气中或植物体表附着
代谢类型
异养兼性厌氧型
异养需氧型
异养需氧型
异养厌氧型
原理
C6H12O6＋6O26CO2＋6H2O；
C6H12O62C2H5OH＋2CO2
糖源充足：
C6H12O6＋2O2
2CH3COOH＋2CO2＋2H2O；
缺少糖源：
C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O
蛋白质小分子肽＋氨基酸，脂肪甘油＋脂肪酸
C6H12O62C3H6O3＋能量
发酵条件
前期需氧，后期无氧，温度18～25 ℃
一直需氧，温度30～35 ℃
一直需氧，温度15～18 ℃
无氧、室温
实验流程
挑选葡萄→冲洗→榨汁→→
↓ ↓
果酒 果醋
豆腐长出毛霉(毛坯)→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
①选择原料→修整、洗涤、晾晒、切分成条状或片状
②加盐→盐水冷却→泡菜盐水
③加入调味料，装坛→发酵→成品
④亚硝酸盐含量检测
共同点
都是天然的发酵，利用了微生物新陈代谢过程中代谢产物的作用或直接获取了代谢产物
例1 在制作果酒、果醋、腐乳、泡菜时，关于发酵过程对氧气的需求，叙述正确的是( )
A.四个过程均需氧气参与，无氧时不能完成这四个过程
B.四个发酵过程中只有果酒制作是在完全无氧的条件下完成的
C.泡菜发酵和果酒制作是应用微生物的无氧发酵，而醋酸菌和毛霉则需在有氧条件下才能正常繁殖
D.腐乳制作时密封发酵进行的是无氧发酵
答案 C
解析 果酒制作的原理是利用酵母菌的无氧发酵，但在最初阶段需提供一定氧气，促使酵母菌大量繁殖，获取一定数量菌体后再密封；泡菜制作是利用乳酸菌的无氧呼吸产生乳酸，有氧条件下发酵受抑制；而酿醋和腐乳的制毛坯都需在有氧条件下完成，毛坯腌制后装瓶发酵，是利用了毛霉菌丝中的蛋白酶、脂肪酶等的催化作用，充分使毛坯蛋白质和脂肪分别水解为小分子的肽和氨基酸、甘油和脂肪酸。
方法链接 几种发酵技术对氧气的要求
(1)果酒制作过程：酵母菌的繁殖需大量能量，而发酵过程进行无氧呼吸，故果酒制作的前期应通入氧气，而后期应保证严格的厌氧环境。
(2)果醋制作过程：要求始终通氧，缺氧时醋酸菌的生长、增殖都会受到影响，醋酸的生成也会受到影响。
(3)泡菜制作过程：乳酸菌是严格的厌氧菌，在制作泡菜时，应将装置密封。若密封不严，则很容易造成泡菜变质，甚至发霉变味。
整合二 发酵食品制作过程中防止杂菌污染的措施
1.果酒和果醋制作
(1)材料的选取与处理：选择新鲜的葡萄，榨汁前应先将葡萄冲洗再去枝梗。
(2)防止发酵液被污染。
①榨汁机要清洗干净，并晾干。
②发酵瓶要清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒。
③装入葡萄汁后要封闭充气口。
④发酵装置的排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身连接。
(3)发酵液的无氧、酸性环境不利于杂菌生长。
2.腐乳制作
(1)将腌制腐乳的玻璃瓶洗刷干净后，还要用沸水消毒。
(2)酒、盐、香辛料都有杀菌作用，接种、封瓶时都要进行无菌操作。
(3)装瓶时要迅速小心，装瓶后要用胶条密封，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止瓶口被污染，进而影响腐乳风味。
3.泡菜制作
(1)将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次，起到消毒作用。
(2)用水封闭坛口可以将坛内与坛外空气隔绝，如不封闭则有许多好氧菌生长，蔬菜会腐烂。
(3)食盐、蒜、生姜、香辛料起到杀菌作用，食盐用量不足10%，容易造成细菌大量繁殖。
(4)泡菜坛内的无氧、酸性环境不利于杂菌生长。
例2 某研究性学习小组以樱桃番茄为材料进行果酒、果醋发酵实验。下列相关叙述正确的是( )
A.酵母菌是嗜温菌，所以果酒发酵所需的最适温度较高
B.先供氧进行果醋发酵，然后隔绝空气进行果酒发酵
C.与人工接种的发酵相比，自然发酵获得的产品品质更好
D.适当加大接种量可以提高发酵速率、抑制杂菌生长繁殖
答案 D
解析 醋酸菌是嗜热菌，果醋发酵所需的最适温度较高，A错误；进行果酒和果醋发酵实验时，要先隔绝空气进行果酒发酵，再通入氧气进行果醋发酵，B错误；人工接种菌种单一，自然发酵菌种多样，获得的产品品质较差，C错误；适当加大接种量，让菌体快速形成优势菌群，可以抑制杂菌生长，提高发酵速率，D正确。
热点考题集训
1.下列有关果酒制作过程的叙述，正确的是( )
A.酵母菌与醋酸菌在结构上的主要区别是前者无核膜，后者有核膜
B.酵母菌发酵时要保持有氧环境
C.果汁发酵后是否有酒精产生，可用碱性重铬酸钾溶液来检验
D.酵母菌在无氧条件下利用葡萄汁产生酒精
答案 D
解析 酵母菌是真核生物，有核膜，醋酸菌为原核生物，无核膜，A项错误；酵母菌在无氧条件下进行发酵，B项错误；果汁发酵后是否有酒精产生，可用酸性重铬酸钾溶液来检验，C项错误；酵母菌在无氧条件下利用葡萄汁产生酒精，D项正确。
2.将接种有醋酸菌的葡萄汁100 mL(4份)和接种有酵母菌的葡萄汁100 mL(4份)分别装在100 mL、200 mL、300 mL、400 mL的烧瓶中，将口密封时，置于适宜温度下培养，24小时后产生的醋酸和酒精最多的烧瓶分别是( )
A.100 mL 100 mL B.400 mL 400 mL
C.100 mL 400 mL D.400 mL 100 mL
答案 D
解析 酵母菌只有在无氧条件下进行无氧呼吸时产生酒精；而醋酸菌只有在氧气充足条件下产生醋酸，所以醋酸菌和酵母菌分别在400 mL、100 mL的瓶内发酵效果好。
3.下图为腐乳制作过程的流程图，下列说法不正确的是( )
→→→
A.毛霉为好氧型真菌，为避免其无氧呼吸，摆放豆腐时要留出一定缝隙
B.加盐腌制的目的是析出豆腐中的水分使之变硬，同时能抑制微生物的生长
C.加卤汤、密封腌制中，毛霉不断增殖，并产生大量的酶，分解蛋白质
D.用胶条密封瓶口时，最好将瓶口通过酒精灯的火焰，以防止瓶口污染
答案 C
解析 制作腐乳时，摆放豆腐要留出一定缝隙，这是为了避免好氧型的毛霉进行无氧呼吸，A正确；摆放豆腐时要加盐，加盐的目的，一是析出豆腐中的水分使之变硬，二是抑制微生物的生长，B正确；毛霉为好氧菌，密封腌制中，毛霉不能继续增殖，C错误；加卤汤装瓶后，应将瓶口通过酒精灯的火焰，并用胶条密封瓶口，目的是防止瓶口污染，D正确。
4.在腐乳制作过程中，豆腐含水量、盐的用量、发酵温度和酒的用量等均会影响腐乳的风味和质量。下列相关叙述正确的是( )
A.豆腐含水量过高，腐乳不易成形
B.加盐量过多，腐乳硬度会减小
C.前期发酵温度过低，不影响腐乳“皮”的形成
D.酒的用量过多，后期成熟时间缩短
答案 A
解析 豆腐含水量过高，腐乳不易成形，A项正确；加盐量过多，会使腐乳失水，硬度会增加，同时影响腐乳的风味，B项错误；前期发酵温度过低，会影响腐乳“皮”的形成，C项错误；酒的用量过多，酒精含量过高，腐乳成熟的时间会延长，D项错误。
5.有关泡菜发酵过程的叙述，正确的是( )
A.发酵过程中要经常补充水槽中的水
B.发酵过程中只有乳酸菌的发酵作用
C.发酵过程中乳酸菌可分解蛋白质和果胶
D.发酵时间越长，亚硝酸盐的含量越高
答案 A
解析 水槽中的水可以起到密封发酵坛的作用，因此发酵过程中要经常补充水槽中的水，故A项正确；发酵过程中有多种微生物参与，发酵初期主要是大肠杆菌和酵母菌等活动消耗发酵坛中的氧气，以形成无氧环境，故B项错误；发酵过程中乳酸菌主要分解葡萄糖产生乳酸，故C项错误；随着发酵时间的延长，发酵液中亚硝酸盐的含量先升高，后降低，故D项错误。
6.用酵母菌酿制葡萄酒时，一般酒中所含的酒精成分在12%左右，其原因是( )
A.加水过多
B.原料中用于发酵的糖太少
C.一定浓度的酒精影响酵母菌的存活
D.发酵过程中产热多，高温使酵母菌死亡
答案 C
解析 酒精浓度过高会对酵母菌产生毒害作用，因此用酵母菌酿制葡萄酒时，一般酒中所含的酒精成分在12%左右。
7.下列关于制作果酒、果醋和腐乳的叙述，不合理的是( )
A.在果酒发酵后期拧松瓶盖的间隔时间可延长
B.条件适宜时醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸
C.果酒发酵过程中发酵液密度会逐渐减小
D.将长满毛霉的豆腐装瓶腌制时，底层和近瓶口处需加大用盐量
答案 D
解析 在果酒发酵的后期，酵母菌活动逐渐减弱，产生的CO2逐渐降低，故拧松瓶盖的间隔时间可延长，故A正确；当O2、糖源都充足时，醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸，故B正确；果酒发酵过程中葡萄糖逐渐被分解并释放CO2，发酵液密度会逐渐减小，故C正确；腐乳制作过程中应随层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面要铺厚一些，故D错误。
8.如图是泡菜的制作及测定亚硝酸盐含量的实验流程示意图。下列说法错误的是( )
A.制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜或其他原料，原因是它们的亚硝酸盐含量低
B.发酵过程中应定期测定亚硝酸盐的含量，原因是发酵不同时期亚硝酸盐的含量会发生变化
C.发酵过程中应及时测定亚硝酸盐的含量，以把握食用泡菜的最佳时机
D.测定亚硝酸盐含量的方法是纸层析法
答案 D
解析 泡菜制作成功的标准是咸淡适中、酸度适中、亚硝酸盐含量低，所以制作泡菜时要选用亚硝酸盐含量低的新鲜蔬菜。发酵的不同时期亚硝酸盐的含量会因微生物活动强弱的变化而发生变化，所以应及时检测泡菜中亚硝酸盐的含量，而检测亚硝酸盐含量一般采用比色法。
9.天津独流老醋历史悠久、独具风味，其生产工艺流程如下图。
请回答下列问题：
(1)在糖化阶段添加酶制剂需要控制反应温度，这是因为酶 。
(2)在酒精发酵阶段，需添加酵母菌。在操作过程中，发酵罐先通气，后密闭。通气能提高
的数量，有利于密闭时获得更多的酒精产物。
(3)在醋酸发酵阶段，独流老醋采用独特的分层固体发酵法，发酵30天。工艺如下：
①发酵过程中，定期取样测定醋酸菌密度变化，趋势如图。
据图分析，与颠倒前相比，B层醋酸菌在颠倒后，密度变化的特点是 。由此推测，影响醋酸菌密度变化的主要环境因素是 。
②乳酸含量高是独流老醋风味独特的重要成因。发酵过程中，发酵缸中 层的醋醅有利于乳酸菌繁殖，积累乳酸。
③成熟醋醅中乳酸菌的种类明显减少，主要原因是发酵后期营养物质消耗等环境因素的变化，加剧了不同种类乳酸菌的 ，淘汰了部分乳酸菌种类。
答案 (1)在最适温度条件下催化能力最强
(2)酵母菌
(3)①先快速增长后趋于稳定 氧气、营养物质、pH
②颠倒前的B层和颠倒后的A(或不翻动，或下)
③种间竞争(或竞争)
10.某校同学在实验室开展生物技术实践活动。请回答下列问题：
(1)A组同学制作泡菜。在泡菜腌制的过程中，要注意控制腌制的时间、 和食盐的用量；最后要向坛盖边沿的水槽中注满水，这一操作的目的是 。
(2)B组同学制作腐乳。在制作腐乳过程中，在腐乳表面往往会有一层致密的“皮”，这层“皮”实际上是微生物的 ，对人体无害；加盐的作用是 ，避免豆腐块变质。
(3)C组同学制作蓝莓果酒与果醋。
①某同学对自己的发酵装置定时通过充气口充气，该同学是在制备蓝莓 (填“果酒”或“果醋”)。另一位同学在蓝莓果汁中直接加入某品牌活性酵母，之后先向发酵罐中通入一段时间的无菌空气，通入无菌空气的目的是 。
②在蓝莓果酒制作过程中，在变酸的酒表面观察到的菌膜是由 大量繁殖形成的，其可在缺少糖源时将乙醇变为 ，然后变为醋酸。
答案 (1)温度 保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境
(2)匍匐菌丝 析出豆腐中的水分使其变硬，同时抑制微生物生长
(3)①果醋 有氧条件下，酵母菌迅速繁殖，增加数量
②醋酸菌 乙醛
解析 (1)泡菜制作过程中，由于腌制的时间、温度、盐的用量等都会影响泡菜的品质，因此在制作过程中，要注意控制腌制的时间、温度、盐的用量等；向坛盖边沿的水槽中注满水的目的是保证坛内乳酸菌发酵所需的无氧环境。
(2)在腐乳的制作过程中，毛霉等的匍匐菌丝在豆腐块的表面形成一层皮，使腐乳成形；加盐的作用是析出豆腐中的水分使其变硬，防止腐乳酥烂，同时抑制微生物的生长，避免豆腐块变质。
(3)①由题意知，该同学对自己的发酵装置定时通过充气口充气，说明菌种进行有氧呼吸，因此是果醋的制作过程；利用酵母菌酿酒时，先通入一段时间的无菌空气使酵母菌迅速繁殖，数量增加。
②果酒制作过程中，如果果酒接触空气，醋酸菌会增殖，在果酒表面形成一层菌膜，在缺少糖源时醋酸菌可以将乙醇变为乙醛，然后将乙醛变为醋酸。
第1课时 果酒和果醋的制作
[学习导航] 1.通过回顾“探究酵母菌细胞呼吸的方式”实验，掌握果酒制作的原理。2.结合教材P3图1－3，理解并掌握果酒和果醋制作的过程。3.结合教材P4图1－4b及操作提示，学会设计并安装简单的生产果酒及果醋的装置。
[重难点击] 1.掌握发酵作用的基本原理和方法。2.学习制作果酒、果醋的实际操作技能。3.设计并安装简单的生产果酒及果醋的装置。
一、果酒、果醋制作的原理
1.果酒制作的原理
(1)菌种：酵母菌。
①菌种来源：主要是附着在葡萄皮上的野生型酵母菌。
②代谢类型：异养兼性厌氧型。
③生长繁殖最适温度：20 ℃左右。
④分布场所：分布广泛，尤其种植水果类的土壤中。
(2)发酵原理
条件
反应式
发酵作用
有氧条件
C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O
大量繁殖
无氧条件
C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2
酒精发酵
(3)发酵所需条件
①环境条件：缺氧、pH呈酸性。
②温度：一般控制在18～25 ℃。
2.果醋制作的原理
(1)菌种：醋酸菌。
①菌种来源：人工接种醋酸菌。
②代谢类型：异养需氧型，对氧气的含量特别敏感。
(2)发酵原理
①氧气、糖源充足：醋酸菌将葡萄汁中的糖分解成醋酸。
②氧气充足、缺少糖源：醋酸菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。反应简式如下：C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O。
(3)发酵所需条件
①环境条件：氧气充足。
②温度：最适生长温度为30～35 ℃。
1.发酵菌种
观察下面酵母菌与醋酸菌结构模式图，比较回答：
(1)酵母菌和醋酸菌在细胞结构方面的主要区别是什么？
答案 酵母菌属于真核生物，醋酸菌属于原核生物，酵母菌中有以核膜为界限的细胞核而醋酸菌没有。
(2)酵母菌和醋酸菌的主要细胞分裂方式分别是哪种？
答案 酵母菌主要进行有丝分裂，醋酸菌主要进行二分裂。
(3)酵母菌和醋酸菌发酵场所有何不同？
答案 酵母菌的有氧呼吸场所是细胞质基质和线粒体，无氧呼吸场所是细胞质基质。醋酸菌是原核生物，只能进行有氧呼吸，全过程均在细胞质中进行。
2.发酵原理
(1)在酒精发酵过程中往往“先通气后密封”，为什么？
答案 通气的目的是：使酵母菌进行有氧呼吸大量繁殖；
密封的目的是：使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。
(2)酒精发酵过程中发生“先来水后来酒”现象，其原因是什么？
答案 酵母菌首先进行有氧呼吸产生了水，然后进行无氧呼吸才产生酒精。
(3)为什么果酒搁置时间过久会有酸味，而且表面常有一层菌膜？
答案 醋酸菌在缺乏糖源时，可以将酒精转化为乙醛，再将乙醛转化为醋酸，所以果酒搁置时间过久，会因醋酸菌的代谢而产生醋酸。菌膜是醋酸菌在液面大量繁殖形成的。
(4)醋酸菌进行醋酸发酵时，无论是利用糖源还是酒精，都需要氧气这一重要条件，请说明原因。
答案 醋酸菌是好氧菌，在生活过程中始终需要氧气，如果氧气中断则会引起醋酸菌的死亡。
归纳总结 (1(发酵是通过微生物的培养来大量生产各种代谢产物的过程，包括有氧发酵(如醋酸发酵、谷氨酸发酵(和无氧发酵(如酒精发酵(，发酵不等于无氧呼吸。
(2(果酒的发酵过程分两个阶段——有氧呼吸阶段和无氧呼吸阶段，有氧呼吸阶段的目的是使酵母菌大量繁殖，无氧呼吸阶段是产生酒精的时期。制作过程中产生的酒精更不利于杂菌生长。
(3(醋酸菌是异养需氧菌，对氧气的含量非常敏感，当进行深层发酵时，即使只是短时间中断通入氧气，也会引起醋酸菌的死亡。醋酸菌能氧化多种有机碳源，其氧化能力随菌种而异。
(4(在糖源供应不足的情况下，可以用果酒发酵后产生的乙醇来制造果醋。开瓶后的葡萄酒如果密封不严，很快变酸也是这一原因。
1.下列关于果酒和果醋制作原理的叙述中，正确的是( )
A.果酒和果醋制作分别需要醋酸菌和酵母菌
B.制作果酒或果醋，都需要不断充入氧气
C.果酒和果醋制作过程中都有气体产生
D.酵母菌和醋酸菌都可以利用糖源进行发酵
答案 D
解析 果酒制作需要的微生物是酵母菌，果醋制作需要的微生物是醋酸菌，A错误；由于酵母菌要在无氧状态下才能产生酒精，所以在酒精发酵阶段不能通入氧气，B错误；酵母菌在发酵过程中始终有气体产生，而醋酸菌在缺少糖源时的发酵过程中无气体产生，C错误；酵母菌可以通过无氧呼吸将葡萄糖转化成酒精，醋酸菌可以在氧气和糖源都充足的条件下将葡萄糖转化为醋酸，D正确。
2.下图表示果酒和果醋制作过程中的物质变化过程，相关叙述正确的是( )
③↑ ④↑
＋
A.过程①和②都只能发生在无氧条件下
B.过程①和③都发生在酵母菌的线粒体中
C.过程③和④都需要氧气的参与
D.过程①～④所需的最适温度基本相同
答案 C
解析 过程①为细胞呼吸的第一阶段，有氧、无氧条件均可以发生；过程②为无氧呼吸的第二阶段，只能发生在无氧条件下，故A错误。过程①在细胞质基质中进行，过程③为有氧呼吸的第二、三阶段，在酵母菌线粒体内进行，需要氧气参与，故B错误。过程④为醋酸发酵阶段，在醋酸菌细胞内进行，需要氧气参与，过程③也需要氧气参与，故C正确。过程①②③为酵母菌的呼吸作用，最适宜温度范围为18～25 ℃；过程④为醋酸发酵阶段，最适宜温度为30～35 ℃，故D错误。
易错辨析 果酒与果醋发酵中，酵母菌和醋酸菌代谢原理的辨析
(1)在果酒和果醋的发酵过程中，酵母菌进行有氧呼吸的目的是使酵母菌进行大量繁殖，醋酸菌是好氧菌，在代谢过程中需要吸收氧气。
(2)酵母菌在有氧呼吸和无氧呼吸时都会产生CO2，醋酸菌在缺少糖源时不产生CO2。
二、果酒、果醋的制作流程
1.果酒、果醋的制作流程及装置分析
(1)实验流程
挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵
↓ ↓
果酒 果醋
(2)实验装置
①充气口；②排气口；③出料口。
2.果酒、果醋制作的操作要求及结果分析
(1)材料的选择与处理
选择新鲜的葡萄，先冲洗，再除去枝梗。
(2)防止发酵液被污染
①榨汁机要清洗干净，并晾干。
②发酵装置要清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒。
(3)发酵条件的控制
①装置：将葡萄汁装入发酵瓶，留大约1/3的空间。
②制葡萄酒：关闭充气口；温度控制在18～25 ℃，时间控制在10～12 d左右。
③制葡萄醋：温度控制在30～35 ℃，时间控制在7～8 d左右；适时通过充气口充气。
(4)果酒、果醋制作结果分析
①酒精发酵的结果检测。
a.检测试剂：重铬酸钾。
b.检测条件：酸性条件。
c.实验现象：呈现灰绿色。
②醋酸发酵的结果检测：可通过检测发酵前后的pH作进一步的鉴定。
1.发酵装置的组成及使用
(1)管口①②③分别有什么作用？
答案 ①充气口：在酒精发酵时关闭，在醋酸发酵时连接充气泵充入无菌空气。
②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2。
③出料口：用来取样检测和放出发酵液。
(2)排气口胶管长而弯曲，有何作用？
答案 防止空气中杂菌污染。
2.材料的选择与处理
(1)冲洗时先去梗还是先冲洗葡萄？为什么？
答案 应该先冲洗葡萄再去梗，防止先去梗时损伤葡萄，再冲洗时增加被杂菌污染的机会。
(2)为什么冲洗葡萄的次数不能过多？
答案 以防将葡萄皮上的野生型酵母菌冲洗掉。
3.发酵条件的控制
(1)葡萄汁充入发酵瓶后，为什么不能超过发酵瓶总体积的2/3?
答案 因为有氧呼吸阶段酵母菌需要氧气，保留1/3的体积(空气)可以为酵母菌提供氧气，还可以防止发酵液在发酵过程中溢出甚至引起爆炸。
(2)在果酒和果醋制作过程中，需要控制的温度相同吗？为什么？
答案 不相同。因为二者所用微生物不同，果酒制作利用的是酵母菌，温度应严格控制在18～25 ℃，果醋制作利用的是醋酸菌，温度应严格控制在30～35 ℃。
(3)为防止杂菌污染，实验中采取了哪些措施？
答案 需要从发酵制作的过程进行全面的考虑。例如，①先冲洗葡萄再去梗；②清洗榨汁机和发酵瓶并用体积分数为70%的酒精消毒；③果酒发酵过程中拧松瓶盖，而不是拧开瓶盖。
4.实验结果分析与评价
(1)试分析在果酒制作过程中酵母菌数量、酒精浓度及发酵液的pH分别有何变化。
答案 酵母菌数量、酒精浓度先增加后稳定，发酵液的pH先下降后稳定。
(2)制作果酒时经检测发酵液中酵母菌数量适宜，但是没有产生酒精，试分析可能的原因是什么。
答案 酒精发酵为无氧发酵，可能是发酵瓶密封不严。
(3)试分析在制作果醋时发酵液中醋酸菌的数量、发酵液的pH有何变化。
答案 醋酸菌数量先增加后稳定，发酵液pH先下降后稳定。
(4)制作果醋时，醋酸菌不能大量繁殖，试分析最可能的原因是什么。
答案 最可能是氧气不足造成的。醋酸菌是严格的好氧细菌，短时间缺氧就会大量死亡。
归纳总结 果酒和果醋制作流程和发酵条件的控制
比较项目
果酒制作
果醋制作
发酵温度
18～25 ℃
30～35 ℃
发酵时间
10～12 d
7～8 d
气体控制
先通气一段时间后再密封发酵容器或预留发酵容器1/3的空间
需不断通入氧气(无菌空气)
杂菌控制
①实验材料的冲洗和实验用具的灭菌
②酸性的发酵液具有抑菌的作用
③发酵菌种迅速形成优势种
制作流程
挑选葡萄→冲洗→榨汁→酒精发酵→醋酸发酵
↓ ↓
果酒 果醋
联系
制作果醋可在酒精发酵的基础上进行醋酸发酵
3.下面是果酒和果醋制作的实验流程和某同学设计的果酒和果醋的发酵装置。
下列相关叙述中，错误的是( )
A.根据图1可知，利用葡萄制作果醋时，必须先进行酒精发酵然后再进行果醋发酵
B.冲洗葡萄时不能次数过多，否则果酒的制作会失败
C.图2中的装置中排气管长而弯曲的目的是防止被杂菌污染
D.制作果酒要关闭充气口、打开排气口，制作果醋时充气口和排气口都要打开
答案 A
解析 图1中的流程是酵母菌发酵产生果酒及醋酸菌利用果酒发酵产生果醋的过程，但醋酸菌也可以在糖源和氧气充足的条件下直接利用糖类进行果醋发酵，A错误。个人用简易装置制作果酒时，所利用的酵母菌来自葡萄皮的表面，所以不能将葡萄冲洗次数过多，否则会冲洗掉葡萄皮上的野生酵母菌，B正确。图2中的排气管长而弯曲的目的是防止发酵液被杂菌污染，C正确。由于酵母菌在有氧呼吸阶段利用的氧气来自装置中的空气，且无氧呼吸阶段需要保持无氧状态，所以无需打开充气口，而发酵过程中都会有二氧化碳产生，所以要打开排气口；醋酸菌属于好氧菌，所以要始终将充气口和排气口打开，D正确。
一题多变
(1)图1中的操作流程中，如果果酒发酵完毕，需要改变什么条件后才能继续进行果醋发酵？
答案 一是温度，果酒发酵的适宜温度是18～25 ℃，而果醋发酵的适宜温度是30～35 ℃；二是气体的控制，果酒发酵过程中充气口关闭，但果醋发酵过程中要打开充气口。
(2)图2中出料口的作用是什么？如何检验有无酒精的产生？
答案 出料口的作用是用来取样，检测有无酒精或醋酸的产生。检验酒精的方法是在酸性条件下在样液中加入重铬酸钾溶液，如果溶液变为灰绿色，则说明有酒精产生。
4.下列评价果酒和果醋制作是否成功的方法中，错误的是( )
A.通过观察相关微生物的存在或数量变化进行鉴定
B.通过向果酒发酵液中加入重铬酸钾试剂进行鉴定
C.通过检测果酒发酵前后发酵液的温度变化进行鉴定
D.通过检测果醋发酵前后发酵液的酸碱度变化进行鉴定
答案 C
解析 发酵成功，微生物的数量会增加，A正确。酸性条件下重铬酸钾溶液与酒精反应呈现灰绿色，B正确。果醋发酵过程中醋酸菌产生醋酸，发酵液pH会下降，D正确。
拓展提升 酒精发酵进程的检测
酒精发酵的进程可以通过出料口取样检测，以便及时掌握发酵状况，并根据实际情况及时调控发酵条件。
(1)酵母菌数量的检测：在整个发酵过程中，酵母菌数量应呈“S”型增长。
(2)酒精含量的检测：正常发酵过程中，酒精含量应先增加，后稳定。
果酒制作
果醋制作
1.下列有关酵母菌和醋酸菌的叙述，不正确的是( )
A.两者的正常繁殖都离不开氧气
B.在无氧条件下，酵母菌可以生产酒精，醋酸菌则不能生产醋酸
C.两者都是异养生物，生存都离不开葡萄糖
D.醋酸菌可以以酵母菌的某种代谢产物为原料来合成醋酸
答案 C
解析 醋酸菌是好氧型生物，在氧气充足的环境中才能完成其正常的生命现象；酵母菌属于兼性厌氧型生物，在有氧和无氧环境中都能生存，但其无氧呼吸产生的能量少，不能满足其繁殖对能量的需求，所以两者的正常繁殖都离不开氧气，A、B正确；醋酸菌在缺乏糖源时，能以酒精为原料合成醋酸，而酵母菌在无氧环境中能产生酒精，C错误、D正确。
2.在酿制果醋的过程中，下列相关说法正确的是( )
A.果醋的制作需用醋酸菌，醋酸菌是兼性厌氧型细菌，需先通一段时间氧气后密封
B.在发酵过程中，温度控制在18～25 ℃，发酵效果最好
C.当氧气、糖源充足时，醋酸菌可将葡萄汁中的糖分解成醋酸而酿制成果醋
D.醋酸菌对氧气特别敏感，但仅在深层发酵时缺氧影响代谢活动
答案 C
解析 果醋制作利用醋酸菌发酵，它属于需氧型细菌，所以要始终通入氧气，A错误；果醋制作的适宜温度是30～35 ℃，B错误；糖源和O2充足时醋酸菌可将糖分解为醋酸，C正确；醋酸菌对氧气特别敏感，所以在制作果醋过程中要始终通入氧气，D错误。
3.下列哪种条件下，醋酸菌可以将葡萄汁中的糖分分解成醋酸( )
A.氧气、糖源充足 B.氧气充足、缺少糖源
C.缺少氧气、糖源充足 D.氧气、糖源都缺
答案 A
解析 醋酸菌是一种好氧细菌，当氧气、糖源都充足时，将葡萄汁中的糖分分解成醋酸，A项正确，B、C、D三项均错误。
4.下面是利用微生物制作果酒、果醋的流程示意图，请据图判断下列说法正确的是( )
→→→→→
A.制作果酒时，先用清水冲洗掉葡萄皮表面的白色杂菌
B.榨汁前，榨汁机和发酵瓶都需要用体积分数为30%的盐酸消毒
C.A过程是酒精发酵，A过程完成后，只需要提高一定的温度就能进行果醋发酵
D.根据流程图可知导致发酵产物不同的重要因素是温度、时间、菌种等
答案 D
解析 制作果酒，用清水冲洗时不能除去葡萄皮表面上的白色杂菌；榨汁前要将榨汁机清洗晾干，发酵瓶需要清洗干净并用体积分数为70%的酒精消毒；A过程是酒精发酵，A过程完成后，需要打开充气口并适当提高温度才能进行果醋发酵。
5.某果酒厂的果酒滞销，预计将生产的部分果酒“转变”为果醋。研究人员设置了如图所示的装置，其中乙瓶为发酵瓶。请回答下列问题：
(1)大规模工业化生产果酒时，需要向果汁中接种纯净的 菌种，整个生产过程需要在 条件下进行。
(2)在乙瓶中，当缺少糖源时，醋酸菌先将酒精变为 ，最后变为醋酸。在果醋发酵过程中，需要不断向乙瓶中通入无菌空气，原因是 ；温度应控制在 。
(3)可以用 来检验丙瓶中是否含有酒精。在酸性条件下，该物质与酒精反应使溶液呈 色。
答案 (1)酵母菌 无菌 (2)乙醛 醋酸菌为好氧细菌 30～35 ℃ (3)重铬酸钾 灰绿
解析 (1)大规模工业化生产果酒时，为了提高果酒的品质，需要向果汁中接种纯净的酵母菌菌种，整个生产过程需要在无菌条件下进行。(2)醋酸菌为好氧细菌，当缺少糖源时，醋酸菌在有氧条件下将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸。由于醋酸菌的最适生长温度为30～35 ℃，因此，应将发酵温度控制在此温度范围内。(3)在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应使溶液呈现灰绿色。
课时作业
[学考达标]
1.下列关于用塑料瓶制作果酒和果醋的叙述，正确的是( )
A.为了提高果酒的产出量，果汁应尽量装满发酵瓶
B.醋酸发酵阶段应封闭瓶口，防止杂菌污染
C.制作果酒过程中每天需适时打开瓶盖
D.果酒制成后，可将装置转移至温度较高的环境中制作果醋
答案 D
解析 葡萄汁装入发酵瓶时，要留出大约1/3的空间，既有利于酵母菌有氧呼吸，大量繁殖，又可防止果酒发酵时产生大量二氧化碳使果汁溢出；醋酸发酵是需氧发酵，应通入氧气，发酵时应敞开瓶口并在瓶口盖上纱布以防杂菌污染；制作果酒过程中定时拧松瓶盖既可排出气体又可避免杂菌污染；醋酸菌发酵的适宜温度比酵母菌高。
2.下列防止发酵液被污染的操作中不正确的是( )
A.榨汁机要清洗干净，并晾干
B.发酵瓶要清洗干净，用无水酒精消毒
C.葡萄汁装入发酵瓶后，要密封充气口
D.发酵装置的排气口要通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连
答案 B
解析 发酵中所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物，一旦污染菌种，将导致产量大大下降，甚至得不到产品。榨汁机要清洗干净，并晾干；发酵瓶要清洗干净，并用体积分数为70%的酒精消毒，防止器材上的杂菌进入发酵液；装入葡萄汁后，要密封充气口，防止空气中的杂菌进入；发酵装置的排气口通过一个长而弯曲的胶管与瓶身相连，目的是阻挡外界空气中的杂菌进入发酵液。
3.果汁发酵后，检验是否有酒精产生，下列叙述不正确的是( )
A.可以用重铬酸钾检验
B.需要设计对照实验
C.在酸性条件下，用重铬酸钾检验酒精能出现灰绿色
D.以上的操作需要加热
答案 D
解析 用重铬酸钾检验酒精的实验不需加热。
4.酵母菌培养液常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，其主要原因是( )
A.碳源供应太充足
B.细胞会发生质壁分离
C.酵母菌代谢旺盛，导致培养基严重缺O2，影响菌体生长
D.葡萄糖不是酵母菌的原料
答案 B
解析 酵母菌培养时，外界葡萄糖浓度过高，会导致酵母菌失水过多，影响代谢甚至死亡。
5.在利用葡萄自然发酵产生果酒的过程中，未经杀菌，但其他杂菌不能生长的原因是( )
A.经冲洗后的葡萄上只有野生型酵母菌无其他杂菌
B.其他杂菌不能利用葡萄汁中的糖作碳源
C.在缺氧和呈酸性的发酵液中，酵母菌能生存，其他杂菌不适应环境而被抑制
D.酵母菌发酵产生大量酒精，杀死了其他杂菌
答案 C
解析 冲洗的目的是洗去浮尘，在冲洗过程中，杂菌和酵母菌被洗掉的机会是均等的；异养微生物都能利用糖；其他杂菌不能生长的根本原因是其他微生物不适应缺氧和酸性环境。
6.乙醇等绿色能源的开发备受世界关注。利用玉米秸秆生产酒精，首先要把秸秆用相应的酶进行预处理，然后用特定的微生物在特定的条件下，进行发酵生产酒精。以下关于处理秸秆的酶、微生物种类和特定的条件的选择正确的是( )
A.淀粉酶、乳酸菌、充足氧气
B.纤维素酶、酵母菌、密封
C.纤维素酶、甲烷杆菌、密封
D.脂肪酶、酵母菌、充足氧气
答案 B
解析 玉米秸秆的主要成分是纤维素，要把它转化为葡萄糖才能被酵母菌利用发酵生产酒精，所以秸秆预处理用的酶应该是纤维素酶。而发酵产生酒精的微生物是酵母菌，在发酵过程中没有氧气时，才能进行无氧呼吸产生酒精，所以要严格密封。
[高考提能]
7.下图中甲是果酒和果醋发酵的装置图，乙是果酒和果醋制作过程中发生的物质变化。
下列相关叙述中，错误的是( )
A.用甲装置制作果酒时，要加入适量的酵母菌，且一直关紧阀a，偶尔打开阀b几秒钟
B.用甲装置制作果醋时，发酵后期阀门a要关闭
C.乙图中过程②只能发生在无氧条件下
D.过程③和④都需要氧气的参与
答案 B
解析 由于在制作果酒过程中，第一阶段需要的氧气来自装置中发酵液以上的空气，所以阀门a无需打开；果酒制作过程中，无论是有氧呼吸阶段还是无氧呼吸阶段，都会产生CO2，所以要偶尔打开阀门b，以排出装置中的CO2，A项正确。由于制作果醋所需的微生物是醋酸菌，醋酸菌是好氧菌，所以阀门a要始终打开，B项错误。乙图中过程②是无氧呼吸，需要在无氧条件下进行，C项正确。有氧呼吸(①＋③)需要氧气条件，醋酸发酵(④)也需要氧气，D项正确。
8.酵母菌是兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下均能生长。如果向培养酵母菌的葡萄糖悬浊液中通入空气。在短时间内发生的变化是( )
①乙醇的产量增加 ②乙醇的产量降低 ③葡萄糖消耗下降 ④葡萄糖消耗明显增加
A.②③ B.②④ C.①③ D.①④
答案 B
解析 在有氧条件下，酵母菌进行有氧呼吸产生CO2和H2O，乙醇的产量降低，而酵母菌数量大大增加，使葡萄糖的消耗明显增加。
9.下列关于果酒和果醋的制作原理、发酵过程的叙述，错误的是( )
A.果酒和果醋的发酵菌种不同，但代谢类型相同
B.制作果酒和果醋时都应用体积分数为70%的酒精对发酵瓶消毒
C.变酸果酒的表面观察到的菌膜可能是醋酸菌的菌落
D.果酒和果醋的制作可用同一装置，但需控制不同发酵条件
答案 A
解析 制作果酒的菌种是酵母菌，是兼性厌氧菌，制作果醋的菌种是醋酸菌，是好氧菌。
10.如图装置可用于生物技术实践的相关实验，下列有关叙述不正确的是( )
A.两种装置都可用于果酒的制作
B.利用装置乙制作葡萄酒时，葡萄汁装入发酵瓶要留有大约1/3的空间
C.用装置乙制作果酒时温度应控制在30 ℃左右，制作果醋时应适当降温
D.装置乙的排气口通过一个长而弯曲的胶管，可防止空气中微生物的污染
答案 C
解析 用装置乙制作果酒时温度应控制在18～25 ℃，制作果醋时温度应控制在30～35 ℃。
11.如图简单表示了葡萄酒的酿制过程，请据图分析：
(1)葡萄酒的酿制原理是先通气进行 ，以增加酵母菌的数量，然后再 获得葡萄酒。
(2)随着发酵程度的加深，液体密度会逐渐变小(可用密度计测量)，原因是 。
(3)下列叙述中不正确的是( )
A.在甲中进行搅拌是为了增加溶氧量
B.在甲中，酵母菌的能量来源将全部消耗
C.甲与乙放出的气体主要是二氧化碳
D.揭开丙容器的盖子，可能会有醋酸产生
(4)如果用葡萄酒来制作葡萄醋，请写出反应式： 。醋酸菌最适生长温度范围是 。
答案 (1)有氧呼吸 密封 (2)由于发酵时糖被消耗，产生酒精和CO2，酒精的密度比糖水低 (3)B (4)C2H5OH＋O2CH3COOH＋H2O 30～35 ℃
解析 果酒制作的原理是先通气使酵母菌进行有氧呼吸，以使酵母菌繁殖，增加酵母菌的数量，然后再密封发酵使酵母菌进行无氧呼吸产生酒精。随着发酵程度加深，糖被消耗，酒精含量增加，酒精的密度比糖水低，液体密度会逐渐降低。在通气使酵母菌大量繁殖时，酵母菌的能量主要来自于葡萄糖，不可能被全部消耗，否则缺少原料，酵母菌不能进行无氧呼吸产生酒精。当氧气充足、糖源不足时，葡萄酒可转化为葡萄醋。醋酸菌最适生长温度范围是30～35 ℃。
12.某同学利用图1所示装置制作苹果酒和苹果醋，请分析回答有关问题：
(1)可分别利用酵母菌和 菌制作果酒和果醋，这两种微生物的主要区别是后者为 (填“厌氧”“好氧”或“兼性厌氧”)微生物。
(2)加入苹果汁时，瓶内要留出大约1/3的空间，目的是 。
(3)酵母菌利用苹果汁进行酒精发酵的反应式为 ，密封充气口后可用 检测是否有酒精生成。
(4)要利用苹果酒继续发酵生产苹果醋，接种发酵所用菌种后，需要将发酵温度改变为 ，并 。
(5)图2中能表示装置内液体发酵过程中pH变化的曲线是 。
答案 (1)醋酸 好氧 (2)利于酵母菌进行繁殖；防止发酵旺盛时汁液溢出 (3)C6H12O6→2C2H5OH＋2CO2 (酸性)重铬酸钾 (4)30～35 ℃ 适时通过充气口充气 (5)②
解析 (1)制作果醋所用的微生物是醋酸菌。酵母菌是兼性厌氧微生物，而醋酸菌是好氧微生物。(2)加入苹果汁时，瓶内要留出大约1/3的空间，可利于酵母菌进行繁殖，同时防止发酵旺盛时汁液溢出。(3)在酸性条件下，重铬酸钾可与酒精反应呈现灰绿色。(4)制作果酒时所需的条件是厌氧、18～25 ℃，而制作果醋时所需的条件是有氧、30～35 ℃。(5)初期酵母菌进行酒精发酵时，产生的CO2使溶液pH略微下降，进行果醋发酵时，产生了大量的醋酸，使溶液pH快速下降，所以图2中符合条件的是曲线②。
[真题体验]
13.(2015·江苏，24)下图为苹果酒的发酵装置示意图，下列叙述错误的是(多选)( )
A.发酵过程中酒精的产生速率越来越快
B.集气管中的气体是酵母菌无氧呼吸产生的CO2
C.发酵过程中酵母种群呈“J”型增长
D.若发酵液表面出现菌膜，最可能原因是发酵瓶漏气
答案 ABC
解析 A项错，发酵后期，底物减少、酒精浓度增加等因素，都会造成酒精产生速率减慢；B项错，发酵初期，由于发酵瓶中有氧气，酵母菌能进行有氧呼吸产生二氧化碳；C项错，发酵后期，酵母菌种群增长曲线呈下降趋势；D项对，发酵瓶漏气，会使醋酸菌大量繁殖而形成表面观察到的菌膜。
14.(2014·江苏，24改编)某同学设计了右图所示的发酵装置，下列有关叙述不正确的是( )
A.该装置可阻止空气进入，用于果酒发酵
B.该装置便于果酒发酵中产生的气体排出
C.去除弯管中的水，该装置可满足果醋发酵时底层发酵液中大量醋酸菌的呼吸
D.去除弯管中的水后，该装置与巴斯德的鹅颈瓶作用相似
答案 C
解析 该装置中注水的弯曲部分可阻止空气进入，能用于果酒发酵，A正确；果酒发酵产生的CO2可溶解在弯管的水中，进一步通过水排出，B正确；醋酸菌是好氧菌，因没有通入无菌空气，去除弯管中的水后也不能满足底层发酵液中醋酸菌的呼吸需求，C错误；去除弯管中的水后，该装置的弯管部分也能防止空气中的微生物进入，与巴斯德的鹅颈瓶作用类似，D正确。
15.(2016·全国甲，39)苹果醋是以苹果汁为原料经发酵而成的。回答下列问题：
③↑
(1)酵母菌的呼吸代谢途径如图所示。图中过程①和②是苹果醋生产的第一阶段，在酵母菌细胞的 中进行，其产物乙醇与 试剂反应呈现灰绿色，这一反应可用于乙醇的检验；过程③在酵母菌细胞的 中进行，与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度 。
(2)第二阶段是在醋酸菌的作用下将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，根据醋酸菌的呼吸作用类型，该过程需要在 条件下才能完成。
(3)在生产过程中，第一阶段和第二阶段的发酵温度不同，第一阶段的温度 (填“低于”或“高于”)第二阶段。
(4)醋酸菌属于 核生物，其细胞结构中 (填“含有”或“不含有”)线粒体。
答案 (1)细胞质基质 重铬酸钾 线粒体 快 (2)有氧 (3)低于 (4)原 不含有
解析 (1)图示中的过程①和②分别表示无氧呼吸的第一、第二阶段，其场所均为细胞质基质；橙色的重铬酸钾溶液，在酸性条件下与乙醇(酒精)发生化学反应，变成灰绿色。过程③表示有氧呼吸的第二、第三阶段，其场所分别为线粒体基质和线粒体内膜，即在酵母菌细胞的线粒体中进行。与无氧条件相比，在有氧条件下，酵母菌的增殖速度快。(2)醋酸菌是一种好氧菌，在氧气充足的条件下才能进行旺盛的生命活动，因此将第一阶段产生的乙醇转变为醋酸的过程，需要在有氧条件下才能完成。(3)第一阶段即果酒的制作，所控制的温度范围是18～25 °C，第二阶段即果醋的制作，所控制的温度范围是30～35 °C，所以第一阶段的温度低于第二阶段。(4)醋酸菌属于原核生物，其细胞结构中不含线粒体等复杂的细胞器。
第2课时 腐乳的制作
[学习导航] 1.结合教材P6“腐乳制作的原理”，理解并掌握与腐乳形成有关的微生物及腐乳的优点。2.通过教材P7“实验设计”，掌握腐乳制作的过程。3.结合教材P8“操作提示”，分析影响腐乳制作的条件。
[重难点击] 1.以制作腐乳为例了解传统发酵技术的应用。2.说明腐乳制作过程的科学原理。3.设计并完成腐乳的制作，分析影响腐乳品质的条件。
一、腐乳制作的原理
1.制作菌种
(1)毛霉
(2)其他微生物：如青霉、曲霉、酵母等。
2.发酵原理
(1)蛋白质小分子的肽和氨基酸。
(2)脂肪甘油和脂肪酸。
3.菌种来源
(1)传统腐乳生产中，豆腐块上生长的毛霉来自空气中的毛霉孢子。
(2)现代腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种在豆腐上，可避免其他菌种的污染。
1.毛霉的特点
(1)从细胞结构上分析毛霉有什么特点？
答案 毛霉具有以核膜为界限的细胞核，属于真核生物。
(2)豆腐上长的白毛与毛霉有何关系？腐乳外部致密的“皮”又与毛霉有何关系？
答案 豆腐上长的白毛是毛霉的白色菌丝，严格地说是直立菌丝，在豆腐中还有匍匐菌丝。“皮”是前期发酵时在豆腐表面上生长的菌丝，它能使腐乳成形。
2.腐乳发酵的原理
(1)王致和做腐乳时，为什么要撒许多盐将长毛的豆腐腌起来？
答案 加盐可以析出豆腐中的水分，使豆腐变硬，在后期的制作过程中不会过早酥烂。同时盐能防止杂菌污染，避免豆腐腐败。
(2)在毛霉的代谢过程中主要有哪些物质参与使豆腐发酵变成腐乳的过程？
答案 主要是毛霉产生的蛋白酶和脂肪酶参与腐乳的发酵过程。
(3)腐乳为什么“闻着臭，吃着香”？
答案 豆腐在微生物的作用下可形成具有芳香气味的物质，以及NH3和少量的H2S，前者使腐乳“吃着香”，后者是腐乳“闻着臭”的主要原因。
归纳总结 腐乳的制作原理
菌种
青霉、毛霉、曲霉、酵母等，主要是毛霉
代谢类型
异养需氧型
繁殖方式
孢子生殖
前期发酵
主要是毛霉等微生物生长。需要满足微生物生长所需要的适宜的温度、充足的氧气、一定的湿度
后期发酵
是微生物生长产生的酶发挥作用的过程。需要抑制微生物的生长，主要是控制高盐、无氧等条件，同时加入酒和香辛料
1.下列关于腐乳制作原理的叙述，错误的是( )
A.腐乳制作的实质就是利用发酵技术，将大分子有机物分解为小分子有机物的过程
B.腐乳发酵中，起作用的微生物多为异养真菌
C.腐乳制作的过程中，不能有细菌参与，因此必须严格灭菌
D.家庭自制腐乳时，一般不需单独接种菌种
答案 C
解析 在腐乳制作过程中，起作用的微生物有毛霉、酵母、曲霉、青霉等，但是以毛霉为主；这些微生物多营腐生生活，为异养真菌，广泛分布在空气中，因此家庭制作腐乳，一般不需特别灭菌和单独接种菌种。腐乳的制作过程，就是在适宜条件下，微生物合成的蛋白酶等将不易吸收的大分子蛋白质、脂质等分解为易吸收的小分子有机物的过程。
2.腐乳自然发酵中毛霉起主要作用的原因是( )
A.在毛霉、青霉、曲霉和酵母中只有毛霉为孢子生殖，孢子繁殖速度快
B.毛霉的孢子小，数量多，适于在豆腐上繁殖
C.毛霉分布广泛，且生长迅速
D.只有毛霉的蛋白酶活性高且数量比其他的多
答案 C
解析 在自然发酵中，毛霉起主要作用的原因是毛霉有发达的直立菌丝和匍匐菌丝，生长速度快，能在短时间内形成优势种群，迅速占据空间。
一题多变
(1)上题中腐乳制作过程中参与的微生物在代谢类型上有何异同？
答案 同化作用均为异养型；异化作用类型不同，毛霉、青霉、曲霉均为需氧型，酵母为兼性厌氧型。
(2)上题中毛霉、青霉、曲霉和酵母在豆腐上生长，形成怎样的种间关系？
答案 毛霉、青霉、曲霉和酵母等共同在豆腐上生长，共同从豆腐中获取营养物质，因此它们之间形成竞争关系。
易错辨析 传统腐乳制作与现代腐乳生产的区别
生产方式
比较项目
传统制作
现代生产
是否灭菌
不需灭菌
严格无菌条件
菌种来源
空气中的毛霉孢子
经筛选的优良毛霉菌种
二、实验设计和操作提示
1.实验流程及材料作用
选材：所用豆腐含水量为70%左右，一般切成3 cm×3 cm×1 cm小块
↓
↓
↓
↓
密封腌制
2.操作提示
(1)控制好材料的用量。
①盐的用量
②酒的用量
(2)防止杂菌污染的其他措施。
①玻璃瓶用沸水消毒。
②装瓶时，操作要迅速且小心。
③装瓶后用胶条将瓶口密封。
④密封时，将瓶口通过酒精灯火焰，防止瓶口被污染。
1.温度的控制
从温度的角度考虑，盛夏制作腐乳会有什么不利影响？
答案 毛霉适宜生长的温度是15～18 ℃，若盛夏制作腐乳，此时气温较高，容易导致豆腐腐败变质。
2.盐的用量及作用
(1)加盐的时候为什么随着层数的加高而增加盐的用量，且接近瓶口表面的盐要铺厚些？
答案 因为越靠近瓶口微生物越多，故随着层数加高应增加盐量。在接近瓶口表面的杂菌最多，盐要铺厚一些，以防止杂菌污染。
(2)试分析在腐乳制作中盐具有哪些方面的作用。
答案 ①抑菌作用；②调味；③降低豆腐含水量，使豆腐块变硬。
3.酒的用量和作用
(1)酒在腐乳制作中有哪些作用？
答案 ①具有杀菌、抑菌的作用。②影响腐乳的风味。③影响酶的活性，进而影响腐乳成熟的时间。
(2)卤汤中酒的含量一般控制在多少为宜？酒精含量过高时，腐乳成熟的时间为何会延长？
答案 酒的含量一般控制在12%左右。酒精可抑制蛋白酶的活性，酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用越大，从而使腐乳成熟时间延长。
4.在腐乳制作时腐败变质的可能原因有哪些？
答案 (1)加入的盐、酒或香辛料过少，它们都对微生物的生长具有抑制作用；(2)在加入豆腐的过程中动作不迅速或没有在酒精灯火焰附近进行；(3)发酵瓶密封不严。
归纳总结 影响腐乳品质的主要因素
(1(菌种和杂菌：菌种是生产发酵的关键，如果菌种退化会影响品质。如有杂菌污染则直接影响产品的色、香、味。
(2(温度：温度影响菌丝的生长和代谢。温度过低会延长发酵时间，温度过高易使杂菌生长。
(3(豆腐中的含水量：以70%为宜，含水量过高的豆腐不易成形，含水量过少会影响毛霉的生长。
(4(盐的用量：随豆腐块层数的增加而加大用盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚些。盐浓度过低，腐乳易腐败变质，盐浓度过高，会影响腐乳的口味。
(5(卤汤中的酒量：一般控制在12%左右，过少不足以抑制杂菌，过多会抑制酶的活性而影响后期发酵。
(6(香辛料：加入的香辛料的种类和数量会影响腐乳的风味和质量。
3.回答下列关于腐乳制作的问题：
(1)腐乳是豆腐经微生物发酵后制成的食品。多种微生物参与了该发酵过程，其产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质分解为 和 ；其产生的 能将豆腐中的脂肪水解为 和 。
(2)发酵完成后需加盐腌制，加盐还可以抑制 生长。
(3)腐乳制作的后期可加入由酒和多种香辛料配制而成的卤汤。卤汤除具有一定的防腐作用外，还能使腐乳具有独特的 。
答案 (1)小分子的肽 氨基酸 脂肪酶 甘油 脂肪酸 (2)微生物 (3)风味(其他合理答案也可)
解析 (1)发酵过程中起作用的微生物有多种，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉，毛霉产生的蛋白酶可将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸，产生的脂肪酶能够将豆腐中的脂肪水解为甘油和脂肪酸。
(2)发酵过程中加盐腌制，不仅可以调制风味，而且能够抑制微生物的生长。
(3)腐乳制作后期加入卤汤，卤汤不仅可以防腐，还可以使腐乳具有独特的风味(或香味)。
一题多变
(1)题中卤汤的成分主要有哪些？
答案 腐乳制作过程中后期装瓶时，为丰富腐乳的色、香、味，需加入卤汤，它是由酒及各种香辛料配制而成的。
(2)题中腐乳发酵过程中以哪种微生物为主？它属于哪类微生物？
答案 腐乳发酵过程中以毛霉为主，它属于真菌。
4.腐乳制作过程中，影响腐乳风味和质量的是( )
①盐的用量 ②酒的种类和用量 ③发酵温度 ④发酵时间 ⑤豆腐含水量 ⑥盛豆腐的容器的大小
A.①④⑥ B.①③⑤⑥ C.①②③④⑤ D.①②③④
答案 C
解析 卤汤直接关系到腐乳的色、香、味。卤汤由酒和各种香辛料组成，酒的种类和用量均可影响腐乳的品质。盐的用量也关系到腐乳的风味和质量，盐浓度过低，不足以抑制微生物的生长；盐浓度过高，则影响腐乳口味。豆腐含水量超过70%时，腐乳不易成形，而且影响毛霉的呼吸。发酵温度的高低直接影响微生物的生长和发酵时间。
一题多变
(1)发酵瓶的大小不影响腐乳的质量，但如果选择的容器有裂缝，会对腐乳的制作造成怎样的影响？
答案 如果容器有裂缝，相当于密封不严，会被杂菌污染，导致豆腐腐败变质。
(2)温度为什么会影响腐乳的制作？
答案 腐乳制作的原理是利用微生物(主要是毛霉)产生的蛋白酶和脂肪酶等的作用，而酶的活性受温度的影响，所以温度会影响腐乳的制作。
方法技巧 影响腐乳口味的因素分析
影响腐乳口味的因素是多方面的，可以从以下几个方面进行分析：
(1)豆腐的含水量是否合适。
(2)盐的用量是否合适。
(3)酒的用量是否合适。
(4)香辛料的种类和用量。
(5)辅料的种类。
1.下列微生物参与豆腐发酵的是( )
①青霉 ②酵母菌 ③毛霉 ④曲霉 ⑤小球菌
A.①②④⑤ B.①②③④ C.①③④⑤ D.②③④⑤
答案 B
解析 现代科学研究表明，多种微生物参与了豆腐的发酵，如青霉、酵母菌、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。
2.在多种微生物的协同作用下，普通的豆腐转变成营养佳品腐乳，其中起主要作用的酶是( )
A.淀粉酶、蛋白酶 B.淀粉酶、脂肪酶
C.蛋白酶、果胶酶 D.蛋白酶、脂肪酶
答案 D
解析 腐乳制作过程中，利用了多种微生物产生的多种酶的作用将豆腐中的营养物质转化成小分子有机物，使腐乳具有一定的风味。由于豆腐中的营养物质主要是蛋白质和脂肪，因此起主要作用的酶是蛋白酶和脂肪酶。
3.下列关于腐乳制作的叙述，错误的是( )
A.毛霉可利用其体内的酶将豆腐中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸
B.卤汤中酒的含量越高，杂菌繁殖越快，豆腐越易腐败
C.用盐腌制腐乳的过程中，要控制盐的用量，过低则难以抑制杂菌的生长，导致豆腐腐败
D.其制作过程可以表示为：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制
答案 B
解析 选项A，豆类中含量最多的有机物是蛋白质，毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸；选项B，卤汤中酒的含量过高，会使腐乳成熟的时间延长；选项C，若盐的含量过低，则难以抑制杂菌的生长，使杂菌繁殖加快，进而导致豆腐腐败；选项D，腐乳的制作过程为：让豆腐上长出毛霉→加盐腌制→加卤汤装瓶→密封腌制。
4.下列关于腐乳制作过程中的操作，不正确的是( )
A.先将豆腐切成块放在消毒的笼屉中，保持温度在15～18 ℃，并保持一定的湿度
B.将长满毛霉的豆腐放在瓶中，并逐层加盐，接近瓶口表面的盐要铺厚一些
C.卤汤中酒的含量一般控制在12%左右
D.卤汤中香辛料的作用仅仅是调制风味，且越多越好
答案 D
解析 香辛料可以调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用。含量多少可根据自己的口味来配制，但并不是越多越好。
5.腐乳是我国古代劳动人民创造的一种经过微生物发酵的大豆食品。腐乳味道鲜美，易于消化吸收，所以一直受到人们的喜爱。请结合腐乳制作的原理及流程示意图回答下列问题：
(1)图中a、b分别表示的是 ，它们的来源是 ，作用是
。
(2)过程一中，为保证产品的质量，应采取的措施是
。
(3)过程二具体的操作应该是
，
这样既不使豆腐块过早酥烂，又能避免豆腐块腐败变质。
(4)过程三中卤汤配制所需要的材料有 。
(5)过程四应如何操作才能取得最佳效果
。
答案 (1)蛋白酶和脂肪酶 毛霉等微生物 蛋白酶将蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶将脂肪水解为甘油和脂肪酸
(2)在严格无菌的条件下，将优良毛霉菌种接种在豆腐上
(3)将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，并逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些
(4)12%左右的酒和香辛料
(5)密封时，将瓶口通过酒精灯的火焰，再用胶条密封瓶口
解析 (1)腐乳制作过程主要利用的微生物是毛霉，在毛霉等多种微生物分泌的蛋白酶和脂肪酶的作用下，蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸，脂肪被分解成甘油和脂肪酸。(2)在接种过程中为保证产品的质量，应在严格无菌条件下，将优良毛霉菌种接种在豆腐上。(3)在加盐腌制的过程中要将豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，并逐层加盐，随着层数的加高而增加盐量，接近瓶口表面的盐要铺厚一些，以防杂菌从瓶口进入。(4)卤汤主要有酒和香辛料。加酒可以抑制微生物的生长，同时能使腐乳具有独特的香味，香辛料可以调制腐乳的风味，也具有防腐杀菌的作用。(5)密封时，为防止杂菌污染，应将瓶口通过酒精灯的火焰，再用胶条密封瓶口。
课时作业
[学考达标]
1.以下四种微生物都参与豆腐的发酵，从代谢类型上考虑，与其他三种微生物有明显区别的是( )
A.青霉 B.酵母菌 C.曲霉 D.毛霉
答案 B
解析 四种微生物中，青霉、曲霉和毛霉都是需氧型微生物，而酵母菌属于兼性厌氧型微生物。
2.下列关于腐乳发酵原理的叙述，不正确的是( )
A.多种微生物参与了腐乳发酵
B.装瓶后腐乳坯上的各种微生物会继续发酵
C.发酵过程中蛋白质被分解成小分子的肽和氨基酸
D.发酵过程中毛霉和根霉为互利共生关系
答案 D
解析 发酵过程中毛霉和根霉为竞争关系。
3.卤汤中酒的含量一般控制在12%左右，下列不属于其作用的是( )
A.抑制微生物的生长
B.使腐乳具有独特香味
C.使腐乳中蛋白质变性
D.使后熟期安全度过，延长保质期
答案 C
解析 腐乳的后期发酵需要加酒，目的是防止杂菌污染，由于酒中特别是黄酒中含酵母菌，经发酵可产生醇，并与有机酸结合形成酯，产生特殊的香味。
4.吃腐乳时，腐乳外部有一层致密的“皮”，它是由什么形成的( )
A.腐乳外层蛋白质凝固形成
B.细菌繁殖形成
C.人工加配料形成
D.霉菌菌丝繁殖于表面而形成
答案 D
解析 豆腐坯在一定温度、湿度条件下，毛霉等生长繁殖于腐乳表面，形成大量的菌丝，便形成一层韧而细致的皮膜。对人体无害，皮膜可防止腐乳变质。
5.根据毛霉在新陈代谢中异化作用的特点，下列哪些措施与其有关( )
A.豆腐含水量控制在70%左右
B.控制温度为15～18 ℃
C.用塑料袋罩时不要太严
D.与上述A、B有关
答案 C
解析 毛霉的代谢类型是异养需氧型，其异化作用过程需要氧气，所以用塑料袋罩豆腐块时应留有一定的缝隙，目的就是供给毛霉必需的氧气。
6.豆腐块用食盐腌制，食盐的作用是( )
①渗透盐分，析出水分 ②给腐乳必要的咸味 ③防止毛霉继续生长及防止杂菌污染
A.①②③ B.①③ C.②③ D.①②
答案 A
解析 腐乳制作中，豆腐块与盐的质量比为5 ∶1。初期食盐可从豆腐块中析出水分，使豆腐块变“硬”，防止酥烂；同时，食盐可防止杂菌污染或抑制有害微生物生长，避免腐乳腐败。
[高考提能]
7.下列关于腐乳制作过程中食盐和酒精用量的说法，正确的是( )
A.食盐不能抑制微生物生长，只会影响腐乳口味
B.酒精含量过高促进微生物生长
C.酒精含量过低可能导致豆腐腐败
D.以上说法均不对
答案 C
解析 在腐乳的制作过程中食盐、酒精和香辛料的加入都会抑制微生物的生长。
8.下列有关卤汤的描述，错误的是( )
A.卤汤是决定腐乳类型的关键因素
B.卤汤是由酒和各种香辛料配制而成的，酒的含量应控制在12%左右
C.卤汤可以调制腐乳的风味，并有加强腐乳营养的作用
D.卤汤也有防腐杀菌作用
答案 C
解析 在腐乳制作过程中，前期发酵是相同的，只有后期成熟时因卤汤中香辛料的不同，而形成了腐乳的不同风味，且卤汤中酒的含量应该为12%左右。卤汤中的酒和香辛料都有杀菌作用，卤汤有调味作用，但不能增加营养。
9.腐乳是我国古代劳动人民创造出的一种经过微生物发酵的大豆食品。下面是腐乳制作的实验流程示意图。
???
