专题2 微生物的培养与应用
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填充：①液体培养基 ②碳源 ③氮源 ④巴氏消毒 ⑤干热灭菌法 ⑥称量 ⑦倒平板 ⑧平板划线 ⑨稀释涂布平板 ⑩样品的稀释 葡萄糖苷 梯度稀释 刚果红
课题1 微生物的实验室培养
1．下列有关培养基叙述正确的是( )
A．培养基的营养成分都有碳源、氮源、水、无机盐
B．除水以外的无机物都属于无机盐
C．用培养基培养甲型H1N1流感病毒作为科学研究
D．培养基配制过程中应调pH，适应各微生物的生长
解析：固氮微生物培养基可无氮源，有的无机物如NH4NO3可作氮源，H1N1流感病毒必须寄生在细胞内，不能用培养基培养。
答案：D
2．下列关于微生物的培养和分离的叙述中，不正确的是( )
A．细菌能在液体培养基中以二分裂方式迅速扩增
B．噬菌体或大肠杆菌可在蛋白胨培养基中增殖
C．灭菌的目的是消灭与培养菌竞争的杂菌
D．稀释涂布法分散细菌得到单菌落的效果更好
解析：细菌繁殖方式是二分裂方式，噬菌体是没有细胞结构的病毒，需要在活细胞中才能存活，在蛋白胨培养基中不能增殖；灭菌目的是防止杂菌和培养菌发生竞争。
答案：B
3．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是( )
A．计算、称量、倒平板、溶化、灭菌
B．计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
C．计算、称量、溶化、灭菌、倒平板
D．计算、称量、灭菌、溶化、倒平板
解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基，应先根据需要计算各成分用量，然后称量、溶化、灭菌、倒平板。
答案：C
4．平板冷凝后，要将平板倒置，其原因是( )
A．接种时再拿起来方便
B．在皿底上标记日期等方便
C．正着放置容易破碎
D．防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
解析：平板倒置主要是防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
答案：D
5．下表是从土壤中分离纯化土壤细菌的培养基配方。请回答下面的问题。
试剂
用量
试剂
用量
牛肉膏
5 g
琼脂
20 g
胨
10 g
水
1 000 mL
NaCl
5 g
—
—
(1)培养基的类型很多，但培养基中一般都含有水、碳源、________和无机盐。上述培养基配方中能充当碳源的成分是__________________。培养基配制完成以后，一般还要调节pH并对培养基进行________处理。
(2)分离纯化微生物最常使用的接种方法是______________和____________。
(3)假设培养结束后，发现培养基上菌落连成一片，可能的原因是什么？(列举两项)
_______________________________________________________
_______________________________________________________
解析：(1)培养微生物的培养基中一般含有水、无机盐、碳源、氮源和生长因子。牛肉膏、蛋白胨既是碳源又是氮源；培养基在接种前必须灭菌处理。
(2)微生物的接种方法包括平板划线法和稀释涂布平板法两种。
(3)多种因素都会导致接种的菌种密度较大，没有形成单一的菌落。
答案：(1)氮源 牛肉膏和蛋白胨 灭菌 (2)平板划线法 稀释涂布平板法 (3)稀释倍数不够，菌液的浓度太高；划线时，划完第一次没有灭菌又接着划第二次；培养过程灭菌不严格，受到微生物的污染
A级 基础巩固
1．下列有关培养基的叙述正确的是( )
A．培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B．培养基只有两类：液体培养基和固体培养基
C．固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D．微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的单个细菌
解析：培养基除固体、液体培养基外，还有半固体培养基，B错误；固体培养基中加入了凝固剂，加入少量水仍为固体培养基，C错误；微生物在固体培养基上生长时，可以形成肉眼可见的菌落，但不一定是单个菌落，D错误。
答案：A
2．下面对微生物培养中灭菌的理解不正确的是( )
A．防止杂菌污染
B．灭菌就是杀死培养基中的杂菌
C．培养基和培养设备都必须进行灭菌
D．灭菌必须在接种前
解析：灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。
答案：B
3．用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基
解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，用牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循的原则之一是单一变量，所以与选择培养基一样接种、培养。
答案：C
4．自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别在于( )
A．碳源 B．氮源
C．无机盐 D．生长因子
