第4章 现代生物技术
知识系统构建
必背要语
1.植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，最终诱导产生愈伤组织、丛芽或完整植株的技术。
2.植物组织培养中常用的基本培养基有MS培养基、怀特培养基、N6培养基等。其中N6培养基常用于花药的组织培养。
3.电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
4.同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。
5.DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。
6.PCR原理：DNA热变性原理，PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。
规律方法整合
整合一 组织培养中污染的预防
1.污染有两种类型
(1)细菌污染。菌斑呈黏液状，界限比较明显，一般接种后1～2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌，一般是由接种人员造成的。
(2)真菌污染。菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子，接种后3～10天才能发现。主要是霉菌污染，可能是植物材料灭菌不当造成的。
2.预防措施
(1)防止外植体带菌。①选择好外植体采集时期和采集部位。外植体采集以春秋为宜，优先选择地上部分作为外植体，阴雨天勿采，晴天下午采，采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。②在室内或无菌条件下进行预培养。③外植体严格消毒。
(2)保证培养基及接种器具彻底灭菌。①分装时，注射器勿与瓶接触，培养基勿粘瓶口。②检查封口膜是否有破损。③扎瓶口要位置适当、松紧适宜。④保证灭菌时间和高压锅内温度。⑤接种工具用前彻底灭菌。⑥工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌。
(3)操作人员严格遵守无菌操作规程。如一定要规范着装，操作过程中不说话等。
(4)保证接种与培养环境清洁。①污染瓶经高压灭菌后再清洁。②接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射或用臭氧灭菌和消毒。③定期对培养室消毒、防止高温。
例1 关于接种时应注意的事项，全部正确的为( )
①接种室要消毒 ②无菌操作 ③接种时可以谈话 ④外植体如茎段、茎尖可随机放入培养基 ⑤接种时要防止交叉污染 ⑥接种完立刻盖好瓶口
A.①②③④ B.①②③④⑤⑥
C.③④⑤⑥ D.①②⑤⑥
答案 D
解析 整个接种过程必须在无菌条件下进行，不能谈话，防止呼吸产生污染。因此操作过程应禁止谈话，并戴口罩；接种的外植体放入培养基时注意将形态学下端插入，而且分布均匀，不能随机放入，以保证必要的营养面积和光照条件。
整合二 PCR技术、蛋白质分离之间的比较
项目
PCR技术
蛋白质分离
实验原理
利用DNA热变性原理体外扩增DNA
依据相对分子质量的大小分离蛋白质
实验过程
变性→复性→延伸
样品处理及粗分离→凝胶色谱操作→变性胶电泳
实验结果
获得大量DNA
相对分子质量不同的蛋白质得以分离
实验意义
解决了DNA研究中材料不足的问题
为蛋白质的研究和利用提供了原材料
例2 如图是PCR技术示意图，请据图回答下列问题：
(1)标准的PCR过程一般分为______、________、______三大步骤。
(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上来说，引物是一小段_____________。
(3)将双链DNA____________________，使之变性，从而导致______________________。
(4)引物延伸需提供______________________________________________________作为原料。
答案 (1)变性 复性 延伸 (2)单链DNA或RNA
(3)加热到94 ℃ 双链DNA解开形成两条单链
(4)四种脱氧核苷酸
整合三 DNA体内复制与体外复制(PCR)的比较
PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，与细胞内DNA复制的过程相比既有相同点又有不同点，通过列表比较的方法准确掌握两者的异同，是防止此类问题出错的重要措施。细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较：
项目
细胞内DNA复制
PCR
不同点
解旋
在解旋酶作用下边解旋边复制
95 ℃高温解旋、双链完全分开
酶
解旋酶、DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶
引物
RNA
一般为单链DNA
能量
ATP
dNTP
温度
体内温和条件
高温
循环次数
受生物自身控制
三十多次
相同点
①需提供DNA复制的模板
②四种脱氧核苷酸作原料
③子链延伸的方向都是从5′端到3′端
④都需要酶的催化
例3 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链DNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A.③④ B.①②
C.①③ D.②④
答案 C
解析 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链DNA，长度通常为20～30个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
热点考题集训
1.对于操作后出现培养物被污染的情况，正确的叙述是( )
①可立即打开培养瓶，进行清洗 ②先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗 ③按要求操作一定不出现培养物被污染 ④细菌污染可能是由接种人员未戴口罩、接种时说话等引起的 ⑤真菌污染可能是植物材料灭菌不当引起的
A.②③⑤ B.②③④⑤
C.①③④⑤ D.②④⑤
答案 D
解析 引起污染的细菌可能是由接种人员未戴口罩、接种时说话等引起的，真菌污染可能是植物材料灭菌不当引起的。为了避免再次污染，应先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗。
2.在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的瓶中外植体正常生长，有的瓶中外植体死亡，你认为外植体死亡的原因不可能是( )
A.接种时培养基灭菌不彻底
B.接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体
C.培养时每日用日光灯照12 h
D.培养过程中保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质、激素的比例
答案 C
解析 菊花的组织培养过程中需每日用日光灯照12 h，这不会造成外植体死亡。
3.菊花的组织培养需要严格的无菌操作，下列说法不正确的是( )
A.对培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌
B.幼苗要先移植到消过毒的蛭石或者珍珠岩等环境下生活一段时间
C.用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，一旦感染杂菌则前功尽弃
D.将菊花茎段插入时应注意方向，不应倒插，是为了防止杂菌污染
答案 D
解析 将菊花茎段插入时，要注意形态学上端朝上，而不应倒插，是因为生长素的运输为极性运输，倒插的菊花茎段不能形成愈伤组织，而不是为了防止杂菌污染。
4.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示。下列叙述正确的是( )
A.将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内
B.若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快
C.将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中
D.若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近
答案 C
解析 透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则乙、丁、丙均已沉淀；用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率取决于分子大小。
5.仔细观察下图，所带负电荷最少的球蛋白是( )
A.α1－球蛋白 B.α2－球蛋白
C.β－球蛋白 D.γ－球蛋白
答案 D
解析 对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极。且γ－球蛋白距点样处最近，所以γ－球蛋白所带负电荷最少。
6.下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是( )
A.片段a、b、c的长度均相同
B.片段a、b只是第一次循环的产物
C.片段c最早出现在第二次循环的产物中
D.经过30次循环后，片段c的数量为230
答案 C
解析 图中片段a、b只有一种引物， 是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项错误。由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项错误。由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C项正确。经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，故D项错误。
7.下列关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法中，正确的是( )
A.以DNA为模板，使DNA子链从5′端延伸到3′端的一种酶
B.Taq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加
C.DNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列
D.Taq DNA聚合酶是从深海中的某种菌体内发现的
答案 A
解析 DNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，引物的5′端与母链发生碱基互补配对，然后从引物的3′端延伸子链，所以，整条子链的合成是从5′端延伸到3′端；Taq DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用，无需另外再添加；PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列；Taq DNA聚合酶是1966年从美国黄石公园的一个热泉内的某种菌体内发现的。
8.如图表示PCR技术扩增DNA分子的过程中，DNA聚合酶作用的底物，据图分析正确的是( )
A.图中A为引物，是一种单链RNA分子
B.图中B为DNA模板链，F端为3′末端
C.PCR技术中通过控制温度来实现DNA双链的解旋和结合
D.DNA聚合酶无需引物也能将单个脱氧核苷酸连接成DNA片段
答案 C
解析 PCR技术中，DNA聚合酶需要引物，才能够将单个脱氧核苷酸连接成DNA片段，该技术中引物通常为单链DNA，即题图中的A；图中B为DNA模板链，F端为5′末端；PCR技术中通过高温和降温来实现DNA双链的解旋和结合。
9.辣椒素作为一种生物碱广泛应用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图，据图回答下列问题：
(1)图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的______________和____________过程。
(2)图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是______________。培养基中的生长素用量和细胞分裂素用量的比值__________(填“高”或“低”)时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是__________________。
(3)图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是________。
答案 (1)脱分化(或去分化) 再分化 (2)琼脂 低 高压蒸汽灭菌 (3)70%
解析 (1)由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。对脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，其又可重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。(2)培养基中常用的凝固剂是琼脂。使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比值影响植物细胞的发育方向。生长素用量和细胞分裂素用量的比值低时，有利于芽的分化；比值高时，有利于根的分化；比值适中时，促进愈伤组织的形成。培养基应用高压蒸汽灭菌法灭菌。(3)外植体消毒所用酒精的体积分数是70%。
10.H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型RNA流感病毒引起的，目前最为快速有效的检测手段是RT－PCR核酸检测。RT－PCR的过程包括逆转录作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增，过程如下图所示。据此分析下列问题：
(1)传统PCR技术的原理是______________，过程中低温复性的含义是________________________________________________________________________。
(2)在RT－PCR中每一步都有酶的参与，上图中过程1中的关键酶是____________；PCR中的关键酶是________________，该酶的作用特点是________、__________________________。
(3)在对病毒核酸进行检测时，主要通过RT－PCR扩增其关键的基因序列，这时引物的设计就非常关键，根据下图分析，请你选择合适的引物：__________________。
答案 (1)DNA复制 引物与模板链互补配对 (2)逆转录酶 Taq DNA聚合酶(DNA聚合酶) 耐高温 不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链 (3)引物Ⅰ和引物Ⅱ
课件36张PPT。章末整合提升第4章 现代生物技术知识系统构建规律方法整合内容索引热点考题集训知识系统构建全能性脱分化植物激素MS接种带电性质大小匀浆电泳染色引物复性延伸琼脂糖凝胶电泳1.植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，最终诱导产生愈伤组织、丛芽或完整植株的技术。
2.植物组织培养中常用的基本培养基有MS培养基、怀特培养基、N6培养基等。其中N6培养基常用于花药的组织培养。
3.电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。4.同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。
5.DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。
6.PCR原理：DNA热变性原理，PCR每次循环都包括变性、复性和延伸三步。规律方法整合整合一 组织培养中污染的预防
1.污染有两种类型
(1)细菌污染。菌斑呈黏液状，界限比较明显，一般接种后1～2天即能发现。主要是大肠杆菌和链球菌，一般是由接种人员造成的。
(2)真菌污染。菌斑呈绒毛状、絮状，界限不明显，伴有不同颜色的孢子，接种后3～10天才能发现。主要是霉菌污染，可能是植物材料灭菌不当造成的。2.预防措施
(1)防止外植体带菌。①选择好外植体采集时期和采集部位。外植体采集以春秋为宜，优先选择地上部分作为外植体，阴雨天勿采，晴天下午采，采前喷杀虫剂、杀菌剂或套塑料袋。②在室内或无菌条件下进行预培养。③外植体严格消毒。
(2)保证培养基及接种器具彻底灭菌。①分装时，注射器勿与瓶接触，培养基勿粘瓶口。②检查封口膜是否有破损。③扎瓶口要位置适当、松紧适宜。④保证灭菌时间和高压锅内温度。⑤接种工具用前彻底灭菌。⑥工作服、口罩、帽子等布质品定期进行湿热灭菌。
(3)操作人员严格遵守无菌操作规程。如一定要规范着装，操作过程中不说话等。
(4)保证接种与培养环境清洁。①污染瓶经高压灭菌后再清洁。②接种环境定期熏蒸消毒、紫外灯照射或用臭氧灭菌和消毒。③定期对培养室消毒、防止高温。例1 关于接种时应注意的事项，全部正确的为
①接种室要消毒 ②无菌操作
③接种时可以谈话 ④外植体如茎段、茎尖可随机放入培养基
⑤接种时要防止交叉污染 ⑥接种完立刻盖好瓶口
A.①②③④ B.①②③④⑤⑥
C.③④⑤⑥ D.①②⑤⑥
解析 整个接种过程必须在无菌条件下进行，不能谈话，防止呼吸产生污染。因此操作过程应禁止谈话，并戴口罩；接种的外植体放入培养基时注意将形态学下端插入，而且分布均匀，不能随机放入，以保证必要的营养面积和光照条件。答案解析整合二 PCR技术、蛋白质分离之间的比较例2 如图是PCR技术示意图，请据图回答下列问题：答案(1)标准的PCR过程一般分为 、 、
三大步骤。
(2)引物是此过程中必须加入的物质，从化学本质上来说，引物是一小段 。
(3)将双链DNA ，使之变性，从而导致 。
(4)引物延伸需提供 作为原料。变性复性延伸单链DNA或RNA加热到94 ℃双链DNA解开形成两条单链四种脱氧核苷酸整合三 DNA体内复制与体外复制(PCR)的比较
PCR技术是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，与细胞内DNA复制的过程相比既有相同点又有不同点，通过列表比较的方法准确掌握两者的异同，是防止此类问题出错的重要措施。细胞内DNA复制与体外DNA扩增(PCR)的比较：例3 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是
①PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链DNA
②PCR过程不需要DNA聚合酶
③PCR过程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的
④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A.③④ B.①②
C.①③ D.②④答案解析解析 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：
(1)PCR过程需要的引物一般是人工合成的单链DNA，长度通常为20～30个核苷酸。
(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。热点考题集训1.对于操作后出现培养物被污染的情况，正确的叙述是
①可立即打开培养瓶，进行清洗
②先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗
③按要求操作一定不出现培养物被污染
④细菌污染可能是由接种人员未戴口罩、接种时说话等引起的
⑤真菌污染可能是植物材料灭菌不当引起的
A.②③⑤ B.②③④⑤
C.①③④⑤ D.②④⑤答案解析23451789106√23451789106解析 引起污染的细菌可能是由接种人员未戴口罩、接种时说话等引起的，真菌污染可能是植物材料灭菌不当引起的。为了避免再次污染，应先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗。2.在菊花的组织培养操作完成了3～4天后，观察同一温室中的外植体，发现有的瓶中外植体正常生长，有的瓶中外植体死亡，你认为外植体死亡的原因不可能是