下列相关叙述中，错误的是( )
A.图中的毛霉来自空气中的毛霉孢子
B.加入盐和卤汤的顺序不能颠倒
C.如果密封不严，则在腌制过程中会感染杂菌而导致腐败变质
D.在高温环境中腐乳制作的时间会大大缩短
答案 D
解析 温度太高会影响毛霉的生存及蛋白酶和脂肪酶的活性，所以并非在高温环境中腐乳制作的时间会大大缩短。
10.请结合腐乳制作的流程示意图判断下列叙述错误的是( )
―→―→―→
① ② ③ ④
A.流程①中，为保证产品的质量，在现代腐乳生产时通常将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上
B.流程②中，需要将长满毛霉的豆腐块分层整齐地摆放在瓶中，并逐层加盐且盐量逐层增加
C.流程③中，卤汤配制中添加12%左右的酒的目的是满足食用者饮酒需要和调节口味
D.流程④中，密封时要将瓶口通过酒精灯的火焰，再用胶条密封瓶口，以防瓶口被污染
答案 C
解析 现代腐乳生产通常在严格无菌的条件下进行，将优良毛霉菌种直接接种在豆腐上，卤汤中加入12%左右的酒的目的是抑制微生物的生长，同时使腐乳具有独特的香味。
11.某实验小组自己动手制作腐乳，他们精心选择豆腐，切成豆腐块，放置在笼屉中，控制温度在15～18 ℃，并保持一定的湿度，几天后发现豆腐块表面已长满毛霉，然后就把长满毛霉的豆腐块分层摆放在瓶中，严格控制每层的盐用量保证均衡。3 d后取出，加入配制的卤汤，控制酒精含量为30%，经过一段时间后取出食用，发现腐乳咸味不均匀，表面还长了一层黄色的某种微生物，难以下咽。
(1)请你帮他们改正制作过程中的四处错误。
① ；
② ；
③ ；
④ 。
(2)毛霉的代谢类型是 ，在毛霉的发酵过程中，现代腐乳的生产和家庭生产的腐乳有很大的不同，主要区别是什么？
。
答案 (1)①加盐应该是随着层数的加高而增加盐量
②加盐腌制的时间过短，应为8 d左右
③腌制的过程中有黄色微生物出现说明盐量太少，没有抑制微生物的生长
④酒精浓度控制的太高，应该为12%左右
(2)异养需氧型 现代腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良的毛霉菌种直接接种到豆腐上，避免其他菌种的污染
12.腐乳是我国古代劳动人民创造出的一种经过微生物发酵的大豆食品。下面是腐乳制作的实验流程示意图。
???
请回答下列相关问题：
(1)腐乳制作的原理是
。
(2)传统的腐乳制作过程中，豆腐块上生长的毛霉来自 ；而现代的腐乳生产是在严格无菌的条件下，将优良的毛霉菌种接种在豆腐上，这样可以 。
(3)腐乳制作过程中，加盐的作用是
。
(4)卤汤是由酒及各种香辛料配制而成的，卤汤中的酒可以选用料酒、黄酒、米酒、高粱酒等，含量一般控制在12%左右。加酒的作用是
。
(5)装瓶时，操作要迅速小心。加入卤汤后要用胶条将瓶口密封，封瓶时最好将瓶口通过酒精灯的火焰，防止 。
答案 (1)毛霉等微生物产生的蛋白酶能将豆腐中的蛋白质分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可将脂肪水解成甘油和脂肪酸 (2)空气中的毛霉孢子 避免其他菌种的污染，保证产品的质量 (3)析出豆腐中的水分，使豆腐变硬，抑制微生物的生长，避免豆腐腐败变质 (4)可以抑制微生物的生长，能使腐乳具有独特的香味 (5)瓶口被污染
解析 (1)制作腐乳的原理是毛霉等微生物可以产生蛋白酶和脂肪酶，蛋白酶可以将大分子的蛋白质水解成小分子的肽和氨基酸，脂肪酶可以将脂肪水解成甘油和脂肪酸。(2)传统工艺制作腐乳时，毛霉来自空气中的毛霉孢子，利用现代工艺制作腐乳时，将优良的毛霉菌种直接接种到豆腐上，可以避免其他杂菌的污染。(3)制作腐乳时加盐可以使豆腐析水变硬，其能抑制其他杂菌的繁殖，还能调味。(4)卤汤中酒的作用一方面可使腐乳具有独特的香味，同时也可以抑制微生物的生长繁殖。(5)封瓶时要将瓶口经过酒精灯火焰，目的是防止杂菌的污染。
13.请完成制作腐乳实验的相关内容：
(1)目的要求
①说明腐乳制作过程的科学原理，设计并完成腐乳的制作。
②在实践中摸索 。
(2)实验步骤
①将豆腐切成3 cm×3 cm×1 cm的若干块。所用豆腐的含水量为70%左右，原因是 。
②将豆腐块平放在铺有干粽叶的平盘内，粽叶可以提供菌种，并能起到 的作用。每块豆腐等距离排放，周围留有一定的空隙。豆腐上面再铺上干净的粽叶。气候干燥时，将平盘用保鲜膜包裹，但不要封严，原因是 。
③将平盘放入温度保持在15～18 ℃的地方，毛霉逐渐生长，大约5 d后豆腐表面丛生着 。
④当毛霉生长旺盛并呈淡黄色时，应去除包裹平盘的保鲜膜以及铺在上面的粽叶，目的是 ，这一过程一般持续36 h以上。
⑤当豆腐凉透后，将豆腐间连接在一起的菌丝拉断，并整齐排列在容器内，准备腌制。
⑥长满毛霉的豆腐块(以下称毛坯)与盐的质量比为5∶1。将培养毛坯时靠近平盘没长直立菌丝的一面统
一朝向玻璃瓶边，将毛坯分层摆放在容器中。分层加盐，并随层数加高而增加盐量，在瓶口表面铺盐厚些，目的是 。约腌制8 d成咸坯。
⑦将黄酒、米酒和糖，按口味不同而配以各种香辛料(如胡椒、花椒、八角、桂皮、姜、辣椒等)混合制成卤汤。
⑧将广口玻璃瓶刷干净后，高压蒸汽灭菌30 min，目的是 ，将腐乳咸坯摆入瓶中，加入卤汤和辅料后，将瓶口用酒精灯加热灭菌，用胶条密封。在常温情况下，一般6个月可以成熟。
答案 (1)②影响腐乳品质的条件
(2)①水分过多则腐乳不易成形 ②保温 以免湿度太高，不利于毛霉的生长 ③直立菌丝 ④使豆腐块的水分和热量迅速散失，同时散去霉味 ⑥防止杂菌从瓶口进入 ⑧彻底杀灭杂菌
解析 (1)目的是学习制作原理，完成腐乳制作，并探究影响腐乳品质的条件。(2)腐乳制作中既要保证毛霉等正常生长繁殖，又要防止杂菌污染。
[真题体验]
14.(2016·江苏，7)下列关于中学“腐乳的制作”实验，叙述正确的是( )
A.加盐主要是为了调节水分，利于毛霉生长
B.加料酒主要是为了灭菌，避免腐乳变质
C.发酵过程中起主要作用的是乳酸菌
D.实验室制作的腐乳不宜直接食用
答案 D
解析 加盐主要是为了抑制微生物的生长，防止豆腐腐败变质，A错误；加料酒主要为了使腐乳具有独特的香味，B错误；发酵过程中起主要作用的是毛霉，C错误；实验室制作的腐乳可能灭菌不彻底，不宜直接食用，D正确。
15.(2015·江苏，17)关于“腐乳的制作”实验，下列叙述错误的是( )
A.将腐乳坯堆积起来会导致堆内温度升高，影响毛霉生长
B.腐乳坯若被细菌污染，则腐乳坯表面会出现黏性物
C.勤向腐乳坯表面喷水，有利于毛霉菌丝的生长
D.装坛阶段加入料酒，可有效防止杂菌污染
答案 C
解析 A项对，将腐乳坯堆积起来会导致微生物大量繁殖，堆内温度升高，影响毛霉生长；B项对，正常情况下，毛霉等菌种会使豆腐表面长出一层菌丝，被细菌污染，腐乳坯表面会出现黏性物；C项错，适于做腐乳的豆腐含水量为70%左右，适于毛霉菌丝生长，再加水不利于腐乳成形；D项对，加入料酒，可抑制杂菌生长。
第3课时 制作泡菜并检测亚硝酸盐含量
[学习导航] 1.通过阅读教材P9“基础知识”，掌握乳酸菌及亚硝酸盐的相关知识。2.通过教材P10～11“实验设计”及“操作提示”，掌握泡菜制作过程，并分析影响泡菜腌制的条件。3.掌握亚硝酸盐含量测定的原理和操作。
[重难点击] 1.尝试制作泡菜。2.尝试用比色法测定泡菜中亚硝酸盐的含量。3.讨论与此相关的食品安全问题。
一、泡菜的制作
1.菌种——乳酸菌
(1)分布广泛：空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内都有分布。
(2)代谢类型：异养厌氧型。
(3)常见种类：乳酸链球菌和乳酸杆菌。其中乳酸杆菌常用于生产酸奶。
2.制作原理
在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解为乳酸。
3.制作的流程
原料加工?新鲜蔬菜修整、洗涤、晾晒、切分成条状或片状
↓
盐水配制?清水∶盐＝4∶1，煮沸冷却
↓
装坛?蔬菜入坛，添加调味料，注入盐水，盖好坛盖，坛盖边沿的水槽中注满水
↓
?测定亚硝酸盐含量
阅读下列材料，探究问题：
泡菜发酵过程中，乳酸菌、杂菌及乳酸含量的变化规律
材料1 发酵初期：蔬菜刚入坛时，其表面带入的微生物，主要以不抗酸的大肠杆菌和酵母菌较为活跃，发酵产物为乳酸、乙醇、醋酸和二氧化碳等。此时泡菜液的含酸量约为0.3%～0.4%，是泡菜初熟阶段，其菜质咸而不酸、有生味。
材料2 发酵中期：由于初期乳酸发酵使乳酸不断积累，pH下降，无氧状态形成，乳酸菌开始活跃，这时乳酸的积累量可以达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8。大肠杆菌、腐生菌、酵母菌、霉菌的活动受到抑制。这一期间为泡菜完全成熟阶段，泡菜有酸味且清香。
材料3 发酵后期：乳酸含量继续增加，可达1.0%以上。当乳酸含量达到1.2%以上时，乳酸菌的活性受到抑制，发酵速度逐渐变缓甚至停止。此阶段泡菜酸度过高，风味不协调。
1.泡菜发酵原理
(1)试写出泡菜发酵过程反应式。
答案 C6H12O62C3H6O3＋能量。
(2)乳酸菌常用于制作酸奶，为什么含有抗生素的牛奶不能发酵成酸奶？
答案 酸奶的制作依靠的是乳酸菌的发酵作用。抗生素能够杀死或抑制乳酸菌的生长，因此含有抗生素的牛奶不能发酵。
(3)发酵初期发酵坛的水槽内会间歇性有气泡冒出，试分析气泡产生的原因。为什么泡菜坛内有时会长一层白膜？
答案 气泡的产生是由于酵母菌等微生物进行细胞呼吸产生的CO2。形成白膜是由于产膜酵母的繁殖。酵母菌是兼性厌氧微生物，泡菜发酵液营养丰富，其表面氧气含量也很丰富，适合酵母菌繁殖。
(4)在坐标系中画出乳酸菌、乳酸含量的“变化”曲线。
答案 如图所示
2.发酵条件的控制
(1)为什么在泡菜制作过程中要保持无氧环境？
答案 制作泡菜所用的菌种是乳酸菌，乳酸菌是一种厌氧菌，只有在无氧环境中才会进行乳酸发酵。
(2)如何制造泡菜制作中的“无氧环境”？
答案 ①选择的泡菜坛要有很好的气密性；②加入蔬菜后要注入盐水并没过全部菜料；③盖上坛盖后要在坛盖边沿的水槽中注满清水。
(3)制作泡菜往往要加入一些白酒，加入白酒有什么作用？
答案 白酒可抑制泡菜表面杂菌的生长，它也是一种调味剂，可增加醇香感。
归纳总结 泡菜发酵过程中乳酸菌、乳酸含量的变化
时期
乳酸菌
乳酸
初期
少(有氧气，乳酸菌活动受抑制)
少
中期
最多(乳酸抑制其他菌活动)
增多，pH下降
后期
减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制自身活动)
继续增多，pH继续下降
变化曲线
1.下列关于乳酸菌的叙述，不正确的是( )
A.乳酸菌的种类很多，常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌
B.乳酸菌在自然界中分布广泛，空气、土壤、植物体表、人或动物的肠道内均有分布
C.乳酸菌是兼性厌氧型微生物
D.乳酸菌可将葡萄糖分解成丙酮酸，再在酶的作用下还原成乳酸
答案 C
解析 乳酸菌在自然界中分布很广泛，种类很多，常见的有乳酸链球菌和乳酸杆菌，它属于严格厌氧型的原核生物。
2.在泡菜的制作过程中，下列叙述不正确的是( )
A.按照清水与盐的质量比为4∶1的比例配制盐水
B.按照清水与盐的质量比为5∶1的比例配制盐水
C.盐水入坛前要煮沸冷却，以防污染
D.在坛盖边沿的水槽中要注满水，以保证坛内的无氧环境
答案 B
方法技巧 发酵过程中杂菌的控制方法
(1)泡菜坛的密闭性及灭菌。
(2)蔬菜的清洗可以防止杂菌繁殖。
(3)食盐的用量合适可以控制杂菌的繁殖。
(4)调味料也具有抑菌的作用。
(5)泡菜盐水的浸泡提供的无氧环境为乳酸菌的繁殖提供条件，同时又能抑制好氧菌繁殖。
二、亚硝酸盐含量的测定
1.亚硝酸盐
(1)物理性质：白色粉末，易溶于水。
(2)应用：在食品生产中用作食品添加剂。
(3)直接危害：当人体摄入总量达0.3～0.5 g时，会引起中毒；当摄入总量达3 g时，会引起死亡。
(4)间接危害：膳食中的绝大部分亚硝酸盐在人体内随尿排出，但在特定条件下，会转变成致癌物——亚硝胺。
(5)我国卫生标准规定
食品类型
肉制品
酱腌菜
婴儿奶粉
亚硝酸盐的残留量(mg·kg－1)
≤30
≤20
≤2
2.亚硝酸盐含量的测定
(1)实验原理
亚硝酸盐＋对氨基苯磺酸生成物；
生成物＋N－1－萘基乙二胺盐酸盐―→玫瑰红色染料。
将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，可大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
(2)方法：比色法。
(3)实验步骤：配制溶液→制备标准显色液→制备样品处理液→比色。
(4)具体流程
1.亚硝酸盐含量的变化
某同学在泡菜腌制过程中每3～4天测一次亚硝酸盐的含量，其结果如下表：
泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化(mg/kg)
坛号
亚硝酸盐含量
腌制天数
1
2
3
封坛前
0.15
0.15
0.15
4天
0.60
0.20
0.80
7天
0.20
0.10
0.60
10天
0.10
0.05
0.20
14天
0.10
0.05
0.20
(1)在下图中绘出1号坛泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化图。
答案
(2)结合曲线和表中数据分析亚硝酸盐含量变化的原因。
答案 泡菜在开始腌制时，坛内环境有利于杂菌的繁殖(包括一些硝酸盐还原菌)，这些细菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐。但随着腌制时间的延长，乳酸菌大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，使其生长繁殖受到影响，同时形成的亚硝酸盐又被分解，因而亚硝酸盐含量下降。
(3)日常生活中不能吃存放时间长、变质蔬菜的原因是什么？
答案 存放时间长、变质的蔬菜中含有大量的亚硝酸盐，亚硝酸盐在特定的条件下会转变成亚硝胺，亚硝胺具有致癌作用，同时对动物具有致畸和致突变作用。
2.亚硝酸盐含量的测定
(1)制备样品处理液时，最后向试管中加入氢氧化铝乳液，过滤后变得透明澄清，试分析氢氧化铝的作用。
答案 氢氧化铝能够吸附样品液中的杂质，使过滤液透明澄清，防止干扰显色反应。
(2)如果样品液显色后，目测比色时发现与标准显色液的浓度不吻合怎么办？
答案 如果不吻合，应在已知浓度范围内，改变浓度梯度，进一步配制标准显色液。
归纳总结 (1)实验中所用各种试剂、药品及作用
①对氨基苯磺酸：与亚硝酸盐发生重氮化反应。
②盐酸：营造酸性环境。
③N－1－萘基乙二胺盐酸盐：与重氮化反应的产物结合生成玫瑰红色染料，作为测定亚硝酸盐含量的指示剂。
④硅胶：干燥剂，用于干燥亚硝酸盐。
⑤干燥后的亚硝酸钠：制备相应浓度的标准显色液。
⑥氯化镉、氯化钡：溶于蒸馏水后作为亚硝酸盐的提取剂。
⑦氢氧化钠：中和过多的盐酸，营造碱性环境。
⑧氢氧化铝：作为吸附剂，使泡菜滤液脱色，变澄清。
⑨蒸馏水：作为溶剂。
(2)亚硝酸盐含量计算公式
亚硝酸盐含量＝
3.下列关于测定亚硝酸盐含量原理的叙述，不正确的是( )
A.亚硝酸盐经一定方式显色反应后呈玫瑰红色
B.显色反应后亚硝酸盐的理化性质没有发生改变
C.不同浓度的亚硝酸盐显色深浅不同
D.样品液显色后，通过与已知浓度的标准显色液比色，可大致估算出样品液中亚硝酸盐的含量
答案 B
解析 显色反应是指在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，所以理化性质发生了改变，故A项正确，B项错误。不同浓度的亚硝酸盐显色深浅不同，因此可以通过与标准显色液比较，大致估算待测液中亚硝酸盐的含量，故C、D项正确。
4.下列关于测定亚硝酸盐含量的操作中，错误的是( )
A.质量浓度为4 mg/mL的对氨基苯磺酸溶液呈酸性
B.对氨基苯磺酸溶液和N－1－萘基乙二胺盐酸盐溶液应避光保存
C.质量浓度为5 μg/mL的亚硝酸钠溶液应保持弱碱性环境
D.制备样品处理液时加入氢氧化铝乳液的目的是中和氢氧化钠
答案 D
解析 制备样品处理液时加入氢氧化铝乳液的目的是吸附样品滤液中的色素等杂质，使滤液变得澄清透明，以便使后续的显色反应更明显。
拓展延伸 检测过程中应注意的问题
(1)标准显色液、样品处理液的制备中计量要精确。
(2)测定亚硝酸盐含量的操作中，注意每次取样要用洗净的筷子、小匙，专人专用，专人清洗。取样后迅速封坛，防止泡菜被污染。
(3)在实验过程中，应比较不同时期亚硝酸盐含量的变化及其对泡菜质量的影响。
(4)比色后，如果发现样品液与标准液浓度不吻合，还应在已知浓度范围内，改变浓度梯度，进一步配制标准显色液，重新比色。
1.泡菜制作过程中，乳酸菌进行无氧呼吸是为了( )
A.获取乳酸 B.获取能量
C.氧化分解有机物 D.获取热能
答案 B
2.某人利用乳酸菌制作泡菜，因操作不当泡菜腐烂。下列原因中不正确的是(多选)( )
A.罐口密闭缺氧，抑制了乳酸菌的生长繁殖
B.罐口封闭不严，氧气抑制了乳酸菌的生长繁殖
C.罐口封闭不严，氧气抑制了其他腐生菌的生长繁殖
D.罐口封闭不严，促进了好氧腐生菌的生长繁殖
答案 AC
解析 乳酸菌是厌氧菌，当发酵过程中，由于密闭不严使氧气进入，会使乳酸菌的生长繁殖受到抑制。同时，由于氧气的进入，使其他好氧菌大量繁殖，导致泡菜腐烂。
3.如图为泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化曲线，其中正确的是( )
答案 C
解析 自然界中，亚硝酸盐分布广泛，没有腌制的蔬菜中也含有一定量的亚硝酸盐，在腌制几天后，泡菜中的亚硝酸盐的含量达到最高峰，但随着腌制时间延长，乳酸菌大量繁殖产生乳酸抑制硝酸盐还原菌的繁殖，致使泡菜中亚硝酸盐含量下降。
4.下列测定泡菜中亚硝酸盐的含量的操作中，用不到的试剂是( )
A.对氨基苯磺酸溶液 B.N－1－萘基乙二胺盐酸盐溶液
C.氯化镉和氯化钡溶液 D.班氏试剂
答案 D
解析 酸性条件下：NO＋对氨基苯磺酸→反应物，反应物＋N－1－萘基乙二胺盐酸盐→玫瑰红色染料，可测定泡菜中亚硝酸盐的含量，氯化镉和氯化钡溶液可用来提取泡菜中的亚硝酸盐。班氏试剂是用于可溶性还原糖鉴定的试剂。
5.泡菜是人们日常生活中比较喜欢食用的一种食品，但是泡菜中却含有亚硝酸盐。某研究性学习小组的同学为了探究泡菜在发酵过程中不同食盐浓度和发酵时间对亚硝酸盐含量变化的影响，设计了相关实验进行研究。请回答下面的问题：
(1)制作泡菜的原理是 ，制作泡菜宜选用新鲜的蔬菜或其他原料，原因是 。
(2)测定亚硝酸盐含量的实验原理是：在 条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生 反应后，与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成 色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，可以估测出泡菜中亚硝酸盐的含量。
(3)如图是该活动小组记录的三种食盐浓度的泡菜中的亚硝酸盐含量与发酵天数的关系图。
根据此实验结果，你认为制作泡菜比较适合的食盐浓度为 ；原因是
。
(4)泡菜的制作方法不当，很容易造成泡菜变质，甚至发霉变味，试分析可能的原因
。
答案 (1)无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸 亚硝酸盐的含量低 (2)盐酸酸化 重氮化 玫瑰红 (3)5% 食盐质量分数为5%的泡菜中亚硝酸盐含量变化最快，说明乳酸菌代谢最旺盛，且在发酵11 d后亚硝酸盐含量降到最低值 (4)泡菜坛子密封不严，或取食工具不卫生，或盐的比例过小，都会引起杂菌滋生，导致泡菜变质
解析 (1)泡菜制作原理是在无氧条件下，乳酸菌将葡萄糖分解成乳酸；与储存时间较久的蔬菜相比，新鲜蔬菜亚硝酸盐含量较低，故制作泡菜宜选择新鲜蔬菜。
(2)亚硝酸盐含量的测定原理是在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料，将显色反应后的样品与标准样品比色，可估测泡菜中亚硝酸盐含量。
(3)图中曲线显示食盐质量分数为5%的泡菜中乳酸菌代谢活动最强，且亚硝酸盐含量下降最快。
(4)乳酸菌为厌氧型微生物，若泡菜坛密封不严或杂菌污染均会导致泡菜腐烂变质。
课时作业
[学考达标]
1.制作泡菜过程中亚硝酸盐的含量变化是( )
A.先减少后增加 B.先增加后减少
C.逐渐增加 D.逐渐减少
答案 B
解析 在泡菜的腌制过程中，由于坛环境内硝酸盐还原菌的繁殖，促进硝酸盐还原为亚硝酸盐，但随腌制时间延长，乳酸菌大量繁殖，产生乳酸，抑制硝酸盐还原菌的繁殖，使亚硝酸盐的含量逐渐下降。
2.在选泡菜坛时，应选择火候好、无裂纹、无砂眼、坛沿深、盖子吻合好的，其目的是( )
A.美观 B.可防止内部液体渗出
C.耐用 D.密封好，保证坛内外气体不交换
答案 D
解析 泡菜的制作离不开乳酸菌，而乳酸菌是厌氧生物，无O2时方可进行乳酸发酵产生乳酸。
3.下列关于亚硝酸盐含量测定原理的描述正确的是( )
A.重氮化→酸化→显色→比色
B.重氮化→酸化→比色→显色
C.酸化→重氮化→显色→比色
D.酸化→重氮化→比色→显色
答案 C
解析 在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成玫瑰红色染料。将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，便可估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
4.泡菜制作过程中，下列对不同时期泡菜坛中乳酸菌含量的叙述，正确的是( )
A.制作泡菜初期并无乳酸菌的存在
B.腌制过程中乳酸菌含量会逐渐增多并达到最高峰，然后下降
C.腌制后期乳酸菌含量会急剧下降
D.腌制的全过程乳酸菌的含量不变，活性不同
答案 B
解析 泡菜的制作是利用蔬菜表面的乳酸菌的代谢，将糖类转化成乳酸，因此发酵初期就有乳酸菌，由于发酵条件的变化，乳酸菌大量繁殖，达到一定量后由于酸度过大，乳酸菌数量会下降。
5.下列是测定亚硝酸盐含量所用的试剂，其中在配制时需加入盐酸的是( )
①对氨基苯磺酸溶液 ②N－1－萘基乙二胺盐酸盐溶液 ③提取剂
A.①②③ B.①② C.①③ D.②③
答案 C
解析 对氨基苯磺酸溶液需将对氨基苯磺酸溶于质量分数为20%的盐酸中；提取剂需用浓盐酸调节pH至1，而N－1－萘基乙二胺盐酸盐溶液是将N－1－萘基乙二胺盐酸盐直接溶于水中制成的，不需加入盐酸。
6.在大小两个容器内加入等量的乳酸菌和葡萄糖的混合液，然后密封瓶口，过一段时间后进行定量分析，应得到的结果是( )
A.小容器的乳酸比大容器的多 B.小容器的乳酸比大容器的少
C.大容器的葡萄糖比小容器的少 D.大容器与小容器中乳酸的量相等
答案 A
解析 由乳酸菌在有氧气存在时呼吸作用受到抑制的特点可知，大容器中氧气多，抑制了乳酸菌的呼吸作用，而小容器中氧含量少，乳酸菌呼吸作用强，因此，小容器中的乳酸应比大容器中的多。葡萄糖的量则相反，即大容器中的葡萄糖比小容器中的多。
[高考提能]
7.下列关于发酵产物的说法，错误的是( )
A.果汁发酵是否产生酒精可以用重铬酸钾来检测
B.检测醋酸产生的简单易行的方法是闻气味
C.泡菜制作产生的亚硝酸盐可以用对氨基苯磺酸和N－1－萘基乙二胺盐酸盐检测
D.检验乳酸产生的简单易行的方法是品尝
答案 D
解析 发酵产物的鉴定不可以用品尝的方法，以防有毒。检验乳酸的方法是用pH试纸检测。
8.人们利用某些微生物制作食品时，需要分析微生物的特点，控制微生物的发酵条件。下列与此有关的各项内容都正确的是( )
选项
A
B
C
D
食品
果酒
果醋
腐乳
泡菜
主要微生物
酵母菌
醋酸菌
毛霉
醋酸菌
制作装置或操作步骤
答案 B
9.下列操作中不会引起泡菜污染的是( )
A.坛盖边沿的水槽应注满水，并且要时常补充水槽中的水
B.腌制时温度过高，食盐量不足10%
C.腌制的时间过短
D.盐水入坛前不用煮沸，直接入坛
答案 A
解析 在泡菜的腌制过程中，要注意控制时间、温度和食盐的用量。温度过高，食盐量不足10%，腌制时间过短，盐水入坛前不煮沸冷却等，都容易引起细菌大量繁殖。
10.泡菜发酵的微生物主要是乳酸菌，而在发酵初期，水槽内经常有气泡产生，这些气泡产生的原因及成分分别是( )
A.乳酸菌是兼性厌氧型微生物，初期进行有氧呼吸产生CO2；气体为CO2
B.因腌制过程中的盐进入蔬菜使蔬菜体积缩小，气体被排出；气体为空气
C.发酵初期活动强烈的是酵母菌，其利用氧产生CO2；气体为CO2
D.乳酸菌在发酵过程中产生了热量，使坛内温度升高，空气受热膨胀排出；气体为空气
答案 C
解析 蔬菜刚入坛时，表面带入的微生物，主要是不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等微生物，较为活跃，它们进行异型乳酸发酵和微弱的酒精发酵产生较多的乳酸、酒精、醋酸和二氧化碳等，二氧化碳以气泡的形式从水槽内放出，逐渐使坛内形成无氧环境。
11.农村中泡菜的制作方法：将新鲜的蔬菜经过整理、清洁后，放入彻底清洗并用白酒擦拭过的泡菜坛中，泡菜坛一般是两头小中间大的陶器，坛口有坛沿，凡有裂缝的菜坛不能用。然后加入盐水、香辛料及一些“陈泡菜水”，密封后置于阴凉处，最适环境温度为28～32 ℃。有时制作的泡菜会“咸而不酸”或“酸而不咸”，前者是用盐过多，后者是用盐过少。
(1)用白酒擦拭泡菜坛的目的是 。
(2)菜坛密封的原因是 。
若菜坛有裂缝，可能会出现的结果是 。
(3)若制作的泡菜“咸而不酸”，最可能的原因是 。
(4)加入一些“陈泡菜水”的作用是 。
(5)制作泡菜的过程中，有机物的干重如何变化？菜坛内有机物的种类如何变化？
。
答案 (1)消毒、杀菌
(2)乳酸菌是严格厌氧型微生物，有氧会抑制乳酸菌发酵 好氧微生物大量繁殖，使泡菜腐败变质
(3)盐的浓度过高，使乳酸菌失水死亡，没有生成乳酸，或产生乳酸过少
(4)提供乳酸菌菌种，使其在短时间内形成菌种优势
(5)有机物干重减少，种类增多
解析 本题主要考查泡菜制作过程及条件控制，分析如下：
(1)
用白酒擦拭的目的是消毒、杀菌，避免泡菜坛中的微生物影响发酵过程
(2)
菜坛密封是为了形成无氧环境，为乳酸菌提供适宜环境；若菜坛有裂缝，则会抑制乳酸菌的发酵，导致好氧微生物大量繁殖，使泡菜腐败变质
(3)
微生物生长需要适宜的渗透压，若外界浓度过高会使微生物失水死亡，不能完成乳酸发酵
(4)
“陈泡菜水”里面乳酸菌含量丰富，利于泡菜的快速发酵
(5)
乳酸菌在进行发酵时，将消耗有机物中的能量，同时将大分子物质分解成许多小分子物质
12.请回答下面有关泡菜发酵过程中的相关问题。
(1)蔬菜刚入坛时，其表面带有不抗酸的大肠杆菌和酵母菌等微生物。其中的酵母菌最初的呼吸作用方式是 ，请写出相关反应式 。
(2)在发酵初期会有气泡从坛沿水槽内的水中间歇性溢出，试说明这些气泡的来源：
。
(3)到发酵中期，无氧状态形成，乳酸菌开始活跃并产生大量乳酸，使乳酸积累量达到0.6%～0.8%，pH为3.5～3.8，试分析此时坛内其他微生物的活动情况及原因 。
(4)发酵后期，乳酸含量继续增加，当达到1.2%以上时，发酵速度逐渐变缓甚至停止，主要原因是 。
(5)请在下列坐标图中画出该过程中乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐含量的变化趋势。
答案 (1)有氧呼吸 C6H12O6＋6O2＋6H2O6CO2＋12H2O＋能量
(2)微生物呼吸作用产生的气体
(3)其他微生物活动减慢甚至停止，因为pH不适宜
(4)pH过低抑制了乳酸菌的生长
(5)如图所示
解析 在泡菜发酵初期，由于发酵坛内有少量氧气，所以酵母菌会进行有氧呼吸并产生CO2气体，随着氧气耗尽，开始进行无氧呼吸，该过程也会产生CO2气体，CO2以气泡的形式从坛沿水槽内溢出。
13.某兴趣小组就“泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化”开展了研究，操作如下：某年1月4日下午选取1、2、3号三只相同的泡菜坛，在每个坛中加入洗净的新鲜莲花菜0.6 kg，再分别倒入相同量的煮沸并冷却的10%的盐水，将坛密封，置于同一环境中。封坛前进行第一次取样测定亚硝酸盐含量，后来定时测定，结果见图。请回答以下问题：
(1)实验中盐水需煮沸并冷却后才可使用，原因是 。在腌制过程中，会出现坛中溶液量增加，这是由于 。
(2)测定亚硝酸盐含量的方法是 ，其原理是：在盐酸酸化条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应后，与N－1－萘基乙二胺盐酸盐结合形成 ，将显色反应后的样品与已知浓度的标准显色液进行目测比较，可以大致估算出泡菜中亚硝酸盐的含量。
(3)该小组对实验数据的处理方法是否合理？ 。并说明理由 。
(4)根据图中数据进一步分析，可推测在腌制过程中的第 d，泡菜中的亚硝酸盐含量达到最大值。若要食用，至少要在腌制的第 d比较好。
(5)实验中3只坛中产生的亚硝酸盐含量存在差异，最可能的原因是 。
答案 (1)加热煮沸是为了杀灭盐水中的杂菌，冷却之后使用是为了保证乳酸菌等微生物的生命活动不受影响 外界溶液浓度过高使细胞渗透失水
(2)比色法 玫瑰红色染料
(3)不合理 应将三个坛中每次测定的亚硝酸盐的含量分别记录，求出平均值，然后以时间为横坐标，亚硝酸盐的含量为纵坐标画出一条曲线
(4)3 10 (5)各坛中微生物种类和数量可能存在差异(其他合理答案也可)
解析 加热煮沸可以杀灭各种杂菌，冷却后再使用，可以使菌种进行正常的生命活动，腌制过程中，外界溶液的浓度大，使细胞渗透失水，增加了坛中溶液量。可以用比色法定量测定亚硝酸盐含量。数据应分别记录，再算出平均值。从三个曲线图中可以看出，在腌制第3 d亚硝酸盐的含量最高，第10 d亚硝酸盐浓度降到比较低的水平，可以食用泡菜。微生物的种类和数量不同可能会导致产生的亚硝酸盐的量存在差异。
[真题体验]
14.(2014·广东，4)下列叙述错误的是( )
A.醋酸菌在无氧条件下利用乙醇产生醋酸
B.酵母菌在无氧条件下利用葡萄汁产生酒精
C.泡菜腌制利用了乳酸菌的乳酸发酵
D.腐乳制作利用了毛霉等微生物的蛋白酶和脂肪酶
答案 A
解析 醋酸菌是好氧型细菌，能在氧气充足的情况下将乙醇转化为醋酸，A错误；酵母菌在无氧条件下利用葡萄糖产生酒精，B正确；泡菜腌制利用的是乳酸菌的乳酸发酵，C正确；腐乳的制作中利用毛霉等微生物的蛋白酶和脂肪酶，D正确。
15.(2015·广东，29)泡菜是我国的传统食品之一，但制作过程中产生的亚硝酸盐对人体健康有潜在危害，某兴趣小组准备参加“科技创新大赛”，查阅资料得到下图。
(1)制作泡菜时，泡菜坛一般用水密封，目的是 。乳酸菌发酵第一阶段的产物有 。
(2)据题图，与第3天相比，第8天后的泡菜更适于食用，因为后者 ；pH值呈下降趋势，原因是 。
(3)该小组得到一株“优选”乳酸菌(亚硝酸盐还原酶活力比普通乳酸菌高5倍)，拟参照资料的实验方案和食盐浓度(4%～10%)，探究与普通乳酸菌相比用“优选”乳酸菌制作泡菜过程中亚硝酸盐含量的高低，并确定其最适条件，请你设计一个实验结果记录表，并推测实验结论。
答案 (1)隔绝空气，创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵 丙酮酸、[H]、ATP
(2)亚硝酸盐含量较低 乳酸菌发酵产生的乳酸增多
(3)两种乳酸菌在泡菜腌制过程中亚硝酸盐含量变化表
乳酸菌类型
及食盐浓度
亚硝酸盐含
量(mg/kg)
发酵时间(天)
普通乳酸菌
“优选”乳酸菌
4%
5%
……
10%
4%
5%
……
10%
1
2
3
……
10
推测实验结论：与普通乳酸菌相比，“优选”乳酸菌制作泡菜时，相同条件下产生的亚硝酸盐含量低。
专题2 微生物的培养与应用
知识系统构建
必背要语
1.实验室常用煮沸消毒法、巴氏消毒法和使用紫外线或化学药剂进行消毒，常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌等。
2.微生物接种最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。长期保存菌种可以采用甘油管藏法。
3.稀释涂布平板法常用来统计活菌的数目，但统计结果往往比实际活菌数目低。
4.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可用尿素作唯一氮源的选择培养基分离该细菌。
5.鉴定分解尿素的细菌的方法是在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，据是否变红进行判断。
6.纤维素酶的作用是：纤维素纤维二糖葡萄糖。
7.刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
规律方法整合
整合一 常见的消毒灭菌方法比较
方法
操作过程
应用范围
煮沸消毒法
100 ℃煮沸5～6 min
日常生活中广泛使用
巴氏消毒法
在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min
牛奶、啤酒、果酒和酱油等不宜进行高温消毒的液体
化学药剂
消毒法
用体积分数为70%～75%的乙醇、碘酒涂抹，来苏水喷洒等
用于皮肤、伤口、动植物组织表面消毒，空气、手术器械、塑料或玻璃器皿等
紫外线
消毒法
30 W紫外灯照射30 min
接种室空间消毒
灼烧灭菌法
酒精灯火焰灼烧
微生物接种工具如接种环、接种针或其他金属用具等，接种过程中试管口或锥形瓶口等
干热灭菌法
干热灭菌箱160～170 ℃加热1～2 h
玻璃器皿(如吸管、培养皿等)、金属用具等凡不适宜用其他方法灭菌而又能耐高温的物品
高压蒸汽
灭菌法
100 kPa、121 ℃维持15～30 min
培养基及多种器材、物品
例1 下列有关微生物培养与应用的说法，正确的是( )
A.天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基
B.接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理
C.大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段
D.分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源
答案 C
解析 天然培养基是成分不明确的培养基，并不是不需加工配制的培养基；实验操作者的双手需进行消毒处理；分离分解尿素的细菌时，尿素是唯一氮源但不是唯一的碳源。
例2 微生物培养过程中，要十分重视无菌操作，现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，以防止杂菌污染，请分析下列操作，错误的是( )
①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢 ②接种操作要在酒精灯火焰附近进行 ③家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌 ④培养基要进行高压蒸汽灭菌 ⑤加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌
A.① B.②③ C.③④ D.③⑤
答案 D
解析 无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中的杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故③⑤操作错误。
整合二 微生物的纯化培养技术
1.技术流程
2.流程解读
(1)无菌技术：主要指消毒和灭菌，实验中对操作者和操作空间进行消毒，对实验用具和培养基进行灭菌。实验过程中严格遵循无菌技术。
(2)倒平板：待培养基冷却到50 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。
(3)平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面，培养后获得由单个菌体繁殖形成的菌落，从而实现菌种的纯化培养。
(4)稀释涂布平板法：先将菌液进行系列梯度稀释后涂布平板，在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而在培养基表面形成单个菌落，实现菌种的纯化培养。
易错易混 (1(自然界中多种微生物混杂在一起，研究菌种时需要将它们分离开来，微生物的纯化培养技术实现了菌种的分离。
(2(平板划线法操作简单，常用于微生物的分离；稀释涂布平板法操作复杂，稀释度足够高时，培养基上生长的菌落大都是由单个细菌形成的，除用于微生物的分离外，还可进行细菌的计数。
例3 1943年，曾获诺贝尔生理学或医学奖的美国科学家鲁里亚和德尔布吕克设计实验，研究大肠杆菌的抗噬菌体突变是发生在接触噬菌体之前还是之后。请阅读以下资料回答下列问题：
培养皿中培养基的基本配方：
配方
蛋白胨
乳糖
KH2PO4
水
琼脂
20%伊红水溶液
0.325%美蓝水溶液
pH
含量
10 g
10 g
2 g
1 000 mL
25 g
20 mL
20 mL
7.2～7.4
(1)在培养基中加噬菌体的作用是 ；加伊红与美蓝的目的是 。
(2)由于大肠杆菌的同化作用类型是 ，因此，在培养基中还加入了一些相应的物质，其中 是大肠杆菌生长的主要碳源， 是氮源。
(3)从生态学的角度看，噬菌体与大肠杆菌这两种生物之间的关系是 。
(4)该实验有两个假设：
假设一：大肠杆菌的抗噬菌体突变发生在大肠杆菌与噬菌体接触之前。
假设二：大肠杆菌的抗噬菌体突变发生在大肠杆菌与噬菌体接触之后。
你认为图中的实验结果支持上述哪个假设： ，如果另一个假设成立的话，实验结果应该是：
。
(5)在这个实验设计中，研究者根据培养皿中菌落数的差异推断，从而证明假设的成立。请你分析出现A4和A5实验结果的原因：
。
答案 (1)选择具有抗噬菌体突变的大肠杆菌 便于识别大肠杆菌菌落 (2)异养型 乳糖 蛋白胨 (3)寄生 (4)假设一 A、B两组所有培养基中菌落数没有显著差异 (5)抗噬菌体变异发生的时间A5比A4早，具有抗噬菌体突变的大肠杆菌数较多，培养皿中出现的菌落数就多
解析 噬菌体与大肠杆菌的关系为寄生，有些大肠杆菌对噬菌体具有抗性，利用加噬菌体的培养基将其筛选出来。伊红美蓝培养基用于特异性鉴别大肠杆菌，其在此培养基上的菌落呈深紫色。大肠杆菌的同化作用类型为异养型，所以培养基中加了乳糖等含碳有机物。由于生物的变异具有不定向性，且通过图示可以看出，将A试管中10 mL菌液先均分到50支试管中再培养24 h以后涂布到50个含噬菌体的平板上，菌落数有了明显差异，说明抗性发生了差异；B试管中10 mL菌液先一起培养24 h后再均分为50份分别涂布，结果各培养基菌落数相当，则说明假设一成立。若假设二成立，则A、B两组所有培养基中菌落数应无显著差异。通过培养基上菌落差异，可以推断出大肠杆菌抗噬菌体变异时间的早晚。A5菌落数为103，A4为7，说明A5变异时间早，经过大量的繁殖，具有抗性的个体远远多于A4。
整合三 有关分解尿素的细菌和纤维素分解菌的比较
1.对比分析尿素分解菌和纤维素分解菌的分离和鉴定
尿素分解菌的分离
纤维素分解菌的分离
原理
提供有利于目的菌株生长的条件(如营养、温度、pH等)，同时抑制其他微生物的生长，常用选择培养基筛选
过程
土壤取样→样品稀释→培养与观察
土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布于含刚果红(CR)鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落→进一步鉴定
鉴定
酚红指示剂(变红)
刚果红(产生透明圈)
培养基
选择培养基：固体培养基，尿素为唯一氮源
选择培养基：液体，富含纤维素
鉴别培养基：固体，加入刚果红
2.分解尿素的细菌和纤维素分解菌的分离流程比较
分离流程
分解尿素的细菌
纤维素分解菌
土壤取样
选择富含有机质的土壤
选择富含纤维素的环境
选择培养
不进行选择培养
液体选择培养基，增加纤维素分解菌的浓度
梯度稀释
梯度稀释到104、105、106倍
梯度稀释101～106倍
涂布平板
涂布到选择培养基
涂布到鉴别培养基
菌种鉴定
培养基中加入酚红指示剂
培养基中加入刚果红染色剂
例4 下列关于尿素分解菌和纤维素分解菌的分离的叙述中，错误的是( )
A.前者需要以尿素为唯一的氮源，后者需要以纤维素为唯一的碳源
B.尿素分解菌能产生脲酶，纤维素分解菌能产生纤维素酶
C.两个过程中都需要梯度稀释
D.刚果红染色法也可以用于鉴定尿素分解菌
答案 D
解析 两种细菌的分离都用到选择培养基，分离尿素分解菌的培养基以尿素为唯一氮源，分离纤维素分解菌的培养基以纤维素为唯一碳源，A正确；两种细菌分别产生脲酶和纤维素酶，B正确；由于在样品中细菌的浓度较大，所以都要进行梯度稀释，C正确；刚果红染色法仅能用于纤维素分解菌的鉴定，D错误。
热点考题集训
1.在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入10%NaCl溶液。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( )
A.金黄色葡萄球菌、硝化细菌、放线菌
B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌
C.霉菌、固氮细菌、金黄色葡萄球菌
D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
答案 C
解析 青霉素可以抑制细菌和放线菌，在添加青霉素的选择培养基上可以筛选分离真菌；在缺乏氮源的培养基上可以筛选分离固氮微生物；加入10%NaCl溶液的培养基可以筛选分离金黄色葡萄球菌，C项正确。
2.3个培养皿中分别加入10 mL不同成分的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36小时后，计数菌落数，结果如下表。下列选项不正确的是( )
培养皿
培养基成分
菌落数
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A.该实验采用的是固体平板培养基
B.该实验采用稀释涂布平板法接种
C.Ⅰ和Ⅱ对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子
D.Ⅱ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长需要糖类
答案 C
解析 培养基中添加了琼脂且能观察到菌落，因此本实验采用的是固体平板培养基，A项正确。对大肠杆菌进行菌落计数用的是稀释涂布平板法，B项正确。Ⅰ和Ⅱ对照，Ⅰ中菌落数比较少，说明生长因子能促进大肠杆菌的生长，C项不正确。Ⅱ和Ⅲ对照，缺少葡萄糖的培养基中大肠杆菌不能生长，说明大肠杆菌的生长需要糖类，D项正确。
3.平板划线法和稀释涂布平板法是纯化微生物的两种常用方法，下列描述正确的是( )
A.都要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.平板划线法是将不同稀释度的菌液通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作
C.稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液倒入液体培养基进行培养
D.都会在培养基表面形成单个菌落
答案 D
解析 平板划线法不需要进行梯度稀释，稀释涂布平板法是将不同稀释度的菌液涂布到固体培养基的表面。平板划线法和稀释涂布平板法都能在培养基表面形成单个菌落。
4.下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是( )
A.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、蒸馏水
B.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、蒸馏水
C.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、蒸馏水
D.KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、蒸馏水
答案 A
解析 要想分离尿素分解菌，应把尿素作为培养基中的唯一氮源。而B项中无氮源，C项中无碳源，D项中牛肉膏、蛋白胨都可以作为氮源。
5.淀粉酶可通过微生物发酵生产获得，生产菌株在含有淀粉的固体培养基上可释放淀粉酶分解淀粉，在菌落周围形成透明圈。为了提高酶的产量，研究人员欲利用诱变育种的方法获得能产生较多淀粉酶的菌株。下列实验步骤中不正确的是( )
A.将生产菌株分为两组，实验组用一定剂量的诱变剂处理，对照组不处理
B.制备含水、淀粉、氮源和无机盐等成分的固体培养基，并进行灭菌处理
C.把实验组的菌株接种于多个配制好的培养基上，同时接种对照组，相同条件下培养
D.观察两组菌株的菌落周围是否出现透明圈，选出有透明圈的菌株即为所需菌株
答案 D
解析 利用诱变育种的方法获得能产生较多淀粉酶的菌株，需要设置对照实验，实验组用诱变剂处理，对照组不处理，从而选出淀粉酶产量高的菌株，A项正确；筛选菌株需要将菌种接种到固体培养基上，培养基需在接种前进行灭菌处理，B项正确；为保证实验结果可靠、可信，要进行重复实验，即将菌种接种在多个培养基上，C项正确；产淀粉酶的菌株在菌落周围都形成透明圈，而产量高的菌株形成的透明圈大，因此应选择透明圈大的菌株进行培养。
6.现有两种固体培养基，已知其配制时所加的成分和含量如下表，用这两种培养基分别去分离土壤中的两种微生物，你认为它们适于分离( )
成分
KH2PO4
MgSO4·7H2O
NaCl
CaSO4·2H2O
CaCO3
葡萄糖
纯淀粉
甲培养基
0.02%
0.02%
0.02%
0.01%
0.5%
0.5%
2%
乙培养基
0.02%
0.02%
0.02%
0.01%
0.5%
－
－
A.甲培养基适于分离自养型自生固氮菌；乙培养基适于分离异养型自生固氮菌
B.甲培养基适于分离异养型自生固氮菌；乙培养基适于分离自养型自生固氮菌
C.甲培养基适于分离酵母菌；乙培养基适于分离真菌
D.甲培养基适于分离自养型共生固氮菌；乙培养基适于分离异养型共生固氮菌
答案 B
解析 固氮菌中能独立生存的是自生固氮菌。甲培养基中含有有机碳源(葡萄糖和淀粉)，无氮源，由此推出该培养基适于分离异养型的自生固氮菌；乙培养基中不含碳源，也不含氮源，所以可用来分离自养型的自生固氮菌。
7.下图表示从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。下列与该实验相关的叙述中不正确的是( )
A.实验中所用的培养基①②③④均属于选择培养基
B.图中Ⅰ、Ⅱ过程实现了对目标微生物的稀释
C.统计⑤处培养基中的菌落数并不一定代表接种到④上的活菌数
D.在⑤处培养基上形成菌落的微生物同化作用类型为异养型
答案 B
解析 该实验的目的是从土壤中分离能分解对羟基苯甲酸的微生物，所以使用的培养基为选择培养基，A项正确。图中Ⅰ、Ⅱ过程为选择培养，目的是增大所分离的微生物的浓度，B项错误。⑤处的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是一个或多个活菌繁殖后形成一个菌落，C项正确。所分离的微生物利用现成的有机物生长繁殖，所以该微生物的同化作用类型为异养型，D项正确。
8.焦化厂活性污泥中富含难降解的有机物苯甲酰肼，是当前焦化行业环保治理的难题。某同学通过查阅资料发现可通过细菌生物降解方法处理焦化厂污染物。下列有关分析错误的是( )
A.配制以苯甲酰肼作为唯一碳源的选择培养基进行筛选
B.利用平板划线法可以对初步筛选出的目的菌进行纯化
C.逐步提高培养基中苯甲酰肼的浓度可以得到高效降解污染物的优质菌株
D.应该从农田土壤中筛选目的菌
答案 D
9.有机农药苯磺隆是一种除草剂，长期使用会污染环境。研究发现，苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。
(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、 四类，该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源，其目的是 。
(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是 。划线的某个平板培养后，第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有 。
(3)为探究苯磺隆的降解机制，将该菌种的培养液过滤离心，取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是 ，该实验设计是否合理？为什么？ 。
答案 (1)氮源和无机盐 使能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖 (2)接种环 ①接种环灼烧后未冷却；②划线未从第一区域末端开始
(3)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 不合理，缺少空白对照
解析 (1)微生物生长繁殖需要的主要营养物质包括碳源、氮源、水和无机盐四类。根据题意可知，土壤中某些微生物有降解苯磺隆的能力，该实验的目的是探索其降解机制，因此，需要从土壤中分离出有降解苯磺隆能力的微生物，故选择培养时为了排除其他碳源的干扰，培养基中唯一碳源只能是苯磺隆。
(2)纯化菌株时，通常使用的划线工具是无菌接种环。划线的平板培养后，发现第一划线区域的划线上不间断地长满了菌落，第二划线区域所划的第一条线上无菌落，而其他划线上有菌落。造成此现象的原因可能有两个：一是接种环灼烧后未冷却，菌种接触到高温的接种环而死亡；二是划第二划线区域第一条线时未从第一区域末端开始。
(3)根据图乙所示实验中的上清液加入蛋白酶溶液推测，实验目的是探究目的菌株是否能分泌降解苯磺隆的蛋白质，实验设计不合理之处是缺少不加蛋白酶溶液、其他条件相同的空白对照。
10.2015年与我国女科学家屠呦呦平分诺贝尔生理学或医学奖的是爱尔兰科学家威廉·坎贝尔和日本药物科学博士大村智，他们二人的贡献是发现了一种新的药物，名为阿维菌素，其衍生产品降低了河盲症和淋巴丝虫病的发病率，同时还能有效对抗其他寄生虫病，治疗效果显著。大村智从土壤样品中分离链霉菌的新菌株，在实验室内通过成千上万链霉菌培养物筛选出一些较有发展前途的菌株，这就是阿维菌素的来源。请回答下列问题：
(1)制备链霉菌培养基时，在各成分都溶化后和分装前，要进行的是 和灭菌，对培养基进行灭菌的常用方法是 。倒平板时要待平板冷凝后，将平板倒置，其主要原因是 。
(2)图①的接种方法是将聚集的菌种进行 后，分散到培养基的表面。在培养基上接种时接种环需通过灼烧灭菌，完成图中划线操作，共需要灼烧接种环 次。图②表示的是用 法接种培养后得到的结果。
(3)在纯化过程中，在固体培养基上划线分离后，经培养，在划线的末端出现 ，表明目的菌已分离纯化。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养。结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快。分析其原因是：振荡培养能提高培养液的 的含量，同时可以使菌体与培养液充分接触，提高 的利用率。
答案 (1)调节pH 高压蒸汽灭菌法 防止培养皿盖上的冷凝水珠落入培养基造成污染，并防止培养基水分过快地挥发
(2)逐步稀释 4 稀释涂布平板
(3)不连续单个菌落
(4)溶解氧 营养物质
第4课时 微生物的实验室培养(一)
[学习导航] 1.阅读教材P14“(一)培养基”，掌握培养基的作用、分类及营养成分。2.阅读教材P15“(二)无菌技术”，区分消毒和灭菌，掌握不同物品的灭菌方法。
[重难点击] 1.了解培养基的基本知识。2.学会无菌操作的基本知识。
一、培养基
1.概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
2.种类
3.成分
(1)主要成分：水、碳源、氮源、无机盐。
(2)其他成分：还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及氧气的要求。
(3)填表完成牛肉膏蛋白胨培养基的营养构成
培养基组分
提供的主要营养
牛肉膏
碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨
碳源、氮源和维生素
NaCl
无机盐
H2O
氢元素、氧元素
(4)某些微生物生长还需要特殊的条件，填表完成培养下列微生物时所需要的特殊条件
培养的微生物
需要满足的其他要求
乳酸杆菌
培养基中添加维生素
霉菌
将pH调至酸性
细菌
将pH调至中性或微碱性
厌氧微生物
需要提供无氧条件
1.培养基的成分与作用
(1)试根据微生物的同化作用类型将微生物进行分类。
答案 分为自养型微生物和异养型微生物。
(2)试从碳源和氮源的角度分析不同类型的微生物所需的培养基成分的特点。
自养型微生物
异养型微生物
碳源
CO2、NaHCO3等无机物
糖类等有机物
氮源
NH3、硝酸盐等无机物
尿素、蛋白质等有机物
2.牛肉膏蛋白胨培养基
(1)牛肉膏蛋白胨培养基中提供碳源和氮源的物质各是什么？
答案 牛肉膏和蛋白胨都可以为微生物提供碳源和氮源。
(2)牛肉膏蛋白胨培养基中主要提供碳源和主要提供氮源的物质各是什么？
答案 主要提供碳源的是牛肉膏，主要提供氮源的是蛋白胨。
归纳总结 培养基的成分及功能
营养要素
含义
作用
主要来源
碳源
凡能提供所需碳元素的物质
构成生物体细胞的物质和一些代谢产物，有些是异养生物的能源物质
无机碳源：CO2、NaHCO3等；
有机碳源：糖类、脂肪酸、花生饼粉、石油等
氮源
凡能提供所需氮元素的物质
合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
无机氮源：NH3、铵盐、硝酸盐等；
有机氮源：尿素、牛肉膏、蛋白胨等
生长因子(特殊营养物质)
生长必不可少的微量有机物
酶和核酸的组成成分
维生素、氨基酸、碱基等
水
在生物体内含量很高，在低等生物体内含量更高
不仅是优良的溶剂，而且可维持生物大分子结构的稳定
培养基、大气、代谢产物等
无机盐
为微生物提供除碳、氮元素以外的各种重要元素，包括某些大量元素
细胞内的组成成分；生理调节物质；某些化能自养菌的能源；酶的激活剂
培养基、大气等环境
1.下列关于培养基的说法正确的是( )
A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B.培养基只有两类：液体培养基和固体培养基
C.除水以外的无机物只能提供无机盐
D.无机氮源不可能提供能量
答案 A
解析 根据培养基的物理性质，可分为液体培养基、半固体培养基和固体培养基，在液体培养基中加入不同量的凝固剂如琼脂可形成半固体或固体培养基；除水以外的无机物如NH4HCO3，既可以是碳源，也可以是氮源，不仅仅提供无机盐；无机氮源有时也能提供能量，如NH3可以为硝化细菌提供能量。
方法链接 培养基的种类
分类标准
培养基种类
培养基特点
作用
物理性质
固体培养基
外观固态
微生物的分离、计数等
半固体培养基
容器放倒不致流出，剧烈振动则破散
观察微生物的运动、鉴定菌种等
液体培养基
呈液态
常用于工业生产
功能
选择培养基
允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长
选择、分离
鉴别培养基
根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品
鉴定
成分
天然培养基
化学成分还不清楚
工业上大规模的微生物发酵生产
来源
合成培养基
化学成分完全了解
在实验室用来对微生物分析
2.下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是( )
原料
①
②
③
④
蛋白胨/g
10
10
10
10
乳糖/g
5
5
5
5
蔗糖/g
5
5
5
5
KH2PO4/g
2
2
2
2
伊红/g
0.4
美蓝/g
0.065
琼脂/g
10
20
NaCl/g
20
蒸馏水/mL
1 000
1 000
1 000
1 000
A.①③ B.②① C.②④ D.③①
答案 D
解析 在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。
一题多变
(1)表格中的蛋白胨主要为微生物提供何种营养成分？
答案 主要为微生物提供碳源、氮源和维生素。
(2)乳糖和蔗糖在培养基中的作用是什么？
答案 可以为微生物提供碳源和能源。
(3)如果用培养基培养某种自养微生物，则该配方中的哪种物质可以去除？
答案 乳糖和蔗糖。
题后总结 有关培养基营养物质的四点提醒
(1)培养不同的微生物所需要的营养物质可能不同。
①自养型微生物的培养基主要以无机营养为主。
②异养型微生物的培养基主要以有机营养为主。
(2)对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源、能源。
(3)微生物需要补充生长因子，是由于缺乏合成这些物质所需要的酶或合成能力有限。
(4)微生物需要量最大的是碳源。能合成含碳有机物的是自养型，反之则为异养型。
二、无菌技术
1.目的：获得纯净培养物。
2.关键：防止外来杂菌的入侵。
3.两种无菌技术的比较
比较项目
消 毒
灭 菌
作用强度
较为温和的理化因素
强烈的理化因素
作用程度
杀死物体表面或内部的部分微生物
杀死物体内外的所有的微生物
芽孢和孢子
一般不能杀灭
能杀灭
适用对象
操作空间、活体生物材料、操作者衣着和双手
操作工具、玻璃器皿、培养基等
常用方法
煮沸消毒法、巴氏消毒法、化学药剂消毒法、紫外线消毒法
灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法
1.“无菌操作”与人们的生活休戚相关，无时无处不在。在日常生活、生产实践、自身健康防护中，有哪些“无菌操作”的例子？
答案 日常生活、生产实践、自身健康防护中“无菌操作”的例子分别有：(1)被褥、鞋袜要常晒；肉制品储存时用盐腌等。(2)家畜阉割后，要在其伤口处涂抹一些酒精或白酒；初冬杨树树干涂刷生石灰水等。(3)打针时，注射部位要用酒精棉球擦洗，一般要在其伤口处涂抹一些碘酒。
2.消毒和灭菌的原理是什么？消毒和灭菌都能杀死所有的微生物吗？是否适用于所有的生物和物品？
答案 (1)都是使微生物的蛋白质变性，借此杀死微生物。
(2)灭菌可杀死处理材料中的全部微生物(包括芽孢和孢子)，而消毒仅能杀死物体表面或内部的部分微生物(一般不包括芽孢和孢子)。(3)不是，无菌技术既要考虑效果，又要考虑操作对象的承受能力。例如，活体生物材料、操作者的双手等只能消毒，而不能灭菌。
3.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
答案 还能有效避免污染环境以及操作者自身被微生物感染。
4.无论是接种微生物还是制备培养基中的倒平板，都要在酒精灯火焰附近进行，请简述理由。
答案 在酒精灯火焰附近进行接种或倒平板，目的是造成一个无菌环境，避免操作过程中受到杂菌的污染。
3.高温灭菌的原理是( )
A.每种微生物生长的最适温度是一定的
B.微生物对于高温环境不适应
C.高温破坏了微生物细胞内的蛋白质、核酸，影响其生命活动
D.高温降低了环境中氧的浓度
答案 C
解析 高温的致死作用主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子物质发生不可逆转的变性。
4.培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手、空气、牛奶所采用的灭菌或消毒方法依次是( )
①化学消毒 ②灼烧灭菌 ③干热灭菌 ④紫外线消毒 ⑤高压蒸汽灭菌 ⑥巴氏消毒法
A.⑤③②①④⑥ B.①②③④⑤⑥
C.⑥②③④①⑤ D.③④②①⑥⑤
答案 A
解析 培养基用高压蒸汽灭菌；培养皿能耐高温，需用干热灭菌；接种环可用灼烧灭菌达到迅速彻底的灭菌效果；实验操作者的双手可用化学药剂进行消毒，如用酒精擦拭双手；对空气可用紫外线消毒；为了不破坏牛奶的营养成分，可采用巴氏消毒法对其进行消毒。
一题多变
(1)接种环灼烧灭菌后为什么不能立即接触菌液？
答案 因为刚刚灼烧后的接种环温度较高，马上接触菌液会将菌种杀死。
(2)选择无菌操作方法的依据除了无菌操作的目的外还有什么？
答案 还要依据无菌操作的对象。
特别提醒 (1)酒精消毒液中酒精浓度对效果的影响：70%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快而凝固成一层保护膜，酒精不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱。
(2)无菌技术措施的选择原则
①考虑效果：灭菌的效果比消毒要好。
②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒的方法，而不能采用灭菌的方法。
1.不同的微生物对营养物质的需求各不相同。下列对一种以CO2为唯一碳源的自养型微生物营养的描述中，不正确的是( )
A.氮源物质为该微生物提供必要的氮元素
B.碳源物质也是该微生物的能源物质
C.无机盐是该微生物不可缺少的营养物质
D.水是该微生物的营养要素之一
答案 B
解析 该微生物以CO2为唯一碳源，但CO2不能为微生物提供能量，不属于能源物质。
2.自养微生物与异养微生物的培养基的主要差别是( )
A.碳源 B.氮源 C.无机盐 D.生长因子
答案 A
解析 自养微生物能够利用二氧化碳和水合成有机物，不利用现成的含碳有机物；而异养微生物只能利用现成的含碳有机物，所以它们的主要区别是碳源不同。
3.下列关于灭菌和消毒的理解，不正确的是( )
A.灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B.消毒和灭菌实质是相同的
C.接种环用灼烧法灭菌
D.常用的灭菌方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法
答案 B
解析 灭菌与消毒是两个概念。灭菌的原理是使蛋白质凝固变性，含水分较多者，其凝固所需温度较低。灭菌时要根据不同的材料选用不同的灭菌方法，如接种环用火焰灼烧法，培养基用高压蒸汽灭菌法，还有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法等。消毒是指使用较为温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。
4.不同的微生物对营养物质的需求各不相同，但一般都需要水、碳源、氮源和无机盐。下列有关微生物所需营养物质的描述，正确的是( )
A.氮源物质只能为该微生物提供必要的氮元素
B.有些碳源也可以给微生物的生长提供能源
C.无机盐是微生物不可缺少的营养物质，所以无机盐越多越好
D.固体培养基中不含水分
答案 B
解析 含氮的有机物既可给微生物提供氮元素，也可给微生物提供能源。含碳的有机物既可给微生物提供碳元素，也可给微生物提供能源。微生物生长需要无机盐，但不是越多越好，过多会导致培养基渗透压过高，使微生物因失水过多而不能生存。固体培养基中也含有水分，因为含有凝固剂琼脂，所以呈固态。
5.下列实验材料和用具的无菌操作中，适合使用消毒方法的是 ，适合使用灭菌方法的是 。
①培养基 ②外植体 ③操作者双手 ④锥形瓶 ⑤接种环 ⑥牛奶 ⑦工作台 ⑧培养皿
答案 ②③⑥⑦ ①④⑤⑧
课时作业
[学考达标]
1.关于微生物的营养，下列说法正确的是( )
A.同一种物质不可能既作碳源又作氮源
B.凡是碳源都能提供能量
C.除水以外的无机物仅提供无机盐
D.无机氮源也可能提供能量
答案 D
解析 对一些微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源，又是氮源。CO2是光能自养细菌的碳源，但不能提供能量。CO2和N2是无机物，也是微生物的碳源和氮源。硝化细菌所利用的氮源是无机氮源氨，同时氨也为硝化细菌提供用以化能合成作用的能源。
2.下列关于培养基的说法，正确的是( )
A.为微生物的生长繁殖提供营养基质的是固体培养基
B.培养基只有两类：液体培养基和半固体培养基
C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D.微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的菌落
答案 D
解析 培养基是微生物生长繁殖的营养基质，根据培养基的物理性质不同，可将培养基分成固体培养基、液体培养基和半固体培养基；液体培养基不加凝固剂。
3.下表是对四种生物的能源、碳源、氮源、新陈代谢类型的描述，正确的一组是( )
选项
项目
硝化细菌
乳酸菌
根瘤菌
衣藻
A
能源
NH3
乳酸
N2
光能
B
碳源
CO2
糖类等
糖类等
CO2
C
氮源
NH3
N2
N2
NO
D
代谢类型
自养需氧型
异养厌氧型
自养需氧型
自养需氧型
答案 B
解析 从能源来看，乳酸菌需糖类等有机物供能；从氮源来看，乳酸菌需要NH、NO；从代谢类型来看，根瘤菌为异养需氧型；从碳源来看，硝化细菌与衣藻需CO2，乳酸菌和根瘤菌需糖类等有机物。
4.下列选项中不含有微生物的是( )
A.洗干净的脸上 B.洗完澡后的皮肤
C.刷完牙后的口腔 D.灼烧之后的接种环
答案 D
解析 用清水洗脸、洗澡、刷牙只是起清洁作用，达不到灭菌效果，只有灼烧过的接种环才是真正无菌的。
5.将配制好的培养基进行灭菌，应用的是( )
A.灼烧灭菌 B.高压蒸汽灭菌 C.干热灭菌 D.煮沸灭菌
答案 B
6.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽灭菌、酒精擦拭、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法依次用于杀死哪些部位的杂菌( )
A.接种环、手、培养基 B.高压锅、手、接种环
C.培养基、手、接种环 D.接种环、手、高压锅
答案 C
解析 高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌；用酒精擦拭双手是消毒的一种方法；火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。
[高考提能]
7.在微生物的实验室培养中，下列各项操作不需要在无菌条件下进行的是( )
A.配制培养基 B.倒平板 C.接种 D.培养
答案 A
解析 配制培养基时不需要无菌操作，因为配制好的培养基需要进行高压蒸汽灭菌。
8.甲、乙、丙为三种微生物，下表中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ中正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是( )
培养基
粉状硫10 g
K2HPO44 g
FeSO40.5 g
蔗糖10 g
(NH4)2SO40.4 g
H2O
100 mL
MgSO49.25 g
CaCl20.5 g
Ⅰ
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
Ⅱ
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
＋
Ⅲ
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
＋
注：“＋”表示培养基中加入了这种物质，“－”表示培养基中没有加入这种物质。
A.甲、乙、丙都是异养微生物
B.甲、乙都是自养微生物，丙是异养微生物
C.甲是异养微生物，乙是固氮微生物，丙是自养微生物
D.甲是固氮微生物，乙是自养微生物，丙是异养微生物
答案 D
解析 Ⅰ是无氮培养基，只有能固氮的微生物才能在其上繁殖；Ⅱ是不含有机碳源的培养基，只有自养微生物才能在其上繁殖。
9.牛肉膏蛋白胨培养基中加入琼脂这一理想的凝固剂，下列关于琼脂的说法不正确的是( )
A.不被所培养的微生物分解利用，对所培养的微生物无毒害作用
B.在微生物生长温度范围内保持固体状态
C.琼脂凝固点低，利于微生物的生长
D.琼脂在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强
答案 C
解析 琼脂作为一种理想的凝固剂，是由其性质决定的，琼脂不会被微生物利用且对微生物无毒害作用，在灭菌过程中不会被破坏，透明度好，凝固力强。琼脂在98 ℃以上可溶解于水，在45 ℃以下凝固，所以在微生物生长温度范围内保持固体状态。
10.下列关于无菌操作的叙述，错误的是( )
A.对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行灭菌
B.将用于微生物培养的培养器皿、接种用具和培养基等进行灭菌
C.为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行
D.实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围物品相接触
答案 A
解析 对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒而不是灭菌。
11.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法：
(1)培养细菌用的培养基；
(2)玻璃棒、试管、烧瓶和吸管；
(3)实验操作者的双手。
判断：
(1) ；
(2) ；
(3) 。
答案 (1)需要灭菌；用高压蒸汽灭菌锅灭菌 (2)需要灭菌；干热灭菌箱灭菌 (3)需要消毒；用75%酒精擦拭双手
12.为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制的培养基的配方如下，请分析回答下列问题：
蛋白胨
乳糖
蔗糖
K2HPO4
伊红
美蓝
蒸馏水
10 g
5 g
5 g
2 g
0.4 g
0.065 g
1 000 mL
将培养基pH调至7.2
(1)该培养基所含碳源有 ，其功能是 。
(2)该培养基所含氮源有 ，其功能是 。
(3)该培养基除含碳源、氮源外，还有微生物需要的营养物质是 。
(4)该细菌在同化作用上的代谢类型是 型。
(5)该培养基可用来鉴别哪种细菌( )
A.霉菌 B.酵母菌 C.大肠杆菌 D.乳酸菌
答案 (1)乳糖、蔗糖、蛋白胨 主要用于构成微生物的细胞物质和一些代谢产物
(2)蛋白胨 主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物
(3)水、无机盐(或K2HPO4)
(4)异养 (5)C
解析 根据培养基的配方，该培养基培养异养微生物，含C、H、O、N的蛋白胨既是碳源，又是氮源。培养微生物需碳源、氮源、水、无机盐、生长因子等营养物质。伊红美蓝培养基可用来鉴定是否含有大肠杆菌。
13.分析有关微生物的资料，回答下列问题。
1982年澳大利亚学者从胃活检组织中分离出幽门螺杆菌。
(1)幽门螺杆菌的遗传物质集中分布的区域称为 。
(2)上图4支试管分别代表4种微生物在半固体培养基(琼脂含量3.5 g/L)中的生长状态，其中②号试管代表幽门螺杆菌的生长状态，由图判断，该菌在 的条件下不能生长。产甲烷细菌的生长状态最可能由试管 代表。
(3)下表是某培养基的配方。
成分
葡萄糖
KH2PO4
MgSO4
NaCl
CaSO4
CaCO3
琼脂
蒸馏水
含量
10 g
0.2 g
0.2 g
0.2 g
0.2 g
5 g
3.5 g
1 L
将幽门螺杆菌接种到pH适宜的该培养基中，置于37 ℃下培养一段时间后，在该培养基中幽门螺杆菌的数目比刚接种时 ，主要原因是 。
(4)幽门螺杆菌形态如下图所示，该菌在人体中可引起胃溃疡等胃部疾病。幽门螺杆菌生长的最适pH为6～7，人体胃腔内pH在1～2之间，但胃黏膜的黏液层靠近上皮细胞侧pH为7.4左右。若幽门螺杆菌随食物进入胃腔，结合其结构特点以及能导致胃溃疡的特性，推测该菌在胃内如何存活？
。
答案 (1)拟核(核区) (2)氧气浓度过高或过低 ③
(3)少 缺少氮源(缺少氮源和生长因子)
(4)幽门螺杆菌进入胃腔后，首先依靠鞭毛运动到pH较高处缓冲，然后分泌蛋白中和胃酸，提高pH，以便继续生存和繁殖
解析 (1)幽门螺杆菌为原核生物，没有以核膜为界限的细胞核，遗传物质集中在拟核。(2)幽门螺杆菌生活在半固体培养基的中部，说明它不能生活在氧气浓度过高或过低的地方；产甲烷菌为厌氧型细菌，应生活在半固体培养基的底部。(3)培养基中缺乏氮源，幽门螺杆菌不能正常生活，数量会减少。(4)幽门螺杆菌进入胃腔后，可以先依靠鞭毛运动到pH较高处缓冲，然后分泌蛋白中和胃酸，提高pH，以便继续生存和繁殖。
[真题体验]
14.(2014·大纲，4)某同学在①、②、③三种条件下培养大肠杆菌，这三种条件是：