解析：自养型微生物主要包括进行光合作用或进行化能合成作用的微生物，他们能够利用CO2来合成自身所需的有机物；而异养型微生物主要是直接利用外界的有机物来合成自身所需的有机物，所以他们培养基的主要差别就在于自养型微生物主要是利用无机物中的碳，而异养型微生物主要是利用有机物中的碳。
答案：A
5．下列制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( )
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．将培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板
D．将平板冷却凝固约5～10 min后将平板倒过来放置
解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，顺序不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏融化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。将培养基冷却至50 ℃，用手触摸锥形瓶感觉刚刚不烫手时倒平板，平板冷却后还需倒置。
答案：A
6．平板冷却凝固后要将平板倒置，其意义是( )
A．利于大肠杆菌的接种
B．有利于大肠杆菌培养
C．利于培养基的冷却
D．防止皿盖冷却水倒流入培养基，防止杂菌污染
解析：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上水珠落入培养基，造成污染。
答案：D
B级 能力训练
7．将牛奶加热至约70 ℃然后晾至室热，加入酸奶搅拌均匀，盖紧盖子，在42 ℃环境下放置4～6 h，凝固后即制成了酸奶。请回答：
(1) 制作酸奶的原理是：常利用________(填“乳酸链球菌”或“乳酸杆菌”)在适宜的温度下进行发酵产生乳酸，即为乳酸菌________的过程，该过程发生在乳酸菌细胞的____________中。
(2) 酸奶制作过程中，“牛奶加热至约70 ℃”的目的是_________，“盖紧盖子”的目的是________________。
(3) 酸奶制作过程中影响发酵时间的因素有温度、奶的品质、乳酸菌活性、________________等。
(4) 从开始制作到成品这段时间内，牛奶逐渐变酸，这段时间内牛奶中乳酸菌和其他杂菌的消长规律是____________________，原因是____________________。
解析：(1) 酸奶的制作是利用乳酸杆菌无氧呼吸产生乳酸的过程，乳酸菌无氧呼吸的场所是细胞质基质。(2) “牛奶加热至约70 ℃”的目的是通过高温加热杀灭杂菌，乳酸杆菌是厌氧菌，“盖紧盖子”是造成无氧的环境，有利于乳酸杆菌发酵。(3) 酸奶制作过程中影响发酵时间的因素有温度、奶的品质、乳酸菌活性、菌种接种数量等。(4) 酸奶制作过程中，由于乳酸菌进行无氧呼吸产生乳酸，牛奶逐渐变酸，随乳酸菌的数量增加，牛奶的酸性增强，不耐酸的杂菌数量逐渐减少。
答案：(1) 乳酸杆菌 无氧呼吸 细胞质(基质) (2) 杀灭杂菌 提供无氧条件 (3) 菌种接种数量 (4) 乳酸菌数量增多，杂菌数量减少 乳酸菌比杂菌更为耐酸
8．为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是________；然后，将1 mL水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37，据此可得出每升水样中的活菌数为________。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌，操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是________。
(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
(4)该小组将得到的菌株接种到液体培养基中并混匀，一部分进行静置培养，另一部分进行振荡培养，结果发现：振荡培养的细菌比静置培养的细菌生长速度快，分析其原因是：振荡培养能提高培养液中________的含量，同时可使菌体与培养液充分接触，提高________的利用率。
答案：(1)检测培养基灭菌是否合格 3.8×107 (2)灼烧 将聚集的菌体逐渐稀释以便获得单个菌落 (3)B (4)溶解氧 营养物质
9．为了获得纯度高的大肠杆菌，需要对大肠杆菌进行培养和分离。培养大肠杆菌一般用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
(1)培养大肠杆菌，配制固体培养基的基本步骤：计算→称量→__________→__________→倒平板。
(2)称量时，由于牛肉膏比较黏稠，可以用______挑取，放在______上称量。由于牛肉膏和蛋白胨________，称量时动作要迅速，称量后要及时盖上瓶盖。
(3)在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的大肠杆菌能生长，说明培养基含有________________________________________________
等大肠杆菌生长所需的营养要素。
(4)微生物纯化培养可以通过多种接种方法如________和________等，使大肠杆菌在固体培养基上形成单个________，从而获得纯菌株。