A.接种时培养基灭菌不彻底
B.接种工具灼烧后未待冷却就接种外植体
C.培养时每日用日光灯照12 h
D.培养过程中保持温度、pH的适宜，但没有及时调整各种营养物质、激素的
比例
解析 菊花的组织培养过程中需每日用日光灯照12 h，这不会造成外植体死亡。答案解析23451789106√3.菊花的组织培养需要严格的无菌操作，下列说法不正确的是
A.对培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌
B.幼苗要先移植到消过毒的蛭石或者珍珠岩等环境下生活一段时间
C.用于植物组织培养的培养基同样适合于某些微生物的生长，一旦感染
杂菌则前功尽弃
D.将菊花茎段插入时应注意方向，不应倒插，是为了防止杂菌污染
解析 将菊花茎段插入时，要注意形态学上端朝上，而不应倒插，是因为生长素的运输为极性运输，倒插的菊花茎段不能形成愈伤组织，而不是为了防止杂菌污染。答案解析√234517891064.已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如右图所示。下列叙述正确的是
A.将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在
袋内，则分子甲也保留在袋内
B.若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快
C.将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分
子丙也存在于沉淀中
D.若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白
质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近答案解析23451789106√23451789106解析 透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离时，相对分子质量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则乙、丁、丙均已沉淀；用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率取决于分子大小。5.仔细观察下图，所带负电荷最少的球蛋白是答案解析23451789106A.α1－球蛋白 B.α2－球蛋白
C.β－球蛋白 D.γ－球蛋白
解析 对于几种球蛋白来说直径相差不大，引起泳动速度的差异主要来自于所带电荷多少，由图可知球蛋白由右向左泳动，因右侧为负极。且γ－球蛋白距点样处最近，所以γ－球蛋白所带负电荷最少。√6.下图a、b、c均为PCR扩增的DNA片段，下列有关说法正确的是答案23451789106解析A.片段a、b、c的长度均相同
B.片段a、b只是第一次循环的产物
C.片段c最早出现在第二次循环的产物中
D.经过30次循环后，片段c的数量为230√23451789106解析 图中片段a、b只有一种引物， 是由原始DNA链为模板复制而来，其长度比片段c长，A项错误。
由于原始模板在每次循环中均可作为模板，则每次循环都能产生图中片段a、b，B项错误。
由于第一次循环的产物只有一种引物，而图中片段c有两种引物，则最早出现在第二次循环，C项正确。
经过30次循环后，得到的DNA片段总数为230，这包括图中的片段a、b，故D项错误。7.下列关于DNA聚合酶催化合成DNA子链的说法中，正确的是
A.以DNA为模板，使DNA子链从5′端延伸到3′端的一种酶
B.Taq DNA聚合酶必须在每次高温变性处理后再添加
C.DNA聚合酶能特异性地复制整个DNA的全部序列
D.Taq DNA聚合酶是从深海中的某种菌体内发现的
解析 DNA聚合酶不能从头开始催化合成DNA，引物的5′端与母链发生碱基互补配对，然后从引物的3′端延伸子链，所以，整条子链的合成是从5′端延伸到3′端；Taq DNA聚合酶能耐高温，所以在反应体系中可反复利用，无需另外再添加；PCR扩增的是引物之间的固定长度的DNA序列；Taq DNA聚合酶是1966年从美国黄石公园的一个热泉内的某种菌体内发现的。23451789106答案解析√8.如图表示PCR技术扩增DNA分子的过程中，DNA聚合酶作用的底物，据图分析正确的是23451789106A.图中A为引物，是一种单链RNA分子
B.图中B为DNA模板链，F端为3′末端
C.PCR技术中通过控制温度来实现DNA双链的解旋和结合
D.DNA聚合酶无需引物也能将单个脱氧核苷酸连接成DNA片段答案解析√23451789106解析 PCR技术中，DNA聚合酶需要引物，才能够将单个脱氧核苷酸连接成DNA片段，该技术中引物通常为单链DNA，即题图中的A；图中B为DNA模板链，F端为5′末端；PCR技术中通过高温和降温来实现DNA双链的解旋和结合。9.辣椒素作为一种生物碱广泛应用于食品保健、医药工业等领域。辣椒素的获得途径如图，据图回答下列问题：答案23451789106(1)图中①和②分别表示辣椒组织培养中细胞的 和_______
过程。
解析 由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，称为植物细胞的脱分化，或者叫做去分化。对脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，其又可重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。脱分化(或去分化)再分化解析(2)图中培养外植体的培养基中常用的凝固剂是 。培养基中的生长素用量和细胞分裂素用量的比值 (填“高”或“低”)时，有利于芽的分化。对培养基彻底灭菌时，应采取的灭菌方法是 。答案23451789106琼脂低高压蒸汽灭菌解析 培养基中常用的凝固剂是琼脂。使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比值影响植物细胞的发育方向。生长素用量和细胞分裂素用量的比值低时，有利于芽的分化；比值高时，有利于根的分化；比值适中时，促进愈伤组织的形成。培养基应用高压蒸汽灭菌法灭菌。解析答案23451789106(3)图中外植体的消毒所需酒精的体积分数是 。解析 外植体消毒所用酒精的体积分数是70%。70%解析10.H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型RNA流感病毒引起的，目前最为快速有效的检测手段是RT－PCR核酸检测。RT－PCR的过程包括逆转录作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增，过程如下图所示。据此分析下列问题：23451789106(1)传统PCR技术的原理是 ，过程中低温复性的含义是_______
。23451789106答案DNA复制引物与模板链互补配对(2)在RT－PCR中每一步都有酶的参与，下图中过程1中的关键酶是______
；PCR中的关键酶是 ，该酶的作用特点是 、 。23451789106答案逆转录酶Taq DNA聚合酶(DNA聚合酶)耐高温不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链答案(3)在对病毒核酸进行检测时，主要通过RT－PCR扩增其关键的基因序列，这时引物的设计就非常关键，根据下图分析，请你选择合适的引物：
。23451789106引物Ⅰ和引物Ⅱ第13课时 植物的组织培养
[学习导航] 1.阅读教材P68、P72内容，了解植物组织培养的基本过程、影响因素和在生产实践中的应用。2.结合教材P68～71内容，尝试胡萝卜的组织培养。
[重难点击] 1.理解植物激素对脱分化和再分化过程的影响。2.归纳MS培养基的配制方法，并设计表格比较微生物培养基与MS培养基的配方的异同。
一、植物组织培养的基本过程和影响因素
我们在必修一中已经学习过一些植物组织培养的知识，请结合探究内容，掌握组织培养的过程。
1.原理
理论基础：细胞的全能性。
(1)概念：已经分化的细胞，仍然具有发育成完整个体的潜能。
(2)原因：具有该种生物全套遗传信息。
2.植物组织培养的过程
植物组织培养就是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，最终诱导产生愈伤组织、丛芽或完整植株的技术。
上图中：
(1)B是愈伤组织，其特点是：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
(2)A过程是脱分化，是指由高度分化的植物组织或细胞产生愈伤组织的过程，又叫去分化。
(3)C过程是再分化，是指愈伤组织重新分化成根或芽等器官的过程。
(4)植物组织培养的过程反映了植物细胞的全能性，证明分化的植物细胞仍具有形成完整植株所需要的全部基因。
3.植物组织培养的影响因素
(1)培养基：植物组织培养中常用的基本培养基有MS培养基、怀特培养基、N6培养基等。其中N6培养基常用于植物花药的组织培养。
(2)植物生长调节剂对植物组织培养的影响
①植物生长调节剂的作用
类别
植物生长调节剂
作用
生长素类
IAA(吲哚乙酸)、IBA、NAA
诱导生根，促进茎的增长
2,4－D
诱导植物愈伤组织，抑制植物形态的发生
细胞分裂素类
6－BA
诱导愈伤组织分化出丛芽
KT和玉米素
刺激培养物的细胞加速分裂，加快培养物的生长速度
赤霉素类
AG3
刺激培养细胞的伸长
②植物激素用量比例的影响
生长素/细胞分裂素比值与结果
比值高时
诱导植物组织脱分化和根原基的形成
比值低时
诱导植物组织再分化和芽原基的形成
比值适中
促进愈伤组织生长
(3)其他因素的影响：pH、温度、光照等条件也对植物组织培养有重要的影响。
1.植物组织培养的理论基础
(1)为什么高度分化的植物细胞还具有全能性？
答案 因为高度分化的植物细胞中含有该物种的全套遗传物质。
(2)高度分化的植物细胞发育成完整的植株需要哪些条件？
答案 ①离体条件；②充足的营养条件；③恰当的激素种类及浓度配比；④适宜的环境条件；⑤无菌条件。
2.植物组织培养的一般过程分析
(1)你认为植物组织培养的核心环节是什么？
答案 植物组织培养的核心环节为脱分化和再分化。
(2)你认为菊花的组织培养的再分化应先诱导生芽还是先诱导生根？
答案 应先诱导生芽，再诱导生根。
(3)植物组织培养的实验操作主要有哪几个步骤？
答案 主要有6个步骤：①制备MS固体培养基；②外植体消毒；③接种；④培养；⑤移栽；⑥栽培。
(4)在配制培养基的过程中，pH的调节是在分瓶前还是分瓶后？
答案 在分瓶前调节pH。
3.植物组织培养中应尽量选择什么样的材料？为什么？
答案 应尽量选择幼嫩的植物组织或器官。因为植物组织或器官年龄越小，分化程度越低，组织培养的成功率就越高。
归纳总结 植物组织培养的过程分析
过程
主要变化
特点
脱分化
由外植体形成愈伤组织
由高度分化的细胞恢复为具有分裂能力的细胞
再分化
由愈伤组织形成根、芽等器官
重新分化出不同的组织、器官
生长
发育成完整植物体
包括营养生长和生殖生长
1.关于植物组织培养技术的叙述正确的是( )
A.用于培养的材料不一定需要离体
B.植物可通过光合作用合成有机物，培养基中不需要加入含碳有机物
C.愈伤组织可制造成人工种子
D.脱分化和再分化都需要培养基中生长素和细胞分裂素刺激、诱导
答案 D
解析 用于培养的材料一定需要离体，否则基因选择性表达会形成组织和器官，A项错误；植物组织培养基中需加入含碳有机物，提供碳源和能源，而完整植株才能进行光合作用，B项错误；胚状体可制成人工种子，C项错误；不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同，可诱导培养物进行分裂和分化，D项正确。
2.如图是基因型为AaBb的菊花茎尖离体培养示意图，据图回答下列问题：
―→
(1)图中A和B分别表示____________和____________。菊花茎尖培养成植物体的根本原因是__________________________。
(2)菊花的组织培养形成试管苗的过程中，其中应大量供给的元素是___________________。试管苗形成过程中要给予一定光照，其原因是_______________________________________。
(3)脱分化是指____________________________________________。脱分化和再分化这两个过程的进行，除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，还要保证______________，否则植物组织培养就不能成功。
(4)这样培养成的试管苗的基因型为________。
答案 (1)脱分化 再分化 植物细胞具有全能性
(2)N、S、P、K、Ca、Mg 试管苗形成过程中要进行光合作用合成有机物
(3)高度分化的植物组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织的过程 无菌
(4)AaBb
解析 (1)离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。脱分化产生的愈伤组织继续培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。菊花茎尖能培养成植物体的根本原因是植物细胞具有全能性。(2)离体的植物组织和细胞，常用MS培养基培养，其主要成分包括：大量元素，如N、P、K、Ca、Mg、S；微量元素，如Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Co、I；有机物以及蔗糖等。在试管苗形成过程中要每日给予光照12 h，其原因是试管苗形成过程中要进行光合作用合成有机物。(3)脱分化和再分化这两个过程的进行除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，还要保证无菌，原因是杂菌产生的毒素等物质会影响或阻碍植物组织脱分化形成愈伤组织或再分化为根和芽，且杂菌的繁殖能力很强，会与植物组织争夺培养基中的营养物质，使植物得不到营养，同时杂菌还会侵染植株，使之受到伤害。(4)由于植物组织培养过程中细胞进行有丝分裂，所以培养成的试管苗的基因型为AaBb。
特别提醒 植物组织培养的两点误区警示
(1)细胞全能性表达的理解
①细胞全能性的表达是由单个细胞发育成完整个体，发育的终点是完整个体，若发育为某个器官或组织不属于细胞全能性的表达。
②细胞全能性的大小是自然条件下的，在适宜外界条件下，植物的体细胞培养比生殖细胞的培养更容易。
(2)对愈伤组织特点的理解：愈伤组织的细胞是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞，具有旺盛的分裂能力，无中央大液泡。
二、胡萝卜的组织培养
下面我们以胡萝卜的肉质茎为材料，体验植物组织培养的基本过程和方法。
1.配制培养基
(1)配制MS培养基
①预先配制成储备液，储存在4 ℃的冰箱中备用。储备液一般包括10倍的大量元素、100倍的微量元素、100倍的有机成分、100倍的Fe盐和0.1 mg/mL的生长激素。蔗糖的用量大多为3%，琼脂用量一般为0.5%～1.0%。
②取少量蒸馏水，按比例加入各种母液和药剂。
③用0.1mol/L的NaOH或HCl调整pH到5.8，定容到设计的最终体积。
④加入琼脂，加热溶解后分装到试管或锥形瓶中。
⑤121℃高压灭菌20 min。
(2)以MS基本培养基为基础配制所需各种培养基
①诱导培养基(MS培养基＋1.0 mg/L 2,4－D)。
②继代培养基(MS培养基＋0.5 mg/L 2,4－D)。
③分化培养基(不添加植物生长调节剂)。
④生根培养基(1/2MS培养基＋0.5 mg/L IBA)。
2.获取培养用胡萝卜组织块
(1)将胡萝卜的根用洗涤剂充分洗净，切段。
(2)在超净工作台上将胡萝卜段用体积分数为70%的酒精消毒30 s后，立即用无菌水冲洗2～3次。再用体积分数为20%的次氯酸钠溶液浸泡30 min后，立即用无菌水清洗2～3次。
(3)用无菌的滤纸吸去表面水分，选取有形成层的部位将胡萝卜段切成2_mm×2_mm×2_mm左右的小块。
3.接种培养
(1)将组织块接种到无菌的诱导培养基上，封紧瓶口，标记。23 ℃～26 ℃恒温避光培养，定期观察记录，计算出愈率。30 d左右后，将愈伤组织分切成小块，然后转接到继代培养基上培养。
(2)将愈伤组织转接到分化培养基上，23 ℃～26 ℃恒温光照培养，每天光照12 h持续14d后，统计计算分化率。
(3)将分化出的幼苗转接到生根培养基上，培养14 d后，统计并计算出生根率。
4.移栽：将试管苗移栽到大田栽培。
1.营养物质对组织培养的作用
(1)MS培养基中各种营养物质有什么作用？
答案 ①大量元素和微量元素：提供植物细胞生活所必需的无机盐。
②蔗糖：提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压。
③甘氨酸、维生素等有机物：主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。
(2)植物是自养生物，为什么用于植物组织培养的MS培养基中需要加入有机物作为碳源？
答案 通常植物体本身进行光合作用产生糖类，不需要外部供给糖，但植物组织培养利用的是离体组织或细胞，在其脱分化过程中不能进行光合作用合成糖类，因此必须在培养基中添加糖类，作为碳源和能源物质，同时维持培养基的渗透压。
2.在植物组织培养过程中是如何实现无菌操作的？
答案 (1)对于培养基：用高压蒸汽灭菌法灭菌。
(2)对于外植体：用酒精和次氯酸钠溶液消毒，放到无菌箱中培养，移栽到消过毒的环境中生活一段时间。
3.植物组织培养技术有哪些用途？
答案 优良品种的快速繁殖、培育脱毒作物、人工种子、单倍体育种、工厂化生产细胞产物等。
归纳总结 试管苗培养过程中应注意的问题
(1(培养一株完整的试管苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养，如果顺序颠倒，先诱导生根，就不好诱导生芽了。
(2(试管苗应该进行见光培养。
(3(试管苗一般在高湿、弱光、恒温下异养生长，出瓶后一定要保温、保湿。
(4(试管苗光合作用能力低，在移栽前给予较强光照闭瓶炼苗，以促进小苗向自养转化。
(5(无菌技术是植物组织培养成功的关键。植物组织培养不同于扦插、压条等常规的无性繁殖。由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高，对无菌操作的要求非常严格。若不小心引起污染，将可能造成培养工作前功尽弃，因此实验过程始终贯穿着灭菌消毒。对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官都要区别对待。
3.生物工程的研究成果已经广泛应用于各个领域，目前科学家利用植物的茎尖和叶片、茎段等，在无菌条件下，培养在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使之发育成完整的植株。下图是运用该技术培养兰花植株的示意图。下列关于这种生物工程技术的叙述，错误的是( )
A.这种技术叫做植物组织培养，可以克隆生物体
B.④过程的单细胞细胞质丰富，液泡小而细胞核大
C.用此方法克隆植物要尽量选择优良、细胞全能性表达不充分的材料
D.这种技术可与基因工程、航天工程结合培育高产、优质的作物品种
问题导析 (1)植物组织培养过程中，细胞中的遗传物质一般不会(填“会”或“不会”)发生改变，所以该项技术属于一种克隆技术。
(2)通过基因工程将目的基因导入植物细胞后，必须采用植物组织培养技术将植物细胞培养成植株。
答案 C
解析 ④过程的单细胞细胞质丰富，液泡小而细胞核大，这是胚性细胞(类似胚胎细胞)的特征，在适宜的培养基中，这种单细胞可发育成胚状体。要获得植物克隆的成功，应尽量选择优良、细胞全能性表达充分的材料。随着科技的发展，植物组织培养可与基因工程、航天工程结合培育高产、优质的作物品种。
4.下列关于MS培养基与微生物培养基的配方相比的不同之处，说法错误的是( )
A.MS培养基中常常添加植物激素，微生物培养基中不需要
B.MS培养基中的碳源和能源是蔗糖，微生物培养基中的碳源和能源主要是葡萄糖
C.MS培养基中需提供植物生长必需的大量元素和微量元素
D.MS培养基中不需加维生素，微生物培养基中要加维生素作生长因子
答案 D
解析 MS培养基中需要加入甘氨酸、维生素等物质，主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。