①以葡萄糖为碳源的培养基，不断补充培养基，及时去除代谢产物 ②以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物 ③以葡萄糖和乳糖为碳源的培养基，不补充培养基，不去除代谢产物
根据培养结果绘制的一段时间内菌体数的对数随时间变化的趋势图如下：
假设三种培养基中初始总糖量相等，则①、②、③三种条件依次对应的趋势图是( )
A.甲、乙、丙 B.乙、丙、甲
C.丙、甲、乙 D.丙、乙、甲
答案 C
解析 ①以葡萄糖为碳源的培养基，不断补充培养基，及时去除代谢产物，随着时间的延长、菌体数不断增加，对应图丙。②以葡萄糖为碳源的培养基，不补充培养
基，不去除代谢产物，随着营养物质的消耗和次级代谢产物的积累，大肠杆菌的生长环境不断恶化，生存阻力增大，因此种群增长到达稳定期后会进入衰亡期，对应图甲。③培养基中含有葡萄糖和乳糖，大肠杆菌先利用葡萄糖，葡萄糖消耗完后，大肠杆菌会经过短期的调整，诱导合成β-半乳糖苷酶等，分解利用乳糖，随着时间的延长，营养物质消耗完，生存阻力增大，最终衰亡，对应图乙。
15.(经典高考题)在自制酸奶的过程中，除了高温加热以外，其他灭菌方法还有( )
A.紫外线照射 B.真空包装
C.用保鲜膜密闭 D.添加防腐剂
答案 A
第5课时 微生物的实验室培养(二)
[学习导航] 1.通过阅读教材P16～17“(一)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基”，掌握配制培养基的步骤和倒平板操作的过程。2.结合教材P18～19“(二)纯化大肠杆菌”，理解并掌握利用平板划线法和稀释涂布平板法来纯化微生物的方法。
[重难点击] 1.掌握制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的方法。2.学会用平板划线法和稀释涂布平板法纯化微生物。
一、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
牛肉膏蛋白胨固体培养基是细菌培养中常用的一种培养基，大肠杆菌的纯化就是用的该培养基。
1.牛肉膏蛋白胨培养基的成分及各成分提供的营养
培养基组分
提供的主要营养物质
牛肉膏5.0 g
碳源、氮源、磷酸盐和维生素
蛋白胨10.0 g
碳源、氮源和维生素
NaCl 5.0 g
无机盐
蒸馏水定容至1 000 mL
氢元素、氧元素
2.制备步骤
(1)培养基的配制
计算：根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制100 mL培养基时各成分的用量
↓
称量
↓
溶化
↓
调节pH：1 moL的NaOH、pH试纸，将pH调为7.4 ～7.6
↓
分装：趁热分装到洁净锥形瓶中
↓
加棉塞：用棉花不用脱脂棉，脱脂棉吸水
↓
包扎：外包牛皮纸，且挂标签
(2)灭菌
(3)倒平板
①将灭过菌的培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞。
②右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰。
③用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖。
④等待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
1.填表比较溶化时两次使用玻棒搅拌的目的
操作
搅拌的目的
往烧杯中加入蛋白胨和氯化钠后用玻棒搅拌
促使蛋白胨和氯化钠溶解
加入琼脂，加热使其熔化的过程中使用玻棒搅拌
防止琼脂糊底而导致烧杯破裂
2.倒平板时的注意事项
(1)培养基灭菌后，需要冷却至50 ℃左右时，才能倒平板的原因是什么？你用什么办法来估计培养基的温度？
答案 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不及时操作，琼脂会凝固。可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。
(2)分析下图，回答①、②问题：
①为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
答案 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
②从防止杂菌污染的角度思考，平板冷凝后将平板倒置的原因是什么？
答案 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
(3)怎样判断制备的培养基是否合格、成功，是否受到污染？
答案 未接种的培养基在恒温箱中保温一段时间后，如果无菌落生长，说明培养基制备成功、合格，未受到污染。
1.某学校开展大肠杆菌培养活动，首先对实验室进行清扫和消毒处理，然后准备各种原料和用具。请回答下列问题：
(1)对买回来的菌种进行扩大培养，首先制备试管培养基，写出制备牛肉膏蛋白胨固体培养基所需的原料： 。
(2)微生物在生长过程中对各种成分需求量不同，配制培养基时各成分要有合适的 。在烧杯中加入琼脂后要不停 ，防止 。
(3)将配制好的培养基分装到试管中，加棉塞后若干支试管一捆，包上牛皮纸并用皮筋勒紧放入 中灭菌。灭菌完毕后拔掉电源，待压力表的压力自然降到0时，将试管取出。如果棉塞上沾有培养基，此试管应 。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨、蒸馏水、NaCl、琼脂
(2)比例 搅拌 琼脂糊底引起烧杯破裂 (3)高压蒸汽灭菌锅 废弃
2.制备各种牛肉膏蛋白胨固体培养基，关于倒平板的具体描述正确的是( )
①待培养基冷却至40 ℃左右时，在酒精灯火焰附近倒平板 ②将灭过菌的培养皿放在桌面上，左手拔出棉塞 ③右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰 ④用左手的拇指和食指完全打开皿盖 ⑤右手将锥形瓶中培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖 ⑥等待平板冷却5～10 s，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上
A.①③④⑤ B.④⑤⑥ C.③⑤ D.①②④⑥
问题导析 (1)培养基灭菌后，需冷却至50 ℃左右时才能倒平板，原因是琼脂在44 ℃以下凝固。
(2)倒平板的过程要在酒精灯火焰附近进行。
答案 C
解析 琼脂是一种多糖，在98 ℃以上可溶解于水，在44 ℃以下凝固，倒平板时高于50 ℃则会烫手，低于50 ℃时若不能及时操作，琼脂会凝固。无菌操作应贯穿于操作的全过程，皿盖全打开则空气中的微生物会进入培养基。等待平板冷却凝固(大约需5～10 min)后，将平板倒过来放置，使皿盖在下，皿底在上。
一题多变
倒平板的过程需要进行无菌操作，在培养基的制备过程中，还有哪些环节需要进行无菌操作？
答案 要对培养基进行高压蒸汽灭菌，对培养皿进行干热灭菌，酒精灯火焰旁属于灼烧灭菌。
二、微生物的分离与纯化技术
1.纯化大肠杆菌
(1)平板划线法
①原理：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②步骤
接种环灭菌：将接种环放在酒精灯火焰上灼烧直至烧红
↓
取菌种
↓
↓
培养：将平板倒置，放入培养箱中培养
(2(稀释涂布平板法
①原理：将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
②步骤
Ⅰ.系列稀释操作
a.编号为101～106试管中分别盛有9 mL水。
b.用移液管吸取1 mL培养的菌液，注入101倍稀释的试管中，得到稀释菌液。
c.从101倍稀释的试管中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中。依次类推，完成菌液的稀释。
注意 移液管要经过灭菌，并且操作应在酒精灯火焰附近完成。
Ⅱ.涂布平板操作
涂布器消毒：将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中
↓
取菌液：取少量菌液滴加到培养基表面
↓
涂布器灭菌：将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，
冷却8～10 s
↓
涂布平板：用涂布器将菌液均匀涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，
使菌液分布均匀
2.菌种保藏
比较项目
临时保藏
甘油管藏
适用范围
频繁使用的菌种
长期保存的菌种
培养基
固体斜面培养基
液体培养基
保藏温度
4 ℃
－20 ℃
具体方法
接种到固体斜面培养基上→适宜温度下培养→4 ℃冰箱中保藏
甘油瓶中装入甘油后灭菌→将菌液转移至甘油瓶中→混匀后冷冻箱中保存
1.平板划线操作注意事项
(1)平板划线法接种菌种时，哪些操作可防止杂菌污染？
答案 ①接种前将接种环放在酒精灯火焰上灼烧。②划完一个区域后，将接种环灼烧，冷却后再划下一区域。③接种环沾取菌液时，要将试管口、棉塞等通过火焰。④划线时将培养皿打开一条缝隙，将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内。
(2)在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？
答案 避免接种环温度太高，杀死菌种。
(3)为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？
答案 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。
(4)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答案 需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
(5)在做第二次划线以及其后的操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答案 划线后末端含有的细菌数目较少，每次从上一次的末端开始划线能够使细菌的数目随划线次数的增加而逐渐减少，最终分散成单个的细菌。
(6)为何最后一次划线不能与第一次划线相连？
答案 最后一次划线已经将细菌稀释成单个的细胞，如果与第一次划线相连则增加了细菌的数目，得不到纯化的效果。
2.稀释涂布平板操作注意事项
(1)涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想将菌液滴加到培养基上时应如何进行无菌操作？
答案 应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适，吸管头不要接触任何其他物体，吸管要在酒精灯火焰附近等。
(2)操作结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个接种的培养基放在一起培养？未接种的培养基表面是否有菌落生长很关键。如果有菌落生长，说明了什么？
答案 培养未接种培养基的作用是对照。未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落生长，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染，需要重新制备。
归纳总结 两种接种方法比较
平板划线法
稀释涂布平板法
用途
一般用于菌种的纯化
一般用于筛选菌株
优点
可对混合菌进行分离
可以计数
缺点
不能计数
较麻烦，平板干燥效果不好；若菌液浓度大则长不出单菌落
培养结果
3.稀释涂布平板法是微生物培养中常用的一种接种方法。下列相关叙述错误的是( )
A.操作中需要将菌液进行一系列的梯度稀释
B.需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C.不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个菌落
D.操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
答案 C
解析 稀释涂布平板法要先将菌液进行一系列的梯度稀释，A项正确；只有在稀释度足够高的菌液中，聚集在一起的微生物才被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个菌落，故而要将不同稀释度的菌液分别涂布平板，B项正确、C项错误；在稀释涂布过程中，为防止杂菌污染，要对培养基和涂布器等进行严格灭菌处理，D项正确。
一题多变
(1)B项中不同稀释度的菌液一般涂布几个平板为宜？
答案 为保证结果准确，每个稀释度的菌液一般涂布3个平板，并对结果取平均值。
(2)如何证明该接种过程是成功的？
答案 将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入适宜温度的恒温箱中，培养12 h和24 h后，观察培养基上的菌落情况，若未接种的培养基上无菌落生长，则证明操作是成功的；否则不成功。
(3)题中如果不同稀释度的菌液接种后都不能得到单细胞菌落，原因可能是什么？
答案 可能是稀释度不够，聚集在一起的微生物没能被分散成单个细胞。
(4)如果不进行D项操作，培养基上的菌落可能有哪些变化？
答案 菌落种类和数目增多。
4.图甲是稀释涂布平板法中的部分操作，图乙是平板划线法操作结果。
下列叙述中，错误的是( )
A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液
B.对于浓度较高的菌液，如果甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不是由单一的细胞或孢子繁殖而成
C.乙中培养皿中所得的菌落都符合要求
D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端
问题导析 (1)对菌液进行稀释时，菌液中菌体的浓度越高，则稀释的倍数也要越高，菌体的浓度低时，则稀释的倍数不必太高。
(2)高温会杀死菌体，所以一些经过高温或灼烧灭菌的器材需要冷却后才能接触菌种。
(3)平板划线法的多次划线中，菌体越来越少，即不同划线处的菌体数目不同，所以形成的菌落并非全部是由单个菌体繁殖而成的。
答案 C
解析 灼烧后的接种环如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确；稀释倍数过低，会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确；平板划线法中一般最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误；连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。
一题多变
稀释倍数和划线次数是两种接种方法的关键，决定稀释倍数和划线次数的因素是什么？
答案 决定稀释倍数及划线次数的因素是菌液的浓度，如果菌液的浓度较高则需要高倍数的稀释，所划线次数也要较多，否则就可以低倍稀释或减少划线次数。
拓展提升 两种接种方法中，只有稀释涂布平板法才适合对细菌进行计数的原因
只要稀释倍数足够高，则稀释涂布平板法中形成的每个菌落都是由单一菌体繁殖而成的，即一个肉眼看不见的细菌对应着一个可以看见的菌落，可以通过统计菌落的数目推测出细菌的数目。而平板划线法中除了最后一次划线末端处的菌落是由单一的细菌繁殖而成的，其他每个菌落往往是由多个细菌一起繁殖而成，即一个菌落并非对应着一个细菌，所以不适合用于细菌的计数。
1.制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( )
A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
答案 C
解析 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。
2.平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是( )
A.接种时再拿起来方便
B.在皿底上标记日期等方便
C.正着放置容易破碎
D.防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
答案 D
解析 平板倒置主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
3.如图是微生物平板划线示意图，划线的顺序为1→2→3→4→5。下列操作方法正确的是( )
A.操作前不用进行任何处理
B.划线操作必须在火焰上进行
C.在5区域中才可以得到所需菌落
D.在1、2、3、4、5区域中划线前后都要对接种环灭菌
答案 D
解析 划线之前应对接种环灭菌；划线操作在酒精灯火焰旁进行；从1区域至5区域菌落密度越来越小，可能会在3、4、5区域得到所需菌落。
4.分离纯化大肠杆菌最常用的方法是平板划线法和稀释涂布平板法。下列有关这两种方法的叙述错误的是( )
A.均将大肠杆菌接种在固体培养基的表面
B.获得的每个菌落均是由一个细菌繁殖而来的子细胞群
C.都应在火焰附近进行操作，以防止杂菌污染
D.稀释分散菌种的原理不同，均能达到分离纯化大肠杆菌的目的
答案 B
解析 用稀释涂布平板法时，如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能是由一个细菌细胞繁殖形成的。平板划线中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求。
5.下表是从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答下面的问题。
试剂
用量
试剂
用量
牛肉膏/g
5
琼脂/g
20
蛋白胨/g
10
水/mL
1 000
NaCl/g
5
—
—
(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、 和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是 。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行 处理。
(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是 和 。
(3)假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举两项)
。
答案 (1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 (2)平板划线法 稀释涂布平板法 (3)稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌又接着划第二次；培养过程灭菌不严格，受到微生物的污染
解析 (1)培养微生物的培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。牛肉膏、蛋白胨既是碳源又是氮源；培养基在接种前必须灭菌处理。
(2)微生物的接种方法包括平板划线法和稀释涂布平板法两种。
(3)多种因素都会导致接种的菌种密度较大，没有形成单一的菌落。
课时作业
[学考达标]
1.下列关于倒平板叙述，错误的是( )
A.右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔出棉塞，为避免污染需放在酒精灯火焰附近
B.倒平板整个过程应在火焰旁进行
C.完全打开培养皿皿盖，右手将锥形瓶中的培养基倒入培养皿，左手立即盖上培养皿的皿盖
D.为避免水滴滴入培养基，平板应倒过来放置
答案 C
解析 C项应是用左手的拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，而不是完全打开，以防杂菌污染。
2.下列有关平板划线操作的叙述，不正确的是( )
A.第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物
B.每次划线前，灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后接种环上的菌种
C.在第二区域内划线时，接种环上的菌种直接来源于菌液
D.划线结束后，灼烧接种环，能及时杀死接种环上的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
答案 C
解析 在第二区域内划线时，接种环上的菌种来源于第一次划线的末端。
3.下列依次表示倒平板、接种的位置以及平板划线法接种的路径的示意图，其中错误的是( )
答案 D
解析 平板划线法除第一次划线外，以后的每一次划线都从上一次划线的末端开始。
4.涂布平板操作需要用到( )
A.接种环、滴管、酒精灯
B.接种环、移液管、酒精灯
C.涂布器、移液管、酒精灯
D.涂布器、接种环、酒精灯
答案 C
5.将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37 ℃恒温箱的目的是( )
A.对比观察培养基有没有被微生物利用
B.对比分析培养基上是否生有杂菌
C.没必要放入未接种的培养基
D.为了下次接种时再使用
答案 B
6.获得纯净培养物的关键是( )
A.将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌
B.接种纯种细菌
C.适宜环境条件下培养
D.防止外来杂菌的入侵
答案 D
[高考提能]
7.如图为纯化大肠杆菌的一个操作环节，下列相关叙述中，错误的是( )
A.该操作步骤是接种，方法是平板划线法
B.除第一次划线外，以后的每一次划线的起点是上一次划线的末端
C.图中细菌密度最小的是5处
D.该接种方法适用于细菌的计数
答案 D
解析 图中所示的纯化方法是平板划线法，该方法要求连续划线多次，直到最后一次划线的末端细菌呈单个存在，所以该方法仅用于纯化大肠杆菌但不适用于细菌的计数。
8.做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是( )
A.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖
B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上
C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落
D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上
答案 D
解析 A项错，高压灭菌加热结束后，让其自然冷却后再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物；B项错，倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖；C项错，灼烧接种环之后，要冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种；D项对，在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。
9.为了保持菌种的纯净，需要进行菌种的保藏，下列有关叙述不正确的是( )
A.对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法
B.临时保藏的菌种一般是接种到试管的固体斜面培养基上
C.临时保藏的菌种容易被污染或产生变异
D.对于需要长期保存的菌种，可以采用低温－4 ℃保藏的方法
答案 D
解析 对于需要长期保存的菌种，可采用甘油管藏法，即在3 mL甘油瓶中加入1 mL甘油后灭菌，将1 mL菌液转移到甘油瓶中，与甘油充分混匀后，放在－20 ℃的冷冻箱中保存。
10.平板划线法和稀释涂布平板法是常用的两种接种方法。下列相关叙述中错误的是( )
A.平板划线法要求要连续多次划线，且除了第一次划线外，每一次划线的起点都是上一次划线的终点
B.除了第一次划线需要将接种环灼烧灭菌外，以后的划线可以不用灭菌
C.如果菌液本来浓度不高，则可以适当降低稀释倍数
D.充分稀释和连续划线的目的都是为了使形成的菌落是由单一的细菌细胞繁殖而成
答案 B
解析 平板划线法需要连续划线的目的就是使得细菌的浓度降低，所以除了第一次划线外，以后的每次划线的起点都是上一次划线的终点，A正确；每一次划线前都要将接种环进行灼烧，将上次划线结束后残留的细菌杀死，使细菌尽快分散成单个，B错误；稀释倍数要随菌液的浓度而定，如果菌液的浓度太大，则需要更高的稀释倍数，否则就可以适当降低稀释的倍数，C正确；稀释涂布平板法中的充分稀释及平板划线法中的连续划线，目的都是为了保证菌落是由单一的细菌细胞繁殖而成的，D正确。
11.回答以下关于微生物的培养和发酵的问题：
(1)某中学生物兴趣小组在进行A细菌的培养过程中，发现了另一种B细菌，在B细菌周围A细菌的生长繁殖受到抑制，这有可能是B细菌产生了不利于(抑制)A细菌生存的物质。现在请你在以下实验的基础上，继续完成验证A细菌生长繁殖受到抑制的原因的实验过程：
(用序号、文字和箭头作答)。
(2)上图示培养基中加入了凝固剂(或琼脂)，致使该培养基属于 。培养微生物前，所用培养基一般需采用 法进行灭菌，接种微生物常用的方法有 和 ，其中后者也可用于微生物的计数。
答案 (1)④去除步骤③中培养皿里的B细菌并保留培养基→⑤再接种A细菌→⑥培养一段时间→⑦观察A细菌的生长情况(答案合理即可) (2)固体培养基 高压蒸汽灭菌 平板划线法 稀释涂布平板法(后两空答案顺序不可颠倒)
解析 (1)在去除B细菌的培养基上再接种A细菌，可根据A细菌的生长情况来验证是否是B细菌产生了不利于A细菌生存的物质。(2)固体培养基中一般需加入琼脂。一般培养基的灭菌方法为高压蒸汽灭菌法，接种微生物的常用方法为平板划线法和稀释涂布平板法，其中只有稀释涂布平板法可用于微生物的计数。
12.在生物技术上常利用大肠杆菌制成“工程菌”。某生物小组的同学，利用实验室提供的大肠杆菌品系及其他必要材料，对该品系大肠杆菌进行了培养。请分析回答下列问题：
(1)微生物在生长过程中对各种成分的需求量不同，故制备培养基时各成分要有合适的 。培养基中含有的蛋白胨、淀粉可分别为微生物提供 。
(2)配制培养基时，各种成分在溶化后分装前必须调节 ，接种前要进行 处理。
(3)对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。
(4)在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，应将平板 放置，这样做的目的是防止皿盖上的水珠落入 而造成污染。
(5)甲同学采用平板划线法接种，获得单个菌落后继续筛选，在每次划线之前都要灼烧 ，他这样做的目的是 。
在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？ ，为什么？
。
(6)实验结束时，使用过的培养基应进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是 。
答案 (1)浓度和比例 氮源(和碳源)、碳源
(2)pH 灭菌
(3)高压蒸汽灭菌
(4)倒过来 培养基
(5)接种环 杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种
需要 防止接种环上残留的菌种对环境造成污染或感染操作者
(6)防止污染环境
解析 (1)培养基中各成分要有合适的浓度和比例，保证微生物有充足的营养，又不会因外界浓度过大而失水。淀粉提供碳源，而蛋白胨含C、N等元素，既能提供碳源，又能提供氮源。(2)各种成分溶化后分装前要调节pH，接种前对培养基灭菌，防止杂菌污染。(3)培养基灭菌用高压蒸汽灭菌法。(4)倒平板时，平板冷凝后应倒置，否则皿盖上的水珠会落入培养基造成污染。(5)每次划线前都要灼烧接种环，将上次划线残留的菌种杀死，使细菌尽快分散成单个。操作结束后灼烧接种环是为了防止残留的菌种污染环境或感染操作者。(6)使用过的培养基要彻底灭菌后再倒掉，否则培养基中的微生物会污染环境。
13.饲养动物常用的植物饲料中含有难溶的植酸钙等物质，很难被动物吸收利用，并且影响其对其他营养物质的利用。若在饲料中添加植酸酶，则能催化其水解成为可以被动物吸收利用的磷酸盐等。如图是科研人员从作物根部土壤中分离产生植酸酶的菌株的过程示意图。请分析作答：
(1)培养基中除了添加植酸钙以外，应含有 、 、水、无机盐等基本营养物质。
(2)为防止杂菌污染，要对培养基和培养皿等进行 处理，其中，培养基的制备过程中灭菌之前要进行 。
(3)接种以前进行的一系列操作，目的是在培养皿表面形成 。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的 就能大致推测出样品中的活菌数。
(4)由于植酸钙不溶解，使培养基形成白色浑浊状态。产生植酸酶的菌株会水解植酸钙，菌落的周围将形成透明的区域，根据透明区域的有无，可初步判断该菌是否产生植酸酶。实验结果显示A～E五种菌株中， 是产生植酸酶的理想菌株。
(5)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行 。
答案 (1)碳源 氮源 (2)灭菌 调pH (3)单个菌落 菌落数 (4)E (5)扩大培养
解析 (1)从土壤中分离培养产生植酸酶的菌株的过程中，培养基中加入植酸钙，以筛选所需要的微生物，此外还要有充足的碳源和氮源等营养物质。(2)实验的灭菌方法一般有：灼烧灭菌(接种环、接种针或其他金属用具)、干热灭菌(玻璃器皿和金属用具等)、高压蒸汽灭菌(培养基)。其中，培养基的制备过程中灭菌之前要调pH。(3)当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。(4)根据题干提供的信息，E的周围形成的透明区域最大，是产生植酸酶的理想菌株。(5)获得目的菌以后，若要用于植酸酶的生产，还需要进行扩大培养。
[真题体验]
14.(2016·全国乙，39)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于 。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是 。
(2)步骤③中，实验组的操作是 。
(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了 现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法 (填“正确”或“不正确”)。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂
(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
(3)污染 不正确
第6课时 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
[学习导航] 1.通过分析具体培养基的配方，归纳选择培养基的选择作用，理解筛选微生物的原理。2.结合实验设计，分析微生物数量测定实验中产生偏差的原因及解决措施，学会微生物的计数方法，并对培养结果进行分析和评价。
[重难点击] 1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。
一、研究培养基对微生物的选择作用
1.筛选菌株
(1)自然界中目的菌株的筛选
①原理：根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。
②实例：能产生耐高温的Taq DNA聚合酶的Taq细菌就是从热泉中筛选出来的。
(2)实验室中目的菌株的筛选
①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。
②实例：从土壤中筛选能分解尿素的细菌。
③方法：利用选择培养基进行微生物的筛选。
2.选择培养基
(1)概念：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
(2)举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以尿素为唯一氮源，按物理性质归类为固体培养基。
1.筛选分解尿素的细菌的选择培养基
下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：
KH2PO4
1.4 g
Na2HPO4
2.1 g
MgSO4·7H2O
0.2 g
葡萄糖
10.0 g
尿素
1.0 g
琼脂
15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL
(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？
答案 碳源是葡萄糖，氮源是尿素。
(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？
答案 该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？
答案 分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源。
2.设计对照实验
(1)如何设计对照实验验证该选择培养基的确筛选到了能分解尿素的细菌？
答案 增设牛肉膏蛋白胨基础培养基并进行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则说明选择培养基的确起到了筛选能分解尿素的细菌的作用。
(2)如何设计对照实验验证所用的选择培养基没有受到污染？
答案 设置一个未涂布平板的能筛选分解尿素的细菌的选择培养基。
归纳总结 选择培养基的分类
(1(利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。
(2(利用化学物质进行的选择培养：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制某些微生物的生长，同时选择所需的微生物。
(3(利用培养条件进行的选择培养：改变微生物的培养条件(如高温、特殊pH等(，筛选特定微生物。
1.下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是( )
A.用全营养牛肉膏蛋白胨培养基筛选大肠杆菌
B.用高NaCl的培养基筛选抗盐突变菌株
C.含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株
D.利用高温条件筛选耐热的Taq细菌
答案 A
解析 全营养牛肉膏蛋白胨培养基常用于大肠杆菌的培养，该培养基对微生物无选择作用，A项错误。抗盐突变菌株具有耐高盐的能力，因此可以利用高NaCl的选择培养基进行选择培养，B项正确。分解尿素的菌株会分解尿素形成氨，使培养基pH升高，因此可以利用含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株，C项正确。利用高温条件可以筛选耐热的Taq细菌，D项正确。
2.下表是微生物培养基的成分。下列有关说法错误的是( )
编号
①
②
③
④
⑤
成分
(NH4)2SO4
KH2PO4
FeSO4
CaCl2
H2O
含量/g
0.4
4.0
0.5
0.5
100 mL
A.此培养基可用来培养自养型微生物
B.此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源
C.若除去①，此培养基可培养圆褐固氮菌
D.培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源和生长因子
答案 C
解析 由题知，该培养基成分中含有水、无机盐、氮源，但不含含碳有机物，可用来培养自养型微生物，选项A、B均对；圆褐固氮菌同化类型为异养型，培养基中必须存在含碳有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌，C错。
技巧链接 选择培养基的常见类型
(1)分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。
(2)常见的选择培养基
①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。
②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。
③无氮源培养基可以分离固氮微生物。
④以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。
⑤将培养基放在高温环境中培养，可以分离耐高温的微生物。
二、进行微生物数量的测定
1.统计菌落数目
(1)方法：活菌计数法、显微镜直接计数法。
(2)统计依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
(3)操作
①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。
②为保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。
③统计的菌落数往往比活菌实际数目低。
(4)计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
2.设置对照
(1)对照实验：是指除了被测试条件以外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如，为了确认培养基是否被杂菌污染，需以不进行接种的培养基培养作为空白对照。
3.实验操作流程
(1)土壤取样
①取样原因：土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
②土壤要求：富含有机质，pH接近中性且潮湿。
③取样部位：距地表约3～8 cm的土壤层。
(2)样品稀释
①稀释原因：样品的稀释程度直接影响平板上生长的菌落数目。
②稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，便于计数。
(3)微生物的培养与观察
①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养温度和培养时间。
②观察
a.观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
b.菌落的特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。
(4)菌种鉴定
①原理：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。
②方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
4.操作提示
(1)无菌操作
①取土样的用具在使用前都需要灭菌。
②实验操作均应在火焰旁进行。
(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等。
(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高工作效率。
下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答下列问题。
1.试写出分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程
答案 土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。
2.统计菌落数目
甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。
(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？
答案 不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。
(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？
答案 不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。
(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。
平板
稀释度
平板1
平板2
平板3
104
320
360
356
105
212
234
287
106
21
23
18
答案 105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。
(4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？
答案 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。
3.对照实验设计的分析
分析教材P22“设置对照”中的实例，探讨下列问题：
(1)在A同学确定自己操作无误的情况下，A同学得出的菌落数多于其他同学的原因可能有哪两种？
答案 可能是他选择的土壤样品不同于其他同学；也可能是培养基受到了污染或操作失误。
(2)如何设计对照实验帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？
答案 ①其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题；②将A同学配制的培养基在不加土样的情况下培养作为空白对照，以判断培养基是否受到污染。
4.微生物数量测定的实验设计
(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？
答案 土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。
(2)本实验中应如何统计培养基上生长的菌落数？
答案 每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
(3)实验中的无菌操作主要有哪些？
答案 ①培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。②称取土壤要在火焰旁进行。③稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。
归纳总结 分离尿素分解菌操作中的注意事项
(1(在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。
(2(样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀释液。
(3(为排除非测试因素(培养基(的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。
(4(每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。
3.如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是( )
A.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为5号的10倍
B.5号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7×108个
C.在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀
D.某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目高
答案 C
4.自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。
(1)实验步骤
①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
②为了得到更加准确的结果，应选用 法接种样品。
③适宜温度下培养。
(2)结果分析
①测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是 。
A.一个平板，统计的菌落数是230
B.两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240
C.三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289
D.四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240
②一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL) 。
③用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量 (填“多”或“少”)，因为
。
问题导析 (1)因为题中操作的目的是对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是稀释涂布平板法。
(2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差越小，且选择的平板要能形成30～300个菌落。
(3)所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显多于或少于其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应重做或舍弃。
答案 (1)②稀释涂布平板 (2)①D ②1.06×109个
③多 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
解析 (1)若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(2)①应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。②212÷0.2×106＝1.06×109(个)。③因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
一题多变
(1)如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中测定的数值高还是低？为什么？
答案 低。因为稀释倍数太低，则大部分菌落是由多个细菌繁殖而成，所以测定的菌落的数值要偏低。
(2)第(2)问第①小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。
答案 ①培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；②接种过程中由于操作不当感染了杂菌；③取菌液时没有摇晃，导致所取菌液中细菌个体浓度偏大等。
技巧链接 用稀释涂布平板法计数微生物的方法
(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。
(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。
(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30～300之间的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。
1.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为( )
A.伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基
B.含青霉素的培养基、含氨的无机培养基
C.含氨的无机培养基、含青霉素的培养基
D.含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基
答案 B
解析 酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素能够抑制细菌生长，但不能够抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。
2.下列操作步骤顺序正确的是( )
①土壤取样 ②称取10 g土样，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度
A.①→②→③→④ B.①→③→②→④
C.①→②→④→③ D.①→④→②→③
答案 C
3.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是( )
A.筛选出能分解尿素的细菌
B.对分离的菌种作进一步鉴定
C.作细菌的营养成分
D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素
答案 B
解析 筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基，目的是对要分离的菌种作进一步的鉴定。
4.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是( )
A.将土壤用无菌水稀释，制备103～106倍的土壤稀释液
B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上
C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌
D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株
答案 C
解析 用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌。
5.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答下列问题：
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·7H2O
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
10.0 g
1.0 g
15.0 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。
(1)此培养基 (填“能”或“不能”)用于植物组织培养，理由是 。
(2)培养基中加入尿素的目的是 ，这种培养基属于 培养基。
(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的 和 ，实验需要振荡培养，原因是 。
(4)图中将细菌转到固体培养基上时，可采用 或 在含尿素的培养基上接种，获得单菌落后继续筛选。初步筛选出来的菌种还需要用生化的方法作进一步的鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成 色，则可准确说明该菌种能够分解尿素。
(5)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是 ，需要消毒的是 。(填序号)
①培养细菌用的培养基与培养皿 ②玻棒、试管、锥形瓶和吸管 ③实验操作者的双手
(6)实验结束后，使用过的培养基应该进行 处理后，才能倒掉。
答案 (1)不能 缺少植物激素(或缺少植物需要的一些营养成分) (2)筛选目的菌 选择 (3)尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气 (4)平板划线法 稀释涂布平板法 酚红 红 (5)①② ③ (6)灭菌
解析 (1)植物组织培养的培养基中需要含有氮、磷、钾及锌、铜、钼、铁等元素，需要蔗糖为植物细胞提供能量，还需要细胞分裂素和生长素等植物激素。(2)该培养基中尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长，属于选择培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型微生物，所以在培养过程中需振荡。(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养利用尿素的细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，由此可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)微生物培养时，一切环境、物质、用具、器材都要消毒或灭菌。(6)为避免实验后培养基中的微生物污染环境，使用过的培养基必须经过灭菌处理后才能丢弃。
课时作业
[学考达标]
1.在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或者阻止其他种类微生物生长的培养基称做( )
A.鉴别培养基 B.加富培养基
C.选择培养基 D.基础培养基
答案 C
解析 选择培养基可选择目标微生物，同时抑制或杀死其他微生物。
2.可以分离并鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂
D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
答案 A
解析 尿素在尿素分解菌的作用下分解产生氨和CO2，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，酚红指示剂变红。
3.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A.①③⑤⑦ B.②④⑥⑧
C.①③⑤⑧ D.①④⑥⑦
答案 C
4.产生标准形态菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A一个细菌、液体培养基
B.许多细菌、液体培养基
C.一个细菌、固体培养基
D.许多细菌、固体培养基
答案 C
解析 在液体培养基中生活的细菌，无论是一个还是许多，肉眼都是看不见的。在固体培养基上生活的细菌，当数目较少时也是看不见的。当固体培养基上有许多细菌并且集中在较小范围内时，肉眼可见。而菌落是一个细菌或几个细菌的子细胞群体，形成于固体培养基上，有一定的形态结构，所以肉眼可见。同种细菌形成的菌落，形态结构是相同的。如果有许多细菌形成的菌落，就不可能有比较标准的形态，因为这些细菌不可能是同一种细菌，也不可能在培养基的同一个点上。
5.下列关于土壤取样的叙述，错误的是( )
A.土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤
B.先铲去表层土，选取距地表3～8 cm左右的土壤层
C.取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D.应在火焰旁称取土壤
答案 C
解析 土壤取样过程中，为防止杂菌污染，取样用的小铁铲和信封在使用前必须灭菌。
6.某同学对101、102、103倍稀释液中的细菌进行计数，平均菌落数分别为2 760、295和16，则样品中菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)( )
A.2.76×104个/mL B.2.95×105个/mL
C.4.6×104个/mL D.3.775×104个/mL
答案 B
解析 为保证结果准确，一般选择菌落数在30～300间的平板进行计数，因此只有295符合要求，其稀释倍数为102，所用稀释液体积为0.1 mL，套入计算公式得样品中菌落总数为2.95×105个/mL。
[高考提能]
7.在“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”课题中，以土壤中的细菌为研究对象，要达到的目的是( )
①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌 ②从土壤中分离出能够分解氨的细菌 ③统计每克土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌 ④统计所取土壤样品中究竟含有多少分解尿素的细菌
A.①③ B.②④ C.①② D.③④
答案 A
解析 从土壤中分离分解尿素的细菌并对其计数，统计的是每克土壤样品中含多少分解尿素的细菌，用公式“每克样品中菌株数＝(C/V)×M”进行推测，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。
8.给无氮培养基接种土壤稀泥浆的正确方法是( )
A.打开培养皿盖，取一根接种环沾取少许稀泥浆，轻轻地点接在培养基的表面上
B.取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，略微打开培养皿盖，在培养基的表面轻点
C.打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
D.略微打开培养皿盖，取一根接种环在酒精灯的火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点
答案 D
解析 接种过程中要防止外来杂菌的入侵，左手将培养皿打开一条缝隙，右手将接种环在火焰上灭菌，冷却后沾取少许稀泥浆，在培养基的表面轻点，用未冷却的接种环沾取稀泥浆会杀灭菌种。
9.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触)，将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析，以下叙述不正确的是( )
A.链霉素能阻止结核杆菌的生长
B.链霉素对结核杆菌比对霍乱菌更有效
C.链霉素对结核杆菌比对伤寒菌更有效
D.链霉素可以用于治疗伤寒病人
答案 D
解析 从图中可以看出，这是含有链霉素的选择培养基，接种的三种细菌中，霍乱菌和结核杆菌都可以被杀灭，并且链霉素对结核杆菌杀灭的有效程度大于对霍乱菌的有效程度，而伤寒菌照常生长不受影响，所以选项D错误。
10.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨固体培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上
C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养
D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
答案 D
解析 检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，A项正确；取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于不同的平板上，B项正确；接种后要将培养皿倒置，置于37 ℃恒温培养，C项正确；在确定对照组无菌后，应选择菌落数在30～300之间的平板进行计数，D项错误。
11.广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗→榨汁(蔗糖)―→酵母发酵→蒸馏→成品(燃料酒精)。
(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。
步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意 和 ，加琼脂后灭菌，制成固体平板。
步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。
步骤4：根据 ，筛选出突变菌。
(2)上述步骤2、3和4的依据分别是
。
答案 (1)添加高浓度蔗糖(葡萄糖) 调低pH 是否能在选择培养基上生长 (2)提供高糖和酸性的筛选环境；获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性
解析 (1)要筛选耐高糖和耐酸的菌种，培养基中必须加入高浓度蔗糖和调低pH，能在选择培养基上生长的即为所需菌种。(2)步骤2是给其提供高糖或酸性的筛选环境；步骤3是为了获得单菌落；步骤4是根据能生长的菌株具有耐高糖和耐酸的特性筛选出突变菌。
12.请回答下列有关微生物的问题：
(1)微生物的分布：微生物主要分布在富含 的土壤表层；不同微生物对pH的要求不同，细菌常生活在酸碱度 的潮湿土壤中。
(2)微生物的消毒和灭菌：在微生物培养中，对培养基常用 法进行灭菌。如果要检测灭菌是否彻底，可以采用的方法是
。
(3)微生物的应用：在葡萄酒的自然发酵过程中，运用吸附在葡萄皮上的野生酵母菌发酵产生酒精，请写出该过程的化学反应式： 。
在果醋制作时，运用醋酸菌在 和糖源充足的条件下，将糖分解成醋酸。
(4)微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是 和 。
(5)微生物的鉴定：为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素为唯一氮源的 (选择、鉴别)培养基中加入 指示剂，如果存在尿素分解菌，则指示剂将变 色。
答案 (1)有机质 接近中性 (2)高压蒸汽灭菌 将灭过菌的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生 (3)C6H12O62C2H5OH＋2CO2 有氧 (4)平板划线法 稀释涂布平板法 (5)选择 酚红 红
解析 (1)微生物主要分布在有机质丰富的土壤表层，细菌常生活在酸碱度接近中性的潮湿土壤中。(2)对培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；可通过在适宜的温度下放置灭过菌的培养基，看其是否有菌落产生来确定培养基灭菌是否彻底。(3)醋酸菌为需氧型微生物。(4)最常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(5)用选择培养基筛选目的菌——尿素分解菌，加入酚红指示剂，若存在尿素分解菌，指示剂将变红色。
[真题体验]
13.(2016·四川，10)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。请据图回答下列问题：
(1)图中选择培养基应以 为唯一氮源；鉴别培养基还需添加 作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成 色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是 ，每克土壤样品中的细菌数量为 ×108个；与血细胞计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较 。
(3)现有一菌株产生的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示的位置增加了70个核苷酸，使图乙序列出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为 ，突变基因表达的蛋白质含 个氨基酸。
答案 (1)尿素 酚红 红
(2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115
14.(2015·浙江自选模块，17节选)某工厂为了生产耐高温植酸酶饲料添加剂，对该酶菌株进行筛选，其流程如下图所示。
→→→→→
请回答下列问题：
(1)土壤悬液首先经80 ℃处理15分钟，其目的是筛选出 。
(2)在无菌条件下，将经过处理的土壤悬液进行 ，然后涂布于含有植酸钠的固体培养基上。培养后观察到 ，其周围出现透明水解圈，圈的直径大小与 强弱相关。
(3)筛选获得的菌株经鉴定后，将优良菌株进行液体扩大培养。培养时需要振荡，其主要目的是 。液体培养基与固体培养基相比，不含有的成分是 。
答案 (1)耐高温菌株 (2)稀释 单菌落 植酸酶的活性 (3)供氧 琼脂
解析 (1)土壤悬液首先经80 ℃处理15分钟，杀死不耐高温的菌株，筛选出耐高温菌株。(2)将处理过的土壤悬液在无菌条件下稀释，降低细菌浓度，以便得到相互分离的单菌落。用含有植酸钠的培养基培养细菌，植酸酶活性高的菌株分解植酸钠多，其周围出现较大的透明水解圈。(3)菌株的扩大培养一般用液体培养基，它与固体培养基成分基本相同，但不含琼脂。用液体培养基培养优良菌株时，需要振荡，以便使液体培养基底部有较高的含氧量，有利于细菌生长繁殖。
第7课时 分解纤维素的微生物的分离
[学习导航] 1.结合教材P27“基础知识”，掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。2.阅读教材P28“实验设计”，理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。3.阅读教材P30“课题延伸”，掌握纤维素酶的测定方法。
[重难点击] 1.简述纤维素酶的种类及作用。2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。3.分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理。
一、纤维素分解菌的筛选
1.纤维素与纤维素酶
(1)纤维素：下图所示为纤维素的结构式。
①基本组成单位：葡萄糖。
②分布：主要分布在植物根、茎、叶等器官的细胞壁。
(2)纤维素酶
①组成：是一种复合酶，至少包括三种酶，即C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。
②作用：
2.纤维素分解菌的筛选
(1)方法：刚果红染色法。
①方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应。
②方法二：在倒平板时就加入刚果红。
(2)原理
纤维素＋刚果红→红色复合物
↓纤维素酶
纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物
↓
以纤维素分解菌为中心的透明圈
1.纤维素酶
(1)纤维素酶是如何将纤维素分解的？
答案 纤维素酶中的C1酶、CX酶使纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
(2)如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？
答案 设计对照实验。取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。
2.纤维素分解菌的获得
(1)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
答案 筛选目的菌株应该到有利于目的菌株生长的环境中寻找。
(2)为什么将滤纸埋在土壤中可以提取到目的菌？
答案 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。
3.分析教材P29“纤维素分解菌的选择培养基配方”，回答下列问题：
(1)此配方是液体培养基还是固体培养基？为什么选择此类培养基？
答案 液体培养基，因为配方中无凝固剂。液体培养基与微生物的接触更密切，微生物更容易从培养基中获得营养物质，因此可以快速增加微生物的浓度。
(2)这个选择培养基对微生物是否具有选择作用？怎样设计对照实验证明你的观点？
答案 有选择作用。本配方中富含纤维素，更适合能够分解纤维素的微生物大量繁殖。对照实验可以用牛肉膏蛋白胨培养基培养微生物。若选择培养基上微生物数量明显少于牛肉膏蛋白胨培养基上微生物的数量，则说明培养基起到了选择作用。
归纳总结 纤维素分解菌的富集培养
(1(培养基特点：纤维素分解菌的选择培养用的是富含纤维素的培养基，而不是以纤维素为唯一碳源的培养基。
(2(培养结果：由于培养基中加入了酵母膏和水解酪素等，因此培养基上除得到大量的纤维素分解菌外，也有其他微生物的存在。
(3(进一步筛选：需根据微生物的菌落特点继续进行鉴别培养以筛选到纤维素分解菌。
(4(选择培养的实质：纤维素分解菌的选择培养实质是富集培养，以便得到大量的目的微生物。
1.下列关于纤维素酶的叙述中，错误的是( )
A.纤维素酶只有一种，只能将纤维素分解为葡萄糖
B.纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分
C.纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质
D.分解纤维素的细菌、真菌和放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的
答案 A
解析 纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分——C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，其中C1酶和CX酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。
一题多变
(1)上题中分解纤维素的细菌能否在不含纤维素但富含其他有机物的环境中生存？为什么？
答案 能。纤维素分解菌分解纤维素只是为了利用纤维素作为碳源，其他有机物若可提供碳源，也可以生存。
(2)题中纤维素酶也在微生物细胞内分解纤维素吗？为什么？
答案 不在细胞中分解纤维素。多数细胞不能直接吸收纤维素，一般来说，纤维素酶都是分泌到细胞外分解纤维素的。
2.分析下表培养基的配方，请回答下面的问题。
纤维素分解菌的选择培养基：
组分
含量
纤维素粉
5 g
NaNO3
1 g
Na2HPO4·7H2O
1.2 g
KH2PO4
0.9 g
MgSO4·7H2O
0.5 g
KCl
0.5 g
酵母膏
0.5 g
水解酪素
0.5 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。
(1)此培养基配方中为微生物提供碳源的主要是 、氮源是 。
(2)此配方为 培养基(根据物理状态)配方。
(3)此培养基选择出的微生物主要是 。
问题导析 (1)该培养基中纤维素是主要的碳源，所以可以用于筛选纤维素分解菌。
(2)由于该培养基中没有加入琼脂，所以为液体培养基。液体培养基中微生物与营养成分的接触更充分，可以提高微生物的代谢效率。
答案 (1)纤维素粉 NaNO3、酵母膏、水解酪素 (2)液体 (3)纤维素分解菌
解析 该培养基的主要碳源是纤维素粉，氮源有NaNO3、酵母膏、水解酪素。因没有凝固剂成分，因此，该培养基从物理状态上看属于液体培养基。因该培养基仅以纤维素粉为主要碳源，因此，可用于选择培养纤维素分解菌。
一题多变
(1)从土壤中分离纤维素分解菌时，哪种情况下可以省略选择培养？
答案 当土壤中纤维素分解菌的浓度很高时，可以省略选择培养这一步骤。
(2)本题中的培养基配方中的酵母膏可以为微生物提供什么成分？
答案 可以提供碳源、氮源和生长因子。
(3)该培养基中纤维素是否为唯一的碳源？
答案 不是，纤维素是主要的碳源，另外，酵母膏和水解酪素也可以提供少量的碳源。
二、尝试从土壤中分离出分解纤维素的微生物
1.实验流程
土壤取样：选择富含纤维素的环境
↓
选择培养：用富含纤维素的选择培养基扩大培养
↓
梯度稀释：依次稀释101～106倍
↓
涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
↓
挑选产生透明圈的菌落
2.实验操作注意事项
(1)土壤取样时要选择富含纤维素的环境。
(2)选择培养的方法：用富含纤维素的选择培养基。
目的：增加纤维素分解菌的浓度。
(3)梯度稀释的目的：能获得单个菌落。
(4)涂布平板时要选择鉴别纤维素分解菌的培养基。
(5)挑选产生透明圈的菌落。
3.菌种的进一步鉴定
(1)鉴定原理：为确定透明圈内的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验。
(2)发酵方法：有液体发酵和固体发酵两种。
(3)纤维素酶的测定方法：一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
1.鉴别纤维素分解菌的培养基
(1)鉴别纤维素分解菌时需在培养基中添加什么物质？
答案 刚果红染色剂。