解析：配制牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的基本步骤：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。称量时，可用玻璃棒挑取，放在称量纸上称量，称量时动作要迅速。牛肉膏蛋白胨琼脂培养基中含有大肠杆菌所需要的碳源、氮源、无机盐、水等营养要素，所以常用来培养大肠杆菌。微生物纯化培养的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法，可使大肠杆菌在固体培养基上形成单个菌落，从而获得纯菌株。
答案：(1)溶化 灭菌 (2)玻璃棒 称量纸 容易吸潮
(3)碳源、氮源、无机盐、水 (4)平板划线法 稀释涂布平板法 菌落
10．下图所示为平板划线法分离纯化细菌示意图。根据所学生物学知识，完成下列问题。
(1)对接种环或涂布器灭菌时用________________法。
(2)平板划线时，为保证每次划线都从上次划线末端的微生物浓度开始，所以每次划线前都要____________________，平板划线结束后，最后一次划的线不能与第一次划的线________。
(3)脲酶可以将尿素分解为NH3，从而使尿素溶液pH升高，这可用________________来检验。用纤维素作唯一碳源的培养基培养微生物，得到的纤维素分解菌中可能还混杂有____________(生物)。
(4)抗生素可以抑制肽聚糖合成，从而可以抑制多数原核生物繁殖。实验室现有酵母菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌三种微生物混杂生长的固体培养基。已知大肠杆菌菌落遇伊红—美蓝试剂变为紫色，并带有金属光泽；金黄色葡萄球菌耐高浓度食盐水，菌落为金黄色；酵母菌细胞壁成分主要为几丁质，在营养条件好、氧气充足的条件下，显微镜下可见典型的出芽生殖。现在请你设计一个合理的实验方案，从一个培养基中将三种微生物依次分离开来。(所需试剂可自选)
实验方案：____________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
_______________________________________________________
解析：(1)对接种环和涂布器灭菌常采用灼烧灭菌法。(2)考查平板划线法的操作方法，如果划线相重合则不能分离出纯种，所以平板划线时，为保证每次划线都从上次划线末端的微生物浓度开始，在每次划线前都要对接种环进行灼烧灭菌。(3)酚红指示剂可检验碱性溶液。用纤维素作唯一碳源的培养基培养微生物，得到纤维素分解菌，但自养菌利用空气中的CO2，也能生存，需要进一步分离。(4)根据条件可以将不同微生物分离开来，即根据菌落颜色，首先分离出金黄色葡萄球菌，然后向培养基中加入伊红—美蓝试剂，将变为紫色、带有金属光泽的菌落分离出来，得到大肠杆菌，然后加入抗生素如青霉素，将培养基中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀死，得到酵母菌。
答案：(1)灼烧灭菌
(2)对接种环灼烧灭菌 相交(相接、相连、交叉等)
(3)酚红指示剂 自养微生物(硝化细菌)
(4)根据菌落颜色，首先分离出金黄色葡萄球菌，然后向培养基中加入伊红—美蓝试剂，将变为紫色、带有金属光泽的菌落分离出来，得到大肠杆菌，然后加入抗生素如青霉素，将培养基中的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌杀死，得到酵母菌(分离顺序不唯一，答案合理即可)
11．(2016·全国Ⅰ卷)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配置培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是________。
(2)步骤③中，实验组的操作是__________________________。
(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了________现象。
答案：(1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂 (2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间 (3)污染
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养细菌后，指示剂将( )
A．变蓝色 B．变红色
C．变黑色 D．变棕色
解析：细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，加入酚红指示剂将变红。
答案：B
2．测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是( )
A．细菌个体小，真菌个体大
B．细菌易稀释，真菌不易稀释
C．细菌在土壤中数量比真菌多
D．随机的，没有原因
解析：土壤中的微生物大约70%～90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生成的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。
答案：C