易错辨析 微生物培养基与MS培养基配方的不同
微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养、无机盐混合物包括植物生长必需的大量元素和微量元素两大类。
1.1958年，美国科学家斯蒂尔德应用植物组织培养技术，将二倍体胡萝卜韧皮部的一些细胞进行离体培养，最终发育成完整的新植株。下列关于这一科学事实的叙述中，错误的是( )
①该实验证明了植物细胞具有全能性
②此种生殖产生的后代有广泛的变异
③韧皮部细胞通过减数分裂增加细胞数目
④此种生殖产生的后代能保持亲本的性状
A.①② B.②③
C.②④ D.③④
答案 B
解析 体细胞组织培养属于无性繁殖，其后代能保持亲本的性状，变异性小；体细胞不能进行减数分裂。
2.下面为植物组织培养过程图解，以下相关叙述错误的是( )
A.b过程发生了脱分化，在此过程中植物激素不发挥作用
B.c过程发生了再分化，是愈伤组织重新分化成根或芽等器官的过程
C.d过程是在胚状结构外包裹人工胚乳和人工种皮制成人工种子
D.人工种子可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等问题
答案 A
解析 在植物脱分化的b过程中，利用植物生长素、细胞分裂素等植物激素可以诱导植物细胞脱分化，因此在此过程中植物激素发挥重要作用。
3.影响植物组织培养的因素包括( )
①培养基的配制 ②外植体的选取 ③激素的使用 ④消毒 ⑤温度、pH、光照
A.①②③④⑤ B.①②③
C.①②③④ D.①②③⑤
答案 A
解析 植物组织培养过程受多种外界因素的影响，其中包括温度、光照、pH等，而培养基的成分、外植体的选取和消毒是否严格等也影响组织培养。
4.下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是( )
A.培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
B.培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的形成和分化
C.离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D.同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因组成相同
答案 D
解析 在植物组织培养过程中，蔗糖是最常用的碳源和能源物质，蔗糖还可以调节培养基的渗透压，从而维持细胞正常的形态和功能；愈伤组织的分化常受细胞分裂素及生长素用量比例的调节，当这一用量比值高时，可诱导芽的形成，反之则有促进生根的趋势；对于同一株绿色开花植物来说，花粉是通过减数分裂形成的，离体培养获得的愈伤组织细胞和体细胞培养获得的愈伤组织细胞基因组成并不完全一样，假定该植株基因型为Aa，花粉培养获得的愈伤组织细胞基因型为A或a，而体细胞培养获得的愈伤组织细胞基因型为Aa，二者不一样。
5.下图表示菊花的茎尖细胞通过无菌操作接种到试管培养基上后，在一定的条件下，形成试管苗的培育过程，请据图回答下列问题：
(1)要促进细胞分裂生长，培养基中应有营养物质和激素。营养物质包括____________和小分子有机物，激素包括细胞分裂素和____________两类植物激素。
(2)此过程依据的原理是________________________________________________________。
A和B阶段主要进行的分裂方式是______________________________________________，
B阶段除了细胞分裂外，还进行细胞______________等。
(3)此过程要无菌操作，主要是指对__________进行灭菌消毒。B阶段需要光照，原因是
________________________________________________________________________。
(4)试管苗的根细胞没有叶绿素，而叶的叶肉细胞具有叶绿素，这是基因__________的结果。
答案 (1)无机物 生长素 (2)细胞的全能性 有丝分裂 分化 (3)培养基 芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照条件 (4)选择性表达
解析 植物组织培养是用离体的植物组织、器官或细胞接种到经消毒灭菌的培养基中，培养基含有供组织细胞生长发育所需要的无机物和小分子有机物，还有调节细胞脱分化和再分化的细胞分裂素和生长素。由外植体发育成试管苗，脱分化阶段细胞进行有丝分裂，再分化阶段愈伤组织细胞经有丝分裂和细胞分化形成试管苗，此阶段需要光照，原因是叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照条件。
课时作业
[基础过关]
1.植物学家将胡萝卜的韧皮部细胞分离出来，将单个细胞放入特定的培养基中培养，获得了许多完整的植株，此过程依据的原理和技术分别是( )
A.细胞分裂和细胞工程
B.细胞的分化和基因工程
C.植物细胞的全能性和植物组织培养
D.花药离体培养和单倍体育种
答案 C
2.植物组织培养依据的原理、培养过程的顺序及诱导使用的植物激素分别是( )
①细胞的全能性 ②离体植物器官、组织或细胞 ③根、芽 ④生长素和细胞分裂素 ⑤生长素和乙烯 ⑥愈伤组织 ⑦再分化 ⑧脱分化 ⑨植物体
A.①、②⑦⑥⑧③⑨、④ B.①、②⑧⑥⑦③⑨、④
C.①、⑥②⑨⑧③⑦、⑤ D.①、②⑨⑧⑥⑦③、⑤
答案 B
解析 植物组织培养依据的原理为植物细胞的全能性；培养过程的顺序是离体植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织，再分化形成根、芽等进而形成新的植物体；诱导使用的植物激素是生长素和细胞分裂素。
3.植物材料的选择直接关系到实验的成败，菊花选材一般选择的是( )
A.未开花植株的茎上部新萌生的侧枝
B.开花植株的茎上部枝条
C.开花植株上的花药
D.未开花植株的茎下部的枝条
答案 A
解析 进行组织培养一般选用幼嫩部分。
4.植物细胞表现出全能性的必要条件是( )
A.给予适宜的营养和外界条件
B.导入其他植物的基因
C.脱离母体并给予适宜的营养和外界条件
D.将成熟筛管的细胞核移植到去核的卵细胞中
答案 C
5.植物组织培养的基本过程：外植体愈伤组织形成根和芽。下列相关叙述中，错误的是( )
A.该过程的理论基础是植物细胞的全能性
B.脱分化依赖有丝分裂完成
C.愈伤组织中的细胞形态、结构相似
D.再分化的实质是某些基因缺失，某些基因表达
答案 D
解析 植物组织培养的理论基础是植物细胞的全能性，A正确；脱分化过程中进行的增殖方式是有丝分裂，该过程还没有进行细胞分化，所以愈伤组织中的细胞形态、结构相似，B、C正确；细胞分化的实质是基因的选择性表达，该过程中没有基因的缺失，D错误。
6.在离体的植物器官、组织或细胞脱分化形成愈伤组织的过程中，需要下列哪些条件( )
①消毒灭菌 ②一定浓度的植物激素 ③适宜的温度 ④充足的光照 ⑤充足的养料 ⑥适宜的pH
A.①③④⑤ B.②③⑤⑥
C.①②③④⑤⑥ D.①②③⑤⑥
答案 D
解析 整个植物组织培养过程中需要无菌环境、激素的调节、适宜温度和pH。形成愈伤组织的过程中，细胞中叶绿体还没有形成，不需要光照进行光合作用，不能制造有机物，需要外界给予。
[能力提升]
7.在植物组织培养再分化阶段中，逐渐改变培养基中植物激素X和植物激素Y的浓度比，细胞群的变化情况如图所示。若培养基中植物激素X的浓度为a、植物激素Y的浓度为a＋0.2，则细胞群分化的结果最可能是试管( )
答案 C
解析 从图中可以看出，植物激素比例适中时有利于愈伤组织的形成，而当植物激素X多于植物激素Y时有利于芽的分化，反之则有利于根的分化，所以当植物激素X浓度为a，而植物激素Y比X多0.2时的培养结果应为C。
8.下列关于植物组织培养中植物激素使用的说法，不正确的是( )
A.植物组织培养中的关键性激素是生长素和细胞分裂素
B.先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂和分化
C.先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂也分化
D.同时使用生长素和细胞分裂素时，两者用量的比例影响植物细胞的发育方向
答案 B
解析 在植物组织培养中，培养基中除营养成分外还须添加植物激素，一般包括生长素和细胞分裂素；外植体脱分化、再分化的诱导方向取决于二者的比例。先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化；先使用细胞分裂素，后使用生长素，对细胞的分裂和分化均有利。
9.下列关于植物组织培养条件控制的叙述中，不正确的是( )
A.选择培养的植物组织最好是分裂能力强的分生组织
B.培养细菌所用的蛋白胨培养基可以用于植物组织培养
C.可以控制生长素和细胞分裂素的使用顺序和用量控制培养的结果
D.菊花组织培养需要光照
答案 B
解析 植物组织培养的第一步就是脱分化，脱分化的实质是有丝分裂，所以用于植物组织培养的组织应是分裂能力强的组织，如分生组织，A正确；用于植物组织培养的培养基是MS培养基，其成分不同于培养微生物的培养基，所以培养微生物的培养基不能用于植物组织培养，B错误；菊花组织培养后期需要光照条件，D正确。
10.某兴趣小组拟用组织培养繁殖一种名贵花卉，其技术路线为“取材→消毒→愈伤组织培养→出芽→生根→移栽”。下列有关叙述，错误的是( )
A.消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害
B.在愈伤组织培养中加入细胞融合的诱导剂，可获得染色体加倍的细胞
C.出芽是细胞再分化的结果，受基因选择性表达的调控
D.生根时，培养基通常应含α－萘乙酸等生长素类调节剂
答案 B
解析 组织培养时应确保无菌操作，消毒剂的使用原则是既能杀死材料表面的微生物，又能防止伤害组织细胞，A正确；植物细胞融合是指经纤维素酶和果胶酶处理后得到的原生质体的诱导融合，具有细胞壁的愈伤组织细胞不能诱导融合形成染色体加倍的细胞，B错误；出芽和生根都是细胞再分化的结果，其实质是基因的选择性表达，C正确；α－萘乙酸为生长素类似物，可诱导愈伤组织生根，D正确。
11.植物组织培养的培养基中加有植物激素。下表是培养基中两种植物激素在不同比例时的实验结果(其中6-BA是细胞分裂素，IAA是生长素)。请分析完成下列问题：
实验组别
1
2
3
4
激素种类及激素浓度关系
6-BA
6-BA＞IAA
6-BA＝IAA
6-BA＜IAA
结果
组织块产生愈伤组织
组织块分化出芽
愈伤组织不断生长
愈伤组织有生根趋势
(1)促进愈伤组织产生的条件是__________________________________________________，
愈伤组织生长的条件是_________________________________________________________。
(2)芽的分化条件是_____________________________________________________________，
根的分化条件是____________________________________________________________。
(3)在植物组织培养中，脱分化可用的激素组合是实验______________和实验__________中的激素浓度关系，再分化时可用的激素组合是实验____________和实验______________中的激素浓度关系。整个实验表明，植物的生根、发芽等生命活动是____________________的结果。
(4)植物组织培养的培养基中，除激素外，还必须含有______________，它的成分至少应该含有__________、____________等。
(5)判断愈伤组织是否产生的依据是看是否产生了______________________________的细胞。
答案 (1)必须有细胞分裂素 细胞分裂素与生长素含量相等 (2)细胞分裂素的含量大于生长素的含量 生长素的含量大于细胞分裂素的含量 (3)1 3 2 4 多种激素共同作用 (4)营养物质 矿质元素 有机物
(5)排列疏松而无规则、高度液泡化的呈无定形状态
解析 (1)由表中实验1和实验3的数据显示，促进愈伤组织产生的条件是必须有细胞分裂素，愈伤组织生长的条件是细胞分裂素与生长素含量相等。(2)由实验2和4可知，细胞分裂素的含量大于生长素的含量，促进芽的分化，生长素的含量大于细胞分裂素的含量促进根的分化。(3)表中1、3组激素的使用利于愈伤组织的形成与生长，即为脱分化。2、4组激素的使用利于根或芽的分化，即为再分化。(4)植物组织培养的培养基中，除激素外，还必须含有营养物质，它的成分至少应该含有矿质元素、有机物等。(5)愈伤组织是一种分化程度较低的细胞，是排列疏松而无规则、高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
12.斯蒂尔德将胡萝卜韧皮部细胞进行培养，最终获得发育完整的新个体，实验过程如下：
细胞团胚状体―→植株
(1)A过程称为______________，诱导这一过程的物质是______________。这一实验的原理是____________________。
(2)植物组织培养过程中多次强调一系列的消毒、灭菌及无菌操作，原因是
________________________________________________________________________。
(3)愈伤组织的培养是很重要的一步，一般从接种到出现愈伤组织需要14 d，到时可以看到外植体长出__________色或__________色的__________状的愈伤组织。
(4)培养时注意恒温箱要关闭光源，因为在__________条件下愈伤组织长得更快，两周以后，由于培养基中的营养几乎耗尽，必须________________进行继续培养。
(5)试管苗的培养可分为__________培养和__________培养，必须先进行____________培养，二者的区别在于____________________________________________________________。
答案 (1)脱分化 植物激素(或生长素与细胞分裂素) 植物细胞具有全能性 (2)外植体材料体积小，抗性差，如果不小心引起污染，将可能造成培养工作的前功尽弃 (3)乳白 黄 瘤 (4)无光 更换培养基 (5)生芽 生根 生芽 培养基中的生长素和细胞分裂素的比例不同
解析 (1)A过程表示由离体的细胞发育成细胞团，所以为脱分化过程，诱导脱分化过程需要有植物激素，主要为生长素和细胞分裂素，该过程的原理是植物细胞的全能性。(2)同植物体相比较，离体的植物组织抗性差，所以在组织培养整个过程中都要执行严格的消毒程序。(3)愈伤组织为外植体经脱分化形成的乳白色或黄色的瘤状物。(4)进行组织培养过程脱分化阶段不需要光照，但在再分化阶段，由于叶片中叶绿素的形成需要光照；当营养耗尽时，需更换有丰富营养成分的培养基。(5)试管苗的培养分为生根和生芽培养，但是先生芽，才有利于生根，生根培养基与生芽培养基的区别就在于生长素和细胞分裂素的比例不同。
[真题体验]
13.(2014·江苏，29，节选)为了获得植物次生代谢产物，先用植物外植体获得愈伤组织，然后在液体培养基中悬浮培养。请回答下列问题：
(1)外植体经诱导后形成愈伤组织的过程称为______________。
(2)在愈伤组织悬浮培养时，细胞干重、蔗糖浓度和pH的变化如图所示。细胞干重在12 d后下降的原因有____________；培养液中蔗糖的作用是____________、______________。
答案 (1)脱分化 (2)蔗糖浓度下降，pH降低 提供能源 调节渗透压
解析 (1)外植体在人工、无菌条件下，经脱分化可形成愈伤组织。(2)由图蔗糖浓度下降，可知外植体离体培养过程中需要消耗蔗糖，12 d后蔗糖浓度变化不大；pH下降会影响酶的活性，愈伤组织细胞对物质的合成小于分解，细胞干重下降。植物组织培养过程中，蔗糖既能维持一定的渗透压，又能提供植物细胞生命活动必需的营养物质(能量)。
14.(2012·新课标全国，39)为了探究6-BA和IAA对某菊花品种茎尖外植体再生丛芽的影响，某研究小组在MS培养基中加入6-BA和IAA，配制成四种培养基(见下表)，灭菌后分别接种数量相同、生长状态一致、消毒后的茎尖外植体，在适宜条件下培养一段时间后，统计再生丛芽外植体的比率(m)，以及再生丛芽外植体上的丛芽平均数(n)，结果如表所示。
培养基编号
浓度/mg·L－1
m/%
n/个
6-BA
IAA
1
0.5
0
76.7
3.1
2
0.1
77.4
6.1
3
0.2
66.7
5.3
4
0.5
60.0
5.0
回答下列问题：
(1)按照植物的需求量，培养基中无机盐的元素可分为____________和____________两类。上述培养基中，6-BA属于____________类生长调节剂。
(2)在该实验中，自变量是____________，因变量是_________________________________，自变量的取值范围是______________。
(3)从实验结果可知，诱导丛芽总数最少的培养基是____________号培养基。
(4)为了诱导该菊花试管苗生根，培养基中一般不加入________(填“6-BA”或“IAA”)。
答案 (1)大量元素 微量元素 细胞分裂素 (2)IAA浓度 再生丛芽外植体的比率(m)和再生丛芽外植体上的丛芽平均数(n) 0～0.5 mg·L－1 (3)1 (4)6-BA
解析 (1)根据植物的需求量，组成生物体的元素可以分为大量元素和微量元素，6-BA属于细胞分裂素类生长调节剂。(2)根据实验目的和实验步骤中的数据，可以得出IAA的浓度是自变量，菊花再生丛芽外植体的比率和外植体上的丛芽平均数是因变量。由表中数据可以看出IAA的浓度范围是0～0.5 mg·L－1。(3)再生丛芽的外植体数乘以外植体上丛芽平均数即为丛芽总数，诱导丛芽总数最少的培养基是1号培养基。(4)当生长素用量与细胞分裂素用量的比值较高时，容易诱导试管苗生根，所以培养基中一般加入IAA，而不加入6-BA。
课件49张PPT。第13课时 植物的组织培养第4章 现代生物技术学习导航
1.阅读教材P68、P72内容，了解植物组织培养的基本过程、影响因素和在生产实践中的应用。
2.结合教材P68～71内容，尝试胡萝卜的组织培养。
重难点击
1.理解植物激素对脱分化和再分化过程的影响。
2.归纳MS培养基的配制方法，并设计表格比较微生物培养基与MS培养基的配方的异同。一、植物组织培养的基本过程和影响因素二、胡萝卜的组织培养内容索引当堂检测一、植物组织培养的基本过程和影响因素基础梳理我们在必修一中已经学习过一些植物组织培养的知识，请结合探究内容，掌握组织培养的过程。1.原理
理论基础：细胞的全能性。
(1)概念：已经 的细胞，仍然具有发育成 的潜能。
(2)原因：具有该种生物全套 。分化完整个体遗传信息2.植物组织培养的过程
植物组织培养就是在无菌和 条件下，将离体的植物___________
，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，最终诱导产生 、丛芽或完整植株的技术。
上图中：
(1)B是 组织，其特点是：细胞排列疏松而无规则，是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞。
(2)A过程是 ，是指由高度分化的植物组织或细胞产生 的过程，又叫去分化。人工控制器官、组织、细胞愈伤组织愈伤脱分化愈伤组织(3)C过程是 ，是指 重新分化成根或芽等器官的过程。
(4)植物组织培养的过程反映了植物细胞的 ，证明分化的植物细胞仍具有形成完整植株所需要的 。
3.植物组织培养的影响因素
(1)培养基：植物组织培养中常用的基本培养基有 培养基、 培养基、 培养基等。其中 培养基常用于植物花药的组织培养。再分化愈伤组织全能性全部基因MS怀特N6N6(2)植物生长调节剂对植物组织培养的影响
①植物生长调节剂的作用吲哚乙酸生根茎愈伤组织植物形态的发生丛芽分裂伸长②植物激素用量比例的影响(3)其他因素的影响： 、温度、 等条件也对植物组织培养有重要的影响。诱导植物组织脱分化和根原基的形成诱导植物组织再分化和芽原基的形成pH光照1.植物组织培养的理论基础
(1)为什么高度分化的植物细胞还具有全能性？
答案 因为高度分化的植物细胞中含有该物种的全套遗传物质。
(2)高度分化的植物细胞发育成完整的植株需要哪些条件？
答案 ①离体条件；②充足的营养条件；③恰当的激素种类及浓度配比；④适宜的环境条件；⑤无菌条件。问题探究答案答案2.植物组织培养的一般过程分析