(2)鉴别培养基和选择培养基在目的和物理性质方面的区别是什么？
答案 ①鉴别培养基是在培养基中加入某些特定的作用底物和指示剂，观察微生物生长过程中分解底物所释放的不同产物，通过指示剂的反应不同来鉴别微生物；选择培养基是在培养基中加入某些物质，以促进目的菌的生长繁殖，同时抑制其他杂菌的生长繁殖。
②选择培养的培养基中没有加入琼脂，所以属于液体培养基，而鉴别培养基一般为固体培养基。
2.鉴别方法——刚果红染色法
从显色结果上看，两种刚果红染色法中哪种染色法更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌？
答案 方法一更容易区分纤维素分解菌和其他杂菌。即先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，所显示的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二中有些微生物具有降解色素的能力，它们在生长过程中会降解刚果红，也会使培养基上形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
3.透明圈的形成
(1)对分离的纤维素分解菌作进一步的鉴定的原因是什么？
答案 产生透明圈的菌落可能是能产生纤维素酶的微生物，也可能是能降解刚果红的菌种，所以需要进一步鉴定。
(2)简要概述筛选纤维素分解菌时透明圈是如何形成的。
答案 纤维素分解菌分解纤维素产生的纤维二糖和葡萄糖，不能与刚果红形成红色复合物，而出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
(3)向含有分解尿素的细菌的培养基中加入酚红指示剂，会出现类似的圈吗？
答案 分解尿素的细菌能够将尿素分解成氨，加入酚红指示剂后会变红，也会形成以尿素分解菌为中心的红色的圈。
归纳总结 两种刚果红染色法的比较
比较项目
方法一
方法二
先培养微生物，再加入刚果红
在倒平板时加入刚果红
优点
显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用
操作简单，不存在菌落混杂
缺点
操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂
有些微生物会降解刚果红，形成透明圈，与纤维素分解菌相混
3.下列有关刚果红染色法的叙述，不正确的是( )
A.刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入
B.刚果红可以在菌落形成后加入
C.刚果红在菌落形成前倒平板时加入，加入的刚果红不需要灭菌
D.在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌
答案 C
解析 刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入，若在细菌菌落形成前倒平板时加入刚果红，则所加刚果红要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；若在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。
4.研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物，请就如何从土壤中获得纤维素分解菌回答以下问题：
(1)纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和 酶。
(2)若获得纯净的菌株，常采用平板划线法进行接种，此过程所用的接种工具是 ，操作时采用 灭菌的方法。
(3)刚果红可以与纤维素等多糖形成红色复合物，但并不与 和 发生这种反应。常用的刚果红染色法有两种：第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在 时就加入刚果红。
(4)如果观察到产生 的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行 的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的 进行定量的测定。
答案 (1)葡萄糖苷 (2)接种环 灼烧 (3)纤维二糖
葡萄糖 倒平板 (4)透明圈 发酵产纤维素酶 葡萄糖
解析 (1)纤维素酶是一种复合酶，包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。(2)常用的接种工具是接种环，操作时采用灼烧的方法灭菌。(3)刚果红不与纤维二糖和葡萄糖发生反应。(4)刚果红与纤维素反应呈红色，纤维素分解菌产生的纤维素酶会将纤维素分解而不能与刚果红染液反应呈红色，在菌落周围会出现透明圈。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。
易错易混 关于纤维素分解菌筛选的三个易错警示
(1)纤维素分解菌的选择培养基中的碳源并不只有纤维素，其中酵母膏和水解酪素也可起碳源的作用。
(2)在纤维素分解菌的选择培养基中生长的不只有纤维素分解菌。因此，选择培养后要进行鉴别培养，才能获得纤维素分解菌。
(3)出现透明圈的菌落也不一定是纤维素分解菌。
1.加工橘子罐头，采用酸碱处理脱去中果皮(橘络)，会产生严重污染。目前使用酶解法去除橘络，可减少污染。下列生长在特定环境中的4类微生物，不能产生所用酶的是( )
A.生长在麦麸上的黑曲霉
B.生长在酸奶中的乳酸菌
C.生长在棉籽壳上的平菇
D.生长在木屑上的木霉
答案 B
2.当纤维素被纤维素酶分解后，会在培养基中出现一些透明圈，这些透明圈是( )
A.刚果红与纤维素形成的复合物
B.纤维素分解后的葡萄糖
C.由纤维素酶聚集在一起形成的
D.以纤维素分解菌为中心形成的
答案 D
解析 刚果红与纤维素反应形成红色复合物，当有纤维素分解菌生长时，菌落周围的纤维素被分解，形成透明圈。
3.在分解纤维素的微生物的分离实验中，为了判断选择培养基是否起到了对纤维素分解菌的选择作用，需要设置的对照是( )
A.未接种的只有纤维素为唯一碳源的培养基
B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D.接种了的只有纤维素为唯一碳源的培养基
答案 C
4.通过分离分解纤维素的微生物实验，对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离提纯的第一步，还需要进行( )
A.发酵产纤维素酶的实验
B.提取纤维二糖的实验
C.浓缩纤维素分解菌的实验
D.提取葡萄糖的实验
答案 A
解析 为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后产生的葡萄糖进行定量测定。
5.下图为分离并统计分解纤维素的微生物的实验流程，据此回答下面有关问题：
→→→
(1)要从富含纤维素的环境中分离纤维素分解菌，从高温热泉中寻找耐热菌，这说明 。
(2)某同学根据需要，配制了纤维素分解菌的选择培养基，成分如下，整个实验过程严格执行无菌操作。
组分
含量/g
纤维素粉
5
NaNO3
1
Na2HPO4·7H2O
1.2
KH2PO4
0.9
MgSO4·7H2O
0.5
KCl
0.5
酵母膏、水解酪素
适量
如果将其中的纤维素粉换成 ，菌落数 ，即可说明选择培养基的作用。
(3)本实验宜采用 法而不使用平板划线法，原因是该法可以根据稀释体积计算每克样品中的细菌数。
答案 (1)根据目的菌株对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找
(2)葡萄糖 明显多于选择培养基上的菌落数
(3)稀释涂布平板
解析 (1)选择菌种是分离、纯化、扩大培养细菌的前提和基础，其基本原理就是根据菌株对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。(2)纤维素分解菌的培养，必须在以纤维素为主要碳源的培养基上进行。要想说明选择培养基的作用，需设立对照实验：将纤维素粉换成葡萄糖，进行菌落数比较，可见后者菌落数较多，说明以葡萄糖为碳源的培养基与以纤维素为碳源的培养基在微生物培养中的作用不同。(3)由题意知，本实验不仅要分离出土壤中的纤维素分解菌，同时还要统计每克土壤样品中的纤维素分解菌的细菌数，因此不能用平板划线法接种，而要用稀释涂布平板法接种。因为前者无法统计出每克样品中细菌数。
课时作业
[学考达标]
1.下列有关分解纤维素的微生物的分离的叙述，不正确的是( )
A.纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵
B.对分解纤维素的微生物进行了初步筛选后，无需再进行其他实验
C.纤维素酶的测定方法，一般是对所产生的葡萄糖进行定量的测定
D.纤维素酶是一种复合酶
答案 B
解析 初步筛选只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。
2.两种刚果红染色法的结果是( )
A.均会出现透明圈
B.均不会出现透明圈
C.方法一出现，方法二不出现
D.方法一不出现，方法二出现
答案 A
解析 两种刚果红染色法都会出现透明圈，但方法一在加入刚果红溶液时会造成菌落混杂，而先加入刚果红的方法则可能出现假阳性反应。
3.从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计，下列流程正确的是( )
A.土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→挑选菌落
B.土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落
C.土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落
D.土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落
答案 B
解析 实验的正确流程是“土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落”，其中选择培养的目的是增加纤维素分解菌的浓度，因此需要在稀释涂布平板之前进行，最后根据菌落的特征挑选纤维素分解菌。
4.在对纤维素分解菌进行选择培养时，用液体培养基的目的是( )
A.用液体培养基可获得大量菌体
B.纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长
C.用液体培养基可以使菌体充分利用培养基中的营养物质
D.用液体培养基可获得高纯度的纤维素分解菌
答案 A
解析 使用液体选择培养基培养纤维素分解菌，一方面可以获得大量纤维素分解菌，另一方面便于稀释涂布平板。
5.在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，一般先进行选择培养，其主要目的是( )
A.完全除去其他微生物
B.没有意义，去掉这一步更好
C.增加纤维素分解菌的浓度
D.使纤维素分解菌充分长大
答案 C
解析 如果在所采集的土样中纤维素分解菌含量较少，稀释涂布到鉴别培养基上后形成的菌落数就更少，不利于挑选所需菌落。通过选择培养可以增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。
6.分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是( )
A.经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B.选择培养这一步可省略，但获得的纤维素分解菌较少
C.样品经稀释培养后，用刚果红染色
D.对照组可将同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
答案 A
解析 分离土壤中的纤维素分解菌，需先进行选择培养，增大纤维素分解菌的浓度，然后再经过梯度稀释，将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。
[高考提能]
7.下列有关培养基和菌种鉴定的叙述，不正确的是( )
A.根据培养基的物理状态可将其分为液体培养基和固体培养基
B.可利用固体培养基上菌落的特征来判断和鉴别细菌的类型
C.利用刚果红培养基上是否形成透明圈来筛选纤维素分解菌
D.在无氮培养基中加入酚红指示剂鉴定尿素分解菌
答案 D
解析 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂鉴定尿素分解菌。
8.在纤维素分解菌的鉴定实验中，纤维素酶的测定方法一般是( )
A.对纤维素进行定量测定
B.对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定
C.对纤维素酶分解纤维素后所产生的纤维二糖进行定量测定
D.对纤维素分解菌进行定量测定
答案 B
解析 纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。
9.不能够与刚果红反应生成红色复合物的是( )
A.纤维二糖 B.纤维素
C.CMC－Na D.淀粉
答案 A
解析 刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但不与纤维二糖、葡萄糖、麦芽糖等发生反应。
10.分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是( )
①稀释倒平板法 ②稀释涂布平板法 ③单菌落挑取法 ④选择培养
A.①② B.②③④
C.②③ D.①③④
答案 B
解析 要获得纤维素分解菌，需从取样的土壤中选择分离出样品，然后用稀释涂布平板法将样品接种到鉴别培养基上经筛选获得目的菌，再用单菌落挑取法接种到纤维素分解菌的选择培养基上，最终获得培养物。
11.某微生物培养基的配方如下：NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO40.01 g，(CH2O)30 g，H2O 1 000 mL，青霉素0.1万单位。请回答下列问题：
(1)依物理性质，该培养基属于 培养基。
(2)该培养基中的碳源是 。不论何种培养基，在各成分都溶化后分装前，要进行的是调整pH和 ，倒平板时，一般需冷却至 左右，在 附近操作。
(3)若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去的物质是 ，应加入的碳源是 ，为检测纤维素分解菌的存在与否还应加入 染料，与纤维素可形成 色复合物，若产生 ，则证明有纤维素分解菌存在。
答案 (1)液体 (2)(CH2O) 灭菌 50 ℃ 酒精灯火焰 (3)(CH2O) 纤维素粉 刚果红 红 透明圈
解析 (1)培养基按物理性质可分为液体培养基和固体培养基等，分析该培养基的成分，该培养基没有添加琼脂，应为液体培养基。(2)其碳源应为(CH2O)，配制培养基时，各成分溶化后要调节pH和灭菌后再分装。倒平板时，培养基应冷却到50 ℃左右，并且在酒精灯火焰附近进行。(3)由于纤维素分解菌能以纤维素为碳源，其他微生物不能，因此若用该培养液培养纤维素分解菌，应除去(CH2O)添加纤维素粉。检测纤维素分解菌常用的方法是刚果红染色法。
12.某同学为了从土壤中分离得到纤维素分解菌，进行了以下操作。
第一步：土壤取样。用小铁铲和普通信封将土取回，然后倒入一烧瓶中，加蒸馏水稀释，塞好棉塞。
第二步：制备培养基。
成分
含量
纤维素粉
5 g
NaNO3
1 g
Na2HPO4·7H2O
1.2 g
KH2PO4
0.9 g
MgSO4·7H2O
0.5 g
KCl
0.5 g
酵母膏
0.5 g
水解酪素
0.5 g
待上述物质溶解后加蒸馏水定容到1 000 mL
第三步：菌悬液涂布平板。用接种环取少量土壤稀释溶液在以上培养基表层涂布。
第四步：培养观察。把接种好的培养皿放到35 ℃的恒温箱中培养1～2 d，观察并记录菌落的生长情况。
根据以上实验操作，完成下列题目：
(1)找出该同学明显的错误操作并改正。
。
(2)要想增加该实验的说服力，还应该怎么做？
。
答案 (1)第一步：取样工具应提前灭菌；不能用蒸馏水，应用无菌水；土壤取回后的操作应在火焰旁进行。第二步：培养基制备好后应灭菌。第三步：接种应在无菌条件下进行，应用灭菌的吸管或移液器取样品
(2)一是设置对照实验，再配制一组无纤维素粉的培养基，接种该土壤样品培养观察。二是最后要对该微生物进行鉴定，用刚果红染色法鉴定该微生物的菌落，看周围是否出现透明圈
解析 从土壤中分离微生物一般的流程是：土壤取样→选择培养→梯度稀释→菌悬液涂布平板→挑选出单个菌落。该实验步骤不完整，且在前三步操作中都没有进行无菌操作，因而无法说明分解纤维素的微生物一定来自土壤。要想增强实验的说服力，设置对照实验必不可少。
13.一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。
(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。现有1 L土壤浸出液，用无菌吸管吸取1 mL至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释至103倍。各取0.1 mL已稀释103倍的稀释液分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液样品中菌体数为 。
(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从用途方面来看，上述培养基的特点是 。
(3)接种技术的核心是 。接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步 ，培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是 或有氧条件抑制了这些细菌的生长。
(4)在培养基上形成的菌落中，无透明圈菌落利用的氮源主要是 ，有透明圈菌落利用的氮源主要是 ，据此可筛选出目的菌。实验结果如下图所示，A～E五种菌株中， 是最理想的菌株。
答案 (1)5.6×108
(2)在无氮培养基中添加了该除草剂
(3)防止杂菌污染，保证培养物的纯度 稀释分散到培养基的表面 培养基中缺少这些细菌可利用的氮源
(4)氮气 该除草剂 E
解析 (1)根据稀释涂布平板法对微生物计数的计算公式：每毫升原土壤浸出液样品中菌体数＝(C÷V)×M＝56÷0.1×103＝5.6×105，则每升原土壤浸出液样品中菌体数为5.6×108。(2)该除草剂是含氮元素的有机物，可以为微生物提供氮源，因此选育能降解该除草剂的细菌应以该除草剂为唯一氮源(无氮培养基中添加了该除草剂)的培养基作为选择培养基。(3)微生物接种技术的核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。平板划线法接种是通过连续划线将微生物稀释分散到培养基的表面，以获得单细胞菌落。由于培养基以该除草剂为唯一氮源，因此不能降解该除草剂的微生物将不能生长。(4)有些自生固氮微生物可以利用大气中的氮气作为氮源，可以在无氮培养基上生长，因此能固氮但不能降解该除草剂的微生物也能生长。但是由于固氮微生物不能降解该除草剂，因此菌落周围不出现透明圈。菌落周围有透明圈的微生物是能够降解该除草剂的微生物，并且降解该除草剂的能力越强，菌落周围出现的透明圈就越大。
[真题体验]
14.(2014·新课标Ⅰ，39)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：
(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将 分解成 。
(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成 色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的 。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
酵母膏
无机盐
淀粉
纤维素粉
琼脂
CR溶液
水
培养基甲
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
培养基乙
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲 (填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是 ；培养基乙 (填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是 。
答案 (1)纤维二糖 葡萄糖 (2)红 透明圈
(3)不能 液体培养基不能分离单菌落 不能 乙培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
解析 (1)纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，如下图：
。
(2)刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)分离和鉴别纤维素分解菌的培养基为固体培养基，且需以纤维素为唯一碳源。
专题3 植物的组织培养技术
知识系统构建
植物的组织培养技术
必背要语
1.植物组织培养的一般过程为：
外植体愈伤组织根、芽完整植株。
2.生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。
3.影响植物组织培养的因素有：植物材料、营养物质、植物激素及pH、温度、光照等。
4.花药培养产生花粉植株有两种途径：一是胚状体途径，二是愈伤组织途径，这两种途径主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
5.影响花药培养的主要因素是材料的选择与培养基的组成。
6.选择单核靠边期的花药培养成功率最高。
7.确定花粉发育时期的方法有醋酸洋红法(最常用)和焙花青－铬矾法(花粉细胞核不易着色时)。
8.对培养出来的植株作进一步鉴定和筛选的原因是在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化。
规律方法整合
整合一 细胞的全能性
1.概念
细胞的全能性是指已经分化的细胞仍然具有发育成完整个体的潜能。
2.原因
构成生物体的所有体细胞都是由受精卵通过有丝分裂发育而来的，含有相同的遗传物质，都含有本物种的所有遗传信息，因此每个体细胞都有发育成完整个体的潜能。生物的生殖细胞在一定条件下也具有全能性，是因为生殖细胞中含有本物种生长发育的全部遗传信息，尽管其遗传物质是体细胞的一半。
3.表达的条件
由于基因的选择性表达，细胞的全能性在植株上受到限制不能表达，只有在离体条件下，在营养、激素和其他条件适宜的情况下，细胞才能表达其全能性。动物细胞难以表达其全能性，但是通过核移植后，细胞核仍可表达其全能性。
4.表达的难易程度
植物细胞全能性易表达，而动物细胞的全能性不易表达，但动物细胞核的全能性可以表达。在所有细胞中，受精卵可直接发育为个体，有的生殖细胞也可在一定条件下表达其全能性。
5.意义
细胞全能性是植物组织培养和体细胞杂交的理论基础，也是现代动物体细胞克隆技术的理论基础。
例1 下列实例中能体现细胞全能性的是( )
①用悬浮培养的胡萝卜单个细胞培养成可育的植株 ②植物用种子繁殖后代 ③用烟草组织培养的单个细胞形成了可育的完整植株
A.①② B.①③ C.②③ D.①②③
答案 B
解析 细胞的全能性是指已经分化的细胞仍具有发育成完整个体的潜能。其中①和③都属于由已经分化的细胞经过培养形成可育的植株，体现了细胞的全能性。用植物种子繁殖后代，实际上是个体发育的过程，不能体现出细胞的全能性。
整合二 菊花的组织培养和月季花药离体培养的比较
项目
菊花的组织培养
月季花药离体培养
理论依据
植物细胞的全能性
材料选取
未开花植株茎上部新萌生的侧枝
完全未开放的花蕾
光照状况
每日用日光灯照射12 h
开始不需要光照，幼小植株形成后需要光照
操作流程
制备MS固体培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培
选材→材料消毒→接种和培养→筛选和诱导→移栽→栽培、选育
影响因素
选材、营养、激素、pH、温度、光照等
基本过程
脱分化、再分化
例2 植物组织培养和花药离体培养都是实验室条件下快速得到大量幼苗的两种方法。下列关于两者的比较中，错误的是( )
A.植物组织培养和花药离体培养的理论基础是细胞具有全能性
B.花药能诱导为单倍体植株的原因是花药细胞中含有本物种生长发育的全部遗传信息，尽管遗传物质是体细胞的一半，但仍具有全能性。
C.植物组织培养获得的试管苗必须经过移栽、炼苗后才能在大田栽培，而花药培养不需要
D.植物组织培养中若发生突变，则其后代不一定表现其突变性状，但是花药培养中的突变一定表现相应突变性状
答案 C
解析 花药培养和植物组织培养的理论依据都是细胞的全能性。尽管花药细胞中的遗传物质是体细胞的一半，但仍含有本物种生长发育所需的全部基因(或遗传信息)，因此仍具有全能性。在组织培养过程中，若发生隐性的基因突变，由于基因成对存在，所以不一定表现其突变性状，仍能保持亲代的性状；而花药中基因单个存在，若有突变，则性状就发生变化。两种方法所得到的试管苗，都必须通过移栽、炼苗后方可进行大田栽培。
整合三 微生物的培养技术、植物组织培养技术、无土栽培技术在设计思路和具体操作上的异同
1.无土栽培是利用溶液培养法的原理，把植物生长发育过程中所需的各种矿质元素，按照一定比例配成营养液，并利用这种营养液栽培植物的技术。在培养过程中，需用基质垫底并固定幼苗，先放在阴凉处，再根据植物习性，放置在光照和温度适宜的地方发育成完整的植株。培养液只含植物生长发育所需要的必需矿质元素，无有机质。
2.植物组织培养，是在无菌条件下，把植物体的器官或组织切下来，接种在适当的培养基上进行离体培养，这些器官或组织的细胞就会经脱分化和再分化过程，逐步产生出植物的各种组织和器官进而发育成完整的植株，其过程包括培养基的配制、灭菌、接种(外植体)、培养。培养基中包括矿质元素、蔗糖、维生素、植物激素和有机添加物，需灭菌。消毒包括接种室、接种箱、操作箱、外植体等的消毒。培养过程中更换培养基，调节细胞分裂素和生长素的比例，先诱导生芽，再诱导生根，最后移栽发育成植株。
3.微生物培养也需要配制培养基，培养基含碳源、氮源、生长因子、无机盐和水，不含植物激素，培养基需灭菌、搁置斜面、接种、培养。在整个培养过程中无需更换培养基，接种过程中需分离纯化。
例3 用于植物组织培养的培养基和无土栽培时所用的培养液相比，最大的差别是( )
A.必须含植物必需的矿质元素
B.必须含有机物
C.浓度必须小于细胞液浓度
D.不一定含有植物激素
答案 B
解析 在植物组织培养初期，需经过一段时间的异养阶段，所以必须在培养基中加入有机营养；而无土栽培所用的培养液中主要成分为植物生长发育所必需的各种矿质元素，不需加入有机营养。
热点考题集训
1.以下不能说明植物细胞全能性的实验是( )
A.胡萝卜韧皮部细胞培养出植株
B.紫色糯性玉米种子培育出植株
C.转入抗虫基因的棉花细胞培育出植株
D.小麦花药离体培育出植株
答案 B
解析 种子发育成植株是个体发育的过程，因为种子不是一个细胞而是具有胚芽、胚根等器官的幼体。
2.下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是( )
A.培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
B.培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的生长和分化
C.离体的组织或细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D.同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织核基因数目相同
答案 D
解析 培养基中加入蔗糖的目的一方面可以提供营养，另一方面可以调节渗透压；在整个组织培养过程中影响再分化的关键因素是生长素和细胞分裂素的使用比例和使用顺序；组织培养过程中的关键环节是脱分化，从而形成愈伤组织；组织培养的对象既可以是体细胞也可以是生殖细胞，因此获得的愈伤组织的基因数目不一定相同。
3.植物组织培养是依据细胞的全能性，在体外将植物组织细胞培养成一个完整植株的过程，如下图所示。下列相关叙述错误的是( )
A.甲和丙分别是脱分化和再分化
B.乙是愈伤组织，是通过离体的植物组织或细胞经过细胞增殖与分化形成的
C.离体的植物细胞之所以能培养成完整植株，因为植物细胞具有全能性
D.丙过程的实质是基因的选择性表达
答案 B
解析 植物组织培养的基本过程包括脱分化和再分化，分别是图中的甲和丙，A正确；愈伤组织的形成过程是脱分化，脱分化过程只进行细胞增殖不进行细胞分化，B错误；植物组织培养的理论基础是细胞的全能性，C正确；细胞分化的实质是基因的选择性表达，D正确。
4.在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的瓶中外植体正常生长，有的瓶中外植体死亡，你认为外植体死亡的原因不可能是( )
A.接种时培养基灭菌不彻底
B.接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体
C.培养时每日用日光灯照12 h
D.培养过程中保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质、激素的比例
答案 C
解析 菊花的组织培养过程中需每日用日光灯照12 h，这不会造成外植体死亡。
5.菊花的组织培养需要严格的无菌操作，下列说法不正确的是( )
A.对培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌
B.幼苗要先移植到消过毒的蛭石或者珍珠岩等环境下生活一段时间
C.用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，一旦感染杂菌则前功尽弃
D.将菊花茎段插入时应注意方向，不应倒插，是为了防止杂菌污染
答案 D
解析 将菊花茎段插入时，要注意形态学上端朝上，而不应倒插，是因为生长素的运输为极性运输，倒插的菊花茎段不能形成愈伤组织，而不是为了防止杂菌污染。
6.选择花药时，一般要通过镜检来确定花粉的发育时期，以下说法正确的是( )
A.确定花粉发育时期最常用的方法是焙花青－铬矾法
B.对某些植物的花粉细胞核不易着色时采用醋酸洋红法
C.焙花青－铬矾法能将细胞核染成蓝黑色
D.醋酸洋红法和焙花青－铬矾法染色过程完全一样
答案 C
解析 在选择花药时，镜检确定花粉的发育时期，最常用的方法是醋酸洋红法；对于某些植物的花粉细胞，因细胞核不易着色，可采用焙花青－铬矾法；焙花青－铬矾法可将花粉细胞核染成蓝黑色，醋酸洋红法与焙花青－铬矾法过程不同，前者需用镊柄将花粉捣碎，后者在染色前需用卡诺氏固定液固定。
7.下列关于花药培养过程中的注意事项的叙述，正确的是( )
A.花药培养成功与否与材料选择无关
B.花药培养成幼苗后，一定不能分瓶培养
C.花药培养成幼苗的过程中，除了维持适宜的温度、pH等，还要注意给予光照
D.一般来说，选用单核期的花药培养成功率较高
答案 D
解析 一般来说，单核期的花药离体培养的成功率最高。花药培养初期要在黑暗中培养，幼小植株形成后再进行适当的光照培养。
8.菊花的组织培养和月季的花药培养都是利用组织培养技术，下列关于两者的叙述中，正确的是( )
序号
比较项目
菊花的组织培养
月季的花药培养
①
植物激素
不必添加
需要添加
②
染色体倍性的鉴定
不需要
需要
③
光照
每日日光灯照射12 h
最初不需要，幼小植株形成后需要
④
形成愈伤组织或胚状体后
不需更换培养基
需要更换培养基
A.①②③ B.②③④ C.①②④ D.①②③④
答案 D
解析 菊花的组织培养用茎段来培养，比较容易，不必添加植物激素；在菊花组织培养中不会发生染色体倍性的变化；需要每天日光灯照射12 h；形成愈伤组织或胚状体后不必更换培养基。月季花药的离体培养需要添加细胞分裂素和生长素等植物激素；在花药培养中，通过愈伤组织形成的植株会出现染色体倍性的变化，所以需要染色体倍性的鉴定；最初不需要光照，幼小植株形成后需要光照；形成愈伤组织或胚状体后需要转移到分化培养基上进一步分化培养。
9.辣椒素作为一种生物碱广泛应用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图，据图回答下列问题：
(1)图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的____________和____________过程。
(2)图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是____________。培养基中的生长素用量和细胞分裂素用量的比值________(填“高”或“低”)时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是______________。
(3)图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是__________________________________。
答案 (1)脱分化(或去分化) 再分化 (2)琼脂 低 高压蒸汽灭菌 (3)70%
解析 (1)由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫作去分化。对脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，其又可重新分化成根或芽等器官，这个过程叫作再分化。(2)培养基中常用的凝固剂是琼脂。使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比值影响植物细胞的发育方向。生长素用量和细胞分裂素用量的比值低时，有利于芽的分化；比值高时，有利于根的分化；比值适中时，促进愈伤组织的形成。培养基应用高压蒸汽灭菌法灭菌。(3)外植体消毒所用酒精的体积分数是70%。
10.将基因型为AaBb的月季(14条染色体)的花粉细胞通过无菌操作接入对应的培养基中，在一定条件下诱导形成幼苗。其过程如下：
月季的花粉细胞①―→愈伤组织②―→丛芽③―→植株④
(1)①―→②过程需要的条件有________(多选)。
A.营养 B.激素 C.光照 D.pH
(2)愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规则的细胞团，愈伤组织形成过程中，必须从培养基中获得________、________和小分子有机物等营养物质。
(3)形成花粉细胞的分裂方式是______，花粉发育成植物体细胞的分裂方式是______。
(4)植株④叫做________幼苗。若要得到可育植株，需要用________对________(填序号)进行处理，所得的植株基因型为_______________，细胞核中含________条脱氧核苷酸链。
(5)AaBb的月季的花药产生的植株的基因型有哪些？
________________________________________________________________________。
(6)①―→②过程为什么不需要光照？
________________________________________________________________________。
答案 (1)A、B、D (2)水 无机盐 (3)减数分裂 有丝分裂 (4)单倍体 秋水仙素 ③ AABB或aabb或AAbb或aaBB 28 (5)AaBb的月季能够产生AB、ab、Ab、aB四种花粉，经组织培养能够长成AB、ab、Ab、aB四种单倍体植株 (6)因为该过程还没有分裂分化形成叶绿体，不需要光照进行光合作用
解析 (1)图中①―→②过程为脱分化过程，该过程不需要光照，但是需要一定的营养物质、激素和适宜的pH。(2)在愈伤组织形成过程中，植物细胞需要从外界吸收水、无机盐(或矿质元素)和小分子有机物等。(3)花粉是单倍体细胞，所以形成过程为减数分裂；花粉植株的形成过程为有丝分裂。(4)植株④称为单倍体或花粉植株，为高度不育植株，若要得到可育植株，需要用秋水仙素处理幼苗，即处理丛芽③，所获得的植株基因型为AABB或aabb或AAbb或aaBB；细胞核中含有14条染色体，14个DNA分子，28条脱氧核苷酸链。
第8课时 菊花的组织培养
[学习导航] 1.阅读教材P32“基础知识”，掌握植物组织培养的基本过程及影响因素。2.阅读教材P34～35“实验操作”，掌握植物组织培养的过程及注意事项。3.结合教材P36“课题延伸”及左侧培养基配方，理解植物激素对实验结果的影响。
[重难点击] 1.熟悉植物组织培养的基本过程。2.理解细胞分化的概念及离体植物细胞的脱分化和再分化。3.归纳MS培养基的配制方法，并设计表格比较微生物培养基与MS培养基的配方的异同。
一、植物组织培养的基本过程和影响因素
1.原理
理论基础：细胞的全能性。
(1)概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。
(2)原因：具有该种生物全套遗传信息。
2.植物组织培养的过程
(1)过程
外植体愈伤组织根或芽―→完整植株。
(2)相关概念
①外植体：用于离体培养的植物器官或组织片段。
②脱分化：又叫去分化，是由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程。
③再分化：愈伤组织继续培养，重新分化成根或芽等器官的过程。
④愈伤组织的特点：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
3.影响植物组织培养的因素
(1)内因
①不同的植物组织：培养的难易程度差别很大。
②同一种植物材料：材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。
③菊花的组织培养：一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。
(2)外因
1.植物组织培养的理论基础。
(1)为什么高度分化的植物细胞还具有全能性？
答案 因为高度分化的植物细胞中含有该物种的全套遗传物质。
(2)高度分化的植物细胞发育成完整的植株需要哪些条件？
答案 ①离体条件；②充足的营养条件；③恰当的激素种类及浓度配比；④适宜的环境条件；⑤无菌条件。
2.植物组织培养的一般过程分析。
(1)你认为植物组织培养的核心环节是什么？
答案 植物组织培养的核心环节为脱分化和再分化。
(2)你认为菊花的组织培养的再分化应先诱导生芽还是先诱导生根？
答案 应先诱导生芽，再诱导生根。
(3)植物组织培养的实验操作主要有哪几个步骤？
答案 主要有6个步骤：①制备MS固体培养基；②外植体消毒；③接种；④培养；⑤移栽；⑥栽培。
(4)在配制培养基的过程中，pH的调节是在分瓶前还是分瓶后？
答案 在分瓶前调节pH。
3.外植体的选择
(1)植物组织培养中应尽量选择什么样的材料作为外植体？为什么？
答案 应尽量选择幼嫩的植物组织或器官作为外植体。因为外植体的年龄越小，分化程度越低，组织培养的成功率就越高。
(2)为什么选择茎尖分生组织可培育出脱毒苗？
答案 植物茎尖分生组织，细胞分裂速度快，其病毒极少，甚至无病毒。
归纳总结 植物组织培养的过程分析
过程
主要变化
特点
脱分化
由外植体形成愈伤组织
由高度分化的细胞恢复为具有分裂能力的细胞
再分化
由愈伤组织形成根、芽等器官
重新分化出不同的组织、器官
生长
发育成完整植物体
包括营养生长和生殖生长
1.关于植物组织培养技术的叙述正确的是( )
A.用于培养的材料不一定需要离体
B.植物可通过光合作用合成有机物，培养基中不需要加入含碳有机物
C.愈伤组织可制造成人工种子
D.脱分化和再分化都需要培养基中生长素和细胞分裂素刺激、诱导
答案 D
解析 用于培养的材料一定需要离体，否则基因选择性表达形成组织和器官，A项错误；植物组织培养基中需加入含碳有机物，提供碳源和能源，而完整植株才能进行光合作用，B项错误；胚状体可制成人工种子，C项错误；不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同，可诱导培养物进行分裂和分化，D项正确。
2.如图是基因型为AaBb的菊花茎尖离体培养示意图，据图回答下列问题：
―→
(1)图中A和B分别表示________和________。菊花茎尖培养成植物体的根本原因是________________________________________________________________________。
(2)菊花的组织培养形成试管苗的过程中，其中应大量供给的元素是________________。试管苗形成过程中要给予一定光照，其原因是_____________________________________。
(3)脱分化是指____________________________________________________________。脱分化和再分化这两个过程的进行，除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，还要保证________，否则植物组织培养就不能成功。
(4)这样培养成的试管苗的基因型为________。
答案 (1)脱分化 再分化 植物细胞具有全能性
(2)N、S、P、K、Ca、Mg 试管苗形成过程中要进行光合作用合成有机物
(3)高度分化的植物组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程 无菌
(4)AaBb
解析 (1)离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。脱分化产生的愈伤组织继续培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。菊花茎尖能培养成植物体的根本原因是植物细胞具有全能性。(2)离体的植物组织和细胞，常用MS培养基培养，其主要成分包括：大量元素，如N、P、K、Ca、Mg、S；微量元素，如Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Co、I；有机物以及蔗糖等。在试管苗形成过程中要每日给予日照12 h，其原因是试管苗形成过程中要进行光合作用合成有机物。(3)脱分化和再分化这两个过程的进行除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，还要保证无菌，原因是杂菌产生的毒素等物质会影响或阻碍植物组织脱分化形成愈伤组织或再分化为根和芽，且杂菌的繁殖能力很强，会与植物组织争夺培养基中的营养物质，使植物得不到营养，同时杂菌还会侵染植株，使之受到伤害。(4)由于植物组织培养过程中细胞进行有丝分裂，所以培养成的试管苗的基因型为AaBb。
特别提醒 植物组织培养的两点误区警示
(1)细胞全能性表达的理解
①细胞全能性的表达是由单个细胞发育成完整个体，发育的终点是完整个体，若发育为某个器官或组织不属于细胞全能性的表达。
②细胞全能性的大小是自然条件下的，在适宜外界条件下，植物的体细胞培养比生殖细胞的培养更容易。
(2)对愈伤组织特点的理解：愈伤组织的细胞是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞，具有旺盛的分裂能力，无中央大液泡。
二、进行菊花的组织培养
1.制备MS固体培养基
(1)配制各种母液。
浓缩倍数
(2)配制培养基：向称好的琼脂中加入蒸馏水―→加热使琼脂熔化―→加入蔗糖和配制好的各种母液―→加蒸馏水定容―→调节pH―→分装。
(3)灭菌：高压蒸汽灭菌法。
2.外植体消毒
(1)方法：用流水冲净―→吸干表面水分―→体积分数为70%的酒精消毒―→无菌水清洗→吸干表面水分―→质量分数为0.1%的氯化汞溶液消毒―→无菌水清洗。
(2)原则：既要考虑药剂的消毒效果，又要考虑植物的耐受能力。
3.接种
(1)前期准备：用体积分数为70%的酒精对工作台消毒，点燃酒精灯。
(2)接种操作：外植体形态学上端朝上插入培养基中，每瓶接种6～8块外植体。
(3)注意事项：接种操作必须在酒精灯火焰旁进行，器械使用后用火焰灼烧灭菌。
4.培养
培养过程应该放在无菌箱中进行，并定期进行消毒，保持适宜的温度和光照。
5.移栽
移栽前应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日，然后用流水清洗根部的培养基。最后将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间，等幼苗长壮后再移栽到土壤中。
6.栽培
将幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗生长情况，适时浇水、施肥，直到开花。
1.营养物质对组织培养的作用
(1)探讨MS培养基中各种营养物质的作用
①大量元素和微量元素：提供植物细胞生活所必需的无机盐。
②蔗糖：提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压。
③甘氨酸、维生素等有机物：主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。
(2)植物是自养生物，为什么用于植物组织培养的MS培养基中需要加入有机物作为碳源？
答案 通常植物体本身进行光合作用产生糖类，不需要外部供给糖，但植物组织培养利用的是离体组织或细胞，在其脱分化过程中不能进行光合作用合成糖类，因此必须在培养基中添加糖类，作为碳源和能源物质，同时维持培养基的渗透压。
(3)同微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？
答案 微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养、无机盐混合物包括植物生长必需的大量元素和微量元素两大类。
2.植物激素在植物组织培养中的作用
(1)试说出植物激素在植物组织培养中的作用
调节剂
主要作用
生长素
促进细胞的伸长，促进愈伤组织和根的形成
细胞分裂素
促进细胞的分裂，促进芽的分化和形成
(2)生长素和细胞分裂素使用顺序及比例对植物组织培养的影响
①按照不同的顺序使用这两类激素，实验结果不同
使用顺序
实验结果
先使用生长素，后使用细胞分裂素
有利于细胞分裂，但细胞不分化
先使用细胞分裂素，后使用生长素
细胞既分裂也分化
同时使用
分化频率提高
②当同时使用这两类激素时，两者用量的比值不同，植物细胞的发育方向不同
生长素与细胞分裂素用量比值与结果
比值高时
促进的根分化，抑制芽的形成
比值低时
有利于芽的分化，抑制根的形成
比值适中
有利于愈伤组织的形成
3.植物组织培养中的无菌技术
在植物组织培养过程中是如何实现无菌操作的？
(1)对于培养基：用高压蒸汽灭菌法灭菌。
(2)对于外植体：用酒精和氯化汞溶液消毒，放到无菌箱中培养，移栽到消过毒的环境中生活一段时间。
3.生物工程的研究成果已经广泛应用于各个领域，目前科学家利用植物的茎尖和叶片、茎段等，在无菌条件下，培养在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使之发育成完整的植株。下图是运用该技术培养兰花植株的示意图。下列关于这种生物工程技术的叙述，错误的是( )
A.这种技术叫做植物组织培养，可以克隆生物体
B.④过程的单细胞细胞质丰富，液泡小而细胞核大
C.用此方法克隆植物要尽量选择优良、细胞全能性表达不充分的材料
D.这种技术可与基因工程、航天工程结合培育高产、优质的作物品种
问题导析 (1)植物组织培养过程中，细胞中的遗传物质一般不会(填“会”或“不会”)发生改变，所以该项技术属于一种克隆技术。
(2)通过基因工程将目的基因导入植物细胞后，必须采用植物组织培养技术将植物细胞培养成植株。
答案 C
解析 ④过程的单细胞细胞质丰富，液泡小而细胞核大，这是胚性细胞(类似胚胎细胞)的特征，在适宜的培养基中，这种单细胞可发育成胚状体。要获得植物克隆的成功，要尽量选择优良、细胞全能性表达充分的材料。随着科技的发展，植物组织培养可与基因工程、航天工程结合培育高产、优质的作物品种。
4.植物组织培养的培养基中加有植物激素。下表是培养基中两种植物激素在不同比例时的实验结果(其中6－BA是细胞分裂素，IAA是生长素)。请分析完成下列问题：
实验组别
1
2
3
4
激素种类及激素浓度关系
6－BA
6－BA＞IAA
6－BA＝IAA
6－BA＜IAA
结果
组织块产生愈伤组织
组织块分化出芽
愈伤组织不断生长
愈伤组织有生根趋势
(1)促进愈伤组织产生的条件是_______________________________________________，
愈伤组织生长的条件是_____________________________________________________。
(2)芽的分化条件是_________________________________________________________，
根的分化条件是___________________________________________________________。
(3)在植物组织培养中，脱分化可用的激素组合是实验__________和实验__________中的激素浓度关系，再分化时可用的激素组合是实验__________和实验____________中的激素浓度关系。整个实验表明，植物的生根、发芽等生命活动是______________________的结果。
(4)植物组织培养的培养基中，除激素外，还必须含有__________________，它的成分至少应该含有________、________等。
(5)判断愈伤组织是否产生的依据是看是否产生了_________________________的细胞。
答案 (1)必须有细胞分裂素 细胞分裂素与生长素含量相等 (2)细胞分裂素的含量大于生长素的含量 生长素的含量大于细胞分裂素的含量 (3)1 3 2 4 多种激素共同作用 (4)营养物质 矿质元素 有机物
(5)排列疏松而无规则、高度液泡化的呈无定形状态
解析 (1)由表中实验1和实验3的数据显示，促进愈伤组织产生的条件是必须有细胞分裂素，愈伤组织生长的条件是细胞分裂素与生长素含量相等。(2)由实验2和4可知，细胞分裂素的含量大于生长素的含量，促进芽的分化，生长素的含量大于细胞分裂素的含量促进根的分化。(3)表中1、3组激素的使用利于愈伤组织的形成与生长，即为脱分化。2、4组激素的使用利于根或芽的分化，即为再分化。(4)植物组织培养的培养基中，除激素外，还必须含有营养物质，它的成分至少应该含有矿质元素、有机物等。(5)愈伤组织是一种分化程度较低的细胞，是排列疏松而无规则、高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
1.影响植物组织培养的因素包括( )
①培养基的配制 ②外植体的选取 ③激素的使用 ④消毒 ⑤温度、pH、光照
A.①②③④⑤ B.①②③ C.①②③④ D.①②③⑤
答案 A
解析 植物组织培养过程受多种外界因素的影响，其中包括温度、光照、pH等，而培养基的成分、外植体的选取和消毒是否严格等也影响组织培养。
2.下面为植物组织培养过程图解，以下相关叙述错误的是( )
A.b过程发生了脱分化，在此过程中植物激素不发挥作用
B.c过程发生了再分化，是愈伤组织重新分化成根或芽等器官的过程
C.d过程是在胚状结构外包裹人工胚乳和人工种皮制成人工种子
D.人工种子可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题
答案 A
解析 在植物脱分化的b过程中，利用植物生长素、细胞分裂素等植物激素可以诱导植物细胞脱分化，因此在此过程中植物激素发挥重要作用。
3.下列哪组符合菊花组织培养的基本步骤( )
A.制备MS固体培养基→外植体消毒→接种→培养→移栽→栽培
B.制备MS固体培养基→外植体消毒→接种→培养→栽培→移栽
C.制备MS固体培养基→外植体消毒→接种→栽培→培养→移栽
D.制备MS固体培养基→外植体消毒→接种→移栽→培养→栽培
答案 A
解析 移栽是指将培养基上培养的幼苗长壮后移栽到土壤中，栽培是对移栽后的幼苗进行精细管理培养的过程，应先移栽后栽培。
4.1958年，美国科学家斯图尔德应用植物组织培养技术，将二倍体胡萝卜韧皮部的一些细胞进行离体培养，最终发育成完整的新植株。下列关于这一科学事实的叙述中，错误的是( )
①该实验证明了植物细胞具有全能性 ②此种生殖产生的后代有广泛的变异 ③韧皮部细胞通过减数分裂增加细胞数目 ④此种生殖产生的后代能保持亲本的性状
A.①② B.②③ C.②④ D.③④
答案 B
解析 体细胞组织培养属于无性繁殖，其后代能保持亲本的性状，变异性小；体细胞不能进行减数分裂。
5.下图表示菊花的茎尖细胞通过无菌操作接种到试管培养基上后，在一定的条件下，形成试管苗的培育过程，请据图回答下列问题：
(1)要促进细胞分裂生长，培养基中应有营养物质和激素。营养物质包括________和小分子有机物，激素包括细胞分裂素和________两类植物激素。
(2)此过程依据的原理是_____________________________________________________
________________________________________________________________________。
A和B阶段主要进行的分裂方式是___________________________________________，
B阶段除了细胞分裂外，还进行细胞_______________________________________等。
(3)此过程要无菌操作，主要是指对________进行灭菌消毒。B阶段需要光照，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)试管苗的根细胞没有叶绿素，而叶的叶肉细胞具有叶绿素，这是基因______的结果。
答案 (1)无机物 生长素 (2)细胞的全能性 有丝分裂 分化 (3)培养基 芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照条件 (4)选择性表达
解析 植物组织培养是用离体的植物组织、器官或细胞接种到经消毒灭菌的培养基中，培养基含有供组织细胞生长发育所需要的无机物和小分子有机物，还有调节细胞脱分化和再分化的细胞分裂素和生长素。由外植体发育成试管苗，脱分化阶段细胞进行有丝分裂，再分化阶段愈伤组织细胞经有丝分裂和细胞分化形成试管苗，此阶段需要光照，原因是叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照条件。
课时作业
[学考达标]
1.植物学家将胡萝卜的韧皮部细胞分离出来，将单个细胞放入特定的培养基中培养，获得了许多完整的植株，此过程依据的原理和技术分别是( )
A.细胞分裂和细胞工程
B.细胞的分化和基因工程
C.植物细胞的全能性和植物组织培养
D.花药离体培养和单倍体育种
答案 C
2.植物组织培养依据的原理、培养过程的顺序及诱导使用的植物激素分别是( )
①细胞的全能性 ②离体植物器官、组织或细胞 ③根、芽 ④生长素和细胞分裂素 ⑤生长素和乙烯 ⑥愈伤组织 ⑦再分化 ⑧脱分化 ⑨植物体
A.①、②⑦⑥⑧③⑨、④ B.①、②⑧⑥⑦③⑨、④
C.①、⑥②⑨⑧③⑦、⑤ D.①、②⑨⑧⑥⑦③、⑤
答案 B
解析 植物组织培养依据的原理为植物细胞的全能性；培养过程的顺序是离体植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成根、芽等进而形成新的植物体；诱导使用的植物激素是生长素和细胞分裂素。
3.植物材料的选择直接关系到实验的成败，菊花选材一般选择的是( )
A.未开花植株的茎上部新萌生的侧枝
B.开花植株的茎上部枝条
C.开花植株上的花药
D.未开花植株的茎下部的枝条
答案 A
解析 进行组织培养一般选用幼嫩部分。
4.植物细胞表现出全能性的必要条件是( )
A.给予适宜的营养和外界条件
B.导入其他植物的基因
C.脱离母体并给予适宜的营养和外界条件
D.将成熟的筛管的细胞移到去核的卵细胞中
答案 C
5.植物组织培养的基本过程：外植体脱分化,愈伤组织再分化,形成根和芽。下列相关叙述中，错误的是( )
A.该过程的理论基础是植物细胞的全能性
B.脱分化依赖有丝分裂完成
C.愈伤组织中的细胞形态、结构相似
D.再分化的实质是某些基因缺失，某些基因表达
答案 D
解析 植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性，A正确；脱分化过程中进行的增殖方式是有丝分裂，该过程还没有进行细胞分化，所以愈伤组织中的细胞形态、结构相似，B、C正确；细胞分化的实质是基因的选择性表达，该过程中没有基因的缺失，D错误。
6.在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要下列哪些条件( )
①消毒灭菌 ②一定浓度的植物激素 ③适宜的温度 ④充足的光照 ⑤充足的养料 ⑥适宜的pH
A.①③④⑤ B.②③⑤⑥
C.①②③④⑤⑥ D.①②③⑤⑥
答案 D
解析 整个植物组织培养过程中需要无菌环境、激素的调节、适宜温度和pH。形成愈伤组织的过程中，细胞中叶绿体还没有形成，不需要光照进行光合作用；不能制造有机物，需要外界给予。
[高考提能]
7.在植物组织培养再分化阶段中，逐渐改变培养基中植物激素X和植物激素Y的浓度比，细胞群的变化情况如图所示。若培养基中植物激素X的浓度为a、植物激素Y的浓度为a＋0.2，则细胞群分化的结果最可能是试管( )
答案 C
解析 从图中可以看出，植物激素比例适中时有利于愈伤组织的形成，而当植物激素X多于植物激素Y时有利于芽的分化，反之则有利于根的分化，所以当植物激素X浓度为a，而植物激素Y比X多0.2时的培养结果应为C。
8.下列关于植物组织培养中植物激素使用的说法，不正确的是( )
A.植物组织培养中的关键性激素是生长素和细胞分裂素
B.先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂和分化
C.先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂也分化
D.同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向
答案 B
解析 在植物组织培养中，培养基中除营养成分外还须添加植物激素，一般包括生长素和细胞分裂素；外植体脱分化、再分化的诱导方向取决于二者的比例。先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化；先使用细胞分裂素，后使用生长素，对细胞的分裂和分化均有利。
9.下列关于植物组织培养条件控制的叙述中，不正确的是( )
A.选择培养的植物组织最好是分裂能力强的分生组织
B.培养细菌所用的蛋白胨培养基可以用于植物组织培养
C.可以控制生长素和细胞分裂素的使用顺序和用量控制培养的结果
D.菊花组织培养需要光照
答案 B
解析 植物组织培养的第一步就是脱分化，脱分化的实质是有丝分裂，所以用于植物组织培养的组织应是分裂能力强的组织，如分生组织，A正确；用于植物组织培养的培养基是MS培养基，其成分不同于培养微生物的培养基，所以培养微生物的培养基不能用于植物组织培养，B错误；菊花组织培养后期需要光照条件，D正确。
10.某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。下列有关叙述，错误的是( )
A.消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
B.在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞
C.出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控
D.生根时，培养基通常应含α－萘乙酸等生长素类调节剂
答案 B
解析 组织培养时应确保无菌操作，消毒剂的使用原则是既能杀死材料表面的微生物，又能防止伤害组织细胞，A正确；植物细胞融合是指经纤维素酶和果胶酶处理后得到的原生质体的诱导融合，具有细胞壁的愈伤组织细胞不能诱导融合形成染色体加倍的细胞，B错误；出芽和生根都是细胞再分化的结果，其实质是基因的选择性表达，C正确；α－萘乙酸为生长素类似物，可诱导愈伤组织生根，D正确。
11.在植物组织培养过程中，愈伤组织的成功诱导是至关重要的步骤。科学家以食用稗的成熟胚作为外植体，在基本培养基上研究植物生长调节剂对食用稗愈伤组织诱导的影响。实验结果如下表。请回答相关问题：
培养基代号
2,4－D/mg·L－1
6－BA /mg·L－1
愈伤组织诱导率/%
L1
1.0
0
65.41
L2
2.0
0
68.76
L3
3.0
0
91.01
L4
3.0
0.2
54.48
L5
3.0
0.5
57.35
L6
3.0
1.0
51.71
注：愈伤组织诱导率(%)＝产生愈伤组织的外植体数/接种外植体总数×100%。
(1)从上表可以知道，在基本培养基中添加较高浓度的____________________有利于食用稗胚形成愈伤组织，而添加______________则不利于食用稗愈伤组织的形成。
(2)影响愈伤组织成功诱导的因素除植物生长调节剂外，培养的环境条件也是重要的因素。现给你提供200个已经消毒过的食用稗的成熟胚，在上述研究的基础上，探究光照对愈伤组织形成的影响。
实验步骤：
①将200个已经消毒过的食用稗的成熟胚平均分为甲、乙两组，分别接种到____培养基上；
②______________________________________________________________________
________________________________________________________________________；
③______________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
预期实验结果和结论：____________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)2,4－D 6－BA (2)①L3 ②甲组置于光照条件下培养，乙组置于黑暗条件下培养，其他条件相同且适宜 ③培养一段时间后，分别计数甲、乙两组中形成愈伤组织的个数并计算愈伤组织诱导率 预期实验结果和结论：①如甲组的愈伤组织诱导率大于乙组的愈伤组织诱导率，则光照有利于愈伤组织的形成；②如甲组的愈伤组织诱导率小于乙组的愈伤组织诱导率，则黑暗有利于愈伤组织的形成；③如甲组的愈伤组织诱导率和乙组的愈伤组织诱导率相当，则光照、黑暗对愈伤组织的形成没有影响
12.斯图尔德将胡萝卜韧皮部细胞进行培养，最终获得发育完整的新个体，实验过程如下：
细胞团胚状体―→植株
(1)A过程称为______________，诱导这一过程的物质是__________。这一实验的原理是______________。
(2)植物组织培养过程中多次强调一系列的消毒、灭菌及无菌操作，原因是__________
________________________________________________________________________。
(3)愈伤组织的培养是很重要的一步，一般从接种到出现愈伤组织需要14 d，到时可以看到外植体长出__________色或__________色的__________状的愈伤组织。
(4)培养时注意恒温箱要关闭光源，因为在__________条件下愈伤组织长得更快，两周以后，由于培养基中的营养几乎耗尽，必须______________进行继续培养。
(5)试管苗的培养可分为_________培养和_________培养，必须先进行_____________培养，二者的区别在于___________________________________________________________。
答案 (1)脱分化 植物激素(或生长素与细胞分裂素) 植物细胞具有全能性 (2)外植体材料体积小，抗性差，如果不小心引起污染，将可能造成培养工作的前功尽弃 (3)乳白 黄 瘤 (4)无光 更换培养基 (5)生芽 生根 生芽 培养基中的生长素和细胞分裂素的比例不同
解析 (1)A过程表示由离体的细胞发育成细胞团，所以为脱分化过程，诱导脱分化过程需要有植物激素，主要为生长素和细胞分裂素，该过程的原理是植物细胞的全能性。(2)同植物体相比较，离体的植物组织抗性差，所以在组织培养整个过程中都要执行严格的消毒程序。(3)愈伤组织为外植体经脱分化形成的乳白色或黄色的瘤状物。(4)进行组织培养过程脱分化阶段不需要光照，但在再分化阶段，由于叶片中叶绿素的形成需要光照，当营养耗尽时，需更换有丰富营养成分的培养基。(5)试管苗的培养分为生根和生芽培养，但是先生芽，才有利于生根，生根培养基与生芽培养基的区别就在于生长素和细胞分裂素的比例不同。
[真题体验]
13.(2014·江苏，29)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题：
(1)外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为________________。
(2)在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如图所示。细胞干重在12 d后下降的原因有___________；培养液中蔗糖的作用是________________、__________。
答案 (1)脱分化 (2)蔗糖浓度下降，pH降低 提供能源 调节渗透压
解析 (1)外植体在人工、无菌条件下，经脱分化可形成愈伤组织。 (2)由图蔗糖浓度下降，可知外植体离体培养过程中需要消耗蔗糖，12 d后蔗糖浓度变化不大；pH下降会影响酶的活性，愈伤组织细胞对物质的合成小于分解，细胞干重下降。植物组织培养过程中，蔗糖既能维持一定的渗透压，又能提供植物细胞生命活动必需的营养物质(能量)。
14.(2012·新课标全国，39)为了探究6－BA和IAA对某菊花品种茎尖外植体再生丛芽的影响，某研究小组在MS培养基中加入6－BA和IAA，配制成四种培养基(见下表)，灭菌后分别接种数量相同、生长状态一致、消毒后的茎尖外植体，在适宜条件下培养一段时间后，统计再生丛芽外植体的比率(m)，以及再生丛芽外植体上的丛芽平均数(n)，结果如表所示。
培养基编号
浓度/mg·L－1
m/%
n/个
6－BA
IAA
1
0.5
0
76.7
3.1
2
0.1
77.4
6.1
3
0.2
66.7
5.3
4
0.5
60.0
5.0
回答下列问题：
(1)按照植物的需求量，培养基中无机盐的元素可分为__________和__________两类。上述培养基中，6－BA属于__________类生长调节剂。
(2)在该实验中，自变量是______，因变量是_______，自变量的取值范围是________。
(3)从实验结果可知，诱导丛芽总数最少的培养基是__________号培养基。
(4)为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入______(填“6－BA”或“IAA”)。
答案 (1)大量元素 微量元素 细胞分裂素 (2)IAA浓度 再生丛芽外植体的比率(m)和再生丛芽外植体上的丛芽平均数(n) 0～0.5 mg·L－1 (3)1 (4)6－BA
解析 (1)根据植物的需求量，组成生物体的元素可以分为大量元素和微量元素，6－BA属于细胞分裂素类生长调节剂。(2)根据实验目的和实验步骤中的数据，可以得出IAA的浓度是自变量，菊花再生丛芽外植体的比率和外植体上的丛芽平均数是因变量。由表中数据可以看出IAA的浓度范围是0～0.5 mg·L－1。(3)再生丛芽的外植体数乘以外植体上丛芽平均数即为丛芽总数，诱导丛芽总数最少的培养基是1号培养基。(4)当生长素用量与细胞分裂素用量的比值较高时，容易诱导试管苗生根，所以培养基中一般加入IAA，而不加入6－BA。
第9课时 月季的花药培养
[学习导航] 1.阅读教材P37“(一)被子植物的花粉发育”，理解被子植物花粉发育的过程。2.阅读教材P38“(二)产生花粉植株的两种途径和(三)影响花药培养的因素”，掌握产生花粉植株的两种途径及影响因素。3.通过阅读教材P39“实验操作”，掌握花药培养的选材方法、材料的消毒及接种和培养。
[重难点击] 1.说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的两种途径。2.说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基本技术。3.尝试用月季或其他植物的花药进行培养。
一、影响花药培养的因素
1.被子植物的花粉发育
(1)花粉的概念：由花粉母细胞经过减数分裂形成的单倍体的生殖细胞。
(2)花粉发育的基本过程
花粉母细胞(小孢子母细胞)
↓减数分裂
小孢子四分体时期：4个单倍体细胞连在一起
↓
单核期
↓有丝分裂
双核期
2.产生花粉植株的两种途径及影响因素
(1)产生花粉植株的两种途径
(2)影响两种途径的因素
①培养基中激素的种类。
②培养基中激素的浓度配比。
3.影响花药培养的因素
(1)内因：材料的选择。
①从花期来看，应当选择初花期的植株。
②从花药来看，应当选择单核期的花药。
③从花蕾来看，应当选择完全未开放的花蕾。
(2)外因
①培养基的组成。
②亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等。
1.被子植物的花粉发育
观察被子植物的花粉发育过程图，并阅读教材P37(一)相关内容，归纳并回答下列问题：
(1)运用文字和箭头表示出被子植物花粉发育的过程。
答案 小孢子母细胞小孢子四分体时期―→单核居中期―→单核靠边期―→双核期(花粉管细胞核、生殖细胞核)。
(2)花粉发育过程中的四分体时期与减数分裂过程中的四分体是同一个概念吗？有什么不同？
答案 不是。减数分裂过程中的四分体是指配对的一对同源染色体含有四条染色单体；花粉发育过程中的四分体时期是指小孢子母细胞经减数分裂后形成的连在一起的4个小孢子。
(3)每个小孢子细胞内的染色体数与小孢子母细胞内的染色体数有何差异？
答案 小孢子是由小孢子母细胞经过减数分裂而形成的，所以小孢子细胞内的染色体数是小孢子母细胞内的染色体数目的一半。
(4)花粉发育时期的单核期细胞具有什么特征？
答案 细胞含有浓厚的原生质，核位于细胞的中央；随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧，并分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，进而形成两个细胞——营养细胞和生殖细胞。
(5)结合上图，分析一个小孢子母细胞产生的花粉粒、花粉管细胞核、生殖细胞核和精子的数目分别是________。
答案 4、4、4、8
(6)营养细胞在花粉萌发过程中的作用是控制花粉的萌发并提供营养。
2.花粉植株形成的过程
阅读教材P38(二)产生花粉植株的两种途径的相关内容，回答下列问题：
(1)产生花粉植株的两种途径都需要经过的过程是脱分化。
(2)产生花粉植株的两种途径是否完全不同？其原因是什么？
答案 两种途径之间并没有严格的界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
(3)进行花粉植株培养时要配制3种培养基，说出每种培养基中激素的比例和目的。
①诱导愈伤组织培养基：生长素与细胞分裂素比例适中，促进愈伤组织的形成。
②生芽培养基：生长素与细胞分裂素比值较低，促进芽的分化，抑制根的形成。
③生根培养基：生长素与细胞分裂素比值较高，促进根的分化，抑制芽的形成。
(4)愈伤组织与胚状体有何差异？
答案 愈伤组织的细胞是未分化的细胞，需经再分化生根发芽，胚状体的细胞已经经过了再分化，具有了生根发芽的能力，可以直接通过分化形成根、芽结构。
3.培养材料的选择
(1)影响花粉植株诱导成功率的主要因素有哪些？
答案 ①植物种类；②亲本植株的生理状况；③合适的花粉发育时期；④亲本植株的生长条件、材料的低温预处理、接种密度等。
(2)为提高花粉植株的诱导成功率，应选择哪个时期的花粉最适宜？
答案 初花期的、发育到单核期的花药中的花粉。
1.如图是花药培养产生花粉植株的两种途径。下列相关判断错误的是( )
生根―→移栽
A.图中的A和B分别是胚状体和愈伤组织
B.C和D过程的实质相同
C.选择的花药在花粉发育过程中越早越好
D.整个培养过程中的细胞增殖方式只有有丝分裂