3．用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，通过统计平板上的菌落数就能推测出样品中的活菌数。原因是( )
A．平板上的一个菌落就是一个细菌
B．菌落中的细菌数是固定的
C．此时的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌
D．此方法统计的菌落数一定与活菌的实际数相同
解析：用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数时，平板上的一个菌落一般来源于样品稀释液中的一个活菌，但偶尔也能来自两个细菌，所以此方法统计的菌落数可能与活菌的实际数不相同。
答案：C
4．土壤中的细菌能分解尿素，是因为它们能合成一种( )
A．尿素酶 B．脲酶
C．蛋白酶 D．肽酶
解析：能够分解利用尿素的细菌，其细胞内含有脲酶，可以把尿素分解成氨，然后进一步利用。
答案：B
5．(2016·四川卷)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以____________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加____________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成____________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是______________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板相比，此计数方法测得的细菌数目较________。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示的位置增加了70个核苷酸，使图乙序列出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
解析：(1)关键信息：“筛选产脲酶细菌”“接种稀释倍数为105的土壤样品溶液”，使“图乙序列”出现终止密码。
(2)解题关键：区别选择培养基与鉴别培养基，掌握细菌计数的方法。
本题考查微生物的培养与分离方法及基因表达。
(1)脲酶能够催化尿素分解为氨，要从土壤中筛选出产脲酶的细菌，需用以尿素作为唯一氮源的选择培养基。由于尿素被分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，pH升高，使酚红指示剂变红色。
(2)将稀释倍数为105的土壤样品溶液接种在细菌培养基平板上，用于计数细菌菌落数的方法是稀释涂布平板法。统计的菌落数应介于30～300之间，选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，每克土壤样品中细菌数量为(156＋178＋191)÷3÷0.1×105＝1.75×108。由于两个或多个细菌连接在一起时，往往统计的是一个菌落，用此方法测得的细菌数目偏低。
(3)密码子由3个相邻的碱基组成，箭头前面的碱基一共构成91个密码子；插入的70个核苷酸和后面2个碱基一共构成24个密码子，后面是UGA，是终止密码，翻译结束后，表达的蛋白质含有115个氨基酸。
答案：(1)尿素 酚红 红
(2)稀释涂布平板法 1.75 少
(3)UGA 115
[A级 基础巩固]
1．分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂糖 ④不加琼脂糖 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
解析：分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有尿素、琼脂糖、葡萄糖，尿素给分解尿素的细菌提供氮源，不加硝酸盐。
答案：C
2．从土壤中分离能分解尿素的细菌，可以利用选择培养基，其成分中一定有( )
①尿素 ②有机氮化物 ③无机盐 ④有机碳化物
⑤水 ⑥无机碳化物
A．①③④⑤ B．②③④⑤
C．①③⑤⑥ D．②③⑤⑥
解析：分离能分解尿素的细菌，故培养基中一定有尿素，一定没有有机氮化物；另外，水、无机盐和碳源、能源也是细菌生长所必不可少的。有机碳在这里既是碳源又是能源，因为分解尿素的细菌是异养微生物，不能利用无机碳化物。
答案：A
3．关于土壤取样的叙述错误的是( )
A．土壤取样，应选取肥沃、湿润的土壤
B．先铲去表层土3 cm左右，再取样
C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D．应在火焰旁称取土壤
答案：C
4．下列关于微生物培养和利用的叙述不正确的是( )
A．利用稀释涂布平板法只能分离微生物不能对微生物进行计数
B．接种时连续划线的目的是将聚集的菌种逐步稀释获得单菌落
C．以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌
D．用大白菜腌制泡菜的过程中亚硝酸盐含量变化是先增加后减少
解析：用稀释涂布平板法可以分离微生物也可以对微生物进行计数；接种划线可以将菌体分散，最后得到单个菌体细胞，经过培养可以得到单个菌落；以尿素为唯一氮源且含酚红的培养基可选择和鉴别尿素分解菌；在泡菜的腌制过程中，开始亚硝酸盐含量增加，10天后含量开始下降。
答案：A
5．在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有( )