(1)你认为植物组织培养的核心环节是什么？
答案 植物组织培养的核心环节为脱分化和再分化。
(2)你认为菊花的组织培养的再分化应先诱导生芽还是先诱导生根？
答案 应先诱导生芽，再诱导生根。
(3)植物组织培养的实验操作主要有哪几个步骤？
答案 主要有6个步骤：①制备MS固体培养基；②外植体消毒；③接种；④培养；⑤移栽；⑥栽培。
(4)在配制培养基的过程中，pH的调节是在分瓶前还是分瓶后？
答案 在分瓶前调节pH。答案3.植物组织培养中应尽量选择什么样的材料？为什么？
答案 应尽量选择幼嫩的植物组织或器官。因为植物组织或器官年龄越小，分化程度越低，组织培养的成功率就越高。归纳总结植物组织培养的过程分析拓展应用1.关于植物组织培养技术的叙述正确的是
A.用于培养的材料不一定需要离体
B.植物可通过光合作用合成有机物，培养基中不需要加入含碳有机物
C.愈伤组织可制造成人工种子
D.脱分化和再分化都需要培养基中生长素和细胞分裂素刺激、诱导答案解析解析 用于培养的材料一定需要离体，否则基因选择性表达会形成组织和器官，A项错误；
植物组织培养基中需加入含碳有机物，提供碳源和能源，而完整植株才能进行光合作用，B项错误；
胚状体可制成人工种子，C项错误；
不同阶段的培养基中细胞分裂素和生长素的比例不同，可诱导培养物进行分裂和分化，D项正确。2.如图是基因型为AaBb的菊花茎尖离体培养示意图，据图回答下列问题：答案解析(1)图中A和B分别表示 和 。菊花茎尖培养成植物体的根本原因是 。
解析 离体的植物组织或细胞，在培养了一段时间以后，会通过细胞分裂，形成愈伤组织。脱分化产生的愈伤组织继续培养，又可以重新分化成根或芽等器官，这个过程叫做再分化。菊花茎尖能培养成植物体的根本原因是植物细胞具有全能性。脱分化再分化植物细胞具有全能性答案解析(2)菊花的组织培养形成试管苗的过程中，其中应大量供给的元素是 。试管苗形成过程中要给予一定光照，其原因是 。
解析 离体的植物组织和细胞，常用MS培养基培养，其主要成分包括：大量元素，如N、P、K、Ca、Mg、S；微量元素，如Fe、Mn、B、Zn、Cu、Mo、Co、I；有机物以及蔗糖等。在试管苗形成过程中要每日给予光照12 h，其原因是试管苗形成过程中要进行光合作用合成有机物。N、S、P、K、Ca、Mg试管苗形成过程中要进行光合作用合成有机物答案解析(3)脱分化是指__________________________________________________
。脱分化和再分化这两个过程的进行，除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，还要保证 ，否则植物组织培养就不能成功。
解析 脱分化和再分化这两个过程的进行除必要的温度、光照和氧气等外界条件外，还要保证无菌，原因是杂菌产生的毒素等物质会影响或阻碍植物组织脱分化形成愈伤组织或再分化为根和芽，且杂菌的繁殖能力很强，会与植物组织争夺培养基中的营养物质，使植物得不到营养，同时杂菌还会侵染植株，使之受到伤害。高度分化的植物组织或细胞，通过离体培养产生愈伤组织无菌的过程答案解析(4)这样培养成的试管苗的基因型为 。
解析 由于植物组织培养过程中细胞进行有丝分裂，所以培养成的试管苗的基因型为AaBb。AaBb植物组织培养的两点误区警示
(1)细胞全能性表达的理解
①细胞全能性的表达是由单个细胞发育成完整个体，发育的终点是完整个体，若发育为某个器官或组织不属于细胞全能性的表达。
②细胞全能性的大小是自然条件下的，在适宜外界条件下，植物的体细胞培养比生殖细胞的培养更容易。
(2)对愈伤组织特点的理解：愈伤组织的细胞是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞，具有旺盛的分裂能力，无中央大液泡。二、胡萝卜的组织培养基础梳理下面我们以胡萝卜的肉质茎为材料，体验植物组织培养的基本过程和方法。
1.配制培养基
(1)配制MS培养基
①预先配制成储备液，储存在4 ℃的冰箱中备用。储备液一般包括10倍的_____
元素、100倍的 元素、100倍的 成分、100倍的Fe盐和0.1 mg/mL的____
。蔗糖的用量大多为3%， 用量一般为0.5%～1.0%。
②取少量蒸馏水，按比例加入各种 和药剂。
③用0.1mol/L的 调整pH到 ，定容到设计的最终体积。
④加入 ，加热溶解后分装到试管或锥形瓶中。
⑤ ℃高压灭菌20 min。大量微量生长有机激素琼脂母液NaOH或HCl5.8琼脂121(2)以MS基本培养基为基础配制所需各种培养基
①诱导培养基(MS培养基＋ mg/L 2,4－D)。
②继代培养基(MS培养基＋ mg/L 2,4－D)。
③分化培养基(不添加植物生长调节剂)。
④生根培养基( MS培养基＋0.5 mg/L IBA)。1.00.51/22.获取培养用胡萝卜组织块
(1)将胡萝卜的根用 充分洗净，切段。
(2)在超净工作台上将胡萝卜段用体积分数为70%的 消毒30 s后，立即用无菌水冲洗2～3次。再用体积分数为20%的 溶液浸泡30 min后，立即用无菌水清洗2～3次。
(3)用无菌的滤纸吸去表面水分，选取有 的部位将胡萝卜段切成 左右的小块。洗涤剂酒精次氯酸钠形成层2 mm×2 mm×2 mm3.接种培养
(1)将组织块接种到无菌的 培养基上，封紧瓶口，标记。23 ℃～26 ℃恒温 培养，定期观察记录，计算 。30 d左右后，将愈伤组织分切成小块，然后转接到 培养基上培养。
(2)将愈伤组织转接到 培养基上，23 ℃～26 ℃恒温 培养，每天光照12 h持续14d后，统计计算 。
(3)将分化出的幼苗转接到 培养基上，培养14 d后，统计并计算出
率。
4.移栽：将试管苗移栽到大田栽培。诱导避光出愈率继代分化光照分化率生根生根1.营养物质对组织培养的作用
(1)MS培养基中各种营养物质有什么作用？
答案 ①大量元素和微量元素：提供植物细胞生活所必需的无机盐。
②蔗糖：提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压。
③甘氨酸、维生素等有机物：主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。问题探究答案(2)植物是自养生物，为什么用于植物组织培养的MS培养基中需要加入有机物作为碳源？
答案 通常植物体本身进行光合作用产生糖类，不需要外部供给糖，但植物组织培养利用的是离体组织或细胞，在其脱分化过程中不能进行光合作用合成糖类，因此必须在培养基中添加糖类，作为碳源和能源物质，同时维持培养基的渗透压。答案2.在植物组织培养过程中是如何实现无菌操作的？
答案 (1)对于培养基：用高压蒸汽灭菌法灭菌。
(2)对于外植体：用酒精和次氯酸钠溶液消毒，放到无菌箱中培养，移栽到消过毒的环境中生活一段时间。
3.植物组织培养技术有哪些用途？
答案 优良品种的快速繁殖、培育脱毒作物、人工种子、单倍体育种、工厂化生产细胞产物等。答案归纳总结试管苗培养过程中应注意的问题
(1)培养一株完整的试管苗，必须先进行生芽培养，然后进行生根培养，如果顺序颠倒，先诱导生根，就不好诱导生芽了。
(2)试管苗应该进行见光培养。
(3)试管苗一般在高湿、弱光、恒温下异养生长，出瓶后一定要保温、保湿。
(4)试管苗光合作用能力低，在移栽前给予较强光照闭瓶炼苗，以促进小苗向自养转化。(5)无菌技术是植物组织培养成功的关键。植物组织培养不同于扦插、压条等常规的无性繁殖。由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高，对无菌操作的要求非常严格。若不小心引起污染，将可能造成培养工作前功尽弃，因此实验过程始终贯穿着灭菌消毒。对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官都要区别对待。拓展应用3.生物工程的研究成果已经广泛应用于各个领域，目前科学家利用植物的茎尖和叶片、茎段等，在无菌条件下，培养在玻璃器皿中人工配制的培养基上，使之发育成完整的植株。下图是运用该技术培养兰花植株的示意图。下列关于这种生物工程技术的叙述，错误的是A.这种技术叫做植物组织培养，可以克隆生物体
B.④过程的单细胞细胞质丰富，液泡小而细胞核大
C.用此方法克隆植物要尽量选择优良、细胞全能性表达不充分的材料
D.这种技术可与基因工程、航天工程结合培育高产、优质的作物品种答案解析问题导析问题导析 (1)植物组织培养过程中，细胞中的遗传物质一般 (填“会”或“不会”)发生改变，所以该项技术属于一种克隆技术。
(2)通过基因工程将目的基因导入植物细胞后，必须采用_____________
技术将植物细胞培养成植株。返回上页答案不会植物组织培养解析 ④过程的单细胞细胞质丰富，液泡小而细胞核大，这是胚性细胞(类似胚胎细胞)的特征，在适宜的培养基中，这种单细胞可发育成胚状体。要获得植物克隆的成功，应尽量选择优良、细胞全能性表达充分的材料。随着科技的发展，植物组织培养可与基因工程、航天工程结合培育高产、优质的作物品种。返回上页答案解析4.下列关于MS培养基与微生物培养基的配方相比的不同之处，说法错误的是
A.MS培养基中常常添加植物激素，微生物培养基中不需要
B.MS培养基中的碳源和能源是蔗糖，微生物培养基中的碳源和能源主要
是葡萄糖
C.MS培养基中需提供植物生长必需的大量元素和微量元素
D.MS培养基中不需加维生素，微生物培养基中要加维生素作生长因子解析 MS培养基中需要加入甘氨酸、维生素等物质，主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基与MS培养基配方的不同
微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养、无机盐混合物包括植物生长必需的大量元素和微量元素两大类。全能性脱分化再分化植物激素MS固体消毒接种当堂检测1.1958年，美国科学家斯蒂尔德应用植物组织培养技术，将二倍体胡萝卜韧皮部的一些细胞进行离体培养，最终发育成完整的新植株。下列关于这一科学事实的叙述中，错误的是
①该实验证明了植物细胞具有全能性
②此种生殖产生的后代有广泛的变异
③韧皮部细胞通过减数分裂增加细胞数目
④此种生殖产生的后代能保持亲本的性状
A.①② B.②③
C.②④ D.③④23451答案解析√23451解析 体细胞组织培养属于无性繁殖，其后代能保持亲本的性状，变异性小；体细胞不能进行减数分裂。2.下面为植物组织培养过程图解，以下相关叙述错误的是答案解析23451A.b过程发生了脱分化，在此过程中植物激素不发挥作用
B.c过程发生了再分化，是愈伤组织重新分化成根或芽等器官的过程
C.d过程是在胚状结构外包裹人工胚乳和人工种皮制成人工种子
D.人工种子可以解决有些作物品种繁殖能力差、结子困难或发芽率低等
问题√23451解析 在植物脱分化的b过程中，利用植物生长素、细胞分裂素等植物激素可以诱导植物细胞脱分化，因此在此过程中植物激素发挥重要作用。3.影响植物组织培养的因素包括
①培养基的配制 ②外植体的选取 ③激素的使用
④消毒 ⑤温度、pH、光照
A.①②③④⑤ B.①②③
C.①②③④ D.①②③⑤
解析 植物组织培养过程受多种外界因素的影响，其中包括温度、光照、pH等，而培养基的成分、外植体的选取和消毒是否严格等也影响组织培养。答案解析23451√4.下列关于植物组织培养的叙述中，错误的是
A.培养基中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压
B.培养基中的生长素和细胞分裂素影响愈伤组织的形成和分化
C.离体器官或组织的细胞都必须通过脱分化才能形成愈伤组织
D.同一株绿色开花植物不同部位的细胞经培养获得的愈伤组织基因组成
相同答案23451解析√23451解析 在植物组织培养过程中，蔗糖是最常用的碳源和能源物质，蔗糖还可以调节培养基的渗透压，从而维持细胞正常的形态和功能；愈伤组织的分化常受细胞分裂素及生长素用量比例的调节，当这一用量比值高时，可诱导芽的形成，反之则有促进生根的趋势；对于同一株绿色开花植物来说，花粉是通过减数分裂形成的，离体培养获得的愈伤组织细胞和体细胞培养获得的愈伤组织细胞基因组成并不完全一样，假定该植株基因型为Aa，花粉培养获得的愈伤组织细胞基因型为A或a，而体细胞培养获得的愈伤组织细胞基因型为Aa，二者不一样。5.下图表示菊花的茎尖细胞通过无菌操作接种到试管培养基上后，在一定的条件下，形成试管苗的培育过程，请据图回答下列问题：23451(1)要促进细胞分裂生长，培养基中应有营养物质和激素。营养物质包括
和小分子有机物，激素包括细胞分裂素和 两类植物激素。答案解析无机物生长素23451解析 植物组织培养是用离体的植物组织、器官或细胞接种到经消毒灭菌的培养基中，培养基含有供组织细胞生长发育所需要的无机物和小分子有机物，还有调节细胞脱分化和再分化的细胞分裂素和生长素。由外植体发育成试管苗，脱分化阶段细胞进行有丝分裂，再分化阶段愈伤组织细胞经有丝分裂和细胞分化形成试管苗，此阶段需要光照，原因是叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照条件。(2)此过程依据的原理是 。A和B阶段主要进行的分裂方式是 ，B阶段除了细胞分裂外，还进行细胞 等。
(3)此过程要无菌操作，主要是指对 进行灭菌消毒。B阶段需要光照，原因是 。
(4)试管苗的根细胞没有叶绿素，而叶的叶肉细胞具有叶绿素，这是基因
的结果。23451答案细胞的全能性有丝分裂分化培养基芽发育成叶，叶肉细胞中叶绿素的合成需要光照条件选择性表达第14课时 蛋白质的提取和分离
[学习导航] 1.阅读教材P74～75内容，理解电泳、同工酶和蛋白质组学。2.结合教材P73～75内容，进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。3.结合教材P73～75内容，总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。
[重难点击] 1.进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。2.总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。
一、电泳、同工酶和蛋白质组学
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
1.电泳
(1)概念：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理
①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
(3)常用的电泳方法
①琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂糖，蛋白质分子的迁移速率主要取决于其所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
②变性胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入十二烷基硫酸钠(SDS)变性剂，蛋白质都变为椭圆形，SDS带有大量的负电荷，掩盖了不同蛋白质的电荷差异，因此变性胶电泳中影响蛋白质的迁移速率的主要因素是蛋白质分子的大小。
2.同工酶
同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。乳酸脱氢酶一般含有5种同工酶，其相对分子质量相同，但所带电荷不同。
3.蛋白质组学
蛋白质组学指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的氨基酸组成分析、立体结构研究和蛋白质的人工合成等。由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学的研究不仅能分析生物体内蛋白质的组成，还可以揭示各种蛋白质在生物体内的相互作用与联系。
1.从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？
答案 各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。
2.变性胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？
答案 否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。
归纳总结 琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳的两点区别
(1(分离原理不同
①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。
②变性胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。
(2(用途不同
①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。
②变性胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。
1.带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于( )
A.所带的电荷多少
B.蛋白质的分子大小
C.蛋白质的相对分子质量
D.蛋白质的分子大小和所带的电荷多少
答案 D
2.下列说法中，不正确的是( )
A.同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同
B.同工酶的相对分子质量一定不同
C.蛋白质的多样性决定了其功能的多样性
D.蛋白质组学是21世纪生命科学研究领域新的前沿
答案 B
解析 同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同，乳酸脱氢酶的5种同工酶的相对分子质量是相同的。
特别提醒 同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。产生同工酶的主要原因是在进化过程中基因发生变异，而其变异程度尚不足以成为一个新酶。
二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离
下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验蛋白质的提取和分离技术。
1.乳酸脱氢酶同工酶的提取
(1)取5 g新鲜的动物心脏，漂洗干净后剪碎到预冷的玻璃匀浆器中，加入25 mL磷酸提取缓冲液，然后冰浴研磨成匀浆(如图1)。
(2)将匀浆收集到冰浴的离心管中，在4 ℃条件下12 000 rpm离心10 min。吸取上清液，然后在4 ℃条件下保存备用(如图2)。
2.琼脂糖凝胶电泳分离
(1)制备琼脂糖凝胶：用TBE电泳缓冲液配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，加热溶解后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量TBE电泳缓冲液(如图3)。
(2)加样：取适量同工酶提取液与等量载样缓冲液(质量分数40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取20 μL加入样品孔内。
(3)电泳：100 V条件下进行电泳约30 min。
(4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时切断电源，取出胶板浸入染色液中，37 ℃染色15～30 min，水洗后观察电泳结果。
3.结果分析
由图中电泳结果可以看出：
(1)每个器官形成了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。
(2)LDH2在心脏中含量最高，在骨骼肌中含量最低，说明不同的器官同一种同工酶的含量不同。
(3)骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的是LDH1，说明同一器官不同的同工酶含量不同。
1.提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保持酶的活性？
答案 酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)，在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。
2.制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了保持酶活性而采取的措施？