问题导析 (1)两种途径中，脱分化的结果不同，一个是形成愈伤组织，一个是形成胚状体。
(2)细胞分化的实质是基因的选择性表达。
(3)选择的培养材料处于单核期最好，尤其是处于单核靠边期的花药最好。
答案 C
解析 图中A和B分别是胚状体和愈伤组织，C和D表示分化和再分化。无论是再分化还是分化，它们的实质都是基因的选择性表达。选择的花药太早或太晚都不利于培养，处于单核期的最好，尤其是单核靠边期，故C错误。整个培养过程中无减数分裂，所以细胞增殖方式只有有丝分裂。
一题多变
(1)图中用于培养的“花药中的花粉”选择单核期以前或单核期以后，均不利于培养，为什么？
答案 选择单核期以前的花药质地幼嫩，极易破碎；选择单核期以后的花药花瓣有些松动，给消毒带来困难。
(2)两种形成花粉植株的途径基本相同，主要区别在于脱分化的结果不同，决定两种途径的决定性因素是什么？
答案 培养基中植物激素的种类及其浓度配比。
2.选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素之一，下列说法正确的是( )
A.任何时期的花粉都可经过培养产生愈伤组织或胚状体
B.对所有植物来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高
C.对一般植物而言，单核期花药培养成功率最高
D.为挑选到单核期的花药，通常选择部分开放的花朵
答案 C
解析 花粉的发育时期对花药培养的成功率有重要的影响，一般在单核期，细胞核由中央移向一侧的时期，花药的培养成功率最高，但并不是所有的植物都是这样的，A、B项错误，C项正确；为挑选到单核期的花药，通常选用完全未开放的花蕾，D项错误。
二、尝试用月季的花药进行培养
1.材料的选取
(1)花粉发育时期的确定：一般通过镜检来确定花粉是否处于适宜的发育期。
(2)花粉染色法
①醋酸洋红法：最常用的方法，能将花粉细胞核染成红色。
②焙花青－铬矾法：当花粉细胞不易着色时采用此法，能将花粉细胞核染成蓝黑色。
2.材料的消毒
选取花蕾
↓
初步消毒：通常先将花蕾用体积分数为70%的酒精浸泡约30 s
↓
冲洗：在无菌水中清洗，并用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分
↓
彻底消毒：放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4 min(也可用质量分数为1%的
次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液)
↓
再冲洗：再用无菌水冲洗3～5次
3.接种
(1)剥离花药
(2)接种花药：立即将花药接种到培养基上。
4.培养
(1)培养条件：温度为25 ℃，前期不需要光照，幼小植株形成后需要光照。
(2)培养过程：先进行脱分化培养，当花药开裂长出愈伤组织后及时转移到分化培养基上；若花药开裂释放出胚状体则要尽快将幼小植株分开。
5.鉴定和筛选
通过愈伤组织形成的花粉植株，染色体组的数目常常会发生变化。
1.培养材料的选择方法
(1)醋酸洋红法和焙花青－铬矾法染色的目的是使细胞核着色，以便观察细胞核的位置，以确定花粉发育的适宜时期。
(2)月季花蕾的消毒与菊花外植体的消毒相比较，二者有何不同？
答案 在酒精消毒前，花药不需要预先用流水冲洗、洗衣粉洗涤和软刷刷洗。
(3)用于培养的花药，只要将整个花蕾或幼穗消毒即可，原因是完全未开放的花蕾中，花药实际上多数未成熟，由于它的外面有花萼、花瓣或颖片保护，通常处于无菌状态。
(4)在菊花的组织培养和月季的花药培养过程中，对光照的要求是否相同？
答案 不相同。在菊花的组织培养过程中每日用日光灯光照12 h，但是月季的花药培养过程中，初期不需要光照，幼小植株形成后才需要光照。
2.花药离体培养在育种上的应用
(1)在花药离体培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，为什么常常会出现染色体加倍的变化？
答案 主要是由花粉管细胞核和生殖细胞核融合造成的，有些是由花粉壁细胞发育形成的二倍体花粉壁植株。
(2)植物花药离体培养得到的单倍体植株是不可育的，如何能使其具有正常的繁殖能力呢？此育种方法有哪些优点？
答案 花粉粒发育为单倍体植株，再经过人工诱导使染色体数目加倍，重新恢复到正常植株的染色体数目。这样得到的植株能够正常生殖，而且每对染色体上成对的基因都是纯合的，自交的后代不会发生性状分离。单倍体育种不仅缩短了育种周期，也为新品种的培育开辟了新途径。
3.育种工作者常采用花药培养的方法，使花粉粒发育为单倍体植株。下面过程是采用水稻的花药进行培养的步骤。
请据此回答下面的问题：
选取水稻花药―→对花药消毒―→接种和培养―→植物体
(1)诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素的影响，其中__________、__________是主要的影响因素；选择合适的______________也是提高诱导成功率的重要因素。
(2)花粉在发育过程中要经历__________、__________、__________等阶段，选取的水稻花药应为__________期的花药，此时细胞核由中央移向细胞一侧，花药培养成功率最高。
(3)在剥离花药时，要尽量不损伤花药，原因是______________________________________；同时还要彻底去除花丝，原因是_____________________________________________。
(4)通过花药培养产生单倍体植株一般有两种途径：一种是花粉通过__________阶段发育为植株；另一种是在诱导培养基上先形成__________，再将其诱导分化成植株。
(5)试管苗形成过程中，必须从培养基中获得无机盐或矿质元素和小分子有机物等营养物质。要促进花粉细胞分裂和生长，培养基中应有__________和__________两类激素。
答案 (1)材料的选择 培养基的组成 花粉发育时期
(2)小孢子四分体时期 单核期 双核期 单核靠边
(3)如果花药受损，接种后容易从受损伤的部位产生愈伤组织 与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成 (4)胚状体 愈伤组织 (5)细胞分裂素 生长素
解析 诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素的影响，其中材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素；选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。花粉在发育过程中要经历小孢子四分体时期、单核期、双核期等阶段，选取的水稻花药应为单核靠边期的花药；在剥离花药时要尽量不损伤花药，否则接种后容易从受伤的部位产生愈伤组织；同时还要彻底去除花丝，因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成；通过花药培养产生单倍体植株一般有两种途径：一种是通过胚状体阶段发育为植株；一种是先形成愈伤组织再将其诱导分化成植株。
一题多变
(1)选择材料时，需要使用显微镜对花药进行观察，对花药进行染色的方法有哪些？
答案 醋酸洋红法和焙花青－铬矾法。
(2)是否整个培养过程都需要光照？
答案 不是，在幼小植株形成以后才需要光照。
(3)使用细胞分裂素和生长素时，哪些方面会影响培养的结果？
答案 使用的顺序和用量的比例。
1.花药培养与植物组织培养的主要不同之处在于( )
A.培养基配制方法 B.无菌技术
C.接种操作 D.选材
答案 D
解析 花药培养技术选取的材料为植物体细胞减数分裂形成的花药；而植物组织培养技术利用的材料为植物的体细胞。
2.月季的花药培养过程中的难点之一是材料的选择，下列有关材料选择的叙述，正确的是( )
A.从花药来看，应当选择盛花期的花药
B.从花粉来看，应当选择小孢子四分体时期的花粉
C.从花蕾来看，应当选择略微开放的花蕾
D.从检测花粉的实验方法看，应该用显微镜观察已染色的花粉样品临时装片
答案 D
解析 从花药来看，应当选择初花期的花药；从花粉来看，应当选择单核期的花粉；从花蕾来看，应当选择完全未开放的花蕾；用已染色的花粉样品作临时装片，才能观察到细胞核的位置，以确定花粉发育的时期。
3.接种和培养花药时应注意的事项全对的一组是( )
①不损伤花药 ②彻底去除花丝 ③幼小植株形成后需要光照 ④花药开裂释放出的幼小植株会分别发育成单倍体，无需分开
A.①②③ B.①②④ C.②③④ D.①③④
答案 A
解析 本题中若花药受损，易从受损部位产生愈伤组织；与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成，因此要彻底去除花丝；幼小植株形成后需要光照，由异养转化为自养；花药开裂释放出的胚状体要尽快分开，分别移植到新培养基上，否则这些植株将难以分开。
4.植物的花药培养在育种上有特殊的意义。植物组织培养可用于无病毒植株及细胞产物的工厂化生产等方面。请回答相关问题：
(1)利用月季的花药离体培养产生单倍体时，选材非常重要。一般来说，选择________期的花药进行培养的成功率最高。为了选择该期的花药，通常选择__________的花蕾。确定花粉发育时期最常用的方法有__________，但是对于花粉细胞核不易着色的植物，需采用____________法，该法能将花粉细胞核染成________色。
(2)进行组织培养需配制MS培养基，在该培养基中常需要添加_________、________等激素。欲利于根的分化，植物激素的用量比例应为_______________________。
(3)无菌技术也是成功诱导出花粉植株的重要因素，下列各项中属于使用化学药剂进行消毒的是________，属于采用灼烧方法进行灭菌的是________。(填序号)
①培养皿 ②培养基 ③实验操作者的双手 ④三角锥形瓶 ⑤接种环 ⑥花蕾
答案 (1)单核 完全未开放 醋酸洋红法 焙花青－铬矾 蓝黑 (2)生长素 细胞分裂素 生长素多于细胞分裂素 (3)③⑥ ⑤
解析 (1)花期早期时的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。该时期的花药通常存在于完全未开放的花蕾中。(2)生长素与细胞分裂素等植物激素可调节脱分化和再分化。当生长素含量多于细胞分裂素时，利于先形成根。(3)对实验器具进行灭菌处理，对实验过程中的具有生物活性的材料或用具进行消毒处理。
课时作业
[学考达标]
1.被子植物花粉发育经历的阶段顺序正确的是( )
A.小孢子四分体时期→双核期→单核居中期→单核靠边期→花粉粒
B.小孢子母细胞→单核靠边期→单核居中期→双核期→花粉粒
C.小孢子母细胞→小孢子四分体时期→单核居中期→单核靠边期→花粉粒
D.小孢子四分体时期→小孢子母细胞→双核期→单核期→花粉粒
答案 C
解析 小孢子母细胞经减数分裂形成四个小孢子，经历小孢子四分体时期、单核居中期、单核靠边期、双核期发育成花粉粒。
2.下列说法错误的是( )
A.被子植物的花粉发育过程依次经历了小孢子四分体时期、单核期、双核期
B.被子植物的花粉是由花粉母细胞经有丝分裂而形成的，因而含有与体细胞中数目相同的染色体
C.花粉是单倍体的生殖细胞
D.花粉粒内有两个精子
答案 B
解析 被子植物的花粉是由花粉母细胞经减数分裂而形成的，因而花粉是单倍体的生殖细胞，含有比体细胞中数目减半的染色体。
3.下列有关花药培养的说法，正确的是( )
A.花期后期时的花药比前期更容易产生花粉植株
B.月季的花药培养一般选择在月季盛开期
C.选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素
D.选择单核期以前的花药接种，培养成功率更高
答案 C
解析 花粉植株的获取中选择合适的花粉发育时期是提高诱导成功率的重要因素，花药培养需选择花蕾期的花粉发育至单核期进行培养，过早或过晚都不易培养成功。
4.产生花粉植株的两种途径中，得到胚状体和愈伤组织都是通过下列选项中的哪个过程( )
A.分化 B.脱分化 C.再分化 D.诱导
答案 B
解析 产生花粉植株的两种途径中，胚状体和愈伤组织都是经过花粉脱分化产生的，两种途径之间没有绝对界限，主要取决于培养基中激素的种类及其浓度配比。
5.下列关于月季花药培养的叙述中，错误的是( )
A.材料的选择与培养基的组成影响花药培养的成功率
B.通常选择完全未开放的花蕾
C.选取材料时一定要进行消毒
D.培养形成的胚状体可继续在原培养基中分化形成植株
答案 D
解析 培养基的组成和材料的选择是影响花药培养能否成功的主要因素，为了检测花粉是否处于适宜的发育期，常选择完全未开放的花蕾以便找到单核期花粉。为了避免微生物使花药腐烂，需对材料进行消毒。在培养过程中，若花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量幼小植株，因此，必须在花药开裂后尽快将幼小植株分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。
6.单倍体育种的常用方法是花药离体培养，为了促进花粉迅速生长发育为单倍体植株，培养基中除必需的营养物质外，还需加入( )
A.秋水仙素 B.三磷酸腺苷
C.植物激素 D.纤维素酶
答案 C
[高考提能]
7.四倍体水稻的花药通过无菌操作接入试管，经培养形成试管苗，下列叙述中不正确的是( )
A.用花药离体培养法获得的植株是二倍体
B.诱导产生愈伤组织的分裂方式为有丝分裂
C.培养基中应有无机养料、有机养料以及生长素和细胞分裂素
D.试管苗的生长发育需要光照
答案 A
解析 四倍体水稻的花药离体培养获得的是含有2个染色体组的单倍体植株，不能叫做二倍体；花药通过培养诱导产生愈伤组织的分裂方式是有丝分裂，同时，培养过程中要加入无机营养、有机营养、生长素和细胞分裂素等物质。培育成试管苗需通过光照进行光合作用，产生糖类，以满足自身生长需求。
8.下图表示应用植物组织培养技术培育优质玉米的过程。对此过程的描述错误的是( )
A.试管苗培养过程必须在无菌条件下进行
B.D试管中组织分化的调控与激素配比有关
C.培养成的试管苗即可用于推广种植
D.在培养基中加入病原体的致病毒素，可筛选出抗病突变体
答案 C
解析 由于外植体和愈伤组织的生活能力较弱，微生物的生活能力较强，不灭菌处理容易导致组织培养失败。组织培养中激素种类和比例不同会导致愈伤组织产生不同的分化结果；培养成的试管苗需要经过一定浓度的秋水仙素处理之后才可以用于推广种植；要筛选出抗病突变体，就要制作对应的选择培养基。
9.下图是水稻的花药通过无菌操作，培养产生花粉植株的两种途径的示意图。下列相关叙述中错误的是( )
A.无论哪条途径都要经过脱分化和再分化过程
B.A是胚状体，C是诱导，B是生根
C.两种培养途径的理论基础都是植物细胞的全能性
D.A和种子的结构相同，都具有种皮、胚芽、胚根、胚轴等结构
答案 D
解析 图中的A是胚状体，C是诱导，B是生根。两种途径都要经过脱分化和再分化过程。植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性。胚状体中有胚轴、胚根和胚芽，但无种皮，故答案选D。
10.有关月季花药培养的叙述，正确的是( )
A.月季花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的单倍体生殖细胞
B.被子植物花粉形成过程中的四分体与高等动物精子形成过程中的四分体概念相同
C.被子植物一个小孢子母细胞经过减数分裂共形成了4个精子
D.花药培养成幼苗后，不需分瓶培养
答案 A
解析 月季花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的单倍体生殖细胞，A正确；被子植物花粉形成过程中的四分体表示4个小孢子，高等动物精子形成过程中的四分体是一对同源染色体联会形成的，二者是不同的概念，B错误；被子植物一个小孢子母细胞经过减数分裂形成4个小孢子，每个小孢子发育成一个花粉粒，每个花粉粒中能够形成2个精子，因此每个小孢子母细胞经过减数分裂共形成了8个精子，C错误；在获得愈伤组织或幼小植株时，要及时分瓶，以便于诱导愈伤组织再分化或幼苗分开，D项错误。
11.下图表示菊花的嫩枝和月季的花药离体培养的过程，请据图回答下面的问题：
(1)对菊花来说，要选择生长旺盛的嫩枝来进行组织培养，其原因是________________
_______________________________________________；对月季来说，适宜花药培养的时期是__________期，为确定花粉是否处于该时期，最常用的镜检方法是______________。
(2)在培养嫩枝组织和花药的培养基中都要加入一定的植物激素，常用的植物激素有________________________________________________________________________。
(3)两种植物材料的培养在进行接种时应注意：
①接种室要消毒；②材料可用____________________进行浸泡，取出用无菌水冲洗后，再用质量分数为0.1%的氯化汞溶液消毒；③接种操作要在________________进行；④接种完毕后立即盖好瓶盖。
(4)月季的花药培养过程中，花粉植株的形成除图中所示途径外，还可以通过__________阶段发育而来，这两种途径的差别主要取决于____________________________________。
(5)图中花粉植株属于_________倍体，要使其能繁殖后代可采取措施是___________。
答案 (1)生长旺盛的嫩枝生理状况好，容易诱导脱分化和再分化 单核 醋酸洋红法
(2)生长素和细胞分裂素
(3)体积分数为70%的酒精 酒精灯火焰旁
(4)胚状体 培养基中激素的种类及其浓度配比
(5)单 用一定浓度的秋水仙素处理幼苗
解析 菊花的组织培养，一般选取未开花植株的茎上部新萌生的侧枝，主要是因为其分裂能力强。被子植物花粉的发育要经历小孢子四分体时期、单核期和双核期等阶段，其中单核期是绝大多数植物花药培养的适宜时期。在组织培养中常要加入一些植物激素如生长素和细胞分裂素，在培养的不同时期加入激素的比例不同。组织培养过程中要求进行严格的无菌操作，因为一旦出现细菌和真菌污染，就会导致实验失败。花粉植株也可以通过胚状体诱导而成。
12.如图表示花药离体培养及单倍体育种的大致过程，请据图回答下列问题：
(1)过程①是把幼小的花药分离出来，并在无菌条件下将其放在MS培养基上进行培养，配制该培养基时，需要的物质应该有__________________________(至少答三种)。
(2)过程②是花药在MS培养基所提供的特定条件下经脱分化形成________________，此过程细胞分裂的方式是________________________。
(3)经过过程③产生的植株(不考虑核与核之间融合)是__________植株，其特点是植株弱小，高度不育，在生产上无推广应用的价值，若要使其正常结果，可在移栽后在幼苗__________滴加适宜浓度的__________。
(4)过程②与过程③所用培养基有差异，主要是__________方面的差异。
答案 (1)水、大量元素、微量元素、有机物、琼脂、植物激素等(任答三种即可)
(2)愈伤组织或胚状体 有丝分裂
(3)单倍体 茎尖 秋水仙素
(4)植物激素
解析 (1)植物组织培养需要的物质主要包括大量元素、微量元素、有机物(如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素、蔗糖等)等。(2)脱分化是由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，此过程细胞进行有丝分裂。(3)经过花药培养得到的植株为单倍体，表现为高度不育，可对其幼苗的茎尖用秋水仙素处理，使染色体加倍后，才能恢复育性。(4)生长素和细胞分裂素的用量比值高时，有利于根的分化、抑制芽的形成；比值低时，有利于芽的分化、抑制根的形成；比值适中时，促进愈伤组织的形成。
13.下图表示植物组织培养过程，请据图回答下列问题：
(1)①表示________________，它能培养成为④的原因是________________________。
(2)②表示的是__________。
(3)若①是花药，则④是__________幼苗，对其使用__________处理可获得可育植株。
(4)若①是胡萝卜根尖细胞，则培养成的④的叶片的颜色是__________色。
(5)对花药离体培养的说法错误的是( )
A.若接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体后，要适时转换培养基，以便进一步分化成植株
B.材料消毒时需先用酒精浸泡，在无菌水中清洗，然后用氯化汞或次氯酸钙溶液浸泡，最后再用无菌水冲洗
C.接种花药后一段时间内不需要光照，但幼小植株形成后需要光照
D.对材料的选择最常用的是焙花青－铬矾法，这种方法能将花粉细胞核染成蓝黑色
答案 (1)外植体(离体的器官、组织或细胞) 植物细胞的全能性 (2)愈伤组织 (3)单倍体 秋水仙素 (4)绿 (5)D
解析 图示为植物组织培养过程，①为外植体，②为愈伤组织，③为胚状结构，④为幼苗。若①是花药，则④是单倍体幼苗，继续对其使用秋水仙素处理可获得可育植株。无论用胡萝卜的哪一部分体细胞培育得到的幼苗，其叶片都是绿色的。
[真题体验]
14.(2013·江苏，11)某种极具观赏价值的兰科珍稀花卉很难获得成熟种子。为尽快推广种植，可应用多种技术获得大量优质苗，下列技术中不能选用的是( )
A.利用茎段扦插诱导生根技术快速育苗
B.采用花粉粒组织培养获得单倍体苗
C.采集幼芽嫁接到合适的其他种类植物体上
D.采用幼叶、茎尖等部位的组织进行组织培养
答案 B
解析 A和C属于无性繁殖技术，能生产出大量的优质苗。D中属于利用体细胞进行的无性繁殖，也能生产出大量的优质苗。B中由于是培养的花粉粒组织，花粉粒形成于减数分裂，所以会发生性状分离。
15.(2011·上海，22)下列关于植物组织培养的表述，错误的是( )
A.外植体可以来自于植物的任何细胞
B.培养应在无菌条件下进行
C.以花粉作为外植体可得到单倍体植株
D.不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同
答案 A
专题4 酶的研究与应用
知识系统构建
酶的研究与应用
必背要语
1.果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶等
2.碱性蛋白酶能将大分子蛋白质水解为可溶性的氨基酸或小分子的肽，所以蛋白质类纤维织物不能用此种加酶洗衣粉洗涤。
3.温度、酸碱度和表面活性剂都会影响加酶洗衣粉的洗涤效果。
4.固定化酶常采用化学结合法和物理吸附法，而固定化细胞则常采用包埋法。
5.配制海藻酸钠溶液浓度过高，则难以形成凝胶珠；若浓度过低，则固定的酵母细胞少，影响实验效果。
6.固定化酶和固定化细胞技术既实现了对酶的重复利用，降低了成本，又提高了产品质量。
规律方法整合
整合一 酶的相关探究实验中的操作提示
1.探究温度对酶活性的影响时，可以选用10 ℃作为温度梯度，设置的具体温度为10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃等，也可以根据酶的特点，尝试以5 ℃作为温度梯度。
2.探究pH对酶活性的影响时，只需将温度梯度改成pH梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液中的pH可以通过体积分数为0.1%的氢氧化钠溶液或盐酸进行调节。
3.探究酶的用量是建立在探究最适温度和pH对酶活性影响的基础之上的。此时，研究的变量是酶的用量，其他因素都应适宜且保持不变。实验时可以配制不同浓度的酶溶液，也可以只配制一种浓度的酶溶液，然后使用不同的体积即可。需要注意的是，反应液的pH必须相同，否则将影响实验结果的准确性。
4.在混合反应物和酶之前，一定要让两者分别达到相应的条件。这样可以避免底物和酶在混合时条件变化而影响实验结果。
5.将酶加入反应物后，应不时地用玻璃棒搅拌，使酶能更充分地催化反应。
6.本课题中的自变量、因变量及注意事项归纳
实验名称(目的)
自变量
因变量
注意事项
探究温度对果胶酶活性的影响
温度
果汁量(澄清度)
①底物和酶在混合时的温度是相同的；②温度梯度越小，实验结果越精确；③各试管中苹果泥的用量相同，果胶酶的用量也相同；④pH为最适pH
探究pH对果胶酶活性的影响
pH
果汁量(澄清度)
①温度应为最适温度；②pH梯度可用0.1%的氢氧化钠溶液和盐酸调节；③用玻璃棒搅拌使反应充分进行
探究果胶酶的用量对酶活性的影响
果胶酶的用量
果汁量(澄清度)
①制备苹果匀浆后迅速加热，使苹果匀浆中的果胶酶变性；
②温度、pH应为最适宜且保持不变
例1 果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要成分之一。果胶酶能够分解果胶，瓦解植物细胞壁和胞间层。在果汁生产中应用果胶酶可以提高出汁率和澄清度。请你帮助完成以下有关果胶酶和果汁生产的实验课题。
实验用具和材料：磨浆机、烧杯、试管、量筒、刀片、玻璃棒、漏斗、纱布等；苹果、质量分数为2%的果胶酶溶液、蒸馏水等。
[课题一] 验证果胶酶在果汁生产中的作用
实验方法及步骤：
(1)将苹果洗净去皮，用磨浆机制成苹果泥，加入适量蒸馏水备用。
(2)取两个100 mL洁净的烧杯，编号为1、2，按相应程序进行操作，请把下表中未填写的内容填上。
操作顺序
项目
烧杯
1
2
①
在烧杯中加入苹果泥
20 mL
20 mL
②
A.
2 mL
/
③
注入蒸馏水
/
B.
④
在恒温水浴中保温，并用玻璃棒不时搅拌
10 min
10 min
(3)取两个大烧杯，同时进行过滤。观察(比较) ，并记录结果。
(4)实验结果的预测及结论：如果
，则说明果胶酶对果胶的水解具有催化作用。
[课题二] 探究果胶酶催化果胶水解的最适pH
本课题实验步骤中，在完成“烧杯中分别加入苹果泥，试管中分别注入果胶酶溶液，编号、编组”之后，有下面两种操作。
方法一：将试管中的果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥相混合，再把混合液的pH分别调至4、5、6、7、8、9、10。
方法二：将试管中的果胶酶溶液和烧杯中的苹果泥的pH分别调至4、5、6、7、8、9、10，再把pH相等的果胶酶溶液和苹果泥相混合。
(1)请问上述哪种方法更科学？ 。理由是
。
(2)该实验步骤中也有用玻璃棒搅拌的操作，其目的是使 。
(3)如果用曲线图记录实验结果，在现有的条件下，可用横坐标表示pH，则纵坐标表示 (果汁体积/试管体积)。根据你对酶特性的了解，下列最可能表示实验结果的曲线是 。
答案 [课题一](2)注入果胶酶溶液 2 mL
(3)相同时间内滤出的果汁体积和果汁澄清度
(4)相同时间内l号烧杯中滤出的果汁体积比2号烧杯中滤出的果汁体积大，且澄清度高
[课题二](1)方法二 方法二的操作能够确保酶的反应环境从一开始便达到实验预设的pH (2)果胶酶和反应物充分接触 (3)果汁体积 A
解析 课题一中，依据实验目的确定单一变量是果胶酶的有无。因为是验证性实验，预测的结果应与实验目的相对应，即相同时间内1号烧杯中滤出的果汁体积比2号烧杯中滤出的果汁体积大，且澄清度高。课题二中方法二是将pH调至预设pH后再把果胶酶溶液和苹果泥相混合，这样能避免在达到预设pH前可能有部分果胶已被果胶酶催化分解。用玻璃棒搅拌可使果胶酶充分地与苹果泥接触来催化反应的进行。
整合二 加酶洗衣粉使用时需要注意的问题
1.碱性蛋白酶能使蛋白质水解，因此，蛋白质类纤维(羊毛、蚕丝等)织物就不能用加酶洗衣粉来洗涤，以免使纤维受到破坏。
2.使用加酶洗衣粉时，必须注意洗涤用水的温度。碱性蛋白酶在35～50 ℃时活性最强，在低温下或60 ℃以上就会失效。
3.加酶洗衣粉也不宜长期存放，存放时间过长会导致酶活力降低。
4.加酶洗衣粉不宜与三聚磷酸盐共存，否则酶的活性将会丧失。
5.添加了碱性蛋白酶的洗衣粉可以分解人体皮肤表面蛋白质，而使人患过敏性皮炎、湿疹等，因此，应避免与这类洗衣粉长时间接触。
例2 为了进一步增强洗衣粉对血渍、奶渍、油污、土豆泥等衣物上常见污垢的去除能力，洗衣粉中常常会添加各种酶类。请回答有关问题：
(1)根据衣物上常见的污垢，加酶洗衣粉中添加的酶类有碱性蛋白酶、 。碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子蛋白质水解成可溶性的 。
(2)下表为加酶洗衣粉包装袋上的产品说明，根据你所学习的有关知识，解释注意事项③的原因： 。
注意事项
①请将本品置于阴凉、干燥处，避热、避湿、避光。
②不慎溅入眼中，立即用水冲洗。
③水温以30～50 ℃为宜，切忌用60 ℃以上的热水。
答案 (1)(碱性)脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶 小分子的肽(氨基酸)
(2)酶的催化受温度影响，30～50 ℃是洗衣粉中酶的适宜温度范围
整合三 从酶到固定化酶再到固定化细胞的发展过程
例3 下列对固定化酶和固定化细胞的说法，正确的是( )
A.固定化细胞常用物理吸附法，固定化酶常用包埋法
B.固定化细胞技术一次只能固定一种酶
C.固定化酶和固定化细胞所固定的酶都可以反复使用，但酶的活性迅速下降
D.固定化酶不溶于反应液中，易于回收，可以重复利用
答案 D
解析 某种固定化酶的优势是酶可以反复使用；固定化细胞技术一次能固定多种酶；固定化酶和固定化细胞都能反复使用，酶的活性一段时间后会下降，但并不是迅速下降。
热点考题集训
1.果胶酶在果汁生产中发挥重要作用，下列说法正确的是( )
A.果胶酶只存在于植物中
B.果胶易溶于水，而不溶于乙醇
C.果胶酶和纤维素酶均能分解果胶
D.果胶酶和纤维素酶一起使用可以除去植物细胞壁
答案 D
解析 果胶酶广泛存在于植物和微生物中。果胶不溶于水，不溶于乙醇。酶具有专一性，因此只有果胶酶才能分解果胶。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，因此使用果胶酶和纤维素酶，可以除去植物细胞壁。
2.下列关于探究果胶酶最适用量的实验，叙述错误的是( )
A.配制不同浓度的果胶酶溶液，并在各组中加入等量的该溶液
B.调节pH，使各组中的pH相同而且处于适宜状态
C.用玻璃棒搅拌加酶的果泥，搅拌时间可以不同
D.在相同且适宜温度条件下进行实验
答案 C
解析 由于要探究果胶酶最适用量，故可配制不同浓度的果胶酶溶液，并在各组中加入等量的溶液，A项正确；该实验中pH为无关变量，故应保持各组中的pH相同而且处于适宜状态，B项正确；用玻璃棒搅拌加酶的果泥和温度都为无关变量，因此搅拌时间必须相同，温度应相同且适宜，C项错误、D项正确。
3.下列进行探究温度对酶活性的影响的实验中，不正确的是( )
A.实验的自变量是温度
B.无关变量有pH、底物浓度、酶浓度、反应时间等
C.通过测定滤出的果汁的体积来判断果胶酶的最适温度
D.温度过低时，酶空间结构改变，果胶酶活性变小，但是不会失活
答案 D
解析 温度过低时，酶的空间结构正常，但活性变小。
4.为了使牛仔裤呈现“穿旧”效果，在工业洗衣机中用酶洗代替传统的浮石擦洗，是目前重要的生产手段(工艺流程见下图)。下列叙述中错误的是( )
A.纤维素酶在仿旧中的作用机理与其在洗衣粉中去污的机理相似
B.在上述工艺中，为重复使用纤维素酶，可选用适当的包埋剂固定化酶
C.在上述工艺中，通过调节温度、酸碱度、处理时间可控制仿旧颜色的深浅
D.纤维素酶催化葡萄糖残基之间的糖苷键水解分解纤维素
答案 B
解析 在仿旧和去污中，纤维素酶均作用于衣物，二者作用机理相似，A正确；由于纤维素酶较小，不能用包埋法固定化酶，B错误；改变温度、酸碱度和处理时间会影响酶作用的结果，控制仿旧颜色的深浅，C正确；纤维素酶催化葡萄糖残基之间的糖苷键水解分解纤维素，D正确。
5.下图是围绕加酶洗衣粉洗涤效果进行的研究结果。下列有关叙述，不正确的是( )
A.本研究的自变量有温度和洗衣粉是否加酶
B.本研究的因变量可能是污渍残留量
C.两类洗衣粉的最佳使用温度都为t1
D.温度超过t2后加酶洗衣粉中的酶可能失活
答案 C
解析 根据实验目的人为改变的变量是自变量，随着自变量的变化而变化的变量是因变量。加入的洗衣粉不同，温度不同，都会造成洗涤效果的差异，故A正确；可用污渍的残留量来表示洗涤效果，故B正确；若纵坐标表示污渍残留量，则加酶洗衣粉的最适温度为t1，普通洗衣粉的最佳使用温度为t2，故C错误；温度过高，酶的活性降低甚至失活，故D正确。
6.下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，错误的是( )
A.固定化酶的主要目的是实现酶的重复利用
B.溶解氧交换受阻是固定化酶应用的重要限制因素
C.固定化细胞用于生产能分泌到细胞外的产物
D.凝胶与被包埋细胞之间不是通过共价键结合
答案 B
解析 A项，固定化酶制作的目的是能够顺利从发酵产物中把酶分离出来，能够使酶反复使用；B项，溶解氧交换受阻会影响细胞呼吸，是固定化细胞应用的重要限制因素；C项，固定化细胞常用于生产能分泌到细胞外的产物，如固定化酵母细胞用于生产酒精；D项，将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞，细胞并不与凝胶通过共价键结合。
7.下列有关固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( )
A.可用包埋法制备固定化酵母细胞
B.反应产物对固定化酶的活性没有影响
C.葡萄糖异构酶固定前后专一性不同
D.固定化细胞可以催化各种反应底物的一系列反应
答案 A
解析 细胞难以被吸附或结合，固定化细胞多采用包埋法，A正确；反应产物积累能影响酶的结构，从而使酶的活性下降，B错误；葡萄糖异构酶在固定前后专一性不变，C错误；固定化细胞固定的是一系列酶，可以催化一系列反应，但不能催化各种反应底物的一系列反应， D错误。
8.下列关于酶和固定化酵母细胞的研究与应用的叙述，错误的是( )
A.从酶的固定方式看，吸附法比化学结合法对酶活性影响小
B.作为消化酶使用时，蛋白酶制剂以口服方式给药
C.尿糖试纸含有固定化的葡萄糖酶和过氧化氢酶，可以反复使用
D.将海藻酸钠凝胶珠用蒸馏水冲洗，目的是洗去CaCl2和杂菌
答案 C
解析 酶的固定方式有包埋法、化学结合法和物理吸附法，物理吸附法是利用吸附剂本身的表面张力对附近的分子产生吸附，与化学结合法相比，不会使被吸附物质的性质发生改变，所以吸附法对酶活性影响较小，A正确；消化酶在人体消化道内发挥作用，蛋白酶制剂一般在最外面加上糖衣后通过口服方式给药，B正确；尿糖试纸是一种由葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和某种无色的化合物固定于滤纸上制成的酶试纸，不能反复利用，C错误；制备固定化酵母细胞时，将海藻酸钠凝胶珠用蒸馏水冲洗的目的是洗去CaCl2和杂菌，防止凝胶珠硬度过大和杂菌污染，D正确。
9.某生物课外活动小组发现，新鲜水果比放置一段时间的水果硬。他们根据所学知识，认为可能的原因是放置一段时间的水果果胶酶含量高，而果胶酶能将细胞壁分解，使水果细胞相互分离，导致水果变软。为探究上述假设是否正确，他们进行了如下探究：
(1)实验原理：
。
(2)实验假设：
。
(3)实验步骤：
①分别将等量的去皮后的新鲜苹果和放置一段时间的苹果切成小块，放在榨汁机中，制成果泥。
②分别用滤纸或5层纱布过滤，收集滤液(条件相同)。
③ 。
(4)实验结论：
。
(5)根据此实验，能否得出水果放置时间越长，营养价值越高的结果？为什么？
。
答案 (1)果胶酶能将胞间层的果胶分解，使细胞分散，水果变软
(2)放置一段时间的水果中果胶酶含量高
(3)③观察比较滤液的体积和澄清度
(4)放置一段时间后的水果中，果胶酶含量比新鲜水果高
(5)不能。因为水果放置时间过久，维生素C会大量损耗
解析 水果变软是细胞壁的支持作用减弱，因此其原理应从细胞壁的成分变化入手来回答。实验假设是未得到证实的结论，可假设放置一段时间的水果中果胶酶含量高。实验步骤中在将两种不同苹果的苹果泥滤液(果汁)分别收集好后，可通过比较滤液的体积和澄清度来判断果胶酶的含量，得到的果汁体积多、澄清度高的滤液中果胶酶含量较多。
10.某实验小组进行固定化酵母细胞的制备，并进行了游离酵母和固定化酵母发酵产酒酒精度的比较，结果如下表所示。请回答下列问题：
产酒酒精度的比较
时间(d)
游离酵母
固定化酵母
0
0
0
2
1.0
2.5
4
2.1
4.2
6
3.2
5.0
8
3.9
5.4
10
4.3
6.0
12
4.6
6.4
(1)制备固定化酵母细胞的实验步骤：酵母细胞的活化→ →配制海藻酸钠溶液→ →固定化酵母细胞。
(2)影响实验成败的关键步骤： 。
(3)海藻酸钠起 的作用。
(4)该小组将制备好的固定化酵母与游离酵母分别放在一定的相同条件下发酵，定时记录发酵液中酒精度的变化。
①实验过程中的“在一定的相同条件下发酵”中的条件是 ，要求条件相同是为了确保 。
②由表格可知，固定化酵母和游离酵母发酵都能产生酒精，但固定化酵母在发酵前期的延迟期的时间比游离酵母发酵前期的延迟期的时间要 。
(5)为了保证酵母菌的正常发酵，发酵装置中应加入的营养物质是 。
(6)怎样检测发酵后发酵液的酒精度？
。
答案 (1)配制CaCl2溶液 海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 (2)配制海藻酸钠溶液 (3)包埋酵母细胞(或载体) (4)①适宜的温度、pH等 单一变量 ②短 (5)葡萄糖溶液 (6)可以利用酸性重铬酸钾溶液检测
解析 (1)制备固定化酵母细胞的实验步骤为：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。
(2)该实验的关键是海藻酸钠溶液的配制。如果浓度过低，则制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色；若浓度过高，则形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，一般呈蝌蚪状。
(3)海藻酸钠起载体作用，用于包埋酵母细胞。
(4)酵母菌酒精发酵过程是细胞内酶的催化过程，需要在适宜的温度、pH条件下进行。两组实验的条件相同，能够确保无关变量相同，遵循单一变量原则。从表中看出，在12 d的发酵时间里，固定化酵母发酵产酒精的酒精度从0度到6.4度。而且固定化酵母在第4天即达到4.2度，表明其延迟期短。
第10课时 果胶酶在果汁生产中的作用
[学习导航] 1.阅读教材P42“基础知识”，掌握影响酶活性的因素和果胶酶的作用及用量。2.阅读教材P43“[资料一]探究温度和pH对酶活性的影响”，理解并掌握对照实验的设计原则和实验流程。3.阅读教材P44“[资料二]探究果胶酶的用量”和“操作提示”，掌握影响果汁产量的因素及果汁生产中需注意的问题。
[重难点击] 1.简述果胶酶的作用。2.检测果胶酶的活性。3.探究温度和pH对果胶酶活性的影响以及果胶酶的最适用量。4.搜集有关果胶酶应用的资料。
一、果胶和果胶酶以及影响酶活性的因素
1.果胶
(1)成分：由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物。
(2)特点：不溶于水。
(3)作用：是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一。
2.果胶酶
(1)种类：多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶、果胶酯酶等。
(2)作用
①瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁变得更容易。
②把果胶分解为可溶性的半乳糖醛酸，使浑浊的果汁变得澄清。
3.酶的活性与影响酶活性的因素
(1)酶的活性
①概念：酶催化一定化学反应的能力。
②表示方法：用在一定条件下，酶所催化的某一化学反应的反应速度来表示。
③酶反应速度的表示方法：单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量。
(2)影响酶活性的因素：温度、pH和酶的抑制剂等。
4.酶的用量
酶用量过多，会导致酶的浪费；酶用量过少，会限制酶促反应的速度。因此要得到适宜的酶用量，需通过设计实验进行探究。
1.果胶和果胶酶
(1)从果胶是植物细胞壁以及胞间层的成分方面思考，果胶对果汁生产有哪些不利影响？
答案 ①果胶会影响出汁率；②果胶还会使果汁浑浊。
(2)果胶酶是否特指分解果胶的一种酶？该酶的化学本质是什么？
答案 ①否，果胶酶是分解果胶的一类酶的总称；②果胶酶的化学本质是蛋白质。
(3)分析下图，回答果胶酶的作用原理。
答案 果胶酶能分解果胶，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使得浑浊的果汁变得澄清，而果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸。
2.影响酶活性的因素
(1)影响酶促反应速度的外界因素有哪些？它们是否都影响酶的活性？请举例说明。
答案 ①影响酶促反应速度的外界因素有温度、pH、酶抑制剂、酶的用量、底物浓度等。②不一定。例如，温度、pH和酶抑制剂能通过改变酶的结构而影响酶的活性，但酶的用量和底物浓度只影响反应速度，并不影响酶的活性。
(2)甲、乙两图是温度、pH对酶活性的影响的数学模型。
①甲、乙两图中B代表的含义分别是什么？
答案 甲、乙两图B点所对应的温度和pH分别是酶的最适温度和最适pH。
②甲乙两图中A点对应的值对酶活性的影响相同吗？
答案 不相同。甲图A点对应的酶活性较低，乙图A点对应的酶已失活。
③甲、乙两图中C点对应的值对酶活性的影响相同吗？
答案 相同。两图C点所对应酶均已失活。
归纳总结 (1)果胶与果胶酶的比较
项目
基本单位
组成
果胶
半乳糖醛酸
半乳糖醛酸聚合而成的高分子化合物
果胶酶
氨基酸
多聚半乳糖醛酸酶、果胶酯酶、果胶分解酶等
(2)影响酶促反应速度的因素及其作用实质
酶促反应速度
1.下列关于果胶酶的说法，正确的是( )
A.果胶酶可以分解细胞壁的主要成分——纤维素
B.果胶酶是由半乳糖醛酸聚合而成的一种高分子化合物
C.果胶酶不特指某种酶，而是分解果胶的一类酶的总称
D.果胶酶的化学本质是RNA
答案 C
解析 植物细胞壁的主要成分有纤维素和果胶，它们分别被纤维素酶和果胶酶水解，A错误；半乳糖醛酸是构成果胶的基本单位，B错误；果胶酶是一类酶的总称，其化学本质是蛋白质，C正确、D错误。
一题多变
(1)两位同学用足量的果肉制作果汁，甲同学使用了果胶酶而乙同学没有使用，过了相同的时间后，二位同学制作的果汁有何区别？
答案 在果汁量和果汁澄清度两个方面均有区别，甲同学由于使用了果胶酶，所以果汁量较多且澄清度也较高。
(2)果胶酶可以催化果胶的水解，而纤维素酶不能催化果胶的水解，这体现了酶的何种特性？
答案 体现了酶具有专一性。
2.下列关于酶活性的说法中，错误的是( )
A.酶的活性是指酶催化一定化学反应的能力
B.酶促反应速度越大，说明酶的活性越大
C.酶的活性受温度、pH等因素影响
D.酶活性的高低与反应物的浓度无关
答案 B
解析 酶的活性是由酶的结构决定的，温度和pH都能影响酶的结构，因此酶的活性受温度和pH的影响。在一定条件下，反应物浓度(或酶的用量)越大，酶促反应速度越大，但并不能说明酶的活性越大，因为反应物浓度(或酶的用量)并不影响酶的活性。
二、探究温度和pH对果胶酶的影响和果胶酶的用量
1.探究温度和pH对果胶酶活性的影响
(1)实验原理
①果胶酶的活性受温度(或pH)影响，处于最适温度(或pH)时，酶的活性最高。
②果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。
(2)实验流程
①处理原料：搅拌器搅拌制苹果泥
↓
②分组处理：将分别装有苹果泥和果胶酶的试管在不同温度的恒温水浴中保温
(或调节至不同的pH)
↓
③反应阶段：加入果胶酶反应一段时间
↓
④测量记录：过滤果汁，用量筒测量果汁体积并记录
2.探究果胶酶的用量
(1)自变量：果胶酶的用量。
(2)无关变量：温度、pH、酶催化反应的时间、苹果泥的用量等。
(3)判断的思路
①如果随着酶的用量增加，过滤到的果汁体积也增加，说明酶的用量不足。
②如果酶的用量增加到某个值后，再增加酶的用量，过滤到的果汁体积不再改变，说明酶的用量已经足够。
1.实验方案
(1)当探究温度(或pH)对果胶酶活性的影响时，自变量是什么？无关变量有哪些？
答案 温度(或pH)是自变量。果泥量、果胶酶的用量、水浴时间和pH(或温度)等属于无关变量。
(2)在探究温度或pH对酶活性的影响时，如何设置对照实验？
答案 不同的温度梯度之间或不同的pH梯度之间可以作为对照，这种对照称为相互对照。
2.实验操作
在苹果泥和果胶酶混合之前，为什么要将苹果泥和果胶酶分装在不同的试管中用同一恒温处理？
答案 使酶与反应物混合前就分别达到预设的温度，避免混合时改变温度进而导致实验误差。
3.结果分析
(1)为什么可以根据滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？
答案 果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此可以根据滤出的苹果汁的体积判断果胶酶的活性。
(2)除果汁的体积外，根据哪个因变量也能判断果胶酶活性的高低？该因变量与果胶酶活性有何对应关系？
答案 果汁的澄清度。果汁越澄清，表明果胶酶的活性越高。
归纳总结 酶相关实验的变量控制
(1(探究温度对酶活性的影响：可以选用10 ℃作为梯度差，设置的具体温度为10 ℃、20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃等，也可以尝试以5 ℃作为梯度差。
(2(探究pH对酶活性的影响：只需将温度梯度改成pH梯度，并选定一个适宜的温度进行水浴加热。反应液的pH可以用体积分数为0.1%的氢氧化钠溶液或盐酸溶液进行调节。
(3(探究酶的用量：该实验是建立在探究最适温度和pH对酶活性影响的基础之上的，此时，研究的变量是酶的用量，其他因素都应保持不变。
3.下表是某同学探究温度对果胶酶活性影响的实验结果。该结果不能说明( )
温度/ ℃
10
20
30
40
50
60
果汁量/mL
2
3
4
5
6
5
A.温度影响果胶酶的活性
B.40 ℃与60 ℃时酶的活性相等
C.50 ℃是该酶的最适温度
D.若温度从10 ℃升高到40 ℃，酶的活性将逐渐增强
答案 C
解析 温度影响酶的活性，上表不能说明50 ℃就是最适温度，只能说明果胶酶的最适温度在40～60 ℃之间。在低于最适温度时，随温度的升高，酶的活性增强；高于最适温度时，随温度的升高，酶的活性降低。温度对酶活性的影响曲线图是钟罩形的，故40 ℃与60 ℃时酶的催化效率相同。
一题多变
(1)请根据本题中表格的实验结果及必修1中的相关知识，描述温度对酶活性的影响。
答案 在一定范围内，随着温度的升高，酶的活性逐渐升高；当达到最适温度时，酶的活性最高；超过最适温度后，随着温度的升高，酶的活性逐渐降低。
(2)本题中的实验及其结果无法确定果胶酶的最适温度，如何通过实验进一步探究？
答案 可以在40～60 ℃再设置多组实验，将相邻两组的温差缩小，然后通过比较果汁量确定比较适合的温度，再以同样的思路进一步探究，可以探究出酶的最适温度。
4.下列操作错误的是( )
A.用橙子做本课题的实验，应去掉橙皮
B.用体积分数为0.1%的NaOH溶液或盐酸调节pH
C.为了使果胶酶能够充分地进行催化反应，应用玻璃棒不时地搅拌反应混合物
D.制作苹果泥时，可先将苹果切成小块放入榨汁机中
答案 A
解析 在用橙子制作果汁时，不必去除橙皮，因为橙皮可以增加果汁的口味和颜色；调节pH用体积分数为0.1%的NaOH或HCl溶液；玻璃棒搅拌可使混合物均匀；制作苹果泥时，为方便榨汁，可先将苹果切成小块，再放入榨汁机中。
1.下列不属于果胶酶成分的是( )
A.纤维素酶 B.果胶分解酶
C.多聚半乳糖醛酸酶 D.果胶酯酶
答案 A
解析 果胶酶是分解果胶的一类酶的总称，它包括果胶分解酶、多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶等，但不包括纤维素酶。在生产上，果胶酶往往与纤维素酶、半纤维素酶配合使用，可降解细胞壁中的果胶和纤维素。
2.如图曲线表示的是温度和果胶酶活性之间的关系，此曲线不能说明的是( )
A.在B点之前，果胶酶的活性和温度成正相关；之后，成负相关
B.当温度到达B点时，果胶酶的活性最高，酶的催化作用最高
C.A点时，果胶酶的活性很低，但随着温度升高，果胶酶的活性可以上升
D.C点时，果胶酶的活性也很低，当温度降低时，酶的活性可以恢复上升
答案 D
解析 从图中可以看出，随着温度的不断升高，果胶酶的活性在上升，等达到B点时，酶的活性达到最高；随后随着温度的继续上升，酶的活性迅速下降。但是A点和C点相比，虽然酶的活性都很低，但是A点是低温条件，对酶的分子结构无影响，所以，随着温度的上升，其活性也会不断上升，而C点是高温条件，会破坏酶的分子结构，使酶的活性发生不可逆的变化。
3.在“探究温度对酶活性的影响”实验中，下列说法不正确的是( )
A.可准备一组烧杯，分别盛有不同温度的水
B.将苹果泥和果胶酶直接混合后放在不同温度的烧杯中恒温水浴处理
C.不同温度梯度之间可相互对照
D.温度过高时，果胶酶会变性失活
答案 B
解析 探究温度对果胶酶活性影响的实验中，应先将装有苹果泥和果胶酶的试管在不同梯度的恒温水浴中分别保温，达到恒温后再混合。
4.在“探究pH对酶活性的影响”实验中，不正确的是( )
A.自变量是不同的pH梯度
B.无关变量有温度、底物浓度、酶浓度、反应时间等
C.可通过测定滤出的果汁体积判断果胶酶的最适pH
D.pH过低时，果胶酶活性变小，但不失活
答案 D
解析 过酸、过碱或温度过高，都会使酶变性，并可造成永久性失活。
5.下列是有关酶的应用问题，请分析回答下面的问题：
工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高出汁率，为研究温度对果胶酶活性的影响，某学生设计了如下实验。
①将果胶酶与苹果泥分装于不同试管中，在10 ℃水浴中恒温处理10 min(如图A)。
②将步骤①处理后的果胶酶和苹果泥混合，再次在10 ℃水浴中恒温处理10 min(如图B)。
③将步骤②处理后的混合物过滤，收集滤液，测量果汁量(如图C)。
④在不同温度条件下重复以上实验步骤，并记录果汁量，结果如下表：
温度/ ℃
10
20
30
40
50
60
70
80
果汁量/mL
8
13
15
25
15
12
11
10
根据上述实验，请分析回答下面的问题：
(1)果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以促进细胞壁中果胶的水解，产物是_____。
(2)实验结果表明，当温度在______附近时，果汁量最多，此时果胶酶的活性______。
(3)为什么该实验能够通过测定过滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(4)果胶酶作用于一定量的某种物质(底物)，保持温度、pH在最适值，生成物量与反应时间的关系如图。在35 min后曲线变成水平是因为________________。若增加果胶酶浓度，其他条件不变，请在图中画出生成物量变化的示意曲线。
答案 (1)半乳糖醛酸 (2)40 ℃ 最高 (3)果胶酶将果胶分解为小分子物质，小分子物质可以通过滤纸，因此苹果汁的体积大小反映了果胶酶催化分解果胶的能力 (4)底物消耗完毕 如图(虚线所示)
解析 从实验数据分析可知，在40 ℃附近时，果汁量最多，说明此时的果胶酶催化活性最高。因为底物的量是一定的，所以底物消耗完时，生成物的量达到最大值，其后不再发生变化；增加酶的浓度可以使反应更快地达到平衡点，会更早结束反应，但生成物的总量不会发生变化。
课时作业
[学考达标]
1.下列关于果胶酶的叙述，正确的是( )
①具有分泌功能的细胞产生的 ②凡是活细胞都能产生果胶酶 ③果胶酶能将果胶分解成半乳糖醛酸 ④植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶 ⑤果胶酶特指分解果胶的一种酶 ⑥纤维素酶和果胶酶可用于去除植物细胞壁 ⑦组成果胶酶的基本单位是氨基酸或核苷酸
A.①②⑦ B.②③⑥ C.③④⑥ D.③④⑤
答案 C
2.下列有关果胶的叙述，不正确的是( )
A.果胶是植物细胞壁的主要成分之一
B.酵母菌可产生果胶酶，是因为酵母菌的细胞壁中也含有果胶
C.果胶酶能够分解果胶
D.果胶影响出汁率
答案 B
解析 果胶是植物细胞壁的组成成分。细菌、真菌等虽然有细胞壁，但其细胞壁中不含果胶成分。
3.下列各项能表示酶活性高低的是( )
A.单位时间、单位体积内反应物的总量
B.一段时间后生成物的总量
C.一段时间后，一定体积中消耗的反应物的量
D.单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量
答案 D
解析 酶活性的高低可以用在一定条件下酶所催化的某一化学反应的反应速度来表示，而酶反应速度是指单位时间内、单位体积中反应物的减少量或产物的增加量。
4.在“探究果胶酶的用量”实验中，下列说法不正确的是( )
A.实验时可配制不同浓度的果胶酶溶液
B.底物浓度一定时，随酶用量的增大滤出的果汁越多
C.本实验应控制在适宜温度和pH条件下
D.反应液的pH必须相同
答案 B
解析 本实验的自变量是酶用量，温度和pH属于无关变量，因此要控制好，即每个实验组实验前后都应控制相同且适宜的温度和pH。实验时可配制不同浓度的果胶酶溶液，也可以配制一种浓度的果胶酶溶液，使用不同的体积即可。在其他条件不变的情况下，一定范围内随着酶用量的增多，酶促反应速度加快，滤出的果汁也增多，当酶用量达到一定量，底物成为限制因素时，再增加酶的用量，酶促反应速度不再增大，滤出的果汁也不再增多。此外，影响果汁产量的因素，除了酶用量、底物浓度外，还有温度、pH、酶促反应时间等。
5.在用果胶酶处理苹果泥时，为了使果胶酶能够充分地催化反应，应采取的措施是( )
A.加大苹果泥用量 B.加大果胶酶用量
C.进一步提高温度 D.用玻璃棒不时地搅拌反应混合物
答案 D
解析 在用果胶酶处理苹果泥时，若让果胶酶充分发生反应，则需扩大果胶酶和苹果泥的接触面积，尽量使果胶酶和苹果泥充分接触，因此可用玻璃棒不时地搅拌反应混合物。对苹果泥用量、酶用量及反应所需的温度和pH的调整，在一定范围内只能增大反应速度，而不能使果胶酶充分地催化反应。
6.在探究温度对果胶酶活性的影响、pH对果胶酶活性的影响、果胶酶的用量三个实验中，实验变量依次为( )
A.温度、酶活性、酶用量 B.苹果泥用量、pH、果汁量
C.反应时间、酶活性、酶用量 D.温度、pH、果胶酶用量
答案 D
解析 首先要明确实验变量、反应变量等基本概念，在此基础上，针对教材中的三个探究实验进行分析。实验一为探究果胶酶的最适温度，实验二为探究果胶酶的最适pH，实验三为探究果胶酶的最适用量，从而选出正确答案D。
[高考提能]
7.某同学在探究果胶酶的最适温度时，将得到的实验数据转换成曲线图如下。关于该曲线图，以下说法错误的是( )
A.该同学的实验数据中有错误
B.该同学设置的温度梯度不合理
C.从该曲线中判断不出果胶酶的最适温度
D.从曲线中可判断出果胶酶的最适温度一定为40 ℃
答案 D
解析 该曲线图至少有两个峰值，与酶只有一个最适温度不吻合，A项正确；该同学的温度设置较多地集中于低温阶段，忽略了对高温阶段实验组的设置，B项正确；结合图示可知，过滤到的果汁量的变化趋势仍然在升高，无法确定最适温度，C项正确；40 ℃是所设置的温度中最接近于最适温度的，但不一定是最适温度，D项错误。
8.下列说法不正确的是( )
A.在探究果胶酶用量的实验中，虽然实验的变量发生了变化，但通过设置梯度来确定最适值的思想方法是不变的
B.植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶
C.通过测定滤出的苹果汁的体积大小无法来判断果胶酶活性的高低
D.人们使用果胶酶、纤维素酶等来解决制作果汁面临的问题
答案 C
解析 果胶酶活性越高，果汁的出汁量越高，故可通过测定滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低。
9.下列有关果胶酶及果胶酶实验探究的有关叙述，正确的是( )
A.探究果胶酶的用量时，pH、温度不影响实验结果
B.果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和葡萄糖异构酶等
C.探究温度对果胶酶活性的影响时，温度、苹果泥、果胶酶用量及反应时间等都是自变量
D.可以用相同时间内过滤得到的果汁体积来确定果胶酶的用量
答案 D
解析 探究果胶酶用量时，pH、温度会影响实验结果；葡萄糖异构酶不属于果胶酶；探究温度对果胶酶活性影响的实验中，温度为单一变量，其他因素保持不变。
10.如图表示某研究小组探究果胶酶用量的实验结果。下列有关说法不正确的是( )
A.在AB段限制反应速度的主要因素是酶的用量
B.在BC段限制反应速度的因素是温度、pH、反应物浓度
C.在AC段增加反应物浓度，可以明显加快反应速度
D.在该实验给定条件下，果胶酶的最佳用量是B点对应的值
答案 C
解析 由曲线图可以看出，在AB段，随着酶的用量的增大，酶促反应速度加快，说明此阶段限制反应速度的主要因素是酶的用量；此时增加反应物浓度，反应速度不会明显加快。在BC段，随着酶的用量的增大，酶反应速度不再加快，此时反应物浓度成为限制反应速度的因素之一，故增加反应物浓度，反应速度会加快。
11.假设你已经探究出了果胶酶的最适温度(为45 ℃)和最适pH(为4.8)，若还想进一步探究果胶酶的最适用量，此时，实验的自变量是____________________。
合理设置果胶酶用量的梯度后，可通过苹果泥出汁的多少来判断果胶酶的用量是否合适。请根据所给的材料和用具完成以下探究实验：
(1)材料用具：制备好的苹果泥、恒温水浴装置、试管、漏斗、滤纸、量筒、试管夹、体积分数为2%的果胶酶溶液、体积分数为0.1%的NaOH溶液和盐酸。
(2)实验步骤：
①取6支试管，编号1～6，分别加入__________________________，调节pH至4.8。
②向1～6号试管中分别加入_______________________________________________，然后放入45 ℃恒温水浴装置中____________________________________________________。
③_______________________________________________________________________。
(3)以上实验步骤的设计是否有不妥之处？如果有试分析原因。
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 果胶酶的用量 (2)①等量的苹果泥 ②不同体积的pH为4.8的果胶酶溶液 保温相同时间 ③过滤并记录果汁体积 (3)有。为了保证苹果泥与果胶酶混合前后的温度相同，应先将盛苹果泥和果胶酶的试管放在同一温度的水浴装置中恒温，再将两者混合
解析 在探究影响果汁产量的酶的用量时，除酶的用量是自变量外，其他条件都应相同且适宜。为了避免因混合导致温度变化而影响实验结果，应先将盛苹果泥的试管和盛不同量酶的试管放到相同温度下恒温，然后再将两者混合。
12.下图是研究人员对黑曲霉A1果胶酶性质的研究结果，据图分析温度、pH和Ca2＋浓度等与酶活力的关系：
(1)从上图可以看出，对酶活力影响最小的是________。
(2)这三个图的共同点说明____________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若探究温度对黑曲霉A1果胶酶活力的影响，则在该实验中，实验组和对照组的pH及Ca2＋浓度是否需要进行调节？________。若需要调节，则pH及Ca2＋浓度分别调节到________和________。其原因是______________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)Ca2＋浓度 (2)在最适条件下，酶的活力最高(3)需要 4 1 遵循单一变量原则，无关变量相同且适宜
解析 (1)图中曲线变动趋势表明，Ca2＋浓度对酶活力影响最小。(2)三种曲线变动趋势均显示在最适条件下酶活力最高。(3)欲探究温度对酶活性的影响，应遵循单一变量原则，将pH、Ca2＋浓度等设为无关变量，且保持最适值。
13.我国水果生产发展迅速，由于收获的季节性强，易造成水果积压，腐烂变质，为了解决上述问题且满足不同人群的需求，可以将水果加工成果汁、果酒、果醋等。在果汁生产中要用到果胶酶，某生物研究小组为了探究果胶酶的某些特性，进行了如下实验：
(1)实验方法：按如图1所示的顺序进行操作。
图1
(2)实验结果：对照组与实验组进行了相同时间的实验，结果如图2曲线甲所示：
图2
①图中自变量是温度，除此之外此曲线还可表示______与苹果汁澄清度的关系。
A.酶的浓度 B.苹果泥的量
C.水的加入量 D.pH
②图中的纵坐标还可用______________来表示。
③实验小组改变了实验条件后重复做实验，得到曲线乙，果汁的澄清度最高点对应的横坐标是同一位置的原因是________________________________________________________
________________________________________________________________________。
④步骤b中在果胶酶和苹果泥混合前，将两者分装在不同试管中进行恒温的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)假设下图中的自变量为酶的浓度，请画出果胶酶用量的变化曲线，并用a点标出酶的最适用量。
答案 (2)①D ②苹果汁的体积 ③同一种酶的最适温度是一定的，不会因酶的浓度、底物的量的不同而改变 ④保证底物和酶在混合时的温度是相同的，避免底物和果胶酶混合时因温度变化而影响果胶酶活性 (3)如图所示
[真题体验]
14.(2015·海南，30)生产果汁时，用果胶酶处理果泥可提高果汁的出汁率。回答下列相关问题：
(1)某同学用三种不同的果胶酶进行三组实验，各组实验除酶的来源不同外，其他条件都相同，测定各组的出汁量，据此计算各组果胶酶活性的平均值并进行比较。这一实验的目的是________________________________________________________________________。
(2)现有一种新分离出来的果胶酶，为探究其最适温度，某同学设计了如下实验：取试管16支，分别加入等量的果泥、果胶酶、缓冲液，混匀，平均分为4组，分别置于0 ℃、5 ℃、10 ℃、40 ℃下保温相同的时间，然后，测定各试管中的出汁量并计算各组出汁量平均值。该实验温度设置的不足之处有_______________________和_______________________。
(3)某同学取5组试管(A～E)分别加入等量的同种果泥，在A、B、C、D 4个实验组的试管中分别加入等量的缓冲液和不同量的同种果胶酶，然后补充蒸馏水使4组试管内液体体积相同；E组加入蒸馏水使试管中液体体积与实验组相同。将5组试管置于适宜温度下保温一定时间后，测定各组的出汁量。通过A～D组实验可比较不同实验组出汁量的差异。本实验中，若要检测加入酶的量等于0而其他条件均与实验组相同时的出汁量，E组设计________(填“能”或“不能”)达到目的，其原因是_____________________________________。
答案 (1)比较不同来源果胶酶的活性 (2)温度范围设置不合理 温度梯度设置不合理 (3)不能 未加入缓冲液
第11课时 探讨加酶洗衣粉的洗涤效果
[学习导航] 1.通过阅读教材P46“基础知识”，掌握常用加酶洗衣粉的种类及洗涤原理。
2.结合教材P46“实验设计”，通过设计有关加酶洗衣粉的实验，掌握不同种类加酶洗衣粉的洗涤效果及影响因素。3.结合教材P48“相关链接”，理解加酶洗衣粉的实际应用。
[重难点击] 1.说出加酶洗衣粉的洗涤原理。2.探讨温度对加酶洗衣粉洗涤的影响。3.探讨不同种类的加酶洗衣粉对同一污物和不同污物洗涤效果的区别。
一、加酶洗衣粉
1.加酶洗衣粉
(1)概念：指含有酶制剂的洗衣粉。
(2)种类
①酶制剂的种类：常用的酶制剂有四类：蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶。应用最广泛、效果最明显的是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。
②根据加入洗衣粉中酶制剂的不同，将其分为两种类型：单一型加酶洗衣粉和复合型加酶洗衣粉。前者是只加入一种酶制剂的洗衣粉，又分为蛋白酶洗衣粉、脂肪酶洗衣粉、淀粉酶洗衣粉等。后者是加入了多种酶制剂的洗衣粉。
(3)去污机理
种类
洗涤原理
洗涤实例
蛋白酶
①蛋白质可溶性氨基酸或小分子的肽
血渍、奶渍及各种食品类的蛋白质污垢
脂肪酶
②脂肪甘油＋脂肪酸
油渍、人体皮脂、口红
淀粉酶
③淀粉麦芽糖＋葡萄糖
来自面条、巧克力等污垢
纤维素酶
使纤维的结构变得蓬松，从而使渗入到纤维深处的尘土和污垢能够与洗衣粉充分接触，达到更好的去污效果
棉麻类衣物的洗涤
(4)影响洗涤效果的因素：温度、酸碱度和表面活性剂。
2.生产方法
利用基因工程的方法生产出能够耐酸、耐碱、忍受表面活性剂和较高温度的酶。
3.优点
加酶洗衣粉降低了表面活性剂和三聚磷酸钠用量，使洗涤剂朝低磷、无磷的方向发展，减少了对环境的污染。
1.洗衣粉的去污原理
人们饮食中的蛋白质等大分子物质需要经消化酶消化为小分子物质才能被吸收。衣物的奶渍、油渍等是如何被加酶洗衣粉去除的？
答案 添加的酶制剂可以将难以清洗的大分子物质水解成小分子物质，小分子物质易溶于水，通过水洗较易去除。
2.加酶洗衣粉的使用
判断下列污渍适宜用含哪种酶制剂的加酶洗衣粉洗涤，并说明原因。
(1)血渍
(2)油渍
(3)粥渍
3.加酶洗衣粉的优缺点
(1)从酶的特性角度分析含蛋白酶的洗衣粉能否洗涤羊毛、蚕丝类衣物。
答案 不能。因为羊毛、蚕丝类衣物的主要成分是蛋白质，蛋白酶能分解蛋白质而损坏衣物。
(2)从影响酶活性因素的角度，分析不同条件下的加酶洗衣粉的洗涤效果是否一定大于普通洗衣粉。
答案 不一定。酶活性受温度、pH等影响，在低温等不利于酶活性发挥的条件下，加酶洗衣粉的洗涤效果不一定好于普通洗衣粉。
4.酶能直接添加到洗衣粉中吗？为什么？科学家是如何解决这一难题的？
答案 不能；因为洗衣粉中的表面活性物质会降低酶的活性；将基因工程生产出的酶用特殊水溶性物质包裹起来，与洗衣粉的其他成分隔离开来。
归纳总结 使用加酶洗衣粉时的注意事项
(1(碱性蛋白酶能使蛋白质水解，因此，蛋白质类纤维(羊毛、蚕丝等(织物就不能用加蛋白酶的洗衣粉来洗涤，以免使纤维受到破坏。
(2(使用加酶洗衣粉时，必须注意洗涤用水的温度。碱性蛋白酶在35～50 ℃时活性最强，在低温下或70 ℃以上就会失效。
(3(加酶洗衣粉也不宜长期存放，存放时间过长会导致酶活性损失。
(4(加酶洗衣粉不宜与三聚磷酸盐共存，否则酶的活性将会丧失。
(5(添加了碱性蛋白酶的洗衣粉可以分解人体皮肤表面蛋白质，而使人患过敏性皮炎、湿疹等，因此，应避免与这类洗衣粉长时间接触。
1.关于酶和加酶洗衣粉的描述正确的是( )
A.洗衣粉中的蛋白酶对皮肤有损伤，因为皮肤中含有蛋白质
B.加酶洗衣粉中的酶变性失活后，其洗涤效果也比普通洗衣粉好
C.加酶洗衣粉中的酶是从植物、霉菌、酵母菌、细菌等生物体内提取出来的
D.加酶洗衣粉因为额外添加了酶制剂，比普通洗衣粉更易污染环境
答案 A
解析 根据酶的专一性，蛋白酶能水解蛋白质，因此对皮肤有损失，A项正确；加酶洗衣粉中由于降低了表面活性剂和三聚磷酸钠的用量，因此若酶变性失活后，其洗涤效果比普通洗衣粉差，B项错误；加酶洗衣粉中的酶是科学家通过基因工程生产的，C项错误；加酶洗衣粉中降低了磷含量，因此与普通洗衣粉相比，不易污染环境，D项错误。
2.下列关于加酶洗衣粉的说法，不正确的是( )
A.加酶洗衣粉的洗涤效果总比普通洗衣粉的洗涤效果好
B.加酶洗衣粉洗涤效果的好坏受很多因素的影响
C.加酶洗衣粉中目前常用的酶制剂有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶
D.加酶洗衣粉相比普通洗衣粉更有利于环保
答案 A
解析 加酶洗衣粉中含有的酶制剂，可以将污物中的大分子、不易溶于水的物质(如蛋白质、脂肪、淀粉和纤维素等)水解成小分子的易溶于水的物质，所以加酶洗衣粉的洗涤效果一般要优于普通洗衣粉。但是，由于酶具有专一性，只有洗衣粉中的酶与污渍相对应时，其优势才能发挥出来；如果不对应，加酶洗衣粉的洗涤效果可能不如普通洗衣粉。
一题多变
(1)如果用加酶洗衣粉和普通洗衣粉分别洗涤被污染的布料，水温都过高，则加酶洗衣粉的洗涤效果会不会好于普通洗衣粉？
答案 不会，因为水温过高会使加酶洗衣粉中的酶制剂失活。
(2)被血渍或花生油污染的衣服，最好选择复合型加酶洗衣粉进行洗涤还是单一型加酶洗衣粉进行洗涤？
答案 因为血渍中主要是蛋白质，花生油中主要是脂肪，所以最好选择单一型加酶洗衣粉进行洗涤。若选择复合型加酶洗衣粉进行洗涤，其中的一些酶制剂不发挥作用，会引起浪费。
方法链接 根据洗衣粉的成分判断洗涤效果
(1)普通洗衣粉的洗涤效果：取决于表面活性剂和水软化剂。
(2)加酶洗衣粉的洗涤效果：取决于酶、表面活性剂和水软化剂等。
(3)加酶洗衣粉中的酶失活后洗涤效果还不如普通洗衣粉，因为加酶洗衣粉中的表面活性剂和水软化剂比普通洗衣粉少。
二、实验设计
1.普通洗衣粉和加酶洗衣粉对衣物污渍的洗涤效果的区别
(1)对照实验：同种污渍＋
(2)自变量：洗衣粉的种类。
(3)无关变量：水温、水量、水质、洗衣粉的用量、衣物的材质和大小、洗涤方式和时间等。
(4)生活经验不能(填“能”或“不能”)代替科学实验。
2.探究使用加酶洗衣粉的最适温度
(1)对照实验：不同温度的实验组之间形成相互对照。
(2)自变量：温度。
(3)设置温度梯度时要考虑实际生活中的具体情况。
3.添加不同种类的酶的洗衣粉的洗涤效果的区别
(1)对照实验
①同种污渍＋不同种类的洗衣粉
②同种洗衣粉＋不同污渍
(2)自变量：洗衣粉的种类和污渍的种类。
4.洗涤效果的判断
比较污染物的残留状况，如已消失、颜色变浅、面积缩小等。
1.实验变量控制
(1)探究普通洗衣粉和加酶洗衣粉洗涤效果的不同时，如何控制变量？
答案 实验设计必须以洗衣粉种类为唯一自变量，其余无关变量相同且适宜。
(2)探究温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响的实验中应如何设置温度梯度？
答案 ①设置温度要围绕常温进行；②根据当地一年中的实际气温变化来确定常温，如冬季、春季、秋季和夏季可分别选取5 ℃、15 ℃、25 ℃和35 ℃的水温，不同季节对应不同水温设置梯度。
(3)若测出在40 ℃时洗涤效果比其他条件下好，应如何设置温度梯度探究最适温度？
答案 可设置温度梯度差更小的实验变量，如35 ℃、36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃、40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃，进行重复实验，直至测出具体的最适温度。
2.实验过程分析
(1)布料和衣物哪个更适合作为洗涤材料？为什么？
答案 布料更好。因为布料容易控制其大小、颜色以及污渍的量，使其相同。
(2)水的用量和洗衣粉用量与布料的大小有什么关系？
答案 水的用量和洗衣粉用量与布料的大小成正比。
3.实验结果的分析
评判实验结果必须有一个客观标准，使用什么方法和标准判断洗涤效果？
答案 相同时间内比较污渍的洗涤状况，如污渍颜色变浅的程度、面积缩小的范围等；相同污渍时也可比较彻底清除所需要的时间的长短。
归纳总结 (1(变量的分析和控制
①影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素有水温、水量、水质、洗衣粉的用量和种类，衣物的材料、大小及浸泡时间和洗涤时间等。
②在探究用加酶洗衣粉洗涤的最佳温度条件实验中，水温是要研究的对象，实验自变量是水温；在探究加酶洗衣粉与普通洗衣粉洗涤效果的实验中，实验自变量为洗衣粉的种类；在探究不同种类的加酶洗衣粉洗涤效果的实验中，实验自变量为加酶洗衣粉的种类。在设计实验时，应遵循单一变量原则和对照原则等。
(2(洗涤材料的选择：洗涤材料的选择也有一些讲究。选用布料作为实验材料比较可行。在设置对照实验时，可以控制布料的大小、颜色及污物的量，使其相同；同时，也便于洗涤效果的比较。
3.某同学进行“加酶洗衣粉和普通洗衣粉的洗涤效果比较”课题研究，实验设计如下：
①设置2组实验，分别使用蛋白酶洗衣粉和复合酶洗衣粉
②2组实验的洗衣粉用量、被洗涤的衣物量、衣物质地、污染物性质和量、被污染的时间、洗涤时间、洗涤方式等全部相同，洗涤温度都为35 ℃
③根据污渍去除程度得出结论
这个实验设计中，错误的是( )
A.① B.①② C.② D.②③
答案 A
解析 步骤①的目的主要是分组和操纵自变量，步骤②的目的主要是为了控制无关变量，步骤③是观察实验的结果。由于本实验的目的是研究加酶洗衣粉和普通洗衣粉的洗涤效果，所以操纵自变量时要一组加入加酶洗衣粉，另一组加入普通洗衣粉。
一题多变
(1)如果将本题的实验目的改为“探究水质对加酶洗衣粉洗涤效果的影响”，则实验的自变量和因变量又分别是什么？步骤①要做怎样的调整？
答案 修改后的实验自变量是洗涤所用的水质，因变量是污渍的去除程度。步骤①调整成“准备等量的两种不同水质的水”。
(2)将本题中的洗涤温度改为90 ℃，则对实验结果会产生怎样的影响？本实验中的实验结果可以用哪两种描述方法？
答案 90 ℃下酶会失活，使得加酶洗衣粉中的酶制剂失去作用，则达不到实验目的。本实验的结果可以用“相同时间内达到的清洁程度”或“达到相同清洁程度所用的时间”来进行描述。
4.某同学用不同种类的洗衣粉进行了如下实验。请分析回答相关问题：
Ⅰ.实验一：
温度(℃)
30
35
40
45
50
55
普通洗衣粉去污力(%)
15
18
20
21
21.5
22
加酶洗衣粉去污力(%)
30
40
48
50
48
37
(1)该实验的目的是探究______________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)上述实验结果可以得出的结论是____________________________________________
____________________、__________________________________________________。
Ⅱ.实验二：探究复合酶洗衣粉和普通洗衣粉的洗涤效果是否存在差异。实验设计如下：
项目
设计内容
对照
设置两组实验，分别使用蛋白酶洗衣粉和复合酶洗衣粉
变量控制
两组实验的洗衣粉用量、被洗涤的衣物量、衣物质地、污染物性质和量、被污染的时间、洗涤时间、洗涤方式等全部相同
结果观察
根据污渍去除程度得出结论
(3)该实验设计中有一处明显的错误，请指出：__________________________________。
(4)修改后的实验最可能的实验结果是___________________________________________
__________________________________________________________________________。
(5)若要洗涤特别脏的衣服，请根据上述两个实验的研究结果，提出两项提高洗涤效果的措施：
①________________________________________________________________________。
②________________________________________________________________________。
(6)推广使用加酶洗衣粉代替含磷洗衣粉，有利于保护生态环境，这是因为__________。
答案 (1)不同洗衣粉在不同温度下的去污力的变化
(2)相同温度下加酶洗衣粉的去污力比普通洗衣粉高
使用加酶洗衣粉的适宜温度为45 ℃左右(合理即可)
(3)对照组设计错误，应设计复合酶洗衣粉和普通洗衣粉作为对照
(4)使用复合酶洗衣粉的去污程度大于普通洗衣粉的去污程度
(5)①用相应的加酶洗衣粉 ②用适宜的温度
(6)酶可被分解，避免水体富营养化
解析 (1)实验一中有两个变量：温度和洗衣粉的种类。可以探究同一温度下不同种类洗衣粉的洗涤效果，也可探究不同温度对同一种洗衣粉洗涤效果的影响。(2)根据单一变量原则，可以得出结论：相同温度下加酶洗衣粉的去污力比普通洗衣粉高；使用加酶洗衣粉的适宜温度为45 ℃左右。(3)探究复合酶洗衣粉与普通洗衣粉的洗涤效果，实验变量应为复合酶洗衣粉和普通洗衣粉。(4)复合酶洗衣粉中的酶具有高效性，洗涤效果好于普通洗衣粉。(5)根据实验可知，加酶洗衣粉洗涤效果好于普通洗衣粉，但其活性的发挥需要适宜的温度。(6)酶具有高效性且易分解，避免水体富营养化。
一题多变
(1)“实验一”中探究不同温度下加酶洗衣粉去污力时，可否先加酶后调整温度？并说明理由。
答案 不能，因为加酶洗衣粉中的酶在不同温度时会分解部分污渍。
(2)“实验二”中控制“洗衣粉用量、洗涤时间、洗涤方式”等相同，为什么这样做？
答案 避免因水量、水质、洗衣粉的量、衣物的质料、大小、污渍量及浸泡时间和洗涤时间不同给实验结果带来误差。
1.下列关于加酶洗衣粉的说法，错误的是( )
A.洗衣粉中的蛋白酶对人体皮肤有损伤
B.洗衣粉中的蛋白酶对皮肤和所有衣物无刺激作用
C.使用加酶洗衣粉时要特别注意水温
D.加酶洗衣粉有保质期
答案 B
解析 皮肤上有蛋白质成分，有些衣物和丝绸等也有蛋白质成分，可被加酶洗衣粉中的蛋白酶水解。
2.用加酶洗衣粉洗涤衣物时，下列说法正确的是( )
A.可用加酶洗衣粉洗涤毛料衣服
B.一般先用热水泡开，然后调至适宜温度
C.水温太低，洗衣粉中的酶丧失活性后不能再恢复
D.使用添加了碱性蛋白酶的洗衣粉洗衣服后应立即冲洗双手
答案 D
解析 毛料衣服的主要成分为蛋白质，加酶洗衣粉中的蛋白酶会损坏衣服；高温会使酶失活，而低温抑制酶的活性，但不会使酶变性；皮肤中的蛋白质也会被加酶洗衣粉中的蛋白酶水解从而损伤皮肤。
3.在探讨不同温度对加酶洗衣粉洗涤效果影响的实验中，下列说法不正确的是( )
A.应根据当地一年中实际气温变化来确定水温
B.可选择洗涤不同污渍的白布作对照
C.选择水温应考虑衣物的承受能力
D.选择水温应考虑洗涤成本
答案 B
解析 在探讨不同温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响实验中，温度是唯一变量，其他各条件应适宜且保持不变。所以实验中白布的污渍应完全相同。
4.某生物学兴趣小组进行了“加酶洗衣粉最适温度的测量”实验，下表是他们记录的不同温度除去不同污渍所需时间对照表，请依据表中数据作答：
水温/℃
去除污渍时间/min
5
20
30
40
50
60
70
80
植物油
48
39
30
20
17
11
12
20
蓝墨水
93
86
80
72
68
67
81
105
奶渍
48
43
28
12
6
4
12
17
(1)要达到最佳洗涤效果，使用加酶洗衣粉的最适温度范围是________。
(2)在适宜温度范围内，加酶洗衣粉对衣物上的________的洗涤效果最佳，对________的洗涤效果最差，其原因是______________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)羊毛、蚕丝等织物________(填“能”或“不能”)用加酶洗衣粉洗涤，因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)50～60 ℃ (2)奶渍 蓝墨水 奶渍的主要成分是蛋白质和脂肪，加酶洗衣粉中含有碱性蛋白酶和碱性脂肪酶，能使蛋白质和脂肪等有机物水解，但很难使蓝墨水中的成分水解 (3)不能 羊毛、蚕丝等织物的主要成分是蛋白质，加酶洗衣粉中的蛋白酶能使蛋白质水解，从而使织物受到破坏
解析 由题表数据可知，加酶洗衣粉在50～60 ℃条件下洗涤效果最好；加酶洗衣粉对奶渍有较强的去污力，说明加酶洗衣粉中有蛋白酶，而羊毛和蚕丝的主要成分是蛋白质，如果使用加酶洗衣粉洗涤，会对衣物造成破坏。
课时作业
[学考达标]
1.影响加酶洗衣粉洗涤效果的因素不包括( )
A.温度 B.pH C.表面活性剂 D.光照
答案 D
2.在探究不同温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响实验时，往往采用同一型号的小容量自动洗衣机洗涤衣物，其原因是( )
A.便于更好地控制变量 B.洗涤时间短
C.洗涤时更省力 D.可洗涤的衣物多
答案 A
解析 欲探究温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响，则将温度作为单一变量，其他条件应该保持一致，如洗衣机的型号要相同，这样有利于控制变量。
3.“衣领净”属于( )
A.单一型加酶洗衣粉 B.复合型加酶洗衣粉
C.浓缩型普通洗衣粉 D.以上三种都不是
答案 B
解析 “衣领净”是一种复合型加酶洗衣粉，其性能优异，且对衣物上的汗渍、奶渍、油渍、血渍、果汁等具有极强的清除功效。
4.蛋白酶能分解其他蛋白质类的酶，但洗衣粉中，蛋白酶并没有将其他几种酶分解掉，以下解释正确的是( )
A.蛋白酶处于抑制状态
B.其他几类酶不是蛋白质类
C.蛋白酶具有识别作用，不分解具有酶作用的蛋白质
D.缺少水环境并且各种酶在添加前已作了保护性修饰
答案 D
解析 加酶洗衣粉中的酶经过了特殊的化学物质的包裹，使之与其他成分隔离，这些酶在遇水后，包裹层分解，才能发挥作用。
5.加酶洗衣粉中的“酶”有多种，对各种污渍要根据不同的情况选用不同的加酶洗衣粉，主要原因是( )
A.酶具有多样性 B.酶具有高效性
C.酶具有专一性 D.酶易受环境影响
答案 C
6.市场上有一种加酶洗衣粉，即在洗衣粉中加入少量的碱性蛋白酶，它的催化活性很强，衣物上的汗渍、血渍以及人体排泄的蛋白质等遇到它，皆能被水解而除去。下列衣物中不能用该加酶洗衣粉洗涤的是( )
①棉织品 ②毛织品 ③腈纶织品 ④蚕丝织品 ⑤涤纶织品 ⑥尼龙织品
A.①②③ B.③④⑤ C.④⑤⑥ D.②④
答案 D
解析 题中的毛织品、蚕丝织品中都含有蛋白质，在蛋白酶的作用下，可以被分解。因此，不能用加酶洗衣粉来洗涤。
[高考提能]
7.生物体内的酶很容易降解、失活，而洗衣粉中的酶却能长时间保持活性的原因是( )
A.生物体内的酶的活性受温度影响，洗衣粉中的酶的活性不受温度影响
B.洗衣粉中的酶外层有特殊的化学物质层层包裹，保持其活性
C.生物体内的酶是蛋白质，洗衣粉中的酶是无机物
D.以上全部正确
答案 B
解析 加酶洗衣粉中加入的酶多是微生物发酵产生的，其本质与生物体内的酶无明显差异，其活性的保持是因为在酶外层有特殊的化学物质层层包裹，使酶与表面活性剂等影响酶活性的因素隔离开。
8.某种生物活性洗衣粉包装袋上印有以下资料，下列对资料表明的信息理解错误的是( )
成分
·蛋白酶 0.2%
·清洁剂 15%
用法
·洗涤前先将衣服浸于溶有洗衣粉的水中数小时
·使用温水效果最佳
·切勿使用60 ℃以上的水
①这种洗衣粉较易清除衣服上的蛋清污渍 ②在60 ℃以上的水中，蛋白酶会失去活性 ③该洗衣粉可洗涤各种污渍的衣料 ④该蛋白酶能够水解各种蛋白质
A.①② B.③④ C.①④ D.②③
答案 B
解析 该洗衣粉包装袋上印有蛋白酶0.2%，说明这种洗衣粉较易清除衣服上的蛋清污渍。但是蛋白酶的种类较多，每种蛋白酶都有作用的专一对象，因此，该蛋白酶不可能水解所有的蛋白质。该洗衣粉可洗涤含蛋白质污渍的衣料而不能处理各种污渍的衣料。洗衣粉用法中提示使用温水效果最佳，若使用60 ℃以上的热水，则会因温度过高而使蛋白酶活性降低或失去活性。
9.下列关于“探究加酶洗衣粉和普通洗衣粉的洗涤效果”的叙述，合理的是( )
A.先用热水溶解洗衣粉，再将水温调节到最适温度
B.实验的观察指标可以是相同洗涤时间内污渍的残留程度
C.相同pH时加酶洗衣粉洗涤效果好于普通洗衣粉
D.衣物质地和洗衣粉用量不会影响实验结果
答案 B
解析 高温会导致加酶洗衣粉中的酶变性失活，所以不能用热水溶解洗衣粉，A错误；本实验的目的是探究两种洗衣粉的洗涤效果，所以观察指标可以是相同洗涤时间内污渍的残留程度或达到同样洗涤效果所需时间的长短，B正确；在酶作用的适宜条件下，加酶洗衣粉的洗涤效果好于普通洗衣粉，“相同pH”不一定是酶的适宜pH，C错误；酶具有专一性，加有蛋白酶的洗衣粉不能用于真丝、羊毛等衣料衣物的洗涤，适当增加洗衣粉的用量会使洗涤效果增强，D错误。
10.下列关于加酶洗衣粉的叙述，正确的是( )
①加酶洗衣粉能将衣服上的蛋白质、脂肪等水解成溶于水的小分子物质 ②加酶洗衣粉最常用的酶制剂是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶 ③使用加酶洗衣粉时一般先用沸水浸开，然后调至适宜温度 ④使用加酶洗衣粉可减少对环境的污染 ⑤加酶洗衣粉的酶通过特殊的化学物质将其层层包裹，遇水后溶解 ⑥实际生活中，用加酶洗衣粉的水温在25～35 ℃之间较适宜 ⑦温度过高或过低均不宜用加酶洗衣粉 ⑧使用加酶洗衣粉时应注意衣服的承受能力
A.①②③④⑤⑥⑦⑧ B.①②④⑤⑥⑦⑧
C.①②③④⑤⑥⑦ D.①②③④⑤⑦⑧
答案 B
解析 加酶洗衣粉所含的碱性蛋白酶能将血渍、奶渍等含有的大分子的蛋白质水解成可溶性的氨基酸或小分子肽；所含有的碱性脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶也能将大分子的脂肪、淀粉和纤维素水解为小分子物质，使污渍容易脱落。普通洗衣粉含磷，含磷污水的排放可造成水体污染。加酶洗衣粉使洗涤剂朝低磷、无磷的方向发展；加酶洗衣粉中的酶制剂及其分解产物能够被微生物分解，减少对环境的污染。为了保护酶的活性，加酶洗衣粉的酶被特殊的化学物质层层包裹，遇水后才被溶解，这样酶就不和洗涤剂直接接触，它才能在洗衣粉中保持稳定。考虑洗涤成本及酶活性，用加酶洗衣粉的水温在25～35 ℃之间，温度过高或过低，酶的活性都降低，温度过高时甚至失活。使用加酶洗衣粉时应注意衣服的承受能力，如毛料和丝织品不宜用含蛋白酶的洗衣粉，因为毛料和丝织品的主要成分是蛋白质，它会被加酶洗衣粉中的蛋白酶分解，损坏衣服。
11.随着生物技术的发展，酶在社会生产、生活中的应用越来越广泛。下列说法不正确的是( )
A.利用酶生产某些化工产品，能显著降低能耗、减少污染，节约成本
B.“加酶洗衣粉”的洗涤效果与水温、酸碱度有关，与污物或衣物的性质无关
C.用于治疗消化不良症的肠溶多酶片含有多种消化酶，但嚼服后会失去疗效
D.为较长时间保持酶活性，各种酶制剂都应保存在低温的条件下
答案 B
解析 酶制剂的活性受温度、酸碱度等条件的影响，在适宜条件下洗涤效果比较好，同时污物或衣物的性质也会影响到酶活性的发挥。
12.洗衣粉是人们日常生活所必需的，有位同学对加酶洗衣粉的作用很感兴趣，为此做了以下探究实验。
实验过程：①用天平称取加酶洗衣粉若干份，每份5 g。
②制作被牛奶(主要含蛋白质、脂肪)和蓝墨水[主要成分：阿拉伯树胶(植物纤维)、鞣酸与硫酸亚铁]处理过的同一布料若干份(污渍大小以滴管滴数为准)。
③取2只500 mL烧杯，依次编号为A、B，分别加入200 mL水和一份已称好的洗衣粉，放入10 ℃水浴锅中，并且搅拌。
④取2块被牛奶和蓝墨水处理过的布料各一份，分别同时放入烧杯中，用玻璃棒搅拌并用秒表记录除去污渍所需时间。
然后，分别以水浴锅温度依次为20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃，重复步骤③④，记录除去污渍所需要的时间，结果如下表。
不同温度下除去不同污渍所需时间/min
水温/ ℃
10
20
30
40
50
60
70
80
奶渍
48
43
28
12
6
4
12
17
蓝墨水
93
86
80
72
68
67
81
105
(1)请以温度为横坐标，酶促反应速度为纵坐标画出除去奶渍实验的大致情况图：
(2)解释在同一水温下除去两种污渍时间不同的可能原因是_______________________。
(3)此加酶洗衣粉不适宜洗涤下列哪些衣料？________。
①棉织品 ②毛织品 ③腈纶织品 ④蚕丝织品 ⑤涤纶织品 ⑥锦纶织品
(4)请你为上述探究实验命题______________________________________。
(5)上述探究过程(①至④)隐含了科学探究的________和______________两个步骤。
(6)上述实验涉及两项对照关系，一项是针对________的成分对照，另一项是针对__________的条件对照。这里的条件对照与一般实验空白对照的区别是____________________。
答案 (1)如图
(2)加酶洗衣粉含有蛋白酶和脂肪酶，酶具有专一性，且不同酶的活性受温度影响不同
(3)②④
(4)探究不同温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响
(5)提出假设 设计实验
(6)不同底物 不同温度 条件对照组互为对照(或互为实验组)
解析 加酶洗衣粉中添加了多种酶制剂，如碱性蛋白酶制剂和碱性脂肪酶制剂等，这些酶适宜温度不同，而且不适合洗涤蛋白质类纤维织物如羊毛、蚕丝等，因为酶能破坏蛋白质结构。该实验探究不同底物及不同温度对酶活性的影响，既可以根据底物不同设置对照，也可以根据温度不同设置对照。
13.某工厂生产了一种加酶洗衣粉，其包装袋上印有如下说明。
成分：含碱性蛋白酶等。
用法：洗涤前先将衣服浸于洗衣粉水内数小时，使用温水效果最佳。
注意：切勿用于丝质及羊毛衣料，用后彻底清洗双手。
请回答下列问题：
(1)质检局针对该洗衣粉设计了如下装置进行实验如图所示。
该实验的目的是___________________________________________________________。
(2)一学生为探索该洗衣粉中酶催化作用的最适温度，参考上述(1)的实验材料及方法进行了如下实验，并把结果用曲线图A、B表示。
①由图可知，使用该加酶洗衣粉的最适温度约为__________。
②在0 ℃和75 ℃时，酶的催化效率基本都降为零，但温度再度回到45 ℃，后者的催化作用已不能恢复，这是因为_____________________________________________________。
③该学生在实验过程中可通过观察_________________________来判断酶的催化效率。
(3)该加酶洗衣粉的去污原理是______________________________________________。
(4)大力推广使用加酶洗衣粉代替含磷洗衣粉，有利于生态环境保护，这是因为________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
答案 (1)检查该洗衣粉是否含蛋白酶
(2)①45 ℃ ②在75 ℃时，酶的活性已丧失 ③胶片上的蛋白膜消失所用时间的长短
(3)蛋白酶能将污垢中的蛋白质分解为易溶于水的小分子
(4)酶本身无毒，含量少，又能被微生物分解，不会引起富营养化，可减少对环境的污染
解析 实验的目的是检验洗衣粉中是否含有蛋白酶；由图中曲线可以得知，该加酶洗衣粉的最适温度约为45 ℃，酶在高温下其结构会被破坏，导致其活性丧失。
[真题体验]
14.(2014·江苏，18)下列关于加酶洗衣粉的叙述，正确的是( )
A.高温易使酶失活，因此冷水洗涤去污效果应该比温水好
B.洗衣粉中表面活性剂对碱性蛋白酶活性有一定的促进作用
C.在pH低于7.0的自来水中，碱性蛋白酶依然能起作用
D.洗衣粉中酶主要是通过快速分解溶在水里的污渍发挥作用
答案 C
解析 A项，酶有最适温度，加酶洗衣粉的酶在水温为45～60 °C时能充分发挥洗涤效果。B项，如果将酶直接加入到洗衣粉中，洗衣粉中的表面活性剂能影响碱性蛋白酶的活性，甚至使酶失活。C项，加酶洗衣粉中的酶是经过特殊处理的，能耐酸、耐碱，可忍受表面活性剂和较高的温度。D项，加酶洗衣粉中的酶的作用是催化衣物上的污渍分解，使其容易从衣物上脱落下来。
15.(2016·海南，30)回答下列问题：
(1)蛋白酶甲、乙、丙三者的活性随pH的变化如图所示。通常，用清水洗涤衣服上的新鲜血迹时，不应该使用开水，原因是_____________________________________________。
若要去除衣服上的血渍，应选择含有________(填“蛋白酶甲”“蛋白酶乙”或“蛋白酶丙”)的碱性洗衣粉，理由是_____________________________________________________。
(2)某同学为了洗去衣服上的油渍，洗衣时在市售的蛋白酶洗衣液中添加脂肪酶，该同学的做法________(填“合理”或“不合理”)，理由是_________________________________
________________________________________________________________________。
(3)已知溶液pH可以影响酶活性，请推测pH影响某种蛋白酶活性的原因可能是其影响了酶和底物分子中________(填“羧基和氨基”“氨基和甲基”“羧基和甲基”或“甲基和甲基”)等基团的解离状态。
答案 (1)开水使血中的蛋白质变性而沉淀，难以清洗 蛋白酶丙 碱性条件下只有蛋白酶丙有活性 (2)不合理 蛋白酶会降解脂肪酶 (3)羧基和氨基
第12课时 酵母细胞的固定化
[学习导航] 1.阅读教材P49“课题背景”，认识在应用酶的过程中，存在的实际问题及解决办法。2.通过阅读教材P49“(一)”，了解高果糖浆及生产高果糖浆的固定化酶技术。3.结合教材P50“(二)”，掌握固定化技术的方法及适合不同固定方法的材料。4.阅读教材P50“实验操作”，掌握固定化酵母细胞的实验操作过程，达到能够进行实际操作的目的。
[重难点击] 1.说出固定化酶和固定化细胞的作用和原理。2.尝试制备固定化酵母细胞，并利用固定化酵母细胞进行酒精发酵。
一、固定化酶和固定化细胞技术
1.固定化酶的应用实例——生产高果糖浆
(1)反应原理：葡萄糖果糖。
(2)生产过程
将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上
↓
放入底端装有分布着许多小孔的筛板的反应柱内(酶颗粒不能通过，反应液能通过)
↓
葡萄糖溶液从反应柱的上端注入
↓
流过反应柱
↓
与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖
↓
果糖从反应柱的下端流出
2.固定化酶和固定化细胞技术
(1)概念：利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
(2)方法及适用范围
(3)优点
①固定化酶：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可以反复利用。
②固定化细胞：与固定化酶技术相比，固定化细胞制备的成本更低，操作更容易。
1.固定化酶和固定化细胞的原理
(1)根据教材“高果糖浆的生产”分析固定化酶依据的原理与其优点分别是什么？
答案 将酶固定在不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。
(2)固定化细胞多采用哪种方法？该方法的原理与优点是什么？
答案 包埋法。包埋法的原理是：将微生物细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中。与固定化酶技术相比较，该方法成本更低，操作更容易。
2.固定化酶和固定化细胞的特点分析
(1)一种酶只能催化一种或一类化学反应，而在实际生产中很多产物的形成都需要通过一系列的酶促反应才能进行，怎样解决这一问题？
答案 可采用固定化细胞技术。因为固定化细胞固定的是活细胞，而细胞中有多种酶，因此可以催化一系列反应。
(2)固定化细胞与固定化酶所固定的酶种类有何区别？
答案 固定化细胞中含有多种酶，能催化一系列生化反应，而固定化酶中只含有一种酶，只能催化一种生化反应。
(3)如果反应物是大分子，能否采用固定化细胞技术？为什么？
答案 不能。因为大分子难以通过细胞膜进入细胞，不能与细胞内的酶接触而发生反应，因此不能用固定化细胞技术，应该用固定化酶技术。
(4)固定化酶和固定化细胞活性的维持需要的条件有何异同？
答案 都需要适宜的温度和pH等影响酶活性的条件，但固定化细胞还需要提供溶解氧和营养物质。
归纳总结 固定化酶和固定化细胞的两个区别
(1(固定方法的区别
①在实际应用中，酶更适用化学结合法和物理吸附法固定，原因是酶分子小，容易被多孔性物质吸附，更适合与化学物质结合，但容易从包埋材料中漏出。
②细胞体积大难以吸附或结合，因而多采用包埋法固定。
(2(催化作用的区别
固定化细胞操作更容易，对酶活性的影响更小，可以催化一系列反应，但是，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。所以，催化的反应物为大分子物质时，最好选用固定化酶技术。
1.下列关于固定化酶和固定化细胞的说法，不正确的是( )
A.固定化酶和固定化细胞的技术方法包括包埋法、化学结合法和物理吸附法
B.固定化酶更适合采用化学结合法和物理吸附法
C.由于细胞体积大，而酶分子很小，因此细胞多采用物理吸附法固定化
D.反应物是大分子物质应采用固定化酶
答案 C
解析 由于细胞体积大，酶分子很小，体积大的细胞难以被吸附或结合，而较小的酶容易从包埋材料中漏出。因此，细胞多采用包埋法固定化，酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化。
一题多变
果汁的生产需要果胶酶，用酶固定法可以提高果胶酶的利用率(如下图)。图中果胶酶的固定化适合采用哪种方法？
答案 酶分子较小，不适合采用包埋法固定化，可采用化学结合法和物理吸附法固定化。
2.如今，固定化酶与固定化细胞技术已经大规模地应用于各个生产领域。
(1)在实际生产中，固定化酶技术能节约成本的原因是
。
与固定化酶技术相比，固定化细胞固定的是 。
(2)填写下列三种固定化酶的方法：①是 ，②是 ，③是 。
(3)制备固定化酵母细胞时，常用的包埋材料是 ，该载体的特点是 。
答案 (1)固定化酶能被反复利用 多酶系统(或一系列酶或多种酶)
(2)化学结合法 物理吸附法 包埋法 (3)海藻酸钠 不溶于水、多孔
解析 (1)将酶固定化后，能使酶在催化反应之后与产物分离，可反复使用；将细胞固定化后，即可以将一种细胞内的多种酶同时进行固定。(2)图示①将酶相互连接起来，是化学结合法；②将酶吸附在载体表面上，是物理吸附法；③将酶包埋在细微网格里，是包埋法。(3)海藻酸钠不溶于水，容易与发酵液分离，在高温时容易熔化，温度降低时又可以形成多孔性固体颗粒，是包埋酵母菌的好材料。
一题多变
(1)题中图①和②方法是否适于固定化酵母细胞？为什么？
答案 不适合。因为细胞体积大，难以被吸附或结合。
(2)题中图③方法用于固定化酶时有何缺点？
答案 酶分子很小，容易从包埋材料中漏出。
方法链接 选择固定化酶与固定化细胞的方法
(1)根据固定方法选择
①固定化酶技术：由于酶分子较小，可以采用物理吸附法和化学结合法进行固定，它催化的是单一的化学反应。
②固定化细胞技术：细胞一般体积较大，适合应用包埋法固定，而且细胞能够产生多种酶，因此固定化细胞可以催化一系列化学反应。
(2)根据反应液中加入物质选择
①在固定化酶应用过程中，反应溶液中只需要加入酶的底物。
②固定化细胞在应用过程中，要保持细胞的正常生命活动，反应溶液中除需要加入反应的底物外，还应加入满足细胞生命活动所需要的营养物质等。
(3)根据反应的特点选择
①固定化酶可以催化的反应物是小分子或大分子。
②固定化细胞则只能催化小分子反应物。
二、实验操作
1.制备固定化酵母细胞
(1)固定方法：包埋法。
(2)常用载体：一些不溶于水的多孔性载体，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
(3)实验操作
酵母细胞的活化
↓
配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液
↓
配制海藻酸钠溶液
↓
海藻酸钠溶液与酵母细胞混合
↓
固定化酵母细胞
2.用固定化酵母细胞发酵
将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次
↓
将150 mL质量分数为10%的葡萄糖溶液转移到锥形瓶中
↓
加入固定好的酵母细胞(凝胶珠)
↓
置于25 ℃下发酵24 h
↓
观察是否有气泡产生，闻闻是否有酒味
1.实验过程分析
(1)用于固定酵母细胞的载体是什么？载体的浓度越高固定效果越好吗？
答案 海藻酸钠。海藻酸钠浓度过高不易形成凝胶珠；浓度过低形成的凝胶珠内包埋的细胞过少。
(2)配制海藻酸钠时小火或间断加热并不断搅拌的目的是什么？
答案 海藻酸钠在水中溶解的速度较慢，需要通过加热促进其溶解，用小火或间断加热并不断搅拌的目的是防止加热过程中海藻酸钠焦糊。
(3)为什么要等海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？
答案 固定的酵母细胞必须保持活性才能发挥作用，冷却后加入酵母细胞的原因是防止高温杀死酵母细胞。
2.实验结果分析
(1)若凝胶珠颜色过浅、呈白色，你知道是什么原因造成的吗？
答案 海藻酸钠浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少。
(2)若凝胶珠不呈圆形或椭圆形，你知道是什么原因造成的吗？
答案 海藻酸钠浓度偏高。
(3)利用固定的酵母细胞发酵产生酒精时，当观察到哪些现象时，则可以说明实验获得成功？
答案 如果看到产生很多气泡，同时闻到酒味，则证明实验获得成功。
归纳总结 固定化酵母细胞的三个注意事项
(1(溶化海藻酸钠，应采用小火或间断加热，直到海藻酸钠完全溶化，以防加热过快，导致海藻酸钠焦糊。
(2(制备固定化酵母细胞时，加入酵母细胞的海藻酸钠溶液不能直接“注入”而应缓慢“滴入”CaCl2溶液中，使刚形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。
(3(要控制好海藻酸钠的浓度。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。
3.关于固定化酵母细胞制备过程的叙述，正确的是( )
A.为使酵母菌活化，应让干酵母与自来水混合并搅拌
B.用小火或间断加热可防止海藻酸钠溶液焦糊
C.向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀
D.将与酵母细胞混匀的海藻酸钠溶液倒入CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成
答案 B
解析 酵母细胞活化时，应让干酵母与蒸馏水混合并搅拌，A项错误；配制海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热的方法，否则海藻酸钠会发生焦糊，B项正确；刚溶化的海藻酸钠应冷却后再与酵母细胞混合，否则温度过高会导致酵母细胞死亡，C项错误；将与酵母细胞混匀的海藻酸钠溶液匀速滴入CaCl2溶液中，D项错误。
4.下面是制备固定化酵母细胞的实验步骤，请回答下列问题：
酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞
(1)在 状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复 状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时 。
(2)固定化细胞技术一般采用包埋法，而固定化酶常用 和 。
(3)影响实验成败的关键步骤是 。
(4)海藻酸钠溶化过程中的注意事项是
。
(5)如果海藻酸钠浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞数目 。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明 。
(6)该实验中CaCl2溶液的作用是
。
答案 (1)缺水 正常的生活 体积增大
(2)化学结合法 物理吸附法
(3)配制海藻酸钠溶液
(4)要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊
(5)过少 海藻酸钠浓度偏高，制作失败
(6)用于海藻酸钠聚沉
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵母细胞恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是配制海藻酸钠溶液，得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小火加热(小火间断加热)并不断搅拌，使海藻酸钠完全溶化，又不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低，包埋的酵母细胞就过少；海藻酸钠浓度过高，不易与酵母细胞混合均匀。(6)氯化钙溶液能使海藻酸钠聚沉。
一题多变
(1)固定酵母细胞的过程中三次使用到蒸馏水，请说出是哪三个环节？
答案 酵母细胞的活化、配制CaCl2溶液以及配制海藻酸钠溶液定容时需要使用蒸馏水。
(2)本题中固定酵母细胞使用了海藻酸钠，固定化细胞还可以使用哪些固定化材料？
答案 明胶、琼脂糖、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。
(3)制备好的固定化酵母细胞可以用于酒精发酵，如果酵母细胞没有活化或溶化好的海藻酸钠溶液没有冷却就加入了酵母细胞，则对酒精发酵会产生怎样的影响？
答案 如果酵母细胞没有活化，则仍处于休眠状态；如果溶化好的海藻酸钠溶液没有冷却就加入了酵母细胞，则酵母细胞会被高温杀死。以上两种情况都会导致酒精发酵失败，而最终无酒精产生。
1.下列属于固定化酶应用特点的是( )
①可以被反复利用 ②有利于酶与产物分离 ③能自由出入载体 ④一种固定化酶只催化一种酶促反应 ⑤酶多用包埋法固定化
A.①②③ B.③⑤ C.①②④ D.①②⑤
答案 C
解析 酶被固定后可与产物分离，故可反复使用，但不能自由出入依附的载体。通常情况下固定化酶种类单一，所以不能催化一系列酶促反应，只催化一种或一类酶促反应。酶分子较小，不适合采用包埋法进行固定化。
2.下列关于使用固定化酶技术生产高果糖浆的说法，正确的是( )
A.高果糖浆的生产需要使用果糖异构酶
B.在反应柱内的顶端装上分布着许多小孔的筛板，防止异物进入
C.将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，果糖从反应柱下端流出
D.固定化酶技术复杂，成本较高
答案 C
解析 生产高果糖浆时所用的酶应为葡萄糖异构酶，将这种酶固定在一种颗粒状的载体上，再将这些酶颗粒装到一个反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。
3.下图所示的几种固定方式中属于包埋法的一组是( )
A.①② B.①③④ C.①④ D.③④
答案 D
解析 ①为吸附法，②为化学结合法，③④为包埋法，③包埋于网格中，④包埋于微胶囊中。
4.在制备固定化酵母细胞的实验中，CaCl2溶液的作用是( )
A.用于调节溶液pH B.用于进行离子交换
C.用于胶体聚沉 D.用于为酵母菌提供Ca2＋
答案 C
解析 海藻酸钠胶体在CaCl2这种电解质溶液的作用下，发生聚沉，形成凝胶珠，其作用机理是由于盐离子的电荷与胶体微粒电荷相互吸引，形成更大的胶体颗粒，类似于人体红细胞与抗凝集素之间的凝集反应。
5.如图所示，图甲为人工种子生产过程示意图，图乙为图甲中③过程的相关操作。请据图回答问题：
(1)图甲中，过程①、②分别称为 、 。
(2)图乙中，包埋形成人工种子的过程中，先适当加热使海藻酸钠溶化，然后将溶化的海藻酸钠溶液 ，再加入 充分搅拌混合均匀。
(3)若用图乙的方法“制备固定化酵母细胞”，海藻酸钠溶液的浓度对实验结果影响较大，若浓度过高，则 ，通常评价该实验结果主要是观察凝胶珠的 。
答案 (1)脱分化 再分化
(2)冷却至室温 胚状体
(3)不易形成凝胶珠 颜色和形状
解析 题图是利用植物组织培养技术生产人工种子及用海藻酸钠包埋人工种子的过程。过程①、②分别称为脱分化、再分化；海藻酸钠溶液的配制是固定化酵母细胞的关键，如果海藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数量较少，都会影响实验效果。
课时作业
[学考达标]
1.下列关于固定化酶和固定化细胞的叙述，正确的是( )
A.固定化细胞技术在多步连续催化反应方面优势明显
B.在固定化酶的应用中，要控制好pH、温度和溶解氧
C.利用固定化酶降解水体中有机磷农药，需提供适宜的营养条件
D.利用固定化酵母细胞进行发酵，糖类的作用只是作为反应底物
答案 A
解析 A项中，固定化细胞技术由于保留了细胞内原有的多酶系统，多步连续催化反应的优势非常明显；B项中，酶的催化受温度、pH的影响，不受氧浓度的影响；C项中，酶的降解作用不需各种营养条件；D项中，糖类的作用不只是作为反应底物，还能维持酵母细胞的渗透压，防止酵母细胞过多地吸水或失水。
2.细胞固定化技术与酶固定化技术相比，所具备的特点是( )
A.成本更低、操作更容易、不能连续性生产
B.成本更高、操作更难、不能连续性生产
C.成本更低、操作更容易、能连续性生产
D.成本更低、操作更难、能连续性生产
答案 C
解析 固定化细胞技术操作更容易，对酶活性影响更小，且能更新，容易回收，可连续性生产，成本自然更低。
3.制备好的凝胶珠是否符合要求，常用的检验方法有( )
①挤压法 ②摔打法 ③观察法 ④培养法
A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②④
答案 A
解析 检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法：一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。此外，还可以通过观察凝胶珠的颜色和形状来判断。
4.下面是制备固定化酵母细胞的步骤，正确的是( )
①配制CaCl2溶液 ②海藻酸钠溶化 ③海藻酸钠溶液与酵母细胞混合 ④酵母细胞的活化 ⑤固定化酵母细胞
A.①②③④⑤ B.④①③②⑤
C.④⑤②①③ D.④①②③⑤
答案 D
解析 制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞的活化→配制物质的量浓度为0.05 mol/L的CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。
5.下列关于制备固定化酵母细胞的操作，正确的是( )
A.制备好海藻酸钠溶液后，要立即将其与酵母细胞混合以防凝固
B.制备固定化酵母细胞的过程中需用到注射器
C.以恒定的速度把混合液注射到CaSO4溶液中
D.凝胶珠在CaCl2溶液中应浸泡10 min左右
答案 B
解析 应将海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入已活化的酵母细胞，否则会把酵母细胞杀死，A错误；应以恒定的速度把混合液滴加到CaCl2溶液中，而不是CaSO4溶液中，C错误；凝胶珠在CaCl2溶液中应浸泡30 min左右，D错误。
6.下列关于配制海藻酸钠溶液的叙述中，不正确的是( )
A.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环
B.海藻酸钠溶液的浓度关系到固定化细胞的质量
C.海藻酸钠溶液的浓度过高时，易形成凝胶珠
D.海藻酸钠溶液的浓度过低时，形成的凝胶珠内包埋的酵母细胞过少
答案 C
解析 海藻酸钠溶液的浓度关系到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠溶液浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目过少，影响实验效果。
[高考提能]
7.固定化酵母细胞在发酵生产中得到了广泛应用，下列有关叙述正确的是( )
A.利用固定化酵母细胞发酵，发酵液浓度不宜过高
B.制备固定化酵母细胞时，形成的凝胶珠越大越好，越硬越好
C.固定化的酵母细胞不能繁殖，性状较为稳定
D.酵母细胞固定化是为了提高发酵速度
答案 A
解析 若发酵液浓度过高，会导致酵母细胞失水过多而死亡。
8.关于固定化酶的说法中，正确的是( )
A.固定化酶的种类多样，可催化一系列的酶促反应
B.酶被固定在不溶于水的载体上，可反复利用
C.酶作为催化剂，反应前后结构不改变，所以固定化酶可永远利用下去
D.固定化酶由于被固定在载体上，所以丧失了酶的高效性和专一性特点
答案 B
解析 固定化酶不能催化一系列酶促反应的进行；固定化酶被固定在不溶于水的载体上，可以反复利用，但是随着利用次数的增加，受到外界因素的影响，其活性会逐渐降低；固定化酶具有高效性和专一性的特点。
9.如图表示某同学进行的澄清苹果汁生产实验，下列相关叙述正确的是( )
A.实验中所用的固定化果胶酶由海藻酸钠直接包埋获得
B.为防止杂菌污染，图示装置制作完毕后应瞬间高温灭菌
C.通过控制阀调节苹果汁流出的速率，保证反应充分进行
D.固定化果胶酶不可重复使用，每次生产前应重新填装反应柱
答案 C
10.如图甲表示制备固定化酵母细胞的有关操作，图乙是利用固定化酵母细胞进行酒精发酵的示意图，下列叙述不正确的是( )
A.刚溶化的海藻酸钠应迅速与活化的酵母菌混合制备混合液
B.图甲中X溶液为CaCl2溶液，其作用是使海藻酸钠形成凝胶珠
C.图乙发酵过程中搅拌的目的是使培养液与酵母菌充分接触
D.图甲中制备的凝胶珠用蒸馏水洗涤后再转移到图乙装置中
答案 A
解析 在该实验中，应将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，再加入已活化的酵母细胞，否则高温会导致酵母细胞死亡；实验中CaCl2溶液的作用是使海藻酸钠形成凝胶珠；固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗2～3次，再将其转移至10%的葡萄糖溶液中，并用搅拌器搅拌，目的是使培养液与固定化酵母细胞充分接触，有利于发酵的正常进行。
11.根据下列材料，回答下列问题：
材料 科学家发现，几乎所有的酶都可以在各种不同的微生物中找到，而微生物有繁殖快、产量高等优点，所以微生物成了酶制剂的主要原料。从20世纪70年代开始，人们找到了一种方法可以设计连续操作的生物反应系统，即固定化酶。科学家将酶或生产酶的细菌以一定的方法固定在某种载体上，这样生产原料从载体的一头流入，产品就从载体的另一头流出，而酶可以重复使用。酶工程具有简便易行、见效迅速、耗能低、废物少等优点。
(1)以上材料体现了科学技术的发展是不断提出问题和解决问题的动态过程，介绍了从 到 ，再到 的发展过程。
(2)请列举利用固定化酶技术的应用实例。
。
(3)固定化酶在生产实践中的优点有
。
(4)固定化酶和固定化细胞通常采用的方法有 、 、 。
答案 (1)酶 固定化酶 固定化细胞
(2)利用固定化葡萄糖异构酶技术生产高果糖浆(答案合理即可)
(3)可反复使用；既能与反应物接触，又能与产物分离
(4)包埋法 化学结合法 物理吸附法
12.如图为固定化酵母细胞及其应用的相关图解，请据图回答下列问题：
(1)某生物小组利用海藻酸钠制备固定化酵母细胞，应使用图甲中方法[ ] (填号码及名称)，而制备固定化酶则不宜用此方法，原因是 。
(2)部分同学制得的凝胶珠如图乙所示，其原因可能是 、 等。观察形成的凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明 ；如果形成的凝胶珠不是 ，说明实验操作失败。
(3)某同学用图丙所示的装置来进行葡萄糖发酵。a代表 ，b代表 。从上端漏斗中加入反应液的浓度不能过高的原因是
。
为使该实验中所用到的固定化酵母细胞可以反复利用，实验过程一定要在 条件下进行。装置中的长导管起的作用是
。
答案 (1)③ 包埋法 酶分子很小，容易从包埋材料中漏出
(2)海藻酸钠溶液的浓度过高 注射器推进速度过快(或针筒口离CaCl2液面过近) 海藻酸钠溶液的浓度过低，固定化酵母细胞数目较少 圆形或椭圆形
(3)固定化酵母细胞 反应柱 若葡萄糖溶液的浓度过高会使酵母细胞因失水过多而死亡 无菌 释放反应产生的CO2和防止空气中的杂菌进入反应柱
解析 固定化酶适宜用化学结合法、物理吸附法；固定化酵母细胞适宜用包埋法。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠溶液的浓度偏高或注射器推进速度过快(或针筒口离CaCl2液面过近)。
13.回答下列有关酶工程的问题：
固定化酶是从20世纪60年代迅速发展起来的一种技术。东北农业大学科研人员利用双重固定法，即采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，研究固定化酶的性质，并对其最佳固定条件进行了探究。下图显示的是部分研究结果(注：酶活力为固定化酶催化化学反应的总效率，包括酶活性和酶的数量)。
(1)酶的固定化技术的应用最主要的目的是 。
(2)从对温度变化适应性和应用范围的角度分析，甲图所示结果可以得出的结论是
。
(3)乙图曲线表明浓度为 的海藻酸钠包埋效果最好，当海藻酸钠浓度较低时，酶活力较低的原因可能是 。
(4)固定化酯酶的活力随使用次数的增多而下降，由丙图可知，固定化酯酶一般重复使用 次后酶活力明显下降。
(5)研究人员固定小麦酯酶不采用海藻酸钠直接包埋，而是同时用戊二醛作为交联剂，这是因为 。
(6)根据介绍，科研人员所采用的固定化技术可用下图中的 表示。
答案 (1)解决酶的回收和再利用的困难
(2)固定化酯酶比游离酯酶对温度变化适应性更强，且应用范围较广
(3)3% 海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足
(4)3
(5)酶分子过小，很容易从包埋材料中漏出
(6)BC
解析 (2)通过分析甲图可知，固定化酶与游离酶相比，固定化酶对温度变化的适应性更强且应用范围较广。(3)乙图曲线表明浓度为3%的海藻酸钠包埋效果最好，此时的酶活力最高。当海藻酸钠浓度较低时包埋不紧密，酶分子容易漏出，数量不足，因此酶活力较低。(4)由丙图可知，固定化酶的活力随使用次数的增多而下降，且在使用3次以后，酶活力显著下降。(5)由于小麦酯酶分子很小，很容易从包埋材料中漏出，因此固定小麦酯酶不采用海藻酸钠直接包埋，而是采用双重固定法。(6)双重固定法是指采用戊二醛作交联剂(使酶相互连接)，海藻酸钠作为包埋剂来固定小麦酯酶，可见科研人员所采用的固定化技术是化学结合法和包埋法，可用图中的B、C表示。
[真题体验]
14.(2015·浙江自选，17节选)温度与植酸酶相对酶活性的关系如图所示。下列叙述错误的是( )
A.测试温度中，固定化与非固定化植酸酶的最适温度分别为60 ℃和45 ℃
B.测试温度范围内，固定化植酸酶的相对酶活性波动低于非固定化植酸酶
C.固定化与非固定化植酸酶相比，相对酶活性在80%以上时的温度范围较宽
D.65 ℃时固定化与非固定化植酸酶的相对酶活性因蛋白质变性而位于最低点
答案 D
15.(2016·江苏，29)为了探索海藻酸钠固定化对绿球藻生长的影响，以及固定化藻对含Zn2＋污水的净化作用，科研人员用筛选到的一株绿球藻进行实验，流程及结果如下。请回答下列问题：
(1)实验中的海藻酸钠作用是 ，CaCl2的作用是 。
(2)为洗去凝胶球上残余的CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻活性，宜采用 洗涤。图1中1.0%海藻酸钠组培养24 h后，移去凝胶球，溶液呈绿色，原因是 。
(3)为探索固定化藻对含Zn2＋污水的净化作用，应选用浓度为 海藻酸钠制备凝胶球。
(4)图2中空白凝胶球组Zn2＋浓度下降的原因是
。结合图1和图2分析，固定化藻的实验组24～48 h间Zn2＋浓度下降速度较快的主要原因是
；
72～96 h间Zn2＋浓度下降速度较慢的原因有
。
答案 (1)包埋绿球藻(包埋剂) 与海藻酸钠反应形成凝胶球(凝固剂) (2)培养液(生理盐水) 海藻酸钠浓度过低(凝胶球孔径过大) (3)2.0% (4)凝胶球吸附Zn2＋ 绿球藻生长(增殖)速度快 绿球藻生长(增殖)速度减慢，溶液中Zn2＋浓度较低
解析 (1)实验中的海藻酸钠是包埋剂，作用是包埋绿球藻，而CaCl2是凝固剂，作用是与海藻酸钠反应形成凝胶球。(2)为洗去凝胶球上残余的CaCl2和其他污染物，并保持绿球藻活性，宜采用培养液(或生理盐水)来洗涤，因为培养液(或生理盐水)的浓度与绿球藻的细胞液浓度相接近。图1中1.0%海藻酸钠组培养24 h后，移去凝胶球，由于海藻酸钠浓度过低，使形成的凝胶球孔径过大，固定下来的绿球藻数量少，结果使溶液呈绿色。(3)分析图1可知，当海藻酸钠浓度为2.0%的时候，绿球藻数量比其他浓度时要多，所以要探索固定化藻对含Zn2＋污水的净化作用，宜选用浓度为2.0%的海藻酸钠制备凝胶球。 (4)分析图2可知，随着培养时间延长，空白凝胶球组Zn2＋浓度下降，Zn2＋浓度下降的原因是凝胶球吸附Zn2＋；图1中海藻酸钠浓度为2.0%时，24～48 h间绿球藻生长(增殖)速度快，使固定化藻的实验组在24～48 h间Zn2＋浓度下降速度较快；在72～96 h间绿球藻生长(增殖)速度减慢，再加上培养液中Zn2＋浓度较低，导致72～96 h间Zn2＋浓度下降速度较慢。
专题5 DNA和蛋白质技术
知识系统构建
DNA和蛋白质技术
必背要语
1.DNA不溶于酒精，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精，可利用酒精将DNA和蛋白质分开。
2.DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最低。
3.PCR原理：DNA热变性原理。
PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。
4.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
5.利用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。
6.在电泳中，待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。
7.SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。
8.蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理与粗分离、纯化和纯度鉴定。
9.在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。
规律方法整合
整合一 DNA的粗提取与鉴定中的“234”
加蒸馏水2次
①加到鸡血细胞液中，使血细胞吸水破裂
②加到含DNA的2 mol/L的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物质的量浓度下降到0.14 mol/L，DNA析出
用纱布过滤3次
①过滤血细胞破裂液，得到含细胞核物质的滤液
②过滤溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液
③滤取0.14 mol/L的NaCl溶液中析出的DNA(黏稠物)
用NaCl溶液4次
①加2 mol/L的NaCl溶液，溶解提取细胞核物质
②用0.14 mol/L的NaCl溶液使DNA析出
③用2 mol/L的NaCl溶液，溶解滤取的DNA黏稠物
④用2 mol/L的NaCl溶液，溶解丝状物用于鉴定DNA
例1 将粗提取的DNA丝状物分别加入0.14 mol/L NaCl溶液、2 mol/L NaCl溶液、体积分数为95%的酒精溶液中，然后用放有纱布的漏斗过滤，分别得到滤液P、Q、R以及存留在纱布上的黏稠物p、q、r，其中由于含DNA少可以丢弃的是( )
A.P、Q、R B.p、q、r C.P、q、R D.p、Q、r
答案 C
解析 DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最小，过滤后DNA在黏稠物p中，可以丢弃P；DNA在2 mol/L NaCl溶液中溶解过滤后，DNA在滤液中，可以丢弃q；DNA不溶于体积分数为95%的酒精溶液，所以过滤后DNA在黏稠物r中，可以丢弃R。
整合二 去除DNA滤液中杂质的三种方案
项目
原理
方法
方案一
DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
在滤液中加入NaCl，使NaCl溶液物质的量浓度为2 mol/L，过滤除去不溶的杂质；再调节NaCl溶液物质的量浓度为0.14 mol/L，析出DNA，过滤除去溶液中的杂质，再用物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA
方案二
DNA对酶的耐受性
直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15 min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质
方案三
DNA对高温的耐受性
将滤液放在60～75 ℃的恒温水浴箱中保温10～15 min，注意严格控制温度范围，使蛋白质沉淀而DNA分子还未变性，可将DNA与蛋白质分离
例2 如图表示以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取与鉴定的操作程序，请分析回答问题。
―→―→―→―→
一 二 三 四
―→―→―→
五 六 七 八
(1)步骤一中，向鸡血细胞液中加入 并搅拌，可使鸡血细胞破裂。
(2)步骤二：过滤后收集含有DNA的 。
(3)步骤三、四的操作原理是
。
步骤四通过向溶液中加入 调节NaCl溶液物质的量浓度至 mol/L, DNA将会析出，过滤去除溶液中的杂质。
(4)步骤七：向步骤六过滤后的 中，加入等体积的冷却的 ，静置2～3 min，溶液中会出现 色丝状物，这就是粗提取的DNA。
(5)步骤八：DNA遇 试剂，沸水浴5 min，冷却后，溶液呈 色。
答案 (1)蒸馏水 (2)滤液 (3)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质 蒸馏水 0.14 (4)滤液 体积分数为95%的酒精 白 (5)二苯胺 蓝
解析 第一步加入蒸馏水的目的是使红细胞涨破，释放出核物质；第二步收集含有核物质的滤液；由于DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，所以通过控制NaCl溶液的浓度可以分别溶解DNA和析出DNA，并且对 DNA进行提纯；第四步加入蒸馏水的目的是逐渐稀释NaCl溶液，使其物质的量浓度为0.14 mol/L，这时DNA在NaCl溶液中溶解度最低，可以析出DNA。DNA不溶于冷酒精，某些蛋白质可以溶于冷酒精，这样可以进一步提纯 DNA。鉴定DNA的方法是用二苯胺试剂，在沸水浴加热条件下，如果变蓝色，证明存在DNA。
整合三 DNA的粗提取、PCR技术、蛋白质分离之间的比较
项目
DNA的粗提取
PCR技术
蛋白质分离
实验原理
DNA在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，且不溶于冷酒精
利用DNA热变性原理体外扩增DNA
依据相对分子质量的大小分离蛋白质
实验过程
选取材料→破碎细胞释放DNA→除杂→DNA析出与鉴定
变性→复性→延伸
样品处理及粗分离→凝胶色谱操作→SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳
实验结果
获得较纯净的DNA
获得大量DNA
相对分子质量不同的蛋白质得以分离
实验意义
为DNA研究打下基础
解决了DNA研究中材料不足的问题
为蛋白质的研究和利用提供了原材料
例3 PCR是一种DNA体外扩增技术。1988年，PCR仪问世，并被广泛应用于基因扩增和DNA序列测定。如图是 PCR技术示意图，请回答下列问题。
(1)①将双链DNA ，使之变性，从而导致 。
②引物延伸需提供 作为原料。
(2)红细胞含有大量血红蛋白，我们可以选择猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。请回答下列有关问题。
①样品处理，它包括红细胞的洗涤、 、分离血红蛋白溶液。
②收集的血红蛋白溶液在透析袋中经过透析，这就是样品的粗分离。透析的目的是 。透析的原理是
。
答案 (1)①加热到95 ℃ 双链 DNA分离成两条单链
②四种脱氧核苷酸 (2)①血红蛋白的释放 ②去除相对分子质量较小的杂质 透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质则保留在透析袋内
解析 (1)引物的延伸需要提供4种脱氧核苷酸为原料。每次循环都包括变性、复性和延伸三步。变性是指在高温90 ℃以上DNA双链解聚为单链的过程。
(2)该实验中样品的处理可分为三步：①红细胞的洗涤；②血红蛋白的释放；③分离血红蛋白溶液。透析所依据的原理是小分子可以自由进出透析袋，而大分子则保留在透析袋内，目的是除去相对分子质量较小的杂质。
整合四 DNA体内复制与体外复制(PCR)的比较
PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，与细胞内DNA复制的过程相比既有相同点又有不同点，通过列表比较的方法准确掌握两者的异同，是防止此类问题出错的重要措施。细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较：
项目
细胞内DNA复制
PCR
不
同
点
解旋
在解旋酶作用下边解旋边复制
95 ℃高温解旋、双链完全分开
酶
解旋酶、DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶
引物
RNA
一般为单链DNA
能量
ATP
dNTP
温度
体内温和条件
高温
循环次数
受生物自身控制
三十多次
相同点
①需提供DNA复制的模板
②四种脱氧核苷酸作原料
③子链延伸的方向都是从5′端到3′端
④都需要酶的催化
例4 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链DNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链 DNA为模板进行复制
A.③④ B.①② C.①③ D.②④
答案 C
解析 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链DNA，长度通常为20～30个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
整合五 DNA粗提取和血红蛋白提取和分离的比较
大分子物质的提取与分离，一般是根据其固有的理化性质，用不同的物理或化学方法，达到不同成分分离的目的。对于DNA与血红蛋白的提取和分离的相关知识，可通过下表来辨析掌握。
项目
DNA粗提取和鉴定
血红蛋白的提取和分离
材料选取
DNA含量高的生物组织
哺乳动物成熟的红细胞
细胞破碎
动物细胞：加蒸馏水并搅拌
植物细胞：加洗涤剂和食盐搅拌、研磨
加蒸馏水和甲苯充分搅拌
去除杂质
①用不同浓度的NaCl溶液处理
②用酒精溶液处理
③用蛋白酶处理
①透析处理
②纯化处理
鉴定
加入二苯胺，沸水浴
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量
例5 下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离(鉴定)实验的分析，正确的是( )
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的降低而减小
B.分离蛋白质装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管先打开后关闭
C.在蛋白质提取和分离过程中进行透析可去除溶液中的DNA
D.利用一定范围内的高温使蛋白质变性而对DNA没有影响的特性可将DNA与蛋白质分离
答案 D
解析 A错误，DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小，超过或低于0.14 mol/L时，溶解度都增大；B错误，分离蛋白质装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应始终打开；C错误，透析可用于去除小分子物质，不能去除大分子的DNA；D正确，一定范围内的高温能使蛋白质变性，对DNA没有影响，利用此原理能将DNA与蛋白质分离。
热点考题集训
1.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验操作的说法中，正确的是( )
A.该实验中有两次加入蒸馏水，均是为了析出DNA
B.该实验中多次要求用玻璃棒单向搅拌，目的是搅拌均匀
C.该实验中有3次过滤，过滤时使用尼龙布层数与DNA的存在状态有关
D.实验中3次加入NaCl溶液，第二次的目的是析出DNA
答案 C
2.下列关于“DNA的粗提取与鉴定实验”的叙述，正确的是( )
A.洗涤剂能瓦解细胞膜并增加DNA在NaCl溶液中的溶解度
B.将DNA丝状物放入二苯胺试剂中沸水浴后冷却变蓝
C.调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质
D.加入冷却的酒精后用玻璃棒快速搅拌滤液会导致DNA获得量增多
答案 C
解析 洗涤剂能瓦解细胞膜，但是并不能增加DNA在NaCl溶液中的溶解度，A项不正确。鉴定DNA时，须先将DNA丝状物溶于2 mol/L的NaCl溶液中，再加入二苯胺试剂并沸水浴加热，冷却后变蓝，B项不正确。DNA和蛋白质在NaCl溶液中的溶解度不同，且对酶的耐受性也不同，因而调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质，C项正确。加入冷却的酒精后应用玻璃棒缓慢地并沿一个方向搅拌滤液，否则会导致DNA丝状物断裂进而使获得量减少，D项不正确。
3.有关PCR技术的说法，不正确的是( )
A.PCR是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术
B.PCR技术的原理是DNA双链复制
C.利用PCR技术获取目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列
D.PCR扩增中必须有解旋酶才能解开双链DNA
答案 D
4.下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是( )
A.片段a、b、c的长度均相同
B.片段a、b只是第一次循环的产物
C.片段c最早出现在第二次循环的产物中
D.经过30次循环后，片段c的数量为230
答案 C
解析 图中片段a、b只有一种引物， 是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项不正确。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项不正确。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，故D项不正确。
5.下列关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法中，正确的是( )
A.以DNA为模板，使DNA子链从5′端延伸到3′端的一种酶
B.Taq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加
C.DNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列
D.Taq DNA聚合酶是从深海中的某种菌体内发现的
答案 A
解析 DNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，引物的5′端与母链发生碱基互补配对，然后从引物的3′端延伸子链，所以，整条子链的合成是从5′端延伸到3′端；Taq DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用，无需另外再添加；PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列；Taq DNA聚合酶是1966年从美国黄石公园的一个热泉内的某种菌体内发现的。
6.下列有关“血红蛋白提取和分离”的相关叙述中，正确的是( )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白
B.将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质
C.血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂
D.整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构
答案 D
解析 红细胞的洗涤应用生理盐水，其目的是去除血浆蛋白等杂质，有利于后续步骤的分离纯化，而不是洗去细胞表面的杂蛋白，A项不正确。将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质，B项不正确。血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放，而不是溶解血红蛋白，C项不正确。整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构，D项正确。
7.下列关于DNA和蛋白质提取与分离实验的叙述，正确的有(多选)( )
A.提取细胞中的DNA和蛋白质都需用蒸馏水涨破细胞
B.用不同浓度NaCl溶液反复溶解与析出DNA，可去除蛋白质
C.蛋白质提取和分离过程中进行透析可以去除溶液中的DNA
D.蛋白质和DNA都可以用电泳的方法进行分离纯化
答案 BD
解析 提取DNA需用蒸馏水涨破细胞，提取蛋白质可以直接用豆浆或研磨的大豆；透析法不能除去DNA；DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，在0.14 moL/L的NaCl溶液中的溶解度最小，DNA可以析出，通过过滤可以除去蛋白质；用电泳的方法可将蛋白质、DNA进行分离纯化。
8.蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述不正确的是( )
A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同蛋白质分离
B.根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质
C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
答案 A
解析 蛋白质分子不能透过半透膜，据此可利用半透膜除去样品中相对分子质量小的杂质，而不是分离样品中的蛋白质；根据蛋白质的带电荷性质，可通过电泳分离蛋白质；根据蛋白质的相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质；根据蛋白质的分子大小、密度不同，可用离心沉降法分离蛋白质。
9.“DNA的粗提取与鉴定”实验中，A、B、C、D、E五个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均相同且正确，但实验结果却不同。
组别
实验材料
提取核物质时加入的溶液
去除杂质时加入的溶液
DNA鉴定时加入的试剂
A
鸡血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精(25 ℃)
二苯胺
B
菜花
蒸馏水
体积分数为95%的酒精(冷却)
双缩脲
C
人血浆
蒸馏水
体积分数为95%的酒精(冷却)
二苯胺
D
人血细胞
2 mol/L的氯化钠
0.14 mol/L的氯化钠
双缩脲
E
鸡血
蒸馏水
体积分数为95%的酒精溶液(冷却)
二苯胺
(1)实验材料选择错误的组别是 ，其原因是
。
(2)沸水浴中试管颜色变蓝的组别是 ；蓝色较淡的是 ，其原因是
。
(3)B组实验不成功的最主要原因是
。
答案 (1)C、D 人的血浆中没有细胞结构，人成熟的红细胞中没有细胞核，选用这些材料得不到DNA或得到的DNA很少 (2)A、E A 冷却的酒精溶液对DNA的凝集效果较佳，该组使用的是25 ℃的酒精溶液 (3)菜花细胞在蒸馏水中不能被破坏，得不到DNA(应采用研磨的方法)
解析 (1)人的血浆中没有细胞结构，人成熟的红细胞没有细胞核，在这些材料中不能得到DNA或得到的DNA很少。(2)冷却的酒精溶液对DNA有较好的凝集效果，而A组中为25 ℃的酒精溶液。(3)菜花细胞外有细胞壁起保护作用，在蒸馏水中不会破裂，所以不能得到DNA。
10.H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型RNA流感病毒引起的，目前最为快速有效的检测手段是RT－PCR核酸检测。RT－PCR的过程包括反转录作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增，过程如下图所示。据此分析下列问题：
(1)传统PCR技术的原理是 ，过程中低温退火的含义是 。
(2)在RT－PCR中每一步都有酶的参与，上图中过程1中的关键酶是 ；PCR中的关键酶是 ，该酶的作用特点是 、 。
(3)在对病毒核酸进行检测时，主要通过RT－PCR扩增其关键的基因序列，这时引物的设计就非常关键，根据下图分析，请你选择合适的引物： 。
答案 (1)DNA复制 引物与模板链互补配对 (2)反转录酶 Taq DNA聚合酶(DNA聚合酶) 耐高温 不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链 (3)引物Ⅰ和引物Ⅱ
第13课时 DNA的粗提取与鉴定
[学习导航] 1.通过阅读教材P54“基础知识”，掌握提取并检验DNA的原理和方法。2.结合教材P55“实验设计”，掌握DNA粗提取的选材、析出及鉴定。3.结合教材P56“操作提示”，掌握实验过程中需注意的问题。4.分析教材P57“结果分析与评价”中的问题，掌握DNA粗提取与鉴定的技术。
[重难点击] 1.理解DNA的理化特性及根据其理化特性而提取和鉴定的原理。2.初步掌握DNA的粗提取和鉴定方法。
一、DNA的理化特性、提取及鉴定的原理
1.提取DNA的方法和原理
(1)提取生物大分子的基本思路：选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。
(2)提取DNA的方法：利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。
2.DNA的溶解性
(1)DNA在NaCl溶液中的溶解度
DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同，其中在0.14 mol/LNaCl溶液中溶解度最低。
(2)在酒精溶液中的溶解性：DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质溶于酒精溶液。
3.DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性
(1)对酶的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但对DNA没有影响。
(2)对温度的耐受性：大多数蛋白质不能忍受60～80 ℃的高温，而DNA在80 ℃ 以上才会变性。
(3)对洗涤剂的耐受性：洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。
4.DNA的鉴定
在沸水浴的条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色。
1.DNA溶解性原理
(1)结合DNA在NaCl溶液中的溶解度曲线，分析DNA在不同浓度NaCl溶液中的溶解度有何特点。
项目
溶解规律
2 mol/L NaCl溶液
0.14 mol/L NaCl溶液
DNA
溶解
析出
蛋白质
蛋白质在NaCl溶液浓度从2 mol/L降低过程中，溶解度逐渐增大
部分发生盐析沉淀
溶解
①低于0.14 mol/L时：DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度增加而逐渐降低。
②高于0.14 mol/L时：DNA的溶解度随NaCl溶液物质的量浓度增加而逐渐升高。
(2)结合图表分析，如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出，以达到去除杂质的目的？
答案 提取获得的DNA滤液中含有蛋白质、多糖和RNA等多种杂质，用2 mol/L的NaCl溶液溶解DNA，然后过滤获得滤液，能够去除该条件下不能溶解的杂质；调节NaCl溶液的物质的量浓度为0.14 mol/L，使DNA析出，然后过滤获得析出物，能够去除该条件下仍然能够溶解的杂质。
(3)DNA不溶于酒精溶液，而细胞中的某些蛋白质则溶于酒精溶液，此特点对于提取DNA有什么作用？
答案 可以将DNA和蛋白质进一步分离。
2.DNA的耐受性原理
DNA变性和蛋白质变性的实质相同吗？请说明原因。