答案 ①提供必要的缓冲系统，以维持pH的相对稳定，防止破坏其活性；②保持低温环境，如将玻璃匀浆器和离心管预冷，低温离心；③避免引入其他杂质或变性剂，导致酶变性，如对材料进行漂洗。
3.溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？
答案 溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应，形成特殊的蓝紫色产物。
归纳总结 (1(实验步骤概括：取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样→电泳→染色→冲洗→观察。
(2(实验操作要点
①所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。
②蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重，防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳前沿指示剂，判断电泳的进行程度。
③将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动。
3.在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用是( )
A.维持溶液浓度不变
B.维持溶液酸碱度不变
C.催化蛋白质分离过程顺利完成
D.无实际意义
答案 B
解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。
4.下列说法不正确的是( )
A.在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性
B.将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保证酶的活性
C.载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维持pH稳定
D.电泳结果出现了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶
答案 C
解析 酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。载样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置；电泳结果出现了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。
特别提醒 琼脂糖凝胶电泳的优点
(1)琼脂糖含液体量大，近似自由电泳。
(2)琼脂糖作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。
(3)电泳速度快。
(4)区带易染色，样品易回收，有利于制备。
(5)操作简单、快速、灵敏。
1.下列有关同工酶的概念，描述正确的是( )
A.催化相同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质不同，电泳行为不同
B.催化不同的化学反应
C.催化不同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质相同，电泳行为相同
D.催化相似的化学反应
答案 A
解析 同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质以及免疫学性质不同的一组酶。
2.乳酸脱氢酶有几种同工酶( )
A.2 B.3 C.4 D.5
答案 D
解析 乳酸脱氢酶的同工酶共有5种。
3.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因( )
A.分子带电性质的差异
B.分子的大小
C.分子的形状
D.分子的变性温度
答案 D
解析 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。
4.科学家发现蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者的重视。分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的__________、大小及形状不同，在电场中的__________不同而实现的分离。
答案 电荷(带电情况) 迁移速度
解析 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
课时作业
[基础过关]
1.电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷__________的电极移动( )
A.相同 B.相反
C.相对 D.相向
答案 B
解析 在一定的pH下，生物大分子中有某些可解离的基团，这些基团会带上正电荷或负电荷，在电场作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
2.电泳实现样品中各种分子的分离是利用了( )
A.各种分子带电性质的差异
B.分子本身的大小不同
C.分子形状的不同
D.以上都正确
答案 D
解析 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小和形状差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
3.下列关于同工酶的叙述正确的是( )
A.同工酶是由多个亚基以共价键结合形成的复合物
B.同工酶对同一种底物有不同的专一性
C.同工酶是催化同一种反应，但结构不完全相同的同一种酶的多种形式
D.各种同工酶在电场电泳时，迁移速率相同
答案 C
解析 同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。
4.在进行琼脂糖凝胶电泳前，用什么溶液溶解琼脂糖( )
A.蒸馏水 B.自来水
C.缓冲液 D.蔗糖溶液
答案 C
解析 用电泳缓冲液溶解琼脂糖，如TBE，这样就能保证凝胶中的离子浓度与电泳液中的离子浓度相同，在电场中活动一致。
5.各种动物血清内乳酸脱氢酶同工酶的组成是不同的。可以通过比较各种动物乳酸脱氢酶同工酶差异的大小来判断动物之间亲缘关系的远近。下列各种实验方法中，不能采用的是( )
A.测乳酸脱氢酶同工酶的氨基酸序列
B.测控制乳酸脱氢酶同工酶合成的基因碱基序列
C.用电泳法比较各种动物乳酸脱氢酶同工酶的电泳带
D.检测不同动物的乳酸脱氢酶同工酶的pH
答案 D
解析 生物是由共同的原始祖先进化而来的，各种生物之间具有或近或远的亲缘关系，亲缘关系越近，则其对应基因的碱基序列的相似程度就越高，而基因控制蛋白质的合成，故其对应的蛋白质的氨基酸序列相似程度也就越高。因此，可以采用测定基因或蛋白质序列的方法进行判断。若蛋白质的相似程度高，则进行电泳时，电泳带的相似程度也就越高。不同动物的乳酸脱氢酶同工酶组成虽然不相同，但不能说明其pH就一定不相同。
6.下图表示对某蛋白质溶液进行变性胶电泳的结果(类似于纸层析法分离色素)，下列相关叙述不正确的是( )
A.蛋白质上某些基团解离后可使蛋白质带电，电场中带电的蛋白质分子(或多肽)会向着与其所带电荷相反的电极移动
B.蛋白质在变性胶中的迁移速率完全取决于其所带净电荷多少
C.蛋白质在变性胶中的迁移速率基本取决于其相对分子质量大小
D.电泳结果表明溶液中蛋白质可能有两种，但也可能只有一种
答案 B
解析 蛋白质的氨基与羧基可发生解离，使其带正电或负电，在电场中发生迁移。变性胶电泳所加的SDS可完全掩盖蛋白质本身所带电荷，故其迁移速率与本身所带电荷无关，而由其分子大小决定。变性胶电泳会使蛋白质水解成肽链，故结果所示可能只有一种蛋白质(有两种肽链)，也可能是两种蛋白质。
7.下图是心脏、骨骼肌和脑中的乳酸脱氢酶同工酶的电泳图谱，据图分析下列说法中不正确的是( )
A.3种器官中都含有5种乳酸脱氢酶同工酶
B.LDH2在心脏中含量最高，在骨骼肌中含量最低
C.骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的LDH1
D.不同的器官同一种同工酶的含量不同，同一器官不同的同工酶含量差别不大
答案 D
解析 电泳图谱中每个器官形成了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。根据条带的宽度可以判断，LDH2在心脏中含量最高，在骨骼肌中含量最低，说明不同的器官同一种同工酶的含量不同。骨骼肌中含量最高的是LDH5，含量最低的是LDH1，说明同一器官不同的同工酶含量不同。
[能力提升]
8.下列说法不正确的是( )
A.在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B.缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
D.透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内
答案 D
解析 透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。
9.蛋白质的分离与纯化是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述中，不正确的是( )
A.根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离
B.根据蛋白质分子所带电荷性质的差异及分子大小等，可利用电泳法分离蛋白质
C.根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D.根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
答案 A
解析 蛋白质分子是生物大分子，都不能通过半透膜，因此不能利用半透膜分离蛋白质；蛋白质分子所带电荷性质的差异及分子大小，可以使蛋白质分子在电场中获得不同的迁移速度，因此可以利用电泳法分离蛋白质；蛋白质相对分子质量的大小不同，通过凝胶柱的时间不同，可通过凝胶色谱法分离蛋白质；蛋白质的分子大小、密度不同，具有不同的离心力，可通过离心沉降法分离蛋白质。
10.蛋白质各种特性的差异，可以用来分离不同种类的蛋白质。下列正确的是( )
A.分子的形状、大小和溶解度
B.所带电荷的性质和多少
C.对其他分子的亲和力
D.以上三项都是
答案 D
解析 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质及对其他分子的亲和力等，都可以用来分离不同蛋白质。
11.下列关于电泳的说法，不正确的是( )
A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动
C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少
D.用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小
答案 C
解析 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
12.电泳技术是在外电场作用下，利用分子携带的净电荷不同，把待测分子的混合物放在一定的介质(如琼脂糖凝胶)中进行分离和分析的实验技术。利用电泳技术可以分离氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等物质和做亲子鉴定。下列图甲～丁是电泳装置及相应电泳结果。请问答：
(1)利用琼脂糖凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶时，需将提取的蛋白质样品加在图甲中的________(填“正极”或“负极”)，理由是________________________________________。电泳过程中分子的迁移率除与本身所带净电荷的多少有关外，你认为还受什么因素的影响？(列出2种)_________________________________ ______________________________。
(2)进行乳酸脱氢酶同工酶琼酯糖凝胶电泳时，当图乙中出现__________________________的现象，即可停止电泳。
(3)图丙是把含有21个氨基酸的多肽进行水解，得到的氨基酸混合物进行电泳的结果。故可推知该多肽由______________种氨基酸组成。
(4)图丁是通过提取某小孩和其母亲以及待测定4位男性的DNA，分别由酶处理并扩增后，生成含有若干DNA片段的混合物，然后进行电泳所得到的一组DNA指纹图谱，该小孩真正生物学上的父亲是______________，理由是
________________________________________________________________________。
答案 (1)负极 在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动 电泳的电压、被测分子的大小、被测分子的形状、凝胶的种类密度等 (2)溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部 (3)6 (4)F2 C和F2两者的DNA指纹图谱完全相同
解析 (1)将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动，电泳过程中分子的迁移率除受自身电荷的性质、电荷多少的影响外，还受电泳的电压、被测分子的大小、被测分子的形状、凝胶的种类密度等因素影响。(2)乳酸脱氢酶同工酶提取液加样前，需与载体缓冲液混合，载体缓冲液中含有溴酚蓝指示剂，作为电泳进行程度的指示剂，当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部意味着电泳结束。(3)图中电泳结果出现6条带，意味着含有6种氨基酸。(4)分析DNA指纹图谱可知，C和F2两者的DNA指纹图谱完全相同。
13.试回答下列“蛋白质的提取和分离实验”的有关问题：
(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是__________________________________。
(2)若要去除血清蛋白中的小分子杂质，采用图1装置。透析液是________________，一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色？并说明判断的依据： ________________________________________________________________________。
(3)图2、图3分别表示电泳法分离蛋白质和纸层析法分离叶绿体中色素的结果。不同蛋白质得以分离是因为________________________________________________________________；
不同色素得以分离是因为__________________________________。条带c呈__________色。
答案 (1)防止红细胞吸水涨破 (2)(磷酸)缓冲液 出现紫色。双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血红蛋白反应，生成紫色物质 (3)不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同 不同色素在层析液中溶解度不同，导致层析时扩散速度不同 黄绿
14.某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的“血红蛋白提取、分离流程图”如下：
→→
→
请回答下列有关问题：
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用__________________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是____________________________________________________________________。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是____________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以____________________________________________________(写出一种方法)。
(3)电泳利用了待分离样品中各种分子的__________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
(4)一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有____种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是______________________________________________________________________。
答案 (1)生理盐水 渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内液浓度时，细胞吸水涨破)
(2)除去小分子杂质 增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液)
(3)带电性质以及分子大小、形状
(4)2 携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质
解析 (1)洗涤红细胞所用的溶液是生理盐水，根据渗透作用原理，将红细胞置于低渗溶液中，红细胞会吸水涨破，释放出血红蛋白。(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去样品中的小分子杂质；可通过增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法缩短透析时间，能尽快达到理想的透析效果。(3)由于各种分子带电性质以及分子大小、形状等的差异，在电泳过程中产生了不同的迁移速度，实现各种分子的分离。(4)根据图示可知，镰刀型细胞贫血症的携带者含有两种血红蛋白，原因是携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，分别控制合成两种不同的蛋白质。
课件30张PPT。第14课时 蛋白质的提取和分离第4章 现代生物技术学习导航
1.阅读教材P74～75内容，理解电泳、同工酶和蛋白质组学。
2.结合教材P73～75内容，进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。
3.结合教材P73～75内容，总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。
重难点击
1.进行乳酸脱氢酶同工酶的提取和电泳分离。
2.总结在琼脂糖凝胶电泳中影响蛋白质迁移率的因素。一、电泳、同工酶和蛋白质组学二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离内容索引当堂检测一、电泳、同工酶和蛋白质组学基础梳理带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳的种类多，应用非常广泛，它已成为分子生物学技术中分离生物大分子的重要手段。
1.电泳
(1)概念：带电粒子在 的作用下发生 的过程。
(2)原理
①带电粒子：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有 的基团，在一定的pH下，这些基团会带上 。电场迁移可解离正电或负电②迁移动力与方向：在电场的作用下，带电分子会向着与其_________
的电极移动。
③分离依据：电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不同，使带电分子产生 ，从而实现样品中各种分子的分离。所带电荷相反带电性质的差异大小形状不同的迁移速度(3)常用的电泳方法
①琼脂糖凝胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入琼脂糖，蛋白质分子的迁移速率主要取决于其所带 以及分子的 等因素。