答案 不同。原因如下：
(1)蛋白质变性是指蛋白质在某些物理或化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变以致生物学活性丧失。
(2)DNA变性是指DNA分子在高温等条件下，由稳定的双螺旋结构解聚为无规则线性结构的现象，变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，当温度等条件恢复正常后，DNA的结构尚能恢复。
归纳总结 DNA粗提取的三个原理
(1(利用DNA随NaCl溶液浓度的不同而溶解度不同的原理可粗提取DNA。
(2(利用DNA不溶于酒精，而细胞内的其他许多物质可溶于酒精的原理可进一步提纯DNA。
(3(利用DNA对酶和高温的耐受性可以去除蛋白质杂质。
1.在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，实验原理是利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同来提取的，DNA的溶解度与图示曲线的对应点相符合的是( )
A.a点浓度最适合析出DNA B.b点浓度最适合析出DNA
C.c点浓度最适合析出DNA D.d点浓度最适合析出DNA
答案 B
解析 用高浓度的NaCl溶液溶解DNA，能除去在高盐溶液中不能溶解的杂质，用低浓度的NaCl溶液使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质，因此，反复溶解、析出DNA，能除去与DNA溶解度不同的杂质。从题图可以看出，DNA在浓度为0.14 moL/L的NaCl溶液中的溶解度最小，因此最适合析出DNA。随着NaCl溶液浓度的增大或减小，溶解度均逐渐增大。
2.下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A.利用DNA能溶于酒精溶液，而蛋白质不溶于酒精溶液，可将DNA与蛋白质分离
B.利用高温能使DNA变性，却对蛋白质没有任何影响的特性，可将DNA与蛋白质分离
C.利用DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最大的特点，可将DNA与蛋白质分离
D.在DNA滤液中加入嫩肉粉，通过木瓜蛋白酶的作用，可将DNA与蛋白质分离
答案 D
解析 DNA不溶于酒精，而蛋白质等杂质溶于酒精，A项不正确。蛋白质比DNA对温度的耐受性更差，因此更容易变性，B项不正确。DNA在0.14 mol/L NaCl溶液中溶解度最小，而蛋白质在该浓度的NaCl溶液中溶解度较大，因此可将DNA与蛋白质分离，C项不正确。嫩肉粉中的木瓜蛋白酶只能催化蛋白质水解，而对DNA没有影响，因此，可将DNA与蛋白质分离，D项正确。
一题多变
在DNA的粗提取过程中，使用嫩肉粉分离DNA与蛋白质的原理是什么？
答案 利用了酶的专一性，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶只能催化蛋白质水解，不能催化DNA水解。
二、“DNA粗提取与鉴定”实验设计与操作提示
(一)实验设计
1.实验材料的选取
选用DNA含量相对较高的生物组织。
2.破碎细胞，获取含DNA的滤液
(1)动物细胞的破碎
①选材及方法：选用动物细胞作为实验材料时，由于其无细胞壁，因此可直接采用吸水涨破的方法。
②过程：以鸡血为例
在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，细胞会吸水涨破，然后用纱布过滤，过滤后收集滤液即可。
(2)植物细胞的破碎
①方法：需要先用洗涤剂溶解细胞膜。
②过程：以提取洋葱的DNA为例。
在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分地搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。
3.去除滤液中的杂质
方案一
利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质
方案二
直接在滤液中加入嫩肉粉，反应10～15 min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质
方案三
将滤液放在60～75 ℃的恒温水浴箱中保温10～15 min，注意严格控制温度范围
4.DNA的析出
利用DNA不溶于冷却的酒精溶液这一原理，可从DNA溶液中析出比较纯净的DNA，此时DNA的状态为白色丝状物。
5.DNA的鉴定
将白色丝状物溶解于5 mL物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中，再加入4 mL的二苯胺试剂，沸水浴加热5 min，冷却后观察溶液的颜色，同时设计不含DNA的NaCl溶液作为对照。
(二)操作提示
1.以血液为实验材料时，每100 mL血液中需要加入3 g柠檬酸钠，防止血液凝固。
2.加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。
3.鉴定DNA用的二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。
1.实验材料的选取
教材中所给的生物材料中，选取哺乳动物的红细胞与鸡血提取DNA哪个效果更好？
答案 用鸡的血液。因为鸡血细胞核DNA含量丰富，材料易得，而哺乳动物的红细胞无细胞核，不含DNA。
2.实验操作分析
(1)实验中应采用什么方法使鸡血细胞破裂？
答案 在鸡血细胞液中加入蒸馏水，使鸡血细胞吸水涨破。
(2)提取菜花的DNA时，加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答案 洗涤剂能瓦解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。
(3)实验过程要充分地搅拌和研磨，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答案 研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物，用二苯胺鉴定不显示蓝色。
(4)实验过程中应如何使用玻璃棒搅拌？为什么？
答案 搅拌时玻璃棒不能直插烧杯底部，并且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。
规律方法 DNA粗提取与鉴定实验中四个关键操作的目的
(1)两次加入蒸馏水
次数
目的
第一次
使鸡血细胞吸水涨破
第二次
稀释NaCl溶液，使DNA逐渐析出
(2)三次加NaCl溶液
次数
目的
第一次
溶解DNA，析出蛋白质等杂质
第二次
使DNA再溶解，为了获得含杂质较少的DNA
第三次
溶解DNA，以便DNA与二苯胺反应
(3)三次过滤
次数
目的
第一次
单层
除去细胞破碎后的细胞膜、核膜、糖类、蛋白质等，获得含核物质的滤液
第二次
两层
除去不溶于2 mol/L NaCl溶液中的蛋白质等杂质，获得含DNA的滤液
第三次
多层
除去溶于0.14 mol/L NaCl溶液中的杂质，获得含DNA的丝状物
(4)六次搅拌
次数
实验操作
目的
第一次
搅拌加蒸馏水的鸡血细胞液
加速细胞破裂
第二次
搅拌含DNA的高浓度盐溶液
加速DNA的溶解
第三次
搅拌加蒸馏水的NaCl溶液
析出DNA
第四次
搅拌含DNA的高浓度盐溶液
加速DNA的溶解
第五次
搅拌含DNA的酒精溶液
提取含杂质较少的DNA
第六次
搅拌含DNA的白色丝状物的盐溶液
加速DNA的溶解
3.在DNA的粗提取实验过程中，对DNA提取量影响较小的是( )
A.使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，释放出DNA等核物质
B.搅拌时要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动
C.在析出DNA黏稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直至黏稠物不再增多
D.要用冷酒精沉淀DNA，甚至可将混合液再放入冰箱中冷却
答案 B
解析 A项的做法是为了充分释放出核中的DNA分子，使进入滤液中的DNA尽量的多；C项是让DNA充分沉淀，保证DNA的量；D项的道理同C项；而B项的操作并不能使DNA增多或减少。
4.下图所示为DNA的粗提取与鉴定实验的实验步骤，请据图回答下列问题：
(1)请写出①②③④的实验步骤名称
① ；
② ；
③ ；
④ 。
(2)A、B两支试管中， 试管中含有DNA， 试管起对照作用。
答案 (1)①提取细胞核物质 ②析出DNA的黏稠物 ③用冷却的酒精析出DNA ④DNA的鉴定 (2)B A
解析 在解答本题时，一定要先将图中的每一步操作都看清楚，然后根据图中的有关文字提示判断每一步实验操作的名称。
一题多变
(1)步骤②是如何操作的？为什么能将DNA析出？
答案 在滤液中加入2 mol/L 的NaCl溶液，然后再加入蒸馏水，直到黏稠物不再增加为止。能将DNA析出的原因是，DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl溶液浓度的改变而改变，在0.14 mol/L时溶解度最低。
(2)步骤③的实验原理是什么？
答案 步骤③是根据DNA和某些蛋白质在酒精中的溶解度不同而进行操作的，DNA不溶于酒精，但某些蛋白质能溶于酒精，据此可以溶解一些杂质，析出含杂质较少的DNA。
1.蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来。下列药品可达到上述同一目的的是( )
A.蒸馏水 B.NaCl溶液 C.NaOH溶液 D.盐酸
答案 B
解析 蛋白酶是利用酶的专一性将DNA和蛋白质分离，而NaCl溶液则是利用DNA和蛋白质在该溶液中的溶解度不同将其分离。
2.下表有关“DNA粗提取和鉴定”的相关操作中所选取的试剂，不正确的是( )
选项
相关操作
选取的试剂
A
破碎鸡血细胞
蒸馏水
B
溶解核内DNA
2 mol/L NaCl溶液
C
提取杂质较少的DNA
冷却的95%的酒精
D
DNA的鉴定
双缩脲试剂
答案 D
解析 鉴定DNA的试剂是二苯胺，用双缩脲试剂鉴定蛋白质。
3.在DNA的粗提取和鉴定实验中，有两次DNA的沉淀析出，其依据的原理是( )
①DNA在NaCl溶液物质的量浓度为0.14 mol/L时溶解度最低 ②DNA在冷却的体积分数为95%的酒精溶液中能沉淀析出
A.两次都是① B.两次都是②
C.第一次是①，第二次是② D.第一次是②，第二次是①
答案 C
解析 第一次沉淀析出是利用浓NaCl溶液溶解核内DNA之后，加蒸馏水稀释NaCl溶液至物质的量浓度为0.14 mol/L，使DNA溶解度降低而析出；第二次沉淀析出是用冷酒精溶液使DNA凝集并溶解非DNA物质，达到提纯DNA的目的。
4.下列关于“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述中，正确的是( )
A.用鸡血作为材料，原因是鸡血红细胞有细胞核，其他动物红细胞没有细胞核
B.用不同浓度的NaCl溶液进行DNA粗提取，原因是DNA在其中溶解度不同
C.用酒精进行提纯，原因是DNA溶于酒精，蛋白质不溶于酒精
D.用二苯胺试剂进行鉴定，原因是DNA溶液中加入二苯胺试剂即呈蓝色
答案 B
解析 只有哺乳动物的成熟红细胞没有细胞核，A选项错误；DNA不溶于酒精，蛋白质溶于酒精，所以可用冷却的酒精来对DNA进行提纯，C选项错误；DNA溶液中加入二苯胺试剂后要在水浴加热的情况下才能出现蓝色，D选项错误。
5.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验的相关操作。
(1)图中实验材料A可以是 等，研磨前加入的B应该是 。
(2)通过上述所示步骤得到滤液C后，再向滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是 ，再过滤得到滤液D，向滤液D中加入蒸馏水的目的是
。
(3)在“DNA的粗提取与鉴定”实验中，将含有一定杂质的DNA丝状物分别放入体积为2 mL的4种溶液中，经搅拌后过滤，获得如表所示的4种滤液，含DNA最少的是滤液 。
1
研磨液
搅拌后过滤
滤液E
2
2 mol/L NaCl溶液
搅拌后过滤
滤液F
3
0.14 mol/L NaCl溶液
搅拌后过滤
滤液G
4
冷却的95%的酒精溶液
搅拌后过滤
滤液H
(4)DNA鉴定的原理是
。
答案 (1)洋葱(菜花等) 洗涤剂和食盐 (2)使DNA溶解 使DNA(溶解度下降而沉淀)析出 (3)H (4)在沸水浴条件下，DNA与二苯胺反应呈现蓝色
课时作业
[学考达标]
1.向含有DNA的浓度较高的NaCl溶液中加入蒸馏水会使( )
A.DNA的溶解度下降 B.DNA的溶解度上升
C.蛋白质的溶解度下降 D.DNA和蛋白质充分溶解
答案 A
2.在提取DNA的过程中，最好使用塑料试管和烧杯，目的是( )
A.不易破碎 B.减少DNA的损失
C.增加DNA的含量 D.容易刷洗
答案 B
3.下列图示中能正确反映DNA溶解度与NaCl溶液浓度之间关系的是( )
答案 C
解析 在质量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA的溶解度最小。
4.在采用鸡血为材料对DNA进行粗提取的实验中，若需进一步提取含杂质较少的DNA，可以依据的原理是( )
A.在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中DNA的溶解度最小
B.DNA遇二苯胺在沸水浴的条件下会染成蓝色
C.DNA不溶于酒精而细胞中的一些物质易溶于酒精
D.质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液具有抗凝血作用
答案 C
解析 DNA粗提取的原理有：DNA在物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小和DNA不溶于体积分数为95%的冷酒精。进一步提取含杂质较少的DNA时用后者。B项用于DNA鉴定，D项中柠檬酸钠可防止血液凝固。
5.下列与析出DNA黏稠物有关的叙述，不正确的是( )
A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度
B.在操作时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子的完整性
C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出
D.当丝状黏稠物不再增加时，此时NaCl溶液的浓度相当于0.14 mol/L
答案 C
解析 向含有DNA的溶液中加入蒸馏水后，NaCl溶液的浓度会变小，当NaCl溶液的浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最小而析出。
6.DNA的粗提取与鉴定实验的正确操作步骤是( )
A.制备鸡血细胞液→提取细胞核物质→溶解核内的DNA→析出并滤取DNA黏稠物→DNA的再溶解→提取较纯净的DNA→鉴定DNA
B.制备鸡血细胞液→提取细胞核物质→溶解并析出DNA→DNA的再溶解→提取较纯净的DNA→鉴定DNA
C.制备鸡血细胞液→溶解DNA→提取细胞核中的DNA→DNA的再溶解→提取较纯净的DNA→DNA的鉴定
D.制备鸡血细胞的细胞核物质提取液→溶解DNA并析出→提取较纯净的DNA→DNA的鉴定
答案 A
解析 B项漏掉了DNA溶解前要过滤；C项提取细胞核中DNA叙述欠妥，应是提取核物质，并且应放在溶解DNA之前；D项叙述明显有误。
[高考提能]
7.在“DNA的粗提取和鉴定”实验中，甲、乙、丙、丁四个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均正确，但实验结果却不同。下列有关叙述不正确的是( )
组别
实验材料
提取核物质时加入的溶液
去除杂质时加入的溶液
DNA鉴定时加入的试剂
甲
鸡血
蒸馏水
95%的酒精(25 ℃)
二苯胺
乙
菜花
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
双缩脲试剂
丙
猪血
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
丁
鸡血
蒸馏水
95%的酒精(冷却)
二苯胺
A.实验材料选择错误的组别是丙
B.沸水浴后试管中溶液颜色变蓝的组别是甲、丁
C.甲组实验现象差的原因是25 ℃的酒精对DNA的凝集效果差
D.乙组实验不成功仅因为在鉴定时加入了双缩脲试剂
答案 D
解析 菜花细胞有细胞壁，加入蒸馏水不破裂，须加入一定的洗涤剂和食盐并经过研磨。鉴定时要用二苯胺试剂。
8.甲、乙两图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置图。下列相关叙述正确的是( )
A.图甲的烧杯和图乙的试管中所用溶剂都为NaCl溶液，但两者浓度不同
B.图乙试管经稍稍加热后即可观察到一支试管中的溶液明显变蓝，另一支试管中的溶液不变蓝
C.图甲操作需用玻璃棒迅速搅拌以使DNA析出，并缠绕在玻璃棒上
D.图乙操作中所用的二苯胺试剂需现配现用以达到较好的鉴定效果
答案 D
解析 图甲烧杯中为冷却的体积分数为95%的酒精溶液，图乙试管中为NaCl溶液，A错误；图乙试管需要在沸水浴中加热5 min，B错误；图甲用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，C错误；图乙操作中所用的二苯胺试剂最好现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，D正确。
9.在DNA的粗提取与鉴定实验中有三次过滤
(1)过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液
(2)过滤含黏稠物的物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液
(3)过滤溶解有DNA的物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液
以上三次过滤分别为了获得( )
A.含核物质的滤液、纱布上的黏稠物、含DNA的滤液
B.含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、含DNA滤液
C.含核物质的滤液、滤液中DNA黏稠物、纱布上的DNA
D.含较纯DNA滤液、纱布上黏稠物、含DNA滤液
答案 A
解析 过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液应取滤液(其内含DNA)；过滤含黏稠物的物质的量浓度为0.14 mol/L的NaCl溶液应取黏稠物(因其内含析出的DNA)；DNA易溶于物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液，故过滤该溶液时应取滤液(其内溶有DNA)。
10.在DNA粗提取与鉴定实验中，将第三次过滤获得的纱布上含有DNA的黏稠物(含有较多杂质)分别处理如下：
序号
操作过程
①
放入2 mol/L的NaCl溶液，搅拌后过滤
②
再加入0.14 mol/L的NaCl溶液，搅拌后过滤
③
再加入冷却的、同体积的体积分数为95%的酒精溶液，用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物
上述操作过程正确的是( )
A.①② B.①②③ C.①③ D.②③
答案 C
解析 第三次过滤后在纱布上的是粗提取的DNA，此DNA中还含有杂质，因此将其溶于2 mol/L的NaCl溶液中，再进行过滤，以除去不溶于2 mol/L的NaCl溶液的杂质。然后向滤液中加入同体积的、冷却的体积分数为95%的酒精溶液即可析出DNA，然后挑出DNA进行鉴定。
11.实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
试管
序号
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5分钟
沸水浴5分钟
实验现象
实验结论
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？
。
(3)在沸水浴中加热的目的是 ，同时说明DNA对高温有较强的 。
(4)A试管在实验中的作用是 。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与 有关。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(2)溶液颜色基本不变 (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析 A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
12.下图为“DNA的粗提取与鉴定”实验装置：
(1)该实验依据的原理是 。
A.DNA在NaCl溶液中的溶解度随NaCl溶液浓度的不同而不同
B.利用DNA不溶于酒精的性质，可除去细胞中溶于酒精的物质而得到较纯的DNA
C.DNA是大分子有机物，不溶于水而溶于某些有机溶剂
D.在沸水浴中DNA遇二苯胺会出现蓝色反应
(2)在图A所示的实验步骤中加蒸馏水的目的是 。通过图B所示的步骤取得滤液，再在溶液中加入2 mol/L的NaCl溶液的目的是 ；图C所示实验步骤中加蒸馏水的目的是 。
(3)鉴定DNA的方法是，向溶有DNA丝状物的试管中加入 试剂，混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，冷却后可观察到溶液呈 ；也可取少许DNA丝状物置于载玻片上，滴一滴 溶液，片刻后用水冲洗，可见丝状物被染成 。
答案 (1)ABD (2)使血细胞破裂 使滤液中的DNA溶于浓盐溶液 降低盐溶液的浓度，使DNA析出 (3)二苯胺 蓝色 甲基绿 绿色
解析 (1)本实验依据的原理是A、B、D三个方面。(2)图A、B、C所示为本实验的三个关键步骤。图A通过添加蒸馏水，血细胞与蒸馏水相混合而使血细胞处于极度低渗的环境之中，细胞因大量吸水而导致最终破裂，并释放出胞内物。图B通过纱布过滤使血细胞释放出的DNA滤入收集的滤液中(将大量胶状物滤出)，再在滤液中加入2 mol/L的NaCl溶液使DNA溶解。图C在DNA浓盐溶液中加入蒸馏水(大量)，可使溶液的NaCl浓度降至较低，由于DNA在较低浓度的NaCl溶液中溶解度很低(在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低)，浓度再变小则DNA溶解度将增大，使DNA低渗析出，经过滤等手段可以收集到DNA。
13.某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动，具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的花菜、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃、另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
DNA粗提取：
第一步：将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步：先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地向一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步：取6支试管，分别加入等量的物质的量浓度为2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水浴中加热5 min，待试管冷却后比较溶液的颜色深浅，结果如下表：
材料保存温度
花菜
辣椒
蒜黄
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题名称是
。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少 。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：
。
②针对结论1，请提出合理的解释：
。
(4)氯仿密度大于水，能使蛋白质变性沉淀，与水和DNA均不相溶，且对DNA影响极小。为了进一步提高粗提取时DNA的纯度，依据氯仿的特性，在第三步的基础上继续操作的步骤是：
，
然后用体积分数为95%的冷酒精溶液使DNA析出。
答案 (1)探究不同实验材料和不同保存温度对DNA提取量的影响 (2)DNA断裂 (3)①等质量的3种实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多，从辣椒中提取的DNA最少(或等量的不同实验材料，在同一温度下DNA提取量不同) ②低温抑制了相关酶的活性，使DNA降解速度变慢 (4)将第三步获得的溶液与等量的氯仿充分混合，静置一段时间，吸取上清液
解析 (1)题目给出了多种实验材料，而且探究了不同保存温度对DNA提取量的不同影响，因此该实验名称可为“探究不同实验材料和不同保存温度对DNA提取量的影响”。(2)在提取DNA时，玻璃棒沿一个方向缓慢搅拌，是为了有效提取DNA，防止DNA分子断裂。(3)①由表格可知，花菜、辣椒、蒜黄三种不同的实验材料在20 ℃时，DNA提取量表现为蒜黄多于花菜，花菜多于辣椒，在－20 ℃时结果相同，等质量的3种实验材料，在同一温度下DNA提取量不同；②低温下DNA水解酶的活性减弱，导致DNA降解速度慢，从而使DNA提取量相对较高。(4)由于氯仿可使蛋白质变性沉淀，而DNA易溶解于其中，对DNA结构无影响，因此可将第三步获得的滤液与等量氯仿混合，静置一段时间，蛋白质变性沉淀，而DNA溶解于上清液中，从而可吸取上清液，从上清液中提取DNA。
[真题体验]
14.(2015·江苏，25)图1、2分别为“DNA的粗提取与鉴定”实验中部分操作步骤示意图，下列叙述正确的是(多选)( )
A.图1、2中加入蒸馏水稀释的目的相同
B.图1中完成过滤之后保留滤液
C.图2中完成过滤之后弃去滤液
D.在图1鸡血细胞液中加入少许嫩肉粉有助于去除杂质
答案 BCD
解析 图1、2中加入蒸馏水稀释的目的分别是破碎细胞获取含DNA的滤液、稀释NaCl溶液析出DNA，故A项错误；图1过滤之后保留滤液，因为滤液中含有DNA，故B项正确；图2过滤之后弃去滤液，因为DNA已析出，故C项正确；嫩肉粉中的蛋白酶可对蛋白质进行水解，故D项正确。
15.(2014·江苏，16)下列关于“DNA 的粗提取与鉴定”实验叙述，错误的是( )
A.酵母和菜花均可作为提取DNA的材料
B.DNA既溶于2 mol/L NaCl溶液也溶于蒸馏水
C.向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，可见玻棒上有白色絮状物
D.DNA溶液加入二苯胺试剂沸水浴加热，冷却后变蓝
答案 C
解析 A项，原则上含DNA的生物材料都可作为提取DNA的材料，只是DNA含量高的材料成功的可能性更大。B项，DNA在2 mol/L的NaCl溶液和蒸馏水中溶解度都较大。C项，向鸡血细胞液中加蒸馏水搅拌，鸡血细胞会吸水破裂，玻棒搅拌会加快血细胞的破裂，但在蒸馏水中不会析出DNA。D项，DNA溶液加入二苯胺试剂后需沸水浴加热，待冷却后变蓝色。
第14课时 多聚酶链式反应扩增DNA片段
[学习导航] 1.阅读教材P58“(一)”，分析PCR技术与DNA复制的区别和联系，掌握PCR技术原理。2.阅读教材P59“(二)”，分析PCR的过程，掌握PCR循环的原理。3.阅读教材P62“实验操作及操作提示”，掌握PCR技术的实验操作过程及注意事项。4.阅读教材P62～63“结果分析与评价”，掌握DNA含量测定的方法。
[重难点击] 1.了解PCR技术的基本操作。2.理解PCR的原理。3.讨论PCR的应用。
一、PCR原理与反应过程
1.PCR原理与条件
(1)PCR的概念
PCR即多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)细胞内DNA复制的基本条件
参与的组分
在DNA复制中的作用
解旋酶
打开DNA双链
DNA母链
提供DNA复制的模板
4种脱氧核苷酸
合成子链的原料
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸
(3)PCR原理
①DNA变性：在80～100 ℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。
②DNA复性：当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。
③子链的合成：DNA聚合酶从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(4)PCR条件
①原料：4种脱氧核苷酸。
②模板：加热变性解旋后的两条DNA母链。
③酶：耐热的DNA聚合酶。
④引物：使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
⑤其他条件：需要稳定的缓冲溶液和能自动调节温度的温控设备等。
2.PCR过程与结果
(1)PCR过程
过程
温度
主要变化
变性
90 ℃以上
双链DNA解聚为单链
复性
50 ℃左右
两种引物通过碱基互补配对分别与两条单链DNA结合
延伸
72 ℃左右
溶液中的四种脱氧核苷酸(A，T，G，C)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链
(2)PCR的结果
DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。
1.PCR原理
PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。
答案 不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。
2.PCR反应过程
(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？
答案 PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。
(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。
答案 每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。
(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？
答案 DNA的羟基(—OH)末端为3′端；磷酸基团的末端为5′端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
归纳总结 PCR扩增与DNA复制的异同
项目
DNA复制
PCR扩增
不
同
点
时期
有丝分裂间期或减Ⅰ前的间期
任何时期
场所
活细胞内
细胞外
酶
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的Taq DNA聚合酶
引物
有转录，产生RNA作引物，无需人工加入
无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物
特点
边解旋边复制
先全部解旋后开始复制
缓冲液
不需缓冲液
配制缓冲液代替细胞核液
设备
无
控制温度变化的温控设备
相
同
点
原理
严格遵循碱基互补配对原则
引物
都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
模板
DNA的两条链为模板
特点
半保留复制
原料
游离的四种脱氧核苷酸
1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是( )
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.PCR扩增的对象是氨基酸序列
答案 C
解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物。DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链。引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。
2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。
(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶。该酶是从 中分离的。
(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。
(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。
(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。
答案 (1)DNA的热变性原理 (2)水生耐热细菌Taq (3)耐高温 (4)一定的缓冲溶液 温度 (5)2 作为DNA复制的起点
解析 (1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。(4)PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。(5)PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。
一题多变
细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？
答案 需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。
易错提醒 与PCR原理有关的三个易错点
(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。
二、PCR的实验操作
1.实验用具
名称
作用
PCR仪
自动调控温度，实现DNA的扩增
微量离心管
实际上是进行PCR反应的场所
微量移液器
用于向微量离心管中转移PCR配方中的液体，每吸取一种试剂后，其上的枪头都必须更换
2.实验步骤
准备：按照PCR反应需要的物质和条件，将需要的试剂和仪器准备好
↓
移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各试剂
↓
混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻弹击管的侧壁，使反应液混合均匀
↓
离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，使反应液集中在离心管底部
↓
反应：将离心管放入PCR仪中进行反应
3.DNA含量的测定
(1)测定原理：DNA在260 nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA含量有关。
(2)计算方法：DNA含量(μg/mL)＝50×(260 nm的读数)×稀释倍数。
1.实验过程分析
(1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？
答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。
(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？
答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。
(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？
答案 为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
2.结果检测
(1)实验中为什么要测定DNA的含量？
答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。
(2)如何判断DNA扩增成功？
答案 ①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？
答案 样品产物少，或产生新的DNA。
3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为( )
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分 ③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④ D.④②⑤③①
答案 C
解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)―→移液―→混合―→离心―→反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。
4.近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至55 ℃时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。
(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则靠 来维持。
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。
问题导析 (1)解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的热变性原理，细胞内是在解旋酶的作用下解旋。
(2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有2个。
答案 (1)氢 解旋 解旋 (2)两 3′ 从子链的5′端向3′端延伸 (3)温度 酸碱度 PCR仪 缓冲液 (4)1/8
解析 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(95 ℃)、复性(55 ℃)、延伸(72 ℃)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。
1.PCR利用了DNA的哪种特性来控制DNA的解聚与结合( )
A.特异性 B.稳定性 C.热变性 D.多样性
答案 C
2.符合PCR反应条件的一项是( )
①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③合成引物 ④四种脱氧核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥DNA解旋酶 ⑦限制酶 ⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥ B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑦⑧ D.①②③④⑤⑧
答案 D
解析 PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制酶)。
3.下列关于PCR的描述中，正确的是( )
①PCR是一种酶促反应 ②引物决定了扩增的特异性 ③扩增DNA利用了热变性的原理 ④扩增的对象是氨基酸序列
A.①②④ B.②③④ C.①③④ D.①②③
答案 D
解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3′端连接脱氧核苷酸。
4.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物( )
A.第一次循环 B.第二次循环
C.第三次循环 D.第四次循环
答案 A
解析 在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。
5.多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题：
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。
(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到 ，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。
(3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有 个这样的DNA片段。
(4)简述PCR技术的主要应用： (要求至少答两项)。
答案 (1)磷酸基团 3′端 (2)耐高温的Taq DNA聚合酶 选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32 (4)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等
解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3′端，含磷酸基团的是5′端。引物的5′端与模板链的3′端结合，然后沿着引物的3′端延伸。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。
课时作业
[学考达标]
1.PCR技术扩增DNA，需要的条件是( )
①目的基因 ②引物 ③四种脱氧核苷酸 ④DNA聚合酶等 ⑤mRNA ⑥核糖体
A.②③④⑤ B.①②③⑥
C.①②③④ D.①③④⑤
答案 C
解析 PCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料，以及一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备。
2.下列有关PCR反应的叙述，正确的是( )
A.PCR反应所需要的引物只是RNA
B.PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸
C.PCR反应所需要的酶在60 ℃会变性
D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行
答案 D
解析 PCR反应需要的引物一般是DNA，反应所需要的材料是脱氧核苷酸，PCR所需要的酶是耐高温的，在60 ℃不会变性。
3.下列各项属于引物作用的是( )
A.打开DNA双链
B.催化合成DNA子链
C.使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制
D.提供模板
答案 C
解析 DNA分子的复制具有方向性，即只能从子链的5′端→3′端方向进行复制。当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。
4.PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时( )
A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D.无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链
答案 B
解析 当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。
5.PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是( )
①95 ℃，使DNA分子变性，磷酸二酯键断开 ②95 ℃，使DNA分子变性，解开螺旋 ③55 ℃时，使DNA分子开始复制、延伸 ④55 ℃时，引物与DNA单链结合 ⑤72 ℃时，使DNA分子开始复制、延伸 ⑥72 ℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
A.①③⑤ B.②③⑤ C.②④⑤ D.②④⑥
答案 C
解析 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。当温度上升至95 ℃时，DNA分子变性，解开双螺旋结构；温度下降到55 ℃时，引物与DNA单链结合，恢复活性；温度上升至72 ℃时，DNA分子开始复制、延伸，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
6.下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是( )
A.在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现
B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的
C.延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D.PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
答案 C
解析 变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与 DNA模板链结合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚合酶。
[高考提能]
7.有关下列操作过程的叙述，错误的是( )
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C项错误。
8.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如下图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )
A.8 B.6 C.4 D.2
答案 A
解析 由图分析可知：X基因第一次复制得到两个两种DNA分子：①和②；X基因第二次复制得到四个四种DNA分子：①复制得①和③、②复制得②和④；X基因第三次复制得到八个五种DNA分子：①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到16个五种DNA分子：①复制得①和③、②复制得②和④、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤得到4个⑤。从上面的推测可知，第四轮循环产物中有8个⑤。
9.在PCR扩增DNA的实验中，预计一个DNA分子经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么出现该现象的原因不可能是( )
A.Taq DNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制
B.系统设计欠妥
C.循环次数不够
D.引物不能与母链结合
答案 D
解析 如果Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少，A项正确。如果PCR系统设计欠妥，则达不到预期的结果，B项正确。如果循环次数过少，产物的量比预期的少，C项正确。如果引物设计不合理，若不能与模板DNA结合，将造成无法进行扩增，而结果得到了210个DNA分子，D项错误。
10.有关PCR技术的说法，下列叙述不正确的是( )
A.多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术
B.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸
答案 C
解析 PCR是多聚酶链式反应的英文缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板(母链)、酶、原料、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步。
11.PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答下面的问题。
(1)A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的原理叙述正确的是 。
A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键
C.该过程不需要解旋酶的作用
D.该过程与人体细胞的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是耐高温的 。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以 加入， (填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有： 。
(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“95 ℃－55 ℃－72 ℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占 。
答案 (1)C (2)DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸，通过控制温度和酸碱度使DNA复制在体外反复进行 (3)25%
解析 (1)高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。(2)C过程中PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。这种DNA聚合酶在高温下不变性，所以一次性加入即可。(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过三次循环，共产生8个DNA分子，其中有2个DNA分子含有15N标记。
12.PCR是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个。PCR需要模板DNA、引物、脱氧核苷酸和DNA聚合酶等条件。下图为模板DNA分子及2种引物，请据图回答相关问题：
(1)PCR的全称是 。PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度环境的不同，在PCR技术中先用95 ℃高温处理的目的是 ，而这一过程在细胞内是通过 实现的。
(2)在PCR技术中所需要的引物通常为一段单链DNA。请在图中绘出引物结合的位置。
(3)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入 个引物。
(4)DNA子链复制的方向是 ，这是由于 。
答案 (1)多聚酶链式反应 使DNA变性(使DNA的两条链解开) 解旋酶的催化
(2)如图所示
(3)211－2
(4)从5′端到3′端 DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接单个脱氧核苷酸分子
解析 PCR技术又称多聚酶链式反应。在PCR技术中，用95 ℃高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂，使两条链解开，即使DNA分子变性。引物通常是一种单链DNA，它能与解开的DNA母链的3′端结合，为DNA聚合酶提供吸附位点，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是从5′端到3′端。在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，即2×210－2＝211－2 (个)。
13.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，此过程需要一种Taq DNA聚合酶。
请回答有关问题：
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术 来实现。
(2)Taq DNA聚合酶是从热泉中的Taq细菌中分离出来的。
①为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？
。
②Taq DNA聚合酶的功能是 。
(3)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。
(4)PCR反应中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。
答案 (1)通过高温使DNA分子发生解旋
(2)①热泉70 ℃～80 ℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物 ②催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
(3)一定的缓冲溶液 温度
(4)2 作为DNA复制的起点
解析 (1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋。(2)①利用Taq细菌特有的特性与其他细菌区分开来，Taq细菌具有耐高温的特性，放在高温环境下，其他绝大多数细菌死亡，而Taq细菌得以保留。②在DNA分子复制中，Taq DNA聚合酶将一个脱氧核苷酸的脱氧核糖和另一个脱氧核苷酸的磷酸连接形成磷酸二酯键。(3)PCR反应是在一定的缓冲溶液中进行的，并需严格控制好温度条件。(4)PCR反应与体内DNA复制过程中的原料是完全相同的，并加入2种引物，引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。
[真题体验]
14.(2013·江苏，22)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)( )
A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
答案 BD
解析 设计扩增目的基因的引物时，要考虑扩增的目的基因与载体两端序列碱基互补配对，A错误。DNA复制沿着模板进行，不必知道基因的全部序列，B正确。PCR技术中的DNA聚合酶是耐高温的DNA聚合酶，不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶，C错误。目的基因编码产物不同，相应的受体细胞不同，D正确。
15.(2011·江苏，33节选)请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。
图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为 。
②在第 轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组： ；
②第2组： 。
(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为 。
答案 (1)①15/16 ②三
(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
解析 (1)①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。②在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)某同学设计的两组引物都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。
第15课时 血红蛋白的提取和分离
[学习导航] 1.通过阅读教材P64“基础知识”，掌握蛋白质分离的方法凝胶色谱法的原理、缓冲液的制备及作用和蛋白质纯度鉴定的方法电泳法的原理。2.分析教材P66“实验操作”，掌握蛋白质提取和分离的过程。3.阅读教材P69“操作提示”，掌握蛋白质分离过程中需注意的问题。
[重难点击] 1.尝试提取和分离血液中的血红蛋白，体验提取生物大分子的基本过程和方法。2.了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子方法的基本原理。
一、蛋白质的分离技术
1.蛋白质的分离依据
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。
2.凝胶色谱法
(1)概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
(2)凝胶的特点
(3)常用凝胶：葡萄糖或琼脂糖。
(4)分离原理
①相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，通过凝胶的时间较长。
②相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快，通过凝胶的时间较短。
3.缓冲溶液
(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。
(3)意义：为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，保持体外溶液的pH与体内环境中的pH基本一致。
4.电泳
(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理
①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
(3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1.凝胶色谱法
(1)结合上图，根据凝胶色谱法的分离原理，填表分析不同大小的分子洗脱后的次序。
相对分子质量大
相对分子质量小
直径大小
较大
较小
运动方式
垂直向下运动
无规则的扩散运动
运动路程
较短
较长
运动速度
较快
较慢
洗脱次序
先流出
后流出
(2)结合上图，分析为什么相对分子质量较大的蛋白质会先从色谱柱中洗脱出来？
答案 相对分子质量较小的蛋白质由于扩散作用进入凝胶颗粒内部，而被滞留；相对分子质量较大的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在颗粒之间迅速通过。
(3)凝胶色谱法分离蛋白质时通过一次洗脱能否将所需蛋白质与其他杂质彻底分离？
答案 不能。相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，移动距离较近，移动速度较快，先洗脱出来；但相对分子质量较小的蛋白质可能进入凝胶颗粒内部，也可能不进入，导致部分相对分子质量较小的蛋白质可能与相对分子质量较大的蛋白质一起洗脱出来。
2.电泳
(1)从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？
答案 各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。
(2)SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？
答案 否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS它所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。
归纳总结 琼脂糖凝胶电泳和SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的两点区别
(1(分离原理不同
①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。
②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。
(2(用途不同
①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。
②SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。
1.凝胶色谱法分离蛋白质时由色谱柱下端最先流出的是( )
A.相对分子质量较小的蛋白质
B.相对分子质量较大的蛋白质
C.凝胶颗粒
D.葡萄糖或琼脂糖分子
答案 B
解析 凝胶色谱法分离蛋白质的原理是依据蛋白质分子相对分子质量的大小，相对分子质量大的分子不能进入凝胶内部的通道，路程较短，移动速度快，先洗脱出来；相对分子质量小的分子能够进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度慢，后洗脱出来，因此最先流出的应是相对分子质量较大的蛋白质，而凝胶颗粒是不能流出的。
2.有关凝胶色谱法和电泳法的说法，正确的是( )
A.它们都是分离蛋白质的重要方法
B.它们的原理相同
C.使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要
D.以上说法都正确
答案 A
解析 不同蛋白质的相对分子质量不同，因此凝胶色谱法可以根据相对分子质量的大小分离蛋白质；电泳法中带电分子迁移速度不仅与分子大小有关，也与分子所带的电荷有关，所以A正确；B错误；这两种方法都用到缓冲溶液，以调节溶液的酸碱度，所以C错误。
二、实验操作和操作提示
1.样品处理
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除杂蛋白。
②方法：低速短时间离心。
③标准：直至上清液不再呈现黄色。
(2)血红蛋白的释放
红细胞到原血液的体积磁力搅拌器上搅拌血红蛋白释放。
(3)分离血红蛋白溶液
①方法：混合液分层。
②分层结果(自上而下)：
第1层：无色透明的甲苯层。
第2层：脂溶性物质的沉淀层——白色薄层固体。
第3层：血红蛋白的水溶液——红色透明液体。
第4层：其他杂质的暗红色沉淀物。
③结果处理：将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。
2.透析——粗分离
(1)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。
(2)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。
(3)目的：去除样品中相对分子质量较小的杂质。
3.凝胶色谱操作——纯化
(1)凝胶色谱柱的制作
↓
(2)凝胶色谱柱的装填：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入
凝胶色谱柱内
↓
(3)样品的加入
↓
(4)洗脱：关闭下端出口，加入磷酸缓冲液，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱
4.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳——纯度鉴定
判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定方法中，使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5.操作提示
(1)红细胞的洗涤：洗涤次数、离心速度与离心时间十分重要。洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白；离心速度过高和时间过长会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。
(2)色谱柱填料的处理：商品凝胶使用前需直接放在洗脱液中膨胀，可以将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，加速膨胀。
(3)凝胶色谱柱的装填：在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
(4)蛋白质的分离：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。
1.实验操作过程
(1)材料的选择：与其他真核细胞相比，哺乳动物成熟红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？
答案 ①哺乳动物成熟红细胞内没有细胞核和各种复杂细胞器，排除了其他物质对实验结果的干扰。②血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。
(2)洗涤红细胞的目的是什么？你如何知道红细胞已洗涤干净？
答案 洗涤的目的是去除血浆蛋白；离心后的上清液不再呈现黄色，证明红细胞已洗涤干净。
(3)在血红蛋白释放过程中，蒸馏水和甲苯的作用分别是什么？
答案 ①蒸馏水可以使红细胞吸水涨破，释放细胞内的血红蛋白；②甲苯是有机溶剂，可以溶解细胞膜，有助于血红蛋白的释放。
(4)血红蛋白释放后的混合液经离心后分为哪几层？如何获得血红蛋白溶液？
答案 ①分为4层：从上往下数，第1层为无色透明的有机溶剂(甲苯)，第2层为白色的脂类物质，第3层为红色透明的血红蛋白溶液，第4层为暗红色的红细胞破碎物沉淀。
②分层的液体→过滤除去脂溶性沉淀层→分液得下层的血红蛋白溶液。
(5)将收集的血红蛋白溶液放在透析袋中进行透析，透析的目的是什么？
答案 血红蛋白是大分子物质，不能透过透析袋，这样可以去除相对分子质量较小的杂质。
2.凝胶色谱操作
(1)在制作凝胶色谱柱时，凝胶色谱柱的高度不足或直径过大对洗脱效果分别有何影响？
答案 ①凝胶色谱柱的高度是样品随缓冲溶液流过的距离，凝胶色谱柱的高度不足会导致达不到分离效果；
②凝胶色谱柱的直径大小并不影响分离效果，但直径过大会导致洗脱液体积大，样品稀释度大，使实验现象不明显。
(2)试从凝胶色谱的分离原理分析，凝胶的装填为什么要紧密、均匀？
答案 如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的洗脱次序，影响分离的效果。
(3)在装填凝胶柱时，如果有气泡存在，会对蛋白质的分离有何影响？
答案 气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。
归纳总结 血红蛋白的提取和分离各操作的主要目的
操作
目的
红细胞的洗涤
去除杂蛋白，如血浆蛋白
血红蛋白的释放
使红细胞破裂，释放血红蛋白
分离血红蛋白溶液
经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开
透析
除去样品中相对分子质量较小的杂质
纯化
除去相对分子质量较大的杂质蛋白质
3.下列关于凝胶色谱法分离血红蛋白实验中样品的加入和洗脱的叙述中，不正确的是( )
A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B.用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
C.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
D.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口
答案 A
解析 加样前，应打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口，而不应使缓冲液下降到凝胶面的下面，A项不正确。加样时不要破坏凝胶面，B项正确。加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，C项正确。等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口，再加缓冲液，D项正确。
4.下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题：
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能。
(2)甲装置用于 ，目的是去除样品中 的杂质，图中A是 。B是 溶液。
(3)用乙装置分离蛋白质的方法叫 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。
(4)乙装置中，C是 ，其作用是 。
(5)用乙装置分离血红蛋白时，待 时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集6管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管②和试管⑤中蛋白质含量最高，则试管⑤中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白 (填“大”或“小”)。
答案 (1)运输 (2)透析(粗分离) 相对分子质量较小 磷酸缓冲液 血红蛋白 (3)凝胶色谱法 相对分子质量的大小 (4)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 (5)红色的蛋白质接近色谱柱底端 小
解析 (1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。(2)甲装置为透析装置，目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。其中A是磷酸缓冲液，B是血红蛋白溶液。(3)乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。(4)乙装置中，C溶液为磷酸缓冲液，作用是洗脱血红蛋白。(5)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。最先收集到的蛋白质是血红蛋白分子，则试管②内的大量蛋白质为血红蛋白。由于试管⑤晚于试管②收集得到， 因此其内收集到的蛋白质比血红蛋白分子移动速度慢，其相对分子质量比血红蛋白小。
规律方法 凝胶色谱法分离蛋白质中确定收集蛋白质时间的方法
(1)血红蛋白的收集：利用血红蛋白的颜色，当红色的蛋白质接近色谱柱底端时，就要收集流出液。
(2)其他无色蛋白质的收集：可以在实验时加入指示剂以掌握样品的移动位置，确定最佳的收集时机。
1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量大的蛋白质( )
A.路程较长，移动速度较慢 B.路程较长，移动速度较快
C.路程较短，移动速度较慢 D.路程较短，移动速度较快
答案 D
解析 凝胶颗粒内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
2.下列各项中不属于电泳使样品中各分子分离的原因的是( )
A.分子带电性质的差异 B.分子的大小
C.分子的形状 D.分子的变性温度
答案 D
解析 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程，样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。
3.下列有关提取和分离血红蛋白的程序，叙述错误的是( )
A.样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液
B.通过透析可以去除样品中相对分子质量较大的杂质，此为样品的粗分离
C.可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化
D.可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度
答案 B
解析 首先通过红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品的处理；再经过透析去除相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化；最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，由此可知B的叙述错误。由玻璃纸制成的透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。