②变性胶电泳：在电泳缓冲液和凝胶中加入十二烷基硫酸钠(SDS)变性剂，蛋白质都变为 形，SDS带有大量的 电荷，掩盖了不同蛋白质的电荷差异，因此变性胶电泳中影响蛋白质的迁移速率的主要因素是蛋白质分子的 。净电荷大小和形状椭圆负大小2.同工酶
同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子 、 乃至
性质不同的一组酶。乳酸脱氢酶一般含有 种同工酶，其相对分子质量 ，但所带电荷 。
3.蛋白质组学
蛋白质组学指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的____
分析、 研究和蛋白质的 等。由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生、细胞代谢等过程的整体而全面的认识。蛋白质组学的研究不仅能分析生物体内蛋白质的 ，还可以揭示各种蛋白质在生物体内的 。结构理化性质免疫学5相同不同氨基酸组成立体结构人工合成组成相互作用与联系1.从电荷方面思考，适合电泳法分离的各种分子需具备什么条件？
答案 各种分子应带有不同种类和不同量的电荷。
2.变性胶电泳分离蛋白质是否依据蛋白质所带电荷的差异？为什么？
答案 否。因为SDS能与蛋白质结合，形成蛋白质－SDS复合物，SDS所带负电荷的量远大于蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全由蛋白质分子的大小决定。问题探究答案归纳总结琼脂糖凝胶电泳和变性胶电泳的两点区别
(1)分离原理不同
①琼脂糖凝胶电泳依据分子所带电荷的差异和分子大小、形状等。
②变性胶电泳则完全取决于分子大小，而非电荷性质和分子形状。
(2)用途不同
①琼脂糖凝胶电泳广泛应用于核酸的研究中，用于分离大分子核酸。
②变性胶电泳则广泛应用于分离蛋白质和相对分子质量较小的核酸。拓展应用1.带电荷的蛋白质在电场中移动的速度主要取决于
A.所带的电荷多少
B.蛋白质的分子大小
C.蛋白质的相对分子质量
D.蛋白质的分子大小和所带的电荷多少答案2.下列说法中，不正确的是
A.同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同
B.同工酶的相对分子质量一定不同
C.蛋白质的多样性决定了其功能的多样性
D.蛋白质组学是21世纪生命科学研究领域新的前沿
解析 同工酶催化的化学反应相同，但结构不完全相同，乳酸脱氢酶的5种同工酶的相对分子质量是相同的。答案解析同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚至同一组织或细胞中。产生同工酶的主要原因是在进化过程中基因发生变异，而其变异程度尚不足以成为一个新酶。二、乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离基础梳理下面我们以乳酸脱氢酶同工酶的提取和分离为例，体验蛋白质的提取和分离技术。
1.乳酸脱氢酶同工酶的提取
(1)取5 g新鲜的动物心脏， 干净后 到预冷的玻璃匀浆器中，加入25 mL 液，然后 成匀浆(如图1)。漂洗剪碎磷酸提取缓冲冰浴研磨(2)将匀浆收集到冰浴的 管中，在 ℃条件下12 000 rpm离心10 min。
吸取 ，然后在 ℃条件下保存备用(如图2)。离心4上清液42.琼脂糖凝胶电泳分离
(1)制备琼脂糖凝胶：用 液配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，
后混匀，缓慢倒入胶床中，插入适当的梳子，室温冷却至凝胶凝固。拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，然后向电泳槽中加入适量_____
液(如图3)。TBE电泳缓冲加热溶解TBE电泳缓冲(2)加样：取适量同工酶提取液与等量 液(质量分数40%的蔗糖溶液、0.25%溴酚蓝)混匀，然后取20 μL加入 内。
(3)电泳： V条件下进行电泳约30 min。
(4)染色：当溴酚蓝指示剂电泳到 时切断电源，取出胶板浸入
中，37 ℃染色15～30 min，水洗后观察电泳结果。载样缓冲样品孔100凝胶底部染色液3.结果分析由图中电泳结果可以看出：
(1)每个器官形成了 个条带说明 。
(2)LDH2在 中含量最高，在 中含量最低，说明_____________
。
(3)骨骼肌中含量最高的是 ，含量最低的是 ，说明________
。5乳酸脱氢酶有5种同工酶心脏骨骼肌不同的器官同一种同工酶的含量不同LDH5LDH1同一器官不同的同工酶含量不同1.提取和分离乳酸脱氢酶同工酶过程中为什么要保持酶的活性？
答案 酶作为一类特殊的蛋白质(具有生物催化活性)，在其提取和分离过程中必须保持其生物活性，这样分离出的酶才有可能用来研究其生化性质及相关功能。
2.制备乳酸脱氢酶同工酶提取液的过程中，哪些是为了保持酶活性而采取的措施？
答案 ①提供必要的缓冲系统，以维持pH的相对稳定，防止破坏其活性；②保持低温环境，如将玻璃匀浆器和离心管预冷，低温离心；③避免引入其他杂质或变性剂，导致酶变性，如对材料进行漂洗。问题探究答案3.溴酚蓝为什么能作为乳酸脱氢酶同工酶的指示剂？
答案 溴酚蓝能和乳酸脱氢酶同工酶发生特定的反应，形成特殊的蓝紫色产物。答案归纳总结 (1)实验步骤概括：取材→剪碎→漂洗→匀浆→离心→制凝胶→加样
→电泳→染色→冲洗→观察。
(2)实验操作要点
①所有提取乳酸脱氢酶同工酶用到的器具最好都提前在冰箱中预冷处理，这样能更好地保持酶的活性。
②蛋白质样品在上样之前，要与等量载体缓冲液混匀。载样缓冲液中的蔗糖可增加蛋白质样品的比重，防止加样时发生“漂样”现象；溴酚蓝作为一种电泳前沿指示剂，判断电泳的进行程度。
③将蛋白质样品加在电泳槽的负极段的加样孔，因为在碱性缓冲液中带负电荷的蛋白质在外加电场作用下会向正极移动。3.在乳酸脱氢酶同工酶分离过程中，使用缓冲液的作用是
A.维持溶液浓度不变
B.维持溶液酸碱度不变
C.催化蛋白质分离过程顺利完成
D.无实际意义
解析 分离蛋白质时加入缓冲液，其原因是缓冲液在一定范围内能抵制外界酸和碱对反应溶液pH的影响，保持pH基本不变。答案解析拓展应用4.下列说法不正确的是
A.在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性
B.将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，是为了保证酶的活性
C.载样缓冲液中的溴酚蓝是一种酸碱缓冲物质，维持pH稳定
D.电泳结果出现了5个条带，说明乳酸脱氢酶有5种同工酶
解析 酶提取之后要进行一系列活性条件下的研究，因此在酶的提取和分离过程中必须保持其生物活性，将心脏研磨成匀浆时要在冰浴下进行，就是为了保证酶的活性。载样缓冲液中的溴酚蓝是一种指示剂，指示酶的迁移位置；电泳结果出现了5个条带说明乳酸脱氢酶有5种同工酶。答案解析琼脂糖凝胶电泳的优点
(1)琼脂糖含液体量大，近似自由电泳。
(2)琼脂糖作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。
(3)电泳速度快。
(4)区带易染色，样品易回收，有利于制备。
(5)操作简单、快速、灵敏。带电性质大小匀浆电泳染色当堂检测1.下列有关同工酶的概念，描述正确的是
A.催化相同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质不同，电泳行为
不同
B.催化不同的化学反应
C.催化不同的化学反应，酶蛋白的分子结构、理化性质相同，电泳行为
相同
D.催化相似的化学反应
解析 同工酶是指催化相同的化学反应而酶蛋白的分子结构、理化性质以及免疫学性质不同的一组酶。2341答案解析√2.乳酸脱氢酶有几种同工酶
A.2 B.3
C.4 D.5
解析 乳酸脱氢酶的同工酶共有5种。答案解析2341√3.下列各项中，除哪项外均为电泳使样品中各分子分离的原因
A.分子带电性质的差异
B.分子的大小
C.分子的形状
D.分子的变性温度
解析 电泳是指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。样品分子的带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，与分子的变性温度无关，故选D项。答案解析2341√23414.科学家发现蝇体内存在一种抗菌活性蛋白。这种蛋白质具有极强的抗菌能力，受到研究者的重视。分离该抗菌蛋白可用电泳法，其原理是根据蛋白质分子的 、大小及形状不同，在电场中的______
不同而实现的分离。
解析 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。答案解析电荷(带电情况)迁移速度第15课时 聚合酶链式反应技术
[学习导航] 1.阅读教材P77～78内容，掌握PCR技术原理。2.结合教材P79～80内容，了解PCR技术的基本操作过程，讨论PCR技术的影响因素。
[重难点击] 1.简述PCR的原理。2.了解PCR技术的基本操作过程并讨论PCR技术的影响因素。
一、PCR的原理
聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的，请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识，分析PCR的原理。
1.DNA的平面结构示意图
(1)写出各个标号的名称①胞嘧啶；②腺嘌呤；③鸟嘌呤核糖；④胸腺嘧啶；⑤脱氧核糖；⑥磷酸基团；⑦胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸；⑧氢键；⑨碱基对；⑩一条脱氧核糖核苷酸链。
(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将羟基末端称为3′端；将磷酸基团的末端称为5′端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。
答案 左链上5′端，下3′端；右链上3′端，下5′端。
2.细胞内DNA复制条件分析
条件
组分
作用
模板
DNA的两条单链
提供复制的模板
原料
四种脱氧核糖核苷酸
合成DNA子链的原料
酶
解旋酶
打开DNA双螺旋
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
能量
ATP
为解螺旋和合成子链供能
引物
RNA
为DNA聚合酶提供合成的3′端起点
3.PCR原理与反应过程
(1) PCR概念：是一种体外酶促合成特定DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。
(2)条件及作用
条件
作用
待扩增的目的DNA片段
作为复制的模板
两种人工合成的单链DNA片段
合成DNA时所需要的特异引物
四种三磷酸脱氧核苷酸
原料
耐热TaqDNA聚合酶
酶促作用
缓冲溶液
反应介质
(3)反应过程
①变性
温度上升到94～98 ℃时，目的DNA双链变性解旋为单链模板。
②复性
温度下降到40～60 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸
温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核糖核苷酸在耐热的TaqDNA聚合酶的作用下。根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
④循环：继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。若开始加入了N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得N·2n个DNA片段。
1.PCR原理
PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。
答案 不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。
2.PCR反应过程
(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？
答案 PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。
(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。
答案 每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。
(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？
答案 DNA的羟基(—OH)末端为3′端，磷酸基团的末端为5′端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
归纳总结 PCR扩增与DNA复制的异同
项目
DNA复制
PCR扩增
不同点
时期
有丝分裂间期或减数分裂Ⅰ前的间期
任何时期
场所
活细胞内
细胞外
酶
解旋酶、DNA聚合酶
耐高温的Taq DNA聚合酶
引物
有转录，产生RNA作引物，无需人工加入
无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物
特点
边解旋边复制
先全部解旋后开始复制
缓冲液
不需缓冲液
配制缓冲液代替细胞核液
设备
无
控制温度变化的温控设备
相同点
原理
严格遵循碱基互补配对原则
引物
都需要分别与两条模板链相结合的两种引物
模板
DNA的两条链为模板
特点
半保留复制
原料
游离的四种脱氧核苷酸
1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是( )
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.PCR扩增的对象是氨基酸序列
答案 C
解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链；引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。
2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是_________。
(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶，该酶是从____________________中分离的。
(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是______________。
(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在______________中才能进行，并且要严格控制________条件。
(5)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是____________________________。
答案 (1)DNA的热变性原理 (2)水生耐热细菌Taq (3)耐高温 (4)一定的缓冲溶液 温度 (5)2 作为DNA复制的起点
解析 (1)PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。
(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。
(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。
(4)PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。
(5)PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。
一题多变
细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？
答案 需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。
易错提醒 与PCR原理有关的三个易错点
(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。
二、DNA片段的PCR扩增和产物检测
DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。阅读教材，完善下列内容：
1.DNA片段的PCR扩增
准备：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上
↓
移液：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分
↓
混合：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁
↓
离心：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是使反应液集中在离心管底部
↓
反应：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应
(1)加入离心管中的物质应包括：模板DNA、TaqDNA聚合酶、4种三磷酸脱氧核苷酸、2种引物、缓冲液。
(2)离心管中要加入少量石蜡油，目的是防止反应溶液的挥发。
(3)热循环仪的反应程序应设定为：
(4)影响因素：在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间越长；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就越低，反之引物越长，G、C含量越多，复性温度就越高，这是因为G、C之间是由3个氢键连接，A、T之间是由2个氢键连接。
(5)PCR过程中，循环次数是不是越多越好？
答案 不是。TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1×10－5的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在25～35个循环。
2.扩增产物的检测
(1)原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。
(2)过程
配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板
↓
在DNA样品中加入0.2倍体积的载样缓冲液混匀
↓
取20 μL加入样品孔内
↓
80 V稳压电泳20～40 min
↓
当溴酚蓝指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源
↓
将胶板浸入溴化乙锭溶液染色5～10 min
↓
在紫外透射仪上观察电泳条带
1.实验过程分析
(1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？
答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。
(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？
答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。
(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？
答案 为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
2.结果检测
(1)实验中为什么要测定DNA的含量？
答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。
(2)如何判断DNA扩增成功？
答案 ①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？
答案 样品产物少，或产生新的DNA。
归纳总结 PCR扩增DNA片段的操作要点
(1)避免外源DNA的干扰，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。
(2)缓冲液、酶、DNA引物和DNA模板等如果长期保存，需要在－20 ℃冰箱内保存。其中，DNA引物和DNA模板要避免反复冻融，否则容易造成DNA的降解。
(3)在用微量移液管混合PCR反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。
(4)为防止DNA引物与模板DNA在室温非特异性结合进行PCR反应，需在冰盒上混合PCR扩增体系的各种组分。
(5)为避免反应过程中高温使EP管中的水蒸气溢出管外而导致PCR过程中各种成分的浓度发生变化，须在PCR反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。
3.使用PCR仪具体实验操作顺序应为( )
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④ D.④②⑤③①
答案 C
解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。
4.近20年来，PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链间的______键完全打开，称为______；而在细胞中是在_______酶的作用下进行的。
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。当温度降低至40 ℃时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的______端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是______________。
(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的________和__________，前者由________自动调控，后者则靠__________来维持。
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。
问题导析 (1)解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的热变性原理，细胞内是在解旋酶的作用下解旋。
(2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有2个。
答案 (1)氢 解旋 解旋 (2)两 3′ 从子链的5′端向3′端延伸 (3)温度 酸碱度 PCR仪 缓冲液 (4)1/8
解析 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94～98 ℃)、复性(40～60 ℃)、延伸(72 ℃)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。
1.用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，是一小段( )
A.DNA
B.RNA
C.单链DNA或RNA
D.双链DNA
答案 C
2.符合PCR反应条件的一项是( )
①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③合成引物 ④四种脱氧核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥DNA解旋酶 ⑦限制性内切酶 ⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥
B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑦⑧
D.①②③④⑤⑧
答案 D
解析 PCR反应模拟的是生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制性内切酶)。
3.下列关于PCR的描述中，正确的是( )
①PCR是一种酶促反应 ②引物决定了扩增的特异性 ③扩增DNA利用了热变性的原理 ④扩增的对象是氨基酸序列
A.①②④ B.②③④
C.①③④ D.①②③
答案 D
解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3′端连接脱氧核苷酸。
4.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物( )
A.第一次循环 B.第二次循环
C.第三次循环 D.第四次循环
答案 A
解析 在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。
5.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题：
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将____________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的________开始延伸DNA链。
(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到________________________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫____________。
(3)PCR的每次循环可以分为__________________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有________个这样的DNA片段。
(4)简述PCR技术的主要应用：_______________________________(要求至少答两项)。
答案 (1)磷酸基团 3′端 (2)耐高温的Taq DNA聚合酶 选择培养基 (3)变性、复性和延伸 32 (4)遗传疾病的临床诊断、法医鉴定、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等
解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3′端，含磷酸基团的是5′端。引物的5′端与模板链的3′端结合，然后沿着引物的3′端延伸。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。
课时作业
[基础过关]
1.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是( )
①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA②PCR过程不需要DNA聚合酶 ③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制
A.③④ B.①② C.①③ D.②④
答案 C
解析 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比较，主要有两点不同：(1)PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA，长度通常为20～30个核苷酸。(2)PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的。
2.DNA扩增过程中，DNA片段经若干次扩增，与其数目的理论值变化相符的图是( )
答案 C
解析 PCR反应中，DNA的扩增数目和生物体内的DNA复制是类似的，即1个DNA分子复制一次，变为2个，复制2次，产生4个DNA分子，呈指数扩增，开始有一个DNA分子的模板，经过n次复制后得到的DNA分子的数量为2n，与曲线C相符合。
3.下列各项属于引物作用的是( )
A.打开DNA双链
B.催化合成DNA子链
C.使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制
D.提供模板
答案 C
解析 DNA分子的复制具有方向性，即只能从子链的5′端→3′端方向进行复制。当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。
4.如图为DNA变性和复性示意图，下列相关说法正确的是( )
A.向右的过程为加热(94～98 ℃)变性的过程
B.向左的过程是DNA双链迅速致冷复性
C.变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同
D.图中DNA片段共有4个游离的磷酸基团、4个3′端
答案 A
5.PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时( )
A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸
D.无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链
答案 B
解析 当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。
6.PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是( )
①94 ℃，使DNA分子变性，磷酸二酯键断开 ②94 ℃，使DNA分子变性，解开螺旋 ③40 ℃时，使DNA分子开始复制、延伸 ④40 ℃时，引物与DNA单链结合 ⑤72 ℃时，使DNA分子开始复制、延伸 ⑥72 ℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性
A.①③⑤ B.②③⑤ C.②④⑤ D.②④⑥
答案 C
解析 PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解旋与结合。PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。当温度上升至94 ℃时，DNA分子变性，解开双螺旋结构；温度下降到40 ℃时，引物与DNA单链结合，恢复活性；温度上升至72 ℃时，DNA分子开始复制、延伸，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
7.下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是( )
A.在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现
B.复性过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的
C.延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D.PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高
答案 C
解析 变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；根据碱基互补配对原则，引物可与 DNA模板链结合；延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚合酶。
8.下列关于琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物的说法中不正确的是( )
A.在DNA样品中加入0.2倍体积的载样缓冲液混匀
B.当指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源
C.电泳后将胶板浸入溴酚蓝溶液中染色5～10 min
D.在紫外透射仪上观察电泳条带
答案 C
解析 溴酚蓝是电泳指示剂，电泳后染色是用溴化乙锭溶液。
[能力提升]
9.下列关于PCR操作过程的叙述，错误的是( )
A.PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌
B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20 ℃储存
C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化
D.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换
答案 C
解析 在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，故C错误。
10.关于PCR技术的应用，错误的一项是( )
A.化石样品分析、刑侦破案、DNA序列测定
B.诊断遗传病、基因克隆、化石样品分析
C.DNA序列测定、基因克隆、刑侦破案
D.诊断遗传病、合成核苷酸、DNA序列测定
答案 D
解析 PCR技术在医学上用于遗传病的基因诊断、基因克隆、DNA序列测定，法医上用于刑侦破案，古生物学上用于生物化石样品分析。PCR技术是以4种脱氧核苷酸为原料，合成双链DNA的过程，PCR技术不能用于合成核苷酸。
11.有关PCR技术的说法，下列叙述不正确的是( )
A.多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术
B.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似
C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸
D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸
答案 C
解析 PCR是多聚酶链式反应的英文缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板(母链)、酶、原料、引物等条件。PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性和延伸三步。
12.在PCR扩增DNA的实验中，预计一个DNA分子经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么出现该现象的原因不可能是( )
A.Taq DNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制
B.系统设计欠妥
C.循环次数不够
D.引物不能与亲链结合
答案 D
解析 如果Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少，则A项正确。如果PCR系统设计欠妥，达不到预期的结果，则B项正确；如果循环次数过少，产物的量比预期的少，则C项正确；如果引物设计不合理，也许不能与模板DNA结合，造成无法进行扩增，而结果得到了210个DNA分子，则D项错误。
13.PCR(多聚酶链式反应)技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答下列问题：
(1)A过程高温使DNA变性解旋，对该过程原理的叙述，正确的是( )
A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键
B.该过程用到限制性内切酶破坏磷酸二酯键
C.该过程不需要解旋酶的作用
D.该过程与人体细胞的过程完全相同
(2)C过程要用到的酶是______________。这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以__________加入，________(填“需要”或“不需要”)再添加。PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有__________________________________________________________。
(3)如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94 ℃～40 ℃～72 ℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占________。
(4)如果模板DNA分子共有a个碱基对，其中含有胞嘧啶m个，则该DNA复制10次，需要加入胸腺嘧啶脱氧核苷酸________个。
(5)PCR中由碱基错配引起的变异属于________。假设对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，则扩增若干次后检测所用DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占________。
答案 (1)C (2)Taq DNA聚合酶 一次 不需要 DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、适当的温度及缓冲溶液 (3)1/4 (4)(210－1)(a－m) (5)基因突变 3/4
解析 (1)高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。(2)C过程为PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升至72 ℃左右时，缓冲溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链，Taq DNA聚合酶是耐热的，高温下不变性，所以一次性加入即可。PCR反应需要模板、四种脱氧核苷酸作原料、酶、能量等，需要在一定的缓冲溶液中进行。(3)PCR技术遵循半保留复制的特点。经过三次循环，共产生23个DNA分子，其中有2个DNA分子含有15N标记。(4)在一个双链DNA分子中，C＋T占碱基总数的一半，故T的数目为a－m，复制10次，相当于新增加了(210－1)个DNA分子。故需补充T的数目为(210－1)(a－m)。(5)基因中的碱基对改变属于基因突变。对一个DNA进行扩增，第一次循环时某一条模板链上发生碱基错配，第二次以后按正常配对方式进行扩增，错配链作模板扩增的都是错误的DNA分子，原正常链作模板扩增的都是正常的DNA分子，故若干次后检测所用DNA的扩增片段，与原DNA相应片段相同的占3/4。
14.PCR是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个。PCR需要模板DNA、引物、脱氧核苷酸和DNA聚合酶等条件。下图为模板DNA分子及2种引物，请据图回答相关问题：
(1)PCR的全称是__________________。PCR与体内DNA复制的不同之处主要表现在温度环境的不同，在PCR技术中先用94 ℃高温处理的目的是____________________，而这一过程在细胞内是通过______________实现的。
(2)在PCR技术中所需要的引物通常为一段单链DNA。请在图中绘出引物结合的位置。
(3)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。
(4)DNA子链复制的方向是__________________，这是由于__________________________。
答案 (1)聚合酶链式反应 使DNA变性(使DNA的两条链解开) 解旋酶的催化
(2)如图所示
(3)211－2
(4)从5′端到3′端 DNA聚合酶只能从引物的3′端开始连接单个脱氧核苷酸分子
解析 PCR技术又称聚合酶链式反应。在PCR技术中，用94 ℃高温处理的目的是使DNA分子中的氢键断裂，使两条链解开，即使DNA分子变性。引物通常是一种单链DNA，它能与解开的DNA母链的3′端结合，为DNA聚合酶提供吸附位点，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是从5′端到3′端。在DNA分子扩增时，需要2种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，即2×210－2＝211－2 (个)。
[真题体验]
15.(2013·江苏，22)小鼠杂交瘤细胞表达的单克隆抗体用于人体试验时易引起过敏反应，为了克服这个缺陷，可选择性扩增抗体的可变区基因(目的基因)后再重组表达。下列相关叙述正确的是(多选)( )
A.设计扩增目的基因的引物时不必考虑表达载体的序列
B.用PCR方法扩增目的基因时不必知道基因的全部序列
C.PCR体系中一定要添加从受体细胞中提取的DNA聚合酶