4.下图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：
(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是 。
(2)图甲表示 过程，该操作目的是去除样品中 的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以 (写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：
。
(3)观察图乙，往色谱柱中加样的正确操作顺序是 (用序号表示)。在进行④操作前，应该等样品 ，且要 (填“打开”或“关闭”)下端出口。
(4)图丙表示电泳法分离蛋白质的结果，不同蛋白质得以分离是因为
。
答案 (1)防止红细胞吸水破裂 (2)透析(粗分离) 相对分子质量较小 增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液) 出现紫色；双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血清蛋白反应，生成紫色物质 (3)②③④① 完全进入凝胶层 关闭 (4)不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同
解析 (1)生理盐水与红细胞内液为等渗溶液，故用其洗涤红细胞主要是防止红细胞吸水涨裂。(2)图甲表示血红蛋白粗提取过程，也为透析过程。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质；若要尽快达到理想的透析实验效果，则可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法。透析袋是一种半透膜，双缩脲试剂可以透过这种半透膜，进入袋内与血清蛋白反应，生成紫色物质。
(3)根据教材中往色谱柱中加样的顺序可知，正确的排序为②③④①；图中进行④操作是在样品上部添加缓冲液，在添加缓冲液之前，应该等样品完全进入凝胶层之后，并要关闭下端出口。(4)电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
课时作业
[学考达标]
1.凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须( )
A.具有相同的相对分子质量
B.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子
C.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子
D.具有不同的相对分子质量
答案 C
解析 若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。
2.将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是( )
A.血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层
B.甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层
C.脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层
D.甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层
答案 D
解析 混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。
3.使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为图中( )
答案 B
解析 相对分子质量较大的蛋白质留在颗粒外面，相对分子质量较小的蛋白质进入颗粒内部；相对分子质量大的通过凝胶间隙先被洗脱，相对分子质量小的进入凝胶内部而后被洗脱。
4.下面说法不正确的是( )
A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内
答案 D
解析 透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质。
5.蛋白质的提取和分离分为哪几步，依次是( )
A.样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
B.样品处理、凝胶色谱操作、纯化
C.样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定
D.样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
答案 C
解析 蛋白质的提取和分离的程序分为：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A项描述的是实验操作过程中的技术。
6.在血红蛋白分离过程中，使用缓冲液的作用是( )
A.维持溶液浓度不变
B.维持溶液酸碱度不变
C.催化蛋白质分离过程顺利完成
D.无实际意义
答案 B
解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。
[高考提能]
7.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示。下列叙述正确的是( )
A.将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内
B.若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快
C.将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中
D.若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近
答案 C
解析 透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则乙、丁、丙均已沉淀；用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率取决于分子大小。
8.对在凝胶柱上加入样品和洗脱的操作，不正确的是( )
A.加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
B.让吸管管口沿管壁环绕移动，贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面
C.打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液，洗脱瓶开始洗脱
D.待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液
答案 C
解析 打开下端出口，待样品完全进入凝胶床内，关闭下端出口，再用同样的方法小心加入适量的20 mmol/L的磷酸缓冲液，然后连接缓冲液，洗脱瓶开始洗脱。
9.凝胶柱制作的顺序一般是( )
①橡皮塞打孔 ②挖凹穴 ③装玻璃管 ④盖尼龙网 ⑤盖尼龙纱 ⑥将橡皮塞插入玻璃管 ⑦接尼龙管、装螺旋夹 ⑧柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞
A.①③④⑤⑥⑧⑦② B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.①②③④⑥⑤⑧⑦ D.①②③⑦⑥⑤⑧④
答案 B
解析 凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管→选择合适的橡皮塞→打孔→挖凹穴→盖尼龙网→盖尼龙纱→将橡皮塞插到玻璃管→接尼龙管→装螺旋夹→柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞。
10.下列关于蛋白质提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是( )
A.红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心
B.血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌
C.分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心，过滤后，用分液漏斗分离
D.透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h
答案 C
解析 红细胞洗涤步骤中应加入生理盐水而不是蒸馏水；血红蛋白释放中加入蒸馏水；透析时缓冲液pH应为7.0而不是4.0。
11.凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很好的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是
。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是
。
(4)若选用Sephadex G—100，则“G”表示 ，100表示 。
答案 (1)a a相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快 (2)尼龙网和尼龙纱
(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
(4)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 凝胶得水值
解析 用凝胶色谱法分离各种物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一个凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而落后于大分子物质洗脱速度。在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。一是在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。二是凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
12.某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下：
→→→
请回答下列有关问题：
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用 反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是 。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是 ，若要尽快达到理想的透析效果，可以 (写出一种方法)。
(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的 等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有 种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是
。
答案 (1)生理盐水 渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破)
(2)除去小分子杂质 增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液)
(3)带电性质以及分子大小、形状
(4)2 携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质
解析 (1)洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水，根据渗透作用原理，将红细胞置于低渗溶液中，红细胞会吸水涨破，释放出血红蛋白。(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去样品中的小分子杂质；可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法缩短透析时间，能尽快达到理想的透析效果。(3)由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异，在电泳过程中产生了不同的迁移速度，实现各种分子的分离。(4)根据图示可知，镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白，原因是携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，分别控制合成两种不同的蛋白质。
13.血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。
(1)将实验流程补充完整：A为 ，B为 。凝胶色谱法是根据 而达到蛋白质分离的有效方法。
(2)洗涤红细胞的目的是去除 ，洗涤次数过少，无法除去 ；离心速度过高和时间过长会使 一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是 。释放血红蛋白的过程中起作用的是
。
(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是 。
如果红色区带 ，说明色谱柱制作成功。
答案 (1)血红蛋白的释放 样品的加入和洗脱 相对分子质量的大小 (2)杂蛋白(血浆蛋白) 血浆蛋白 白细胞和淋巴细胞 离心后的上清液中没有黄色 蒸馏水和甲苯 (3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致 均匀一致地移动
解析 凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质分离与提取过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术，需要注意。
[真题体验]
14.(2011·广东，5)以下关于猪血红蛋白提纯的描述中，不正确的是( )
A.洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂
B.猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少
C.血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
D.在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢
答案 D
解析 生理盐水和红细胞内的溶液为等渗溶液，A正确；各种细胞器和细胞核中都含有蛋白质，所以不含有细胞器和细胞核的红细胞内，蛋白质种类较少，提纯时杂蛋白较少，B正确；血红蛋白有颜色，所以在凝胶色谱法分离过程中易分辨，可用于监测，C正确；凝胶色谱法分离蛋白质，分子量较小的易进入凝胶内部，移动速度比较慢，故血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动快，D错误。
专题6 植物有效成分的提取
知识系统构建
必背要语
1.植物芳香油具有很强的挥发性，主要包括萜类化合物及其衍生物。植物芳香油的提取方法有蒸馏、压榨和萃取等。
2.玫瑰精油的提取一般用水蒸气蒸馏法。其流程是：鲜玫瑰花＋清水(1∶4)→水蒸气蒸馏→油水混合物分离油层除水玫瑰油。
3.橘皮精油的提取一般用压榨法。其流程是：石灰水浸泡→漂洗→压榨→过滤→静置→再次过滤→橘皮油。
4.胡萝卜素不溶于水，易溶于石油醚等有机溶剂，可用萃取法提取。
5.胡萝卜素有α、β、γ三类，其中β－胡萝卜素是最主要的组成成分。
6.提取胡萝卜素的流程：胡萝卜→粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩→胡萝卜素。
7.萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件对萃取的效率也有影响。
8.萃取过程要避免明火加热，应采用水浴加热。
9.对提取的胡萝卜素可通过纸层析进行鉴定。
规律方法整合
整合一 几种物质的提取方法、原理及步骤
不同物质的提取是根据其理化性质的不同来进行的，因此在提取物质时，应先确定该物质的理化性质，然后再选择适宜的提取方法进行提取。
提取物质
提取方法
提取原理
步骤
DNA
盐析法
①在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同
②不溶于酒精，但某些蛋白质则溶于酒精
①溶解在物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中
②加水稀释至物质的量浓度为0.14 mol/L NaCl溶液，使DNA析出，过滤
③加入冷却酒精析出
血红蛋白
凝胶色
谱法、
电泳法
①根据相对分子质量的大小
②各种分子带电性质差异
样品处理→粗提取→纯化→纯度鉴定
玫瑰精油
水蒸气
蒸馏法
利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来
水蒸气蒸馏→分离油层→除水过滤
橘皮精油
压榨法
通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油
石灰水浸泡、漂洗→压榨、过滤、静置→再次过滤
胡萝卜素
萃取法
使提取物溶解在有机溶剂中，蒸发后得到提取物
粉碎、干燥→萃取、过滤→浓缩
例1 下列关于用萃取法来提取芳香油的理解，不正确的是( )
A.用萃取法来提取芳香油，要求原料尽可能细小
B.用萃取法提取的芳香油要易溶于有机溶剂
C.在浸泡植物材料时，要选用低沸点的有机溶剂
D.芳香油充分溶解在有机溶剂后，再把芳香油蒸发出来后剩余有机溶剂，从而使芳香油和有机溶剂分离
答案 D
解析 用萃取法来提取芳香油时，芳香油充分溶解在有机溶剂后，再把有机溶剂蒸发出来，剩余芳香油。
整合二 玫瑰精油和橘皮精油的提取方法比较
项目
化学性质
提取方法
提取原理
玫瑰精油
稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，能同水蒸气一同蒸馏
水蒸气蒸馏法
利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层
橘皮精油
无色透明，主要化学成分是柠檬烯
压榨法
橘皮精油有效成分在用水蒸气蒸馏时会发生部分水解，同时又会导致原料焦糊，故一般采用压榨法
例2 芳香油的提取方法主要分为三种：蒸馏法、萃取法和压榨法。以下关于提取方法的选取认识中，错误的是( )
A.水蒸气蒸馏法适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
B.压榨法适用于柑橘、柠檬等易焦糊原料的提取
C.若植物有效成分易水解，应采用水蒸气蒸馏法
D.提取玫瑰精油和橘皮精油的实验流程中共有的操作是分液
答案 C
整合三 比较水蒸气蒸馏法与萃取提取装置及用途
比较
水蒸气蒸馏装置
有机溶剂萃取装置
装置图示
用途
用于水蒸气蒸馏法提取“易挥发”且难溶于水的植物芳香油
用于易溶于有机溶剂、且不适于水蒸气蒸馏的原料中的有效成分的提取
有效成分位置
存在于右侧接收瓶中
存在于烧瓶内有机溶剂中
例3 下图是玫瑰油提取的水蒸气蒸馏装置图和胡萝卜素提取的装置图，请据图分析，并比较回答下面有关问题：
(1)从装置上看，A装置多了 、连接管、 ；B装置增加了 ，目的是 。
(2)A装置中提取物最后存在于 ，B装置提取物存在于 。
(3)两个装置的差别是由于提取物的方法不同，归根到底是由于提取物的分子结构不同、理化性质不同。A装置中提取物一般具有 ，B装置中提取物在石油醚等有机溶剂中有较高的 。
答案 (1)温度计 接收瓶(锥形瓶) 水浴锅 避免因明火加热可能导致的燃烧、爆炸
(2)接收瓶(锥形瓶) 烧瓶 (3)挥发性 溶解度
解析 (1)两装置相比，A装置多了温度计、连接管及接收瓶，B装置则增加了水浴锅。
(2)提取物存在于A中的接收瓶，B中的烧瓶中。
(3)A装置中的提取物应具较强的挥发性，B装置中的提取物应在有机溶剂中有较高的溶解度。
热点考题集训
1.在工业生产中提取薄荷、香茅、桉树叶等植物中的植物精油，通常将其置于蒸馏锅内的筛板上，筛板下盛放一定量水以满足蒸馏操作所需的足够的饱和水蒸气，水层高度以水沸腾时不溅湿原料底层为原则。然后采用直接火加热、直接或间接蒸气加热等方式提取此类植物的精油。这种方法叫( )
A.水中蒸馏法 B.水上蒸馏法
C.水气蒸馏法 D.既叫水上蒸馏法，也叫水气蒸馏法
答案 B
解析 解题时注意分析题干内容，将薄荷、香茅、桉树叶等植物置于蒸馏锅内的筛板上，筛板下盛放一定量水加热蒸馏，此法为水上蒸馏法。
2.在植物有效成分的提取过程中，常用萃取法、蒸馏法和压榨法，下列关于这三种方法的叙述错误的是( )
A.蒸馏法和萃取法都需要水浴加热
B.压榨法适用于易焦糊原料的提取，如柑橘、柠檬等
C.萃取法适用范围较广，一般原料颗粒小、萃取温度高、时间长，萃取效果好
D.蒸馏法适用于提取玫瑰油、薄荷油等挥发性强的芳香油
答案 A
解析 蒸馏法适用于提取挥发性强的芳香油，其操作过程中不需要水浴加热，萃取法需要水浴加热。
3.在植物有效成分的提取过程中，常用萃取法、蒸馏法和压榨法，下列关于这三种方法叙述错误的是( )
A.蒸馏法的实验原理是利用水将芳香油溶解，再把水蒸发掉，剩余的就是芳香油
B.压榨法的实验原理就是通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油
C.萃取法的实验原理是使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发掉溶剂后就可获得芳香油
D.柑橘和柠檬不易采用蒸馏法提取
答案 A
解析 蒸馏法的实验原理是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后再分离出油层和水层；水不能溶解芳香油，A项错误；压榨法是通过机械加压，压榨出果皮中的芳香油，适用于柑橘、柠檬等原料易焦糊的提取，B项正确；萃取法是使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发掉有机溶剂后就可获得芳香油，适用范围较广，要求原料的颗粒尽量小，能充分浸泡在有机溶剂里，C项正确；水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题，因此柑橘、柠檬芳香油的制备通常使用压榨法，D项正确。
4.新鲜的柑橘皮中含有大量的果蜡、果胶和水分，压榨之前，需要将柑橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡。下列叙述不正确的是( )
A.石灰水能破坏细胞结构、分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱
B.石灰水是强碱，浸泡主要是为了中和柑橘皮中的酸性物质
C.浸泡后的柑橘皮要用流水漂洗，避免与皮肤接触
D.橘皮在石灰水中的浸泡时间应在10小时以上
答案 B
解析 压榨法提取橘皮精油，使用石灰水浸泡的原理是石灰水能够破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨的滑脱，提高出油率，石灰水有强碱性，所以应避免与皮肤接触；为提高出油率浸泡时间要达10小时以上；用石灰水浸泡柑橘皮主要是利用它的强碱性破坏细胞结构、分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率，而不是与酸性物质发生中和反应。
5.下列关于玫瑰精油和橘皮精油提取的过程，叙述正确的是( )
A.玫瑰精油和橘皮精油都可用蒸馏、压榨和萃取的方法提取
B.在水蒸气蒸馏出的玫瑰乳浊液中加入无水Na2SO4的目的是除水
C.新鲜的橘皮中含有大量的果蜡、果胶等，为了提高出油率，需用CaCO3水溶液浸泡
D.玫瑰精油和橘皮精油都有很强的挥发性，易溶于有机溶剂，其成分都是萜类化合物的衍生物
答案 B
解析 橘皮易焦糊，适于用压榨法提取，不能用蒸馏法提取，A项错误；在玫瑰乳浊液的处理过程中，加入无水Na2SO4的目的是除水，B项正确；新鲜的橘皮中含有大量的果蜡、果胶等，如果直接压榨，出油率低，为了提高出油率，需用石灰水溶液浸泡，C项错误；大部分植物芳香油的主要成分是萜类化合物及其衍生物，但橘皮精油的主要成分是柠檬烯，D项错误。
6.胡萝卜素可用于治疗因缺乏维生素A而引起的各种疾病，下图是提取胡萝卜素的实验流程示意图，相关说法正确的是( )
→→→→→→
A.图中干燥处理时的温度越高、时间越长越利于胡萝卜素提取
B.图中甲过程表示萃取，此过程用到的有机溶剂具有较低的沸点
C.图中乙过程表示浓缩，浓缩之前进行过滤的目的是除去萃取液中的不溶物
D.只能从植物中提取天然β－胡萝卜素
答案 C
解析 新鲜胡萝卜素含大量水分，提取时应干燥，但要控制干燥时间和温度，若温度太高、干燥时间太长会导致胡萝卜素分解。图中甲是萃取，所用萃取剂应具有较高的沸点，并能充分溶解胡萝卜素。工业生产上，β－胡萝卜素的提取方法主要有三种：一是从植物中提取，二是从岩藻中获得，三是利用微生物发酵生产。
7.胡萝卜素被认定为A类优秀营养色素，下列关于β－胡萝卜素说法不正确的是( )
A.β－胡萝卜素属脂溶性维生素A的一种，可治疗因缺乏维生素A而引起的骨质疏松、佝偻病等
B.β－胡萝卜素是一种抗氧化剂，可清除体内自由基，抑制自由基生成，具有抗衰老作用
C.β－胡萝卜素具有促进免疫细胞增殖，增强免疫细胞功能的作用，故可防治肿瘤、癌症等疾病
D.β－胡萝卜素摄入量大时，在体内可积累又不会引起中毒，故可作为食品添加剂和营养补充剂
答案 A
8.胡萝卜素的纸层析鉴定，正确的是( )
①制备滤纸：取18 cm×30 cm滤纸条，在滤纸下端距底边2 cm处做一基线，取A、B、C、D 4个点。
②点样：用最细注射器针头分别吸取标准样品和提取样品在A、D和B、C点上点样，吹干。
③层析：将滤纸卷成筒状并固定，放到盛有1 cm深石油醚的密封玻璃瓶中层析。
④观察：取出滤纸条，使石油醚自然挥发后观察层析带。
⑤注意滤纸条预先干燥处理；点样时快速细致、样点圆点尽量细小；滤纸筒的竖直边缘不能接触；石油醚易挥发，注意层析容器要密封。
A.全对 B.四项对 C.三项对 D.二项对
答案 A
解析 胡萝卜素的纸层析鉴定过程为：制备滤纸→点样→层析→观察。点样和层析过程最为关键，点样时要快速细致，圆点尽量小，点样后要吹干。层析过程滤纸筒的竖直边缘不能接触；为防止石油醚挥发，层析容器要密封处理。
9.根据提取橘皮精油的实验流程示意图回答下列问题：
①石灰水浸泡→②漂洗→③压榨→④过滤→⑤静置→⑥再次过滤→橘皮油
(1)第①步之前对橘皮的处理是 。
(2)新鲜的橘皮中含有大量的 、 和 ，如果直接压榨，出油率较低。
(3)压榨是个机械加压过程，要求是 。
(4)为了使橘皮油易与水分离，还要分别加入 ，并调节pH至 。
(5)第④步用 过滤，目的是除去 。
(6)第⑥步用 过滤。
答案 (1)干燥去水 (2)果蜡 果胶 水分 (3)既要将原料压紧，防止原料滑脱，又要将油分挤压出来 (4)相当于橘皮质量0.25%的小苏打和5%的硫酸钠 7～8 (5)普通布袋 固体物和残渣 (6)滤纸
解析 由于鲜橘皮中含有大量的果蜡、果胶和水，若直接压榨，出油率极低，故应先将橘皮干燥去水，并用石灰水破坏细胞，水解果胶。压榨时要使油与水分离，应加入相当于橘皮质量0.25%的小苏打和5%的硫酸钠，并调节pH至7～8。该过程中两次过滤的目的不同，第一次过滤是用普通布袋除去固体物和残渣，第二次则用滤纸除去少量水分和蜡质等杂质。
10.下图为提取胡萝卜素的装置示意图，请回答有关问题：
(1)胡萝卜素萃取的效率主要取决于 和 。
(2)一般来说，要想萃取效果好，要保证 。
(3)萃取过程应该避免明火加热，采用 加热，其原因是 。
(4)在加热瓶口安装冷凝回流装置的目的是 。
(5)实验完成后，通过观察 ，可以验证实验是否成功。
答案 (1)萃取剂的性质 使用量
(2)需要提取的物质充分溶解
(3)水浴 有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧爆炸
(4)防止加热使有机溶剂挥发
(5)萃取样品是否出现标准样品对应的胡萝卜素层析带
解析 萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量，同时还受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件的影响。需要提取的物质能够充分溶解，萃取的效果就好。胡萝卜素的提取效果可通过纸层析法鉴定，通过观察萃取样品是否出现标准样品对应的胡萝卜素层析带验证实验是否成功。
第16课时 植物芳香油的提取
[学习导航] 1.阅读教材P72“基础知识”，了解植物芳香油的来源、提取方法和不同材料的提取方法的选择。2.分析教材P73“(一)”，掌握玫瑰精油提取的方法、装置及过程。3.分析教材P74“(二)”，掌握橘皮精油提取的方法、材料的处理及提取过程。4.通过教材P75“操作提示”，分析影响精油品质的因素。
[重难点击] 1.简述植物芳香油的来源及其提取方法。2.通过实验设计，初步掌握植物芳香油的提取技术。
一、植物芳香油的来源和提取方法
1.芳香油的来源及特点
(1)来源
香料种类
来源
动物香料
麝、灵猫、海狸、抹香鲸等
植物香料(植物芳香油)
大约50多个科的植物，如玫瑰、樟树、柑橘等
(2)成分：成分复杂，以萜类化合物及其衍生物为主。
(3)特点：具有很强的挥发性，易溶于有机溶剂。
2.提取植物芳香油的方法
(1)选用依据：根据植物原料的特点。
(2)提取方法
提取方法
提取原理
方法步骤
适用范围
水蒸气蒸馏法
利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来
①水蒸气蒸馏
②分离油层
③除水过滤
提取玫瑰油、薄荷油等
压榨法
通过机械加压，压榨出植物中的芳香油
①石灰水浸泡、漂洗
②压榨、过滤、静置
③再次过滤
适用于柑橘、柠檬等易焦糊、有效成分易水解等原料的提取
萃取法
使提取物溶解在有机溶剂中，蒸发后得到提取物
①粉碎、干燥
②萃取、过滤
③浓缩
适用范围广，要求原料的颗粒要尽可能细小，能充分浸泡在有机溶剂中
(3)用于萃取的有机溶剂必须事先精制，目的是除去杂质，否则会影响芳香油的质量。
1.水蒸气蒸馏法的种类
(1)三种水蒸气蒸馏法的分类依据是什么？
答案 根据原料放置的位置分为三种方法。
(2)三种方法的操作过程有哪些相同点？
答案 都有过滤提纯这一环节，即除去液体中的固体杂质。
2.植物芳香油提取方法的选取
(1)选择植物芳香油提取方法的依据是什么？
答案 要根据植物原料的特点来确定。
(2)柑橘和柠檬为何不适于用水中蒸馏？
答案 对于柑橘和柠檬，水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解，因此柑橘和柠檬芳香油的提取常用压榨法。
3.某植物芳香油易溶于有机溶剂，分析可用什么方法提取。如何操作？
答案 萃取法。先将粉碎、干燥的原料用有机溶剂浸泡，溶解芳香油，然后蒸发出有机溶剂，获得纯净的植物芳香油。
归纳提炼 水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏的区别
(1)这三种方法的基本原理相同，但蒸馏过程中原料放置位置不同。
①水中蒸馏：原料放在蒸馏容器的水中，水要完全浸没原料。
②水上蒸馏：容器中水的上方有筛板，原料放在筛板上，水量以沸腾时不浸湿原料为宜。
③水气蒸馏：蒸馏容器下方有一排气孔，连接外源水蒸气，上方有筛板，上面放原料。
(2)各自特点：水中蒸馏设备简单、成本低、易操作，而水上蒸馏和水气蒸馏所需时间短，出油率高。
1.下列属于植物芳香油理化性质的是( )
①具有较强的挥发性 ②易溶于水 ③易溶于有机溶剂 ④具有特殊的植物香味
A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②④
答案 C
解析 植物芳香油是植物有效成分的提取液，其特点是有特殊的植物香味和较强的挥发性，且不易溶于水，易溶于有机溶剂。
2.柑橘、柠檬芳香油的制备通常采用压榨法而不采用水蒸气蒸馏法，其原因不包括( )
A.水中蒸馏会导致原料焦糊
B.柑橘、柠檬芳香油易溶于有机溶剂
C.会使芳香油的有效成分水解
D.柑橘皮、柠檬皮中的芳香油含量高
答案 B
解析 柑橘、柠檬等水中蒸馏会导致原料焦糊，且会使芳香油的有效成分水解，因此不宜采用水蒸气蒸馏法提取，柑橘皮、柠檬皮中的芳香油含量高，因此可以利用压榨法分离。柑橘、柠檬芳香油均易溶于有机溶剂，但不是采用压榨法而不采用水蒸气蒸馏法的原因。
方法链接 植物芳香油提取方法的选择原则
植物芳香油提取方法的选择主要根据植物原料的性质确定：
(1)挥发性强、热稳定性高的芳香油可以用水蒸气蒸馏法提取。
(2)植物芳香油含量高的材料一般采用压榨法提取。
(3)易溶于有机溶剂的植物芳香油可以采用萃取法提取。
二、实验操作及注意事项
1.玫瑰精油的提取
(1)用途：制作高级香水的主要成分。
(2)性质：化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，能随水蒸气一同蒸馏。
(3)方法：一般可采用水蒸气蒸馏法提取；根据其化学性质，也可采用萃取法提取。
(4)实验流程
①取材：在玫瑰的盛花期，最好是选用当天采摘的鲜玫瑰花。
②安装蒸馏装置。
③蒸馏：在蒸馏瓶中加几粒沸石，防止液体过度沸腾。
④分液：用锥形瓶收集乳白色的乳浊液，向锥形瓶中加入NaCl，使乳浊液分层。
⑤除水：加入无水Na2SO4吸收水分，再过滤除去。
2.橘皮精油的提取
(1)橘皮精油的特点
①性质：无色透明，具有诱人的橘香味。
②成分：主要为柠檬烯。
③用途：是食品、化妆品和香水配料的优质原料。
(2)橘皮精油的提取
①方法：一般采用压榨法。
②流程
橘皮的处理：将新鲜橘皮干燥去水
↓
石灰水浸泡：用石灰水浸泡橘皮
↓
清水漂洗：浸泡好的橘皮用流水漂洗干净，沥干水分
↓
粉碎与压榨：将橘皮粉碎，加入相当于橘皮质量0.25%的NaHCO3和5%的Na2SO4，
并调节pH至7～8，用压榨机压榨得到压榨液
↓
过滤压榨液：用普通布袋过滤，再离心处理滤液，分离出上层橘皮油
↓
静置处理：将橘皮油在5～10 ℃下静置5～7 d，分离出上层澄清橘皮油
↓
再次过滤：将下层橘皮油用滤纸过滤，滤液与上层橘皮油合并，得到橘皮精油
3.操作提示
(1)玫瑰精油的提取：蒸馏时温度不能太高，时间不能太短。
(2)橘皮精油的提取：橘皮在石灰水中浸泡时间为10 h以上，这样压榨时不会滑脱，出油率高，并且过滤时不会堵塞筛眼。
1.玫瑰精油的提取
(1)所给的材料有鲜玫瑰花和干玫瑰花，应分别选取哪种方法提取玫瑰精油？
答案 ①鲜玫瑰花用水中蒸馏法，更简便易行。②干玫瑰花可使用有机溶剂萃取法，一般不用压榨法。
(2)如图所示蒸馏装置，分析使用水蒸气蒸馏装置的注意事项有哪些(从安装顺序、水的应用方面考虑)?
答案 ①图中装置安装时一般按自下而上，从左到右的顺序，拆卸装置的顺序与安装时相反。保证冷凝管中的水下进上出。
②蒸馏开始时，先通冷水后加热；蒸馏完毕时，先撤热源后停止通水。
(3)在玫瑰乳浊液的处理过程中，先后使用NaCl和无水Na2SO4有何作用？
答案 加入NaCl，增加盐的浓度，能促使油水分层；无水Na2SO4能吸去油层中含有的少量水分。
(4)蒸馏时许多因素都会影响产品的品质，为了提高品质，对蒸馏温度和蒸馏时间应如何控制？
答案 蒸馏温度太高、时间太短，产品品质就比较差，为了提高品质要严控蒸馏温度，适当延长蒸馏时间。
2.橘皮精油的提取
(1)为了提高橘皮精油的出油率，对原料要如何处理？
答案 为提高出油率，需将橘皮干燥去水，并用石灰水浸泡。
(2)在提取橘皮精油的过程中用石灰水浸泡的目的是什么？对浸泡时间有何要求？
答案 ①石灰水的pH为12，强碱性，能破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。②橘皮在石灰水中的浸泡时间应为10 h以上。
(3)在提取橘皮精油的实验流程中，第一次过滤之后、静置之前还有一个离心操作，目的是什么？
答案 进一步除去质量较小的残留固体物。
(4)压榨法提取橘皮精油时的两次过滤有何不同？
答案 第一次过滤是普通布袋过滤，目的是除去固体物和残渣；第二次过滤是滤纸过滤，目的是除去少量的水和果蜡。
归纳总结 橘皮精油提取中的注意事项
(1(实验中要注意避免石灰水与皮肤接触。
(2(为了能将柑橘皮均匀地浸泡在石灰水中，柑橘皮可以放入家用榨汁机中粉碎，但要注意安全。
(3(可以将未经浸泡的样品作为对照，探究浸泡时间对出油率的影响。
(4(压榨前要充分考虑容器能够承受的压力范围，防止容器破裂，导致实验失败和发生安全事故。
(5(为了使橘皮油易与水分离，还要分别加入相当于橘皮质量0.25%的NaHCO3和5%的Na2SO4，并调节pH至7～8。
(6(静置处理要掌握好温度(5～10 ℃(和时间(5～7 d(。
3.在利用水蒸气蒸馏法制取的玫瑰乳浊液提纯的过程中，先后使用NaCl、无水Na2SO4，其作用分别是( )
A.分层、吸水 B.溶解、吸水
C.吸水、分层 D.分层、萃取
答案 A
解析 玫瑰乳浊液的处理过程中，加入NaCl的目的是降低玫瑰油的溶解度，利于水、油分层，便于分液。加入无水Na2SO4(常用的干燥剂)的目的是进一步吸取分液出来的油层中的水分。
4.下列是与芳香油提取相关的问题，请回答：
(1)玫瑰精油适合用水蒸气蒸馏法提取，其理由是玫瑰精油具有 的性质。蒸馏时收集的蒸馏液 (填“是”或“不是”)纯的玫瑰精油，原因是
。
(2)当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有蒸馏时间和 。当原料量等其他条件一定时，提取量随蒸馏时间的变化趋势是
。
(3)如果蒸馏过程中不进行冷却，则精油提取量会 ，原因是
。
(4)密封不严的瓶装玫瑰精油保存时最好存放在温度 的地方，目的是 。
(5)某植物花中精油的相对含量随花的不同生长发育时期的变化趋势如下图所示。提取精油时采摘花的最适时间为 天左右。
(6)从薄荷叶中提取薄荷油时 (填“能”或“不能”)采用从玫瑰花中提取玫瑰精油的方法，理由是
。
答案 (1)易挥发、难溶于水、化学性质稳定 不是 蒸馏时玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，得到的是油水混合物 (2)蒸馏温度 一定时间内提取量随蒸馏时间的延长而增加，一定时间后提取量不再增加 (3)下降 部分精油会随水蒸气的蒸发而散失 (4)较低 减少挥发(或防止挥发) (5)a (6)能 薄荷油与玫瑰精油化学性质相似
解析 (1)水蒸气蒸馏法利用了玫瑰精油易挥发、难溶于水、化学性质稳定的特性，蒸馏时由于玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，因此得到的是油水混合物，不是纯的玫瑰精油，需经分液、除水、过滤后才能得到纯的玫瑰精油。
(2)当蒸馏瓶中的水和原料量一定时，蒸馏过程中，影响精油提取量的主要因素有蒸馏时间和蒸馏温度。当原料量等其他条件一定时，一定时间内提取量随蒸馏时间的延长而增加，一定时间后提取量不再增加。
(3)蒸馏时玫瑰精油随水蒸气一起蒸馏出来，如果不进行冷却，部分精油会随水蒸气的蒸发而散失。
(4)玫瑰精油易挥发，应保存在温度较低的地方。
(5)采摘花的最适时间是精油含量最高时，由图可知，a天左右时精油含量最高，因此采摘花的最适时间为a天左右。
(6)薄荷油与玫瑰精油化学性质相似，同样可以采用水蒸气蒸馏法提取。
一题多变
(1)为什么易挥发、难溶于水、化学性质稳定的植物芳香油适合用蒸馏法提取？
答案 易挥发的物质能够与水蒸气一同蒸馏出来；难溶于水的物质易与水分离；化学性质稳定的物质不会在蒸馏时被破坏。
(2)提取玫瑰精油时还可以采用什么方法？为什么？
答案 还可以用萃取法提取，因为玫瑰精油易溶于有机溶剂。
规律方法 玫瑰精油的提取和橘皮精油的提取中过滤的作用
(1)玫瑰精油的提取实验中过滤的作用是除去固体Na2SO4。
(2)橘皮精油的提取实验中过滤的作用是除去固体物和残渣。
1.提取的植物芳香油具有很强的挥发性，其组成比较复杂，主要包括( )
A.蛋白质和糖 B.核酸和蛋白质
C.脂肪和蛋白质 D.萜类化合物及其衍生物
答案 D
解析 植物芳香油的种类虽然很多，但化学本质基本一致，其主要成分是萜类化合物及其衍生物。
2.在蒸馏过程中，将水蒸气蒸馏法划分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏的标准是( )
A.原料的种类 B.原料的特性
C.原料放置的位置 D.原料的成分
答案 C
解析 蒸馏是提取植物芳香油的最常用方法，可根据原料放置位置的不同分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。水中蒸馏是指水和原料混合。水上蒸馏是指原料在水上，和水不相接触。水气蒸馏是指原料和水不在同一容器中，两容器靠一管道相通，以便输送蒸气。
3.分离出的橘皮精油一般要放在5～10 ℃的冰箱中，静置5～7天，其主要目的是( )
A.低温保持橘皮精油的活性
B.低温降低橘皮精油的挥发性
C.去除水和蜡质等杂质
D.低温使橘皮精油凝固
答案 C
解析 用分液漏斗分离得到的橘皮精油还含有少量的水和果蜡，需要在5～10 ℃的冰箱中，静置5～7天，使杂质沉淀。
4.萃取法是将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中，蒸发出某种物质，就可以得到纯净的植物芳香油。蒸发出的物质是( )
A.有机溶剂 B.芳香油
C.有机溶剂中杂质 D.芳香油中杂质
答案 A
解析 萃取法是将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中，然后再把有机溶剂蒸发，从而得到芳香油的方法。
5.通过对玫瑰精油、橘皮精油提取过程的学习，请你自己设计一个提取茉莉油的过程，并回答下列问题：
(1)第一步，采摘原料，提炼茉莉油的原料为 ，要在 期采收，此时，茉莉油的含量较高。
(2)提取茉莉油常采用 法，此方法是通过水分子向原料中渗透，使 ，形成精油与水的共沸物，蒸馏出的水蒸气与精油通过 、 后得到精油。
(3)下图是茉莉油的生产工艺，请据图回答：
①向蒸馏器中加入原料时，茉莉花与清水的质量比大约为 。
②A表示 过程，B表示 过程，C表示 。通过C提取出的直接精油，可能还混有一定的水分，所以要向提取液中加入D 吸水，放置过夜，再过滤除去固体物质，即可得到茉莉油。
答案 (1)茉莉花 盛花 (2)水蒸气蒸馏 植物中精油成分向水中扩散 冷凝 油水分离 (3)①1∶4 ②水蒸气蒸馏 冷凝 分离油层 无水硫酸钠
课时作业
[学考达标]
1.不少植物器官用于提取植物芳香油，下面所列芳香油由茎和叶提取的是( )
A.薄荷油 B.玫瑰油 C.橘皮油 D.茴香油
答案 A
解析 薄荷油、玫瑰油、橘皮油、茴香油依次由茎和叶、花、树皮、果实提取。
2.将原料完全浸没于水中的蒸馏方法叫( )
A.水上蒸馏 B.水下蒸馏 C.水中蒸馏 D.水气蒸馏
答案 C
解析 按照蒸馏过程中原料放置的位置，可以将水蒸气蒸馏法划分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏，水中蒸馏是指将原料完全浸没于水中的蒸馏方法。没有水下蒸馏这一说法。
3.植物芳香油生产的原料采自植物的花、茎、叶、果实、根等部位，出油量的多少及油的品质与多种因素有关，其中在材料的处理上，下列哪项是错误的( )
A.应及时采收
B.摘收部位要符合要求
C.对原料应及时进行处理
D.摘收后不能马上加工，应停放一段时间后加工
答案 D
解析 影响材料出油量的因素很多，主要有采收时间、取材部位、处理时间要及时等。
4.在水蒸气蒸馏装置中从进水口通入水的作用是( )
A.加热 B.防止过度沸腾 C.过滤 D.冷却
答案 D
解析 利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后混合物又会重新分出油层和水层，从而达到分离的目的。因此，从进水口通入水的作用是冷却。
5.在蒸馏过程中，要提高产品质量，应该采取的措施是( )
A.提高蒸馏温度，延长蒸馏时间
B.提高蒸馏温度，缩短蒸馏时间
C.降低蒸馏温度，缩短蒸馏时间
D.严控蒸馏温度，延长蒸馏时间
答案 D
解析 用蒸馏法分离植物有效成分时，温度会影响其性质，温度过高则破坏其结构，温度过低则分离不出其有效成分。如果在一定温度范围内延长蒸馏时间，就可以得到较多的植物有效成分。
6.压榨完橘皮后，处理压榨液时，离心的目的是( )
A.除去质量较小的残留固体物 B.除去固体物和残渣
C.除去果蜡、果胶 D.除去水分
答案 A
解析 压榨完橘皮后，先用普通布袋过滤除去固体物和残渣，然后离心进一步除去质量较小的残留固体物。
[高考提能]
7.提取茉莉精油的正确步骤是( )
A.鲜茉莉花＋清水―→水蒸气蒸馏―→除水―→分离油层―→茉莉油
B.鲜茉莉花＋清水―→水蒸气蒸馏―→油水混合物―→分离油层―→除水―→茉莉油
C.鲜茉莉花＋清水―→除水―→水蒸气蒸馏―→油水混合物―→分离油层―→茉莉油
D.鲜茉莉花＋清水―→分离油层―→除水―→水蒸气蒸馏―→茉莉油
答案 B
解析 用水蒸气蒸馏法提取茉莉精油时，应先将新鲜的茉莉花与清水共沸进行蒸馏，然后在得到的油水混合物中加入氯化钠使之分层，进行分液，为除去茉莉油中仍存在的水分，可加入无水硫酸钠，过滤后可以得到较纯的茉莉油。
8.橘皮精油的提取中，用压榨法得到压榨液，为了使橘皮油易于与水分离，还要分别加入两种物质，并调节pH至7～8，这两种物质是( )
A.相当于橘皮质量0.25%的小苏打和0.25%的硫酸钠
B.相当于橘皮质量0.25%的小苏打和5%的硫酸钠
C.相当于橘皮质量5%的小苏打和0.25%的硫酸钠
D.相当于橘皮质量5%的小苏打和5%的硫酸钠
答案 B
解析 为了使橘皮油易于与水分离，还要分别加入相当于橘皮质量0.25%的小苏打和5%的硫酸钠，目的是使橘皮油易于与水分离。
9.某同学在实验中设计了如图所示的装置提取玫瑰精油，装置中的两处错误是( )
A.温度计位置过低、冷凝管进水口和出水口接错
B.冷凝管进水口和出水口接错、无需用酒精灯加热
C.温度计位置过低、无需用酒精灯加热
D.以上叙述均不正确
答案 A
解析 装置中温度计应位于锥形瓶与冷凝装置相接出口处相平行的位置。冷凝装置应将图中的出水口和进水口位置交换。
10.玫瑰精油素有“液体黄金”之称，下面是提取玫瑰精油的实验流程图，请据图分析下列说法中，不正确的是( )
→→
A.提取玫瑰精油的方法是水蒸气蒸馏法
B.①和②操作要求分别加入氯化钠和无水硫酸钠
C.③操作是萃取，以除去固体硫酸钠
D.该实验流程也可用于从薄荷叶中提取薄荷油
答案 C
解析 加入氯化钠是为了增大盐水的浓度，利于玫瑰油与水的分层，加入无水硫酸钠是为了吸收精油中残留的水分，③操作是利用过滤的方法除去固体硫酸钠。
11.如图是用水蒸气蒸馏法从薄荷叶中提取薄荷油的装置图，请据图补充完整下面的实验步骤并回答有关问题：
Ⅰ.实验步骤：
(1)安装好如图所示的装置，特别要注意将冷凝器夹好。
(2)将薄荷叶尽量剪碎，取适量的薄荷叶放入 瓶内。
(3)向 瓶内加水，至容积的 左右，为防止出现水碱，可加入数滴稀硫酸。还应向瓶中放入几粒 以防暴沸。
(4)向冷凝器中通入 。
(5)放好连接管，将连接管的出口放在接收瓶中。接收瓶口上盖一小块铝箔或牛皮纸。
(6)将蒸气发生器加热，至瓶中的水沸腾，然后调节火的大小，以维持水稳定的沸腾温度。
(7)当接收瓶内漂在水上的油状物(即精油)不再增多时即可停止实验。
Ⅱ.回答有关问题：
(1)A蒸馏瓶通入B蒸馏瓶中的连接管为什么插入B蒸馏瓶底部？
。
(2)冷凝器的作用是 。
(3)接收瓶口上盖一小块铝箔或牛皮纸，其目的是
。
答案 Ⅰ.(2)B
(3)A 2/3 沸石(或碎玻璃、碎砖瓦)
(4)自来水(或冷水)
Ⅱ.(1)让水蒸气由下而上进行蒸馏
(2)使混合气体冷凝
(3)薄荷油具有挥发性，以减少薄荷油的散失
解析 水蒸气蒸馏法的原理是利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后混合物又会重新分出油层和水层。用水蒸气蒸馏法提取芳香油时，原料放入B瓶中，通入水蒸气的玻璃管到达瓶底，让水蒸气由下而上进行蒸馏。A瓶中水量不能加满，约占2/3就行，为防止水暴沸，可向A瓶内放入几粒沸石或碎玻璃、碎砖瓦等。薄荷油具有挥发性，因此在接收瓶口上盖一小块铝箔或牛皮纸。
12.请回答下列与实验室提取芳香油有关的问题：
(1)植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、 和 。
(2)芳香油溶解性的特点是不溶于 ，易溶于 ，因此可用 作为提取剂来提取芳香油。
(3)橘子果实含有芳香油，通常可用 作为材料提取芳香油，而且提取时往往选用新鲜的材料，理由是 。
(4)对材料压榨后可得到糊状液体，为除去其中的固体物获得乳状液可采用的方法是 。
(5)得到的乳状液加入氯化钠并放置一段时间后，芳香油将分布于液体的 层，原因是 。加入氯化钠的作用是 。
(6)从乳状液中分离得到的芳香油中要加入无水硫酸钠，作用是 。
答案 (1)蒸馏法 萃取法
(2)水 有机溶剂 有机溶剂(其他合理答案也可)
(3)橘子皮 芳香油含量较高
(4)过滤(其他合理答案也可)
(5)上 油的密度比水小(其他合理答案也可) 增加水层密度，使油和水分层
(6)吸收芳香油中残留的水分
解析 (1)植物芳香油的提取可采用的方法有压榨法、蒸馏法、萃取法。(2)芳香油溶解性的特点是不溶于水，易溶于有机溶剂，因此可用有机溶剂作为提取剂来提取芳香油。(3)一般采用新鲜的橘子皮来提取橘皮精油，因为新鲜的橘皮含芳香油多。(4)除去液体中的固体常用方法是过滤。(5)芳香油密度比水小，且不溶于水，会浮在液体的表面。加入氯化钠会增加水层密度，使油和水分层。(6)无水硫酸钠的作用是吸收芳香油中残留的水分。
13.阅读以下材料，完成相关问题：
从玫瑰花中提取出的玫瑰精油称为“液体黄金”，是世界香料工业不可取代的原料，多用于制造高级香水、化妆品等。提取出的玫瑰精油不含有任何添加剂或化学原料，是纯天然的护肤品，具有极好的抗衰老和止痒作用，能够促进细胞再生、防止肌肤老化、抚平肌肤细纹，还具有使人放松、愉悦心情的功效。
玫瑰精油的化学性质稳定，难溶于水，易溶于有机溶剂，挥发性较强。
(1)根据材料中介绍的玫瑰精油的性质，要提取玫瑰精油用水中蒸馏法，其原因是该法具有
的优点。
(2)对用上述方法接收到的乳浊液进行如下处理：
玫瑰油与水的混合物分层油层无水玫瑰精油较纯净玫瑰精油。
试剂A是 ，试剂C是 ，装置B是 ，试剂C的作用是 。
答案 (1)设备简单、成本低、易操作 (2)NaCl 无水Na2SO4 分液漏斗 吸去油层中少量水分
解析 (1)应根据原料特点来选择提取方法。根据玫瑰精油挥发性强，化学性质稳定，可以用蒸馏法。(2)蒸馏得到的乳浊液，为促进其分层，可加入NaCl，而后用分液漏斗将其分开，得到的油层中还含有少量的水分，可以用无水Na2SO4吸去，然后过滤。
[真题体验]
14.(2011·海南，30)许多植物含有天然香料，如薄荷叶中含有薄荷油。现用薄荷叶提取薄荷油。
回答问题：
(1)薄荷油是挥发性物质，提取薄荷油时应选用 (鲜、干)薄荷叶作原料，其原因是 。
(2)用萃取法提取薄荷油时，采用的溶剂是 ，原理是 。
(3)用水蒸气蒸馏法提取薄荷油时，在油水混合物中加入氯化钠的作用是 。常用于分离油层和水层的器皿是 。分离出的油层中加入无水硫酸钠的作用是 ，除去固体硫酸钠的常用方法是 。
答案 (1)鲜 薄荷油易挥发，鲜薄荷叶中薄荷油含量高
(2)乙醚 薄荷油易溶于有机溶剂，且乙醚沸点低、易蒸发
(3)增加盐的浓度，使分层更明显 分液漏斗 吸去油层中的水分 过滤
15.(2011·山东，34)研究发现柚皮精油和乳酸菌素(小分子蛋白质)均有抑菌作用，两者的提取及应用如图所示。
(1)柚皮易焦糊，宜采用 法提取柚皮精油，该过程得到的糊状液体可通过 除去其中的固体杂质。
(2)筛选乳酸菌A时可选用平板划线法或 接种。对新配制的培养基灭菌时所用的设备是 。实验前需对超净工作台进行 处理。
(3)培养基中的尿素可为乳酸菌A生长提供 。电泳法纯化乳酸菌素时，若分离带电荷相同的蛋白质，则其分子量越大，电泳速度 。
(4)抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈。可通过测定透明圈的 来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。
答案 (1)压榨 过滤
(2)稀释涂布平板法 高压蒸汽灭菌锅 紫外线消毒
(3)碳源和氮源 越慢
(4)直径(或大小)
解析 (1)柚皮易焦糊，宜采用压榨法提取柚皮精油，不宜用蒸馏法，压榨所得糊状液体可通过过滤除去其中的固体杂质。(2)接种方法常用的为平板划线法和稀释涂布平板法，对培养基灭菌时所用的设备是高压蒸汽灭菌锅。实验前需对超净工作台进行紫外线消毒处理。(3)培养基中的尿素可为乳酸菌A生长提供碳源和氮源。电泳法纯化乳酸菌素时，若分离带电荷相同的蛋白质，则其分子量越大，电泳速度越慢。(4)抑菌实验时，在长满致病菌的平板上，会出现以抑菌物质为中心的透明圈。可通过测定透明圈的大小来比较柚皮精油和乳酸菌素的抑菌效果。
第17课时 胡萝卜素的提取
[学习导航] 1.通过教材P77“课题背景”和“基础知识”，了解胡萝卜素的价值、工业提取方法，掌握胡萝卜素的性质和作用。2.阅读教材P77“实验设计”，掌握胡萝卜素提取的方法及实验装置。3.分析教材P79“结果分析与评价”，掌握用纸层析法鉴定提取的胡萝卜素粗品。
[重难点击] 1.了解有关胡萝卜素的基础知识和提取胡萝卜素的基本原理。2.初步学会胡萝卜素的提取技术和纸层析法的操作方法。
一、胡萝卜素的性质及萃取要求
1.胡萝卜素的基础知识
(1)胡萝卜素的性质：胡萝卜素是橘黄色结晶，化学性质比较稳定，不溶于水，微溶于乙醇，易溶于石油醚等有机溶剂。
(2)种类划分：根据胡萝卜素的分子结构可以将胡萝卜素划分为三类，最主要的组成成分是β－胡萝卜素。
(3)提取途径
2.提取胡萝卜素的基本原理
(1)萃取剂的选择
①选择萃取胡萝卜素的有机溶剂的原则
a.具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶。
b.萃取效率要高。
c.对人无毒性，不易燃，易与产品分离，不影响产品质量。
②有机溶剂的分类
有机溶剂分为水溶性和水不溶性两种：a.乙醇和丙酮能够与水混溶，是水溶性有机溶剂；b.石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳等不能与水混溶，称为水不溶性有机溶剂。
(2)影响萃取的因素
①主要因素：萃取的效率主要取决于萃取剂的性质和使用量。
②次要因素：萃取的效率受到原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等条件的影响。
1.提取胡萝卜素能否用乙醇或丙酮作为萃取剂？为什么？
答案 不能。因为乙醇和丙酮属于水溶性有机溶剂，而胡萝卜素应该用水不溶性有机溶剂进行提取，如石油醚、乙酸乙酯、乙醚、苯、四氯化碳等。
2.为什么用于提取胡萝卜素的萃取剂要有较高的沸点？
答案 有机溶剂的沸点较高，可以充分溶解胡萝卜素。
3.影响萃取效率的因素除了萃取剂的性质和使用量之外，还有哪些因素？
答案 原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间等。
4.萃取胡萝卜素时为什么要避免明火加热？
答案 因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧或爆炸。
1.下列关于胡萝卜素的说法，不正确的是( )
A.胡萝卜素存在于叶绿体类囊体薄膜上
B.胡萝卜素可划分为α、β、γ三类，其中β－胡萝卜素是最主要的组成成分
C.胡萝卜素可用来预防肿瘤、癌症和心脑血管疾病等
D.β－胡萝卜素只存在于蔬菜中
答案 D
解析 叶绿体中的色素包括叶绿素、类胡萝卜素(叶黄素和胡萝卜素)，分布在叶绿体类囊体薄膜上。胡萝卜素分子中有大量的碳碳双键，根据双键数目不同，可将胡萝卜素划分为α、β、γ三类，β－胡萝卜素是其中最主要的组成成分，一分子的β－胡萝卜素可被氧化成两分子的维生素A，因此，胡萝卜素可以用来治疗因缺乏维生素A而引起的各种疾病。β－胡萝卜素不但存在于蔬菜(如胡萝卜)中，也存在于某些橙色、黄色的水果中。
2.萃取剂是萃取过程中必不可少的，故萃取剂的选择也是至关重要的，一般不考虑( )
A.萃取剂与萃取物的溶剂互不相溶
B.萃取物在萃取剂中的溶解度要大于在原溶液中的溶解度
C.萃取剂的沸点
D.萃取剂可分为水溶性和水不溶性两种
答案 D
二、胡萝卜素的提取和鉴定
1.提取方法：萃取法。
2.操作流程及注意事项
(1)操作流程：胡萝卜→粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩→胡萝卜素。
(2)注意事项
①避免明火加热，采用水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接使用明火加热容易引起燃烧、爆炸。
②为防止加热时有机溶剂挥发，需在加热瓶口安装回流冷凝装置。
③萃取液的浓缩可直接使用蒸馏装置。浓缩前要进行过滤，除去萃取液中的不溶物。
3.胡萝卜素粗品的鉴定
(1)方法：通过纸层析进行鉴定。
(2)步骤
做基线：在18 cm×30 cm滤纸下端距底边2 cm处做一基线，在基线上取A、B、C、D四点
↓
对照点样：A、D点点上标准样品，B、C点点上萃取样品
↓
干燥层析：吹干溶剂，放入石油醚中层析
↓
对比观察：对比观察标准样品与萃取样品对应层析带的异同
1.实验装置分析
如图为提取胡萝卜素的装置图，请据图回答下列问题：
(1)图中⑤是什么？有什么作用？
答案 冷凝管。降温，防止加热时有机溶剂挥发。
(2)④烧瓶内加入的萃取剂一般是什么？原料在加入前，一般要进行怎样的处理？
答案 石油醚。原料要进行粉碎和干燥处理。
(3)该萃取过程采用的是水浴加热，其目的是什么？
答案 避免使用明火加热引起燃烧、爆炸。
2.实验过程分析
(1)萃取操作之前，为什么要将胡萝卜粉碎、干燥？
答案 萃取的效率与原料颗粒大小和含水量等有关，原料颗粒小、含水量低时萃取效果好。
(2)实验操作中浓缩的实质是什么？
答案 浓缩的实质是蒸发有机溶剂，提纯胡萝卜素。
3.胡萝卜素粗品的鉴定
(1)结合教材中的图示分析本图有哪些错误。
答案 ①玻璃瓶未加盖密封；②层析液过多，没过了基线；③滤纸两边接触，滤纸的两边不能相互接触。
(2)层析结果怎样才能表明提取的胡萝卜素纯度高？
答案 若萃取样品中出现了与标准样品一样的层析带，则提取的胡萝卜素纯度高。
3.下列关于提取胡萝卜素的实验流程的叙述中，不正确的是( )
A.萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶
B.萃取过程中在加热瓶口安装冷凝回流装置，是为了防止加热时有机溶剂的挥发
C.为了提高萃取的效率，可以适当地提高温度，可采用酒精灯直接加热的方法
D.浓缩的过程是为了把萃取剂与β－胡萝卜素分开
答案 C
解析 萃取胡萝卜素的有机溶剂应该具有较高的沸点，以便在较高温度下保持液态，从而利于胡萝卜素溶于有机溶剂，有机溶剂不与水混溶，防止原料中的水分进入萃取液，难以分离，A项正确；萃取过程中在加热瓶口安装冷凝回流装置，是为了防止加热时有机溶剂的挥发，B项正确；为了提高萃取的效率，可以适当地提高温度，但是由于有机溶剂易挥发且易燃易爆，因此应避免明火加热，不能采用酒精灯直接加热的方法，C项不正确；浓缩的过程是为了把萃取剂与β－胡萝卜素分开，D项正确。
4.下列关于胡萝卜素鉴定实验的有关叙述中，正确的是( )
A.每次点样应快速细致，形成直径相同的小圆点
B.点样后应立即将滤纸放入层析液中
C.层析液所用试剂为石油醚和酒精的混合液
D.层析过程中，滤纸放在普通烧杯中
答案 A
解析 每次点样应快速细致，形成直径为2 mm左右的大小相同的小圆点，A项正确。点样后需等滤纸上的点样液挥发干后，再将滤纸放入层析液中层析，B项不正确。层析液所用试剂为石油醚，C项不正确。层析过程中，滤纸应放在密闭的玻璃瓶中，而不能放在普通烧杯中，因为普通烧杯不能密封，层析液易挥发，D项不正确。
方法链接 蒸馏装置的两种用法
(1)在蒸馏法中的应用：用于蒸馏过程，蒸馏后植物有效成分随水蒸气一起蒸馏，冷凝后存在于油水混合物中。
(2)在萃取法中的应用：用于萃取液的浓缩，植物有效成分存在于蒸馏烧瓶中，冷凝后收集到的是有机溶剂。
1.石油醚经常被用作植物有效成分提取时的萃取剂，其原因是( )
A.具有较高的沸点、萃取效率高、毒性很小
B.具有较低的沸点、萃取效率高、毒性很小
C.具有较高的沸点、萃取效率一般、毒性较小
D.具有较低的沸点、萃取效率高、毒性较大
答案 A
2.下列有关胡萝卜素的叙述，错误的是( )
A.胡萝卜素的化学性质稳定，溶于水，不溶于乙醇
B.胡萝卜是提取天然β－胡萝卜素的原料
C.微生物的发酵生产是工业提取β－胡萝卜素的方法之一
D.提取后，干燥过程中，时间不能太长，温度不能太高
答案 A
解析 胡萝卜素为橘黄色结晶粉末，不溶于水，微溶于乙醇。胡萝卜素在弱碱性条件下比较稳定，在酸中不稳定，在光照和含氧条件下也不稳定。
3.影响胡萝卜素提取的因素有( )
①温度 ②胡萝卜的干燥程度 ③萃取剂的性质 ④萃取剂的使用量 ⑤胡萝卜粉碎块大小 ⑥加热时间
A.①②③④⑤⑥ B.①③④⑥
C.①②④⑤⑥ D.①②③⑤
答案 A
4.在胡萝卜素的提取过程中，对材料的处理正确的是( )
A.要把买来的胡萝卜放置几天后，再做实验
B.在烘箱中烘干胡萝卜时，为了节省时间，要求温度越高越好
C.为了充分干燥胡萝卜，所以干燥时间越长越好
D.要把烘干好的胡萝卜用研钵研成胡萝卜干粉备用
答案 D
解析 新鲜的胡萝卜含有大量的水分，若放置时间太长，就容易变质。干燥时，若温度太高，时间太长，则胡萝卜素容易分解。因此，需要适宜的温度和时间将胡萝卜烘干，然后用研钵研成干粉备用。
5.根据从胡萝卜中提取胡萝卜素的相关知识及胡萝卜素的性质，回答下列问题：
(1)胡萝卜素是 色的结晶。从胡萝卜中提取胡萝卜素时，常用 作为溶剂，原因是 。
(2)从胡萝卜中提取胡萝卜素常用的方法是 法。用这种方法提取胡萝卜素的主要步骤是：粉碎、干燥、 、 、 。
(3)在胡萝卜颗粒的加热干燥过程中，应严格将 和 控制在一定范围内，原因是 。
(4)提取的胡萝卜素可通过 法进行鉴定，在鉴定过程中需要用 对照。
(5)一般情况下，提取胡萝卜素时，提取效率与原料颗粒的含水量成 比。
答案 (1)橘(橙)黄 亲脂性有机溶剂(或有机溶剂) 胡萝卜素是脂类物质(或胡萝卜素不溶于水，易溶于有机溶剂) (2)萃取 萃取 过滤 浓缩
(3)温度 时间 温度过高或时间过长会导致胡萝卜素分解 (4)纸层析 标准样品 (5)反
解析 (1)胡萝卜素的颜色是橘(橙)黄色，胡萝卜素是脂类物质，根据相似相溶原理，易溶于亲脂性有机溶剂。(2)提取胡萝卜素常用萃取法，步骤：胡萝卜→粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩→胡萝卜素。(3)胡萝卜颗粒在加热过程中，应严格将温度和时间控制在一定范围内，防止胡萝卜素因温度过高和时间过长而导致分解。(4)提取到的胡萝卜素通过纸层析法鉴定，该过程需要用标准样品作为对照。(5)一般情况下，提取胡萝卜素时，提取效率与原料颗粒含水量成反比。
课时作业
[学考达标]
1.胡萝卜素可以分为α、β、γ三类，划分的依据是( )
A.层析后出现在滤纸条上的位置
B.根据在人和动物体内的功能和作用部位
C.根据分子式中碳碳双键的数目
D.根据分解后产生的维生素A的分子数
答案 C
解析 胡萝卜素的分子式中含有多个碳碳双键，如β－胡萝卜素中含有9个双键。根据双键的数目可以把胡萝卜素分为α、β、γ三类，其中β－胡萝卜素是最主要的组成成分。
2.萃取前往往要将胡萝卜烘干，粉碎，并且原料颗粒越小越好，这样做的目的是( )
A.让胡萝卜尽快溶解成胡萝卜素
B.让原料与萃取剂充分接触，提高萃取效率
C.让原料颗粒尽快溶于萃取剂中
D.节省萃取剂的使用量
答案 B
解析 这样做的目的是让原料形成尽量小的颗粒，以便原料颗粒能与萃取剂发生充分的接触，保证萃取的彻底性，提高萃取的效率。
3.有同学想研究萃取胡萝卜素的最佳温度，在设计实验时应注意的是( )
A.萃取时间不用考虑是否相同
B.使用不同的萃取剂，但量要相同
C.原料颗粒大小不同
D.除温度外，其他因素相同，以保证单一变量
答案 D
解析 本实验的目的是研究萃取胡萝卜素的最佳温度，因此，温度就应该是本实验中的实验变量，也是唯一变量，为了排除其他因素对实验结果的干扰，应保证其余条件相同。
4.下列有关萃取的说法中，不正确的是( )
A.萃取后常需分液
B.分液不一定要有萃取
C.分液常用的仪器是分液漏斗
D.萃取所用的试剂一般为水
答案 D
解析 萃取所用的溶剂一般为有机溶剂。
5.为了增加胡萝卜素的萃取量，应该( )
A.尽量使用含水量多的胡萝卜
B.尽量使用粉碎的胡萝卜颗粒
C.尽量使用水溶性强的有机溶剂
D.尽量在常温条件下萃取
答案 B
解析 胡萝卜素不溶于水，而溶于有机溶剂，因此萃取胡萝卜素时应选用水不溶性的有机溶剂作为萃取剂，同时应降低原料的含水量。为了增加胡萝卜素的萃取量，应将胡萝卜粉碎后再使用，以增加胡萝卜与萃取剂的接触面积；还应加热处理，以促进胡萝卜素快速地进入和溶解于萃取剂。
6.对胡萝卜素的提取顺序，正确的是( )
A.胡萝卜→粉碎→萃取→干燥→浓缩→过滤→胡萝卜素
B.胡萝卜→粉碎→过滤→干燥→萃取→浓缩→胡萝卜素
C.胡萝卜→粉碎→过滤→萃取→干燥→浓缩→胡萝卜素
D.胡萝卜→粉碎→干燥→萃取→过滤→浓缩→胡萝卜素
答案 D
解析 胡萝卜粉碎，干燥后进行萃取，然后进行过滤，除去萃取液中的不溶物，最后用蒸馏装置进行浓缩，就可以获得胡萝卜素。
[高考提能]
7.对比观察下列4个纸层析鉴定提取的胡萝卜素粗品的层析装置，正确的是哪一个( )
答案 D
解析 A项中将点好样的滤纸卷成筒状时，滤纸两边相互接触，会导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果；B项除与A项有相同的错误外，还有的错误是层析液太多，淹没了样点，会导致层析失败；C项中将卷好的滤纸筒贴放在色谱容器内壁上，会发生与A项同样的现象。
8.提取胡萝卜素和提取玫瑰油时都需要加热，但用萃取法提取胡萝卜素时，采用的是水浴加热法，而用水蒸气蒸馏法提取玫瑰油时是直接加热。其原因是( )
A.前者需要保持恒温，后者不需要恒温
B.前者容易蒸发，后者不容易蒸发
C.胡萝卜素不耐高温，玫瑰油耐高温
D.前者烧瓶里含有机溶剂，易燃易爆，后者瓶中是水
答案 D
解析 萃取法提取胡萝卜素利用的原理是胡萝卜素易溶于有机溶剂的特点，因为有机溶剂为易燃物，应避免明火加热防止爆炸，所以需采用水浴加热的方法。水蒸气蒸馏法提取玫瑰油利用水蒸气将挥发性强的玫瑰油携带出来，直接加热烧瓶中的热水，不易爆炸。
9.如图甲为胡萝卜素粗品鉴定装置示意图，图乙为胡萝卜素的纸层析结果示意图。下列相关叙述中，错误的是( )
A.甲图中a的作用是防止层析液挥发
B.在对甲图中的e进行点样时，应该快速细致并保持滤纸干燥
C.图乙中A、B、C、D四点中，属于标准样品样点的是A和D
D.在图中的层析谱中，②代表的物质是胡萝卜素，①代表的物质是其他色素和杂质
答案 D
解析 甲图为纸层析的装置，乙图为层析的结果。甲图中的e是样品原点，点样应该快速细致并保持滤纸干燥。图乙中的A和D是标准样品中的样点，B和C是提取样品的样点。在图中的层析谱中，①代表的物质是胡萝卜素，②代表的物质是其他色素和杂质。
10.如图为科研人员分别用六种不同的提取溶剂(编号为1～6)按相同的提取步骤提取类胡萝卜素的含量图，下列叙述错误的是( )
A.使用有机溶剂为提取剂，是因为类胡萝卜素易溶于有机溶剂
B.相同的提取步骤是为了确保单一变量
C.实验课题为探究六种溶剂系统对枸杞中类胡萝卜素提取的影响
D.实验结论为不同溶剂对不同品种的类胡萝卜素的提取量影响不同
答案 D
解析 从图中可看出，自变量为六种溶剂，因变量为类胡萝卜素含量，结论应为不同溶剂对同一品种(枸杞)的类胡萝卜素的提取量影响不同。
11.结合所学知识及装置图，回答下列问题：
(1)萃取剂可分为 和 两种，乙醇和丙酮属于 ，能否用于萃取β－胡萝卜素？ 。作为β－胡萝卜素萃取剂应符合
的特点。
(2)在提取β－胡萝卜素时，常采用的原料是 ，因为其不仅 ，而且 。
(3)萃取的效率主要取决于 ，同时也受到 等条件的影响。
(4)萃取过程中，第一步需 ，以提高效率。因为 ，所以应避免明火加热，而采用水浴加热的方法。通过加热处理，β－胡萝卜素溶解在萃取液中，再经 得到萃取液，经过 后，可用 装置直接进行浓缩。
答案 (1)水溶性 水不溶性 水溶性 不能 具有较高的沸点，能够充分溶解胡萝卜素，并且不与水混溶 (2)胡萝卜 廉价易得 β－胡萝卜素含量也较高
(3)萃取剂的性质和使用量 原料颗粒的大小、紧密程度、含水量、萃取的温度和时间 (4)将胡萝卜进行粉碎和干燥 有机溶剂大都是易燃物 萃取 过滤 蒸馏
12.胡萝卜素可用于治疗因缺乏维生素A而引起的各种疾病；还是常用的食品色素；还具有使癌变细胞恢复为正常细胞的作用。如图是提取胡萝卜素的实验流程示意图，请回答下列相关问题：
→→→→→→
(1)除了可以从植物中提取天然胡萝卜素外，还可以从养殖的岩藻中获得或者利用 生产。
(2)新鲜的胡萝卜含有大量的水分，在胡萝卜素的提取过程中，要对新鲜的胡萝卜进行
处理，但要注意控制 和时间，这是因为 。
(3)图中A过程表示 ，此过程用到的有机溶剂应该具有较高的 ，能够充分 胡萝卜素，并且不与水混溶。
(4)图中B过程表示 ，浓缩之前进行过滤的目的是 。
答案 (1)微生物的发酵
(2)干燥 温度 温度太高、干燥时间太长会导致胡萝卜素分解
(3)萃取 沸点 溶解
(4)浓缩 除去萃取液中的不溶物
解析 (1)天然胡萝卜素除取自植物外，还可以从养殖的岩藻中获得或利用微生物的发酵生产。(2)进行有机溶剂萃取时宜对原料进行干燥处理。(3)图中A为萃取，该过程所用到的有机溶剂应具有很高的沸点，能充分溶解胡萝卜素，且不与水混溶。(4)图中B为浓缩，在浓缩前宜进行过滤以除去萃取液中的不溶物。
[真题体验]
13.(2015·全国Ⅱ，39)回答与胡萝卜素有关的问题：
(1)胡萝卜含有的胡萝卜素中，最主要的是 (填“α-胡萝卜素”、“β-胡萝卜素”或“γ-胡萝卜素”)，该胡萝卜素在人体内可以转变成两分子 ，后者缺乏会引起人在弱光下视物不清的病症，该疾病称为 ，胡萝卜素是 (填“挥发性”或“非挥发性”)物质。
(2)工业生产上，用养殖的岩藻作为原料提取胡萝卜素时， (填“需要”或“不需要”)将新鲜的岩藻干燥。
(3)现有乙醇和乙酸乙酯两种溶剂，应选用其中的 作为胡萝卜素的萃取剂，不选用另外一种的理由是
。
答案 (1)β-胡萝卜素 维生素A 夜盲症 非挥发性
(2)需要 (3)乙酸乙酯 萃取胡萝卜素的有机溶剂应不与水混溶，而乙醇属于水溶性有机溶剂(其他答案合理也可)
解析 (1)胡萝卜素中β-胡萝卜素是最主要的组成成分；一分子的β-胡萝卜素在人或动物的小肠、肝脏等器官被氧化成两分子的维生素A；缺乏维生素A会造成夜盲症(暂时性夜盲症可补充维生素A得以痊愈)。胡萝卜素为非挥发性物质。(2)提取胡萝卜素时，新鲜的岩藻具有大量的水分需要进行干燥，以提高萃取效率。(3)乙酸乙酯属于水不溶性有机溶剂，能够溶解胡萝卜素；乙醇是水溶性有机溶剂，因萃取过程中能与水混溶而影响萃取效果，所以不宜选作萃取剂。
14.(2013·山东，34)胡萝卜素是一种常用的食用色素，可分别从胡萝卜或产生胡萝卜素的微生物体中提取获得，流程如下：
(1)筛选产胡萝卜素的酵母菌R时，可选用 或平板划线法接种。采用平板划线法接种时需要先灼烧接种环，其目的是 。
(2)培养酵母菌R时，培养基中的蔗糖和硝酸盐可以分别为酵母菌R提供 和 。
(3)从胡萝卜中提取胡萝卜素时，干燥过程应控制好温度和 以防止胡萝卜素分解；萃取过程中宜采用 方式加热以防止温度过高；萃取液浓缩前需进行过滤，其目的是 。
(4)纸层析法可用于鉴定所提取的胡萝卜素。鉴定过程中需要用胡萝卜素标准品作为 。
答案 (1)稀释涂布平板法 杀灭接种环上的微生物
(2)碳源 氮源
(3)干燥时间 水浴 滤去萃取液中的不溶物
(4)(实验)对照
解析 (1)接种微生物的方法主要是稀释涂布平板法和平板划线法，接种过程为了避免其他杂菌的污染，要做无菌操作，所以接种前需对接种环灭菌操作。(2)蔗糖主要提供碳源，当然也可以作为能源物质，硝酸盐含氮元素，可提供氮源。(3)温度过高、干燥时间过长会导致胡萝卜素分解；由于萃取剂往往有挥发性，直接加热时挥发出来的有机溶剂遇明火易爆炸；萃取后需将原料中的固体物滤去。(4)提取出来的胡萝卜素往往不是纯的，用标准样品主要起一个对照的作用。