D.一定要根据目的基因编码产物的特性选择合适的受体细胞
答案 BD
解析 设计扩增目的基因的引物时，要考虑扩增的目的基因与载体两端序列碱基互补配对，A错误；DNA复制沿着模板进行，不必知道基因的全部序列，B正确；PCR技术中的DNA聚合酶是耐高温的DNA聚合酶，不是从受体细胞中提取的DNA聚合酶，C错误；目的基因编码产物不同，相应的受体细胞不同，D正确。
16.(2011·江苏，33节选)请回答基因工程方面的有关问题：
(1)利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似(如图所示)。
图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。
①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为________。
②在第________轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。
(2)设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物都不合理(如图)，请分别说明理由。
①第1组：________________________________________________________________；
②第2组：________________________________________________________________。
(3)PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为______________________________________________________________。
答案 (1)①15/16 ②三
(2)①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效
(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上
解析 (1)①从理论上推测，第四轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为15/16。②在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。(2)某同学设计的两组引物都不合理，原因：①引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效。②引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效。(3)DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸连续结合到双链DNA片段的引物链上。
课件49张PPT。第15课时 聚合酶链式反应技术第4章 现代生物技术学习导航
1.阅读教材P77～78内容，掌握PCR技术原理。
2.结合教材P79～80内容，了解PCR技术的基本操作过程，讨论PCR技术的影响因素。
重难点击
1.简述PCR的原理。
2.了解PCR技术的基本操作过程并讨论PCR技术的影响因素。一、PCR的原理二、DNA片段的PCR扩增和产物检测内容索引当堂检测一、PCR的原理基础梳理聚合酶链式反应简称PCR，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，这项技术中DNA复制的过程和细胞内DNA复制的过程是类似的，请结合已学习的DNA分子结构和复制的相关知识，分析PCR的原理。
1.DNA的平面结构示意图(1)写出各个标号的名称
① ； ② ；
③ ； ④ ；
⑤ ； ⑥ ；
⑦ ；
⑧ ； ⑨ ；
⑩ 。胞嘧啶腺嘌呤鸟嘌呤核糖胸腺嘧啶脱氧核糖磷酸基团胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸氢键碱基对一条脱氧核糖核苷酸链(2)DNA的两条链是反向平行的，为了明确表示DNA链的方向，通常将羟基末端称为3′端；将磷酸基团的末端称为5′端，按此原则在图上方框内标出两条链的方向。
答案 左链上5′端，下3′端；右链上3′端，下5′端。2.细胞内DNA复制条件分析脱氧核糖核苷酸两DNA双螺旋合成DNA子链ATP3′端3.PCR原理与反应过程
(1)PCR概念：是一种 的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。体外酶促合成特定DNA片段(2)条件及作用合成DNA时所需要的特异引物原料耐热TaqDNA聚合酶缓冲溶液(3)反应过程
①变性温度上升到 ℃时，目的DNA双链 为单链模板。②复性温度下降到 ℃左右，两种引物通过 与两条单链DNA结合。94～98变性解旋40～60碱基互补配对③延伸温度上升到 ℃左右，溶液中的 在耐热的________
的作用下。根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。
④循环：继续上述的3个过程，DNA片段被不断的扩增。若开始加入了
N个DNA模板片段，理论上，循环n次后能获得 个DNA片段。72四种脱氧核糖核苷酸TaqDNAN·2n聚合酶1.PCR原理
PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？请分析原因。
答案 不相同。体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工合成的单链DNA片段。问题探究答案答案2.PCR反应过程
(1)PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？
答案 PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶需耐高温。
(2)PCR的每次循环中应如何控制温度？请分析原因。
答案 每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于Taq DNA聚合酶发挥作用。(3)结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？答案 DNA的羟基(—OH)末端为3′端，磷酸基团的末端为5′端。当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。答案PCR扩增与DNA复制的异同归纳总结拓展应用1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是
A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链
B.DNA复制不需要引物
C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合
D.PCR扩增的对象是氨基酸序列
解析 DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物；
DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链；
引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合；
PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。答案解析2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是 。
解析 PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。答案解析DNA的热变性原理(2)此过程需要一种Taq DNA聚合酶，该酶是从 中分离的。
解析 Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。
(3)与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶具有的特性是 。
解析 与普通DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶在90 ℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。
(4)与体内DNA复制相比较，PCR反应要在 中才能进行，并且要严格控制 条件。
解析 PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。答案解析水生耐热细菌Taq耐高温一定的缓冲溶液温度(5)PCR中加入的引物有 种，加入引物的作用是 。
解析 PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。答案解析2作为DNA复制的起点细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？若需要，是如何实现的？
答案 需要。细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。答案与PCR原理有关的三个易错点
(1)酶的作用位点：解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。
(2)DNA聚合酶和DNA连接酶：DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。
(3)PCR中的解旋过程：PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。二、DNA片段的PCR扩增和产物检测基础梳理DNA片段的PCR扩增可以利用PCR热循环仪完成，而产物的检测则利用琼脂糖凝胶电泳进行。阅读教材，完善下列内容：
1.DNA片段的PCR扩增
：按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上
↓
：用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组成成分
↓
：盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁准备移液混合 ↓
：将微量离心管放在离心机上，离心约10 s，目的是使反应液集中在
离心管底部
↓
：将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应
(1)加入离心管中的物质应包括： 、 酶、4种_____
、2种 、缓冲液。
(2)离心管中要加入少量石蜡油，目的是 。离心反应模板DNATaqDNA聚合三磷酸脱氧核苷酸引物防止反应溶液的挥发(3)热循环仪的反应程序应设定为：94944072(4)影响因素：在PCR实验中，需要扩增的DNA片段的大小决定延伸的时间，片段越大，中温延伸的时间 ；引物的碱基数量和组成则决定着复性温度的选择，如果引物越短，A、T含量越多，复性温度就 ，反之引物越长，G、C含量越多，复性温度就 ，这是因为G、C之间是由___个氢键连接，A、T之间是由 个氢键连接。
(5)PCR过程中，循环次数是不是越多越好？
答案 不是。TaqDNA聚合酶在PCR扩增过程中存在1×10－5的出错几率，而且随着循环次数的增加，其活性也会逐渐降低。因此，PCR过程中，循环次数并非越多越好，一般控制在25～35个循环。越长越低越高322.扩增产物的检测
(1)原理：琼脂糖凝胶具有大小一致的刚性滤孔，带有大量负电荷的DNA分子在外加电场的作用下可以通过这些滤孔向正极泳动。DNA片段在凝胶中的泳动速率主要取决于其分子的大小，因此大小一致的DNA分子会在凝胶的一定位置形成DNA条带。
(2)过程
配制质量分数为1%的琼脂糖凝胶，制作成电泳胶板
↓
在DNA样品中加入0.2倍体积的 混匀
↓载样缓冲液取20 μL加入 内
↓
V稳压电泳20～40 min
↓
当 指示剂电泳到凝胶底部时，切断电源
↓
将胶板浸入 溶液染色5～10 min
↓
在 上观察电泳条带样品孔80溴酚蓝溴化乙锭紫外透射仪问题探究答案1.实验过程分析
(1)离心的目的是什么？在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？
答案 离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。
(2)在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？
答案 离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。(3)PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？还有哪些操作与此目的相同？
答案 为避免外源DNA等的污染。在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。
2.结果检测
(1)实验中为什么要测定DNA的含量？
答案 实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。答案(2)如何判断DNA扩增成功？
答案 ①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。
②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。
(3)PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？
答案 样品产物少，或产生新的DNA。答案归纳总结PCR扩增DNA片段的操作要点
(1)避免外源DNA的干扰，所用仪器、缓冲液、蒸馏水等都需要在使用前高压灭菌。
(2)缓冲液、酶、DNA引物和DNA模板等如果长期保存，需要在－20 ℃冰箱内保存。其中，DNA引物和DNA模板要避免反复冻融，否则容易造成DNA的降解。
(3)在用微量移液管混合PCR反应体系的各种成分时，一定注意避免各种溶液之间的相互污染，需遵循每吸取一种溶液就要更换一个枪头的原则。(4)为防止DNA引物与模板DNA在室温非特异性结合进行PCR反应，需在冰盒上混合PCR扩增体系的各种组分。
(5)为避免反应过程中高温使EP管中的水蒸气溢出管外而导致PCR过程中各种成分的浓度发生变化，须在PCR反应过程中加入无菌的石蜡油防止溶液的挥发。拓展应用3.使用PCR仪具体实验操作顺序应为
①设计好PCR仪的循环程序 ②按配方准备好各组分③用微量移液器在微量离心管中依次加入各组分 ④进行PCR反应 ⑤离心使反应液集中在离心管底部
A.②③⑤④① B.①⑤③②④
C.②③⑤①④ D.④②⑤③①
解析 PCR反应的操作步骤一般分为准备(包括配制配方及将各配方放于实验台上)→移液→混合→离心→反应。PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。答案解析4.近20年来，PCR技术(聚合酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。(1)加热使DNA双链间的 键完全打开，称为 ；而在细胞中是在 酶的作用下进行的。
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入 种特定的引物。当温度降低至40 ℃时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的 端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是 。
(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的 和 ，前者由 自动调控，后者则靠 来维持。
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是 。答案解析问题导析氢解旋解旋两3′从子链的5′端向3′端延伸温度酸碱度PCR仪缓冲液1/8问题导析 (1)解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的 原理，细胞内是在 酶的作用下解旋。
(2)DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有 个。返回上页答案热变性解旋2解析 (1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。
(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(94～98 ℃)、复性(40～60 ℃)、延伸(72 ℃)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。
(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。
(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。返回上页引物复性延伸PCR仪琼脂糖凝胶电泳当堂检测1.用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸，是一小段
A.DNA
B.RNA
C.单链DNA或RNA
D.双链DNA23451答案√2.符合PCR反应条件的一项是
①稳定的缓冲液环境 ②DNA模板 ③合成引物 ④四种脱氧核苷酸 ⑤DNA聚合酶 ⑥DNA解旋酶 ⑦限制性内切酶 ⑧温控设备
A.①②③④⑤⑥
B.①②③④⑤⑥⑦⑧
C.③④⑤⑥⑦⑧
D.①②③④⑤⑧
解析 PCR反应模拟的是生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶(可热变性)，也不需要基因工程的工具酶(限制性内切酶)。答案解析23451√3.下列关于PCR的描述中，正确的是
①PCR是一种酶促反应 ②引物决定了扩增的特异性
③扩增DNA利用了热变性的原理 ④扩增的对象是氨基酸序列
A.①②④ B.②③④
C.①③④ D.①②③
解析 PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3′端连接脱氧核苷酸。答案解析23451√4.下图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物答案23451解析A.第一次循环 B.第二次循环
C.第三次循环 D.第四次循环√23451解析 在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。5.聚合酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列问题：
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将 的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的 开始延伸DNA链。
解析 一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3′端，含磷酸基团的是5′端。引物的5′端与模板链的3′端结合，然后沿着引物的3′端延伸。耐高温的Taq DNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。PCR一次循环要经历变性、复性和延伸三个阶段。23451磷酸基团3′端答案解析(2)PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到 ，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫 。
(3)PCR的每次循环可以分为 三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有___个这样的DNA片段。
(4)简述PCR技术的主要应用：______________________________________
(要求至少答两项)。23451答案耐高温的Taq DNA聚合酶选择培养基变性、复性和延伸32遗传疾病的临床诊断、法医鉴定、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等