①由于土样不同 ②由于培养基被污染 ③由于操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
答案：A
6．下列关于统计菌落数目的方法的叙述，不正确的是( )
A．采用平板计数法获得的菌落数往往少于实际的活菌数
B．当样品的稀释度足够高时，一个活菌会形成一个菌落
C．为了保证结果准确，一般采用密度较大的平板进行计数
D．在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果
解析：当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。一般选择菌落数在30～300的平板进行计数，密度过大会使计数结果偏小，影响结果的准确性。涂布三个平板，作为重复组，取其平均值作为统计结果能增强试验的说服力与准确性。
答案：C
B级 能力训练
7．在农业生产研究上，常常需要进行微生物的培养和计数。
(1)如图是利用________法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步________分散到培养基的表面。
(2) 分析下面培养基的配方：NaNO3、KH2PO4、NaH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、H2O。若此培养基用于培养分解尿素的细菌，则应除去上述的________，并加入________，以补充________源。
(3) 若在稀释倍数为106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为233，那么每毫升样品中的菌落数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)________。
解析：(1) 由题图可知，其采取的是平板划线法，该方法能把聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。(2) 培养分解尿素的细菌，其氮源是尿素，所以培养基中要除去含氮物质，即除去NaNO3，并加入尿素和葡萄糖，以提供氮源和碳源。(3) 根据题意可知，每毫升样品中的菌落数＝平板上菌落数的平均值÷体积×稀释倍数＝233÷0.2×106＝1.165×109。
答案：(1) 平板划线 稀释 (2) NaNO3 尿素和葡萄糖 氮、碳 (3) 1.165×109
8．有机化工原料氯苯不易降解，会污染环境，现欲从土壤中分离高效降解氯苯的微生物。回答下列问题：
(1) 为了获得能降解氯苯的微生物菌种，可在被氯苯污染的土壤中取样，并应选用以________为碳源的培养液进行选择培养。除含有碳源外，培养液还应含有________、无机盐和蒸馏水等。
(2) 将获得的3种待选微生物甲、乙、丙分别接种在1 L含20 mg氯苯的相同培养液中培养(培养液中其他营养物质充裕、条件适宜)，观测从实验开始到微生物停止生长所用的时间，甲、乙、丙分别为33 h、15 h、46 h，则应选择微生物乙作为菌种进行后续培养，理由是_____________________________________________________。
(3) 若要测定培养液中选定菌种的菌体数，既可在显微镜下用________直接计数，也可选用________法统计活菌数目。
(4) 制备固体培养基，基本步骤是：
计算→称量→溶化→分装→________→包扎→高压蒸汽灭菌→________。
(5) 接种时要对接种环进行灼烧，目的是________。
答案：(1) 氯苯 氮源 (2) 微生物乙分解氯苯的能力比甲、丙更强
(3) 血细胞计数板 稀释涂布平板
(4) 加棉塞 倒平板 (5) 杀灭接种环上的微生物，避免感染杂菌
9．广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗→榨汁(蔗糖)→酵母发酵→蒸馏→成品(燃料酒精)。
(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：
步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。
步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意________和________，加琼脂后灭菌，制成固体平板。
步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。
步骤4：根据___________________________________________，
筛选出突变菌。
(2)上述步骤2、3和4的依据分别是________________________
______________________________________________________。
解析：(1)要筛选耐高糖和耐酸的菌种，培养基中必须加入高浓度蔗糖和调低pH，能在选择培养基上生长的即为所需菌种。(2)步骤2是给其提供高糖或酸性的筛选环境；步骤3是为了获得单菌落；步骤4是根据能生长的菌株具有耐高糖和耐酸的特性筛选出突变菌。
答案：(1)添加高浓度蔗糖(葡萄糖) 调低pH 是否能在选择培养基上生长 (2)提供高糖和酸性的筛选环境；获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性
10．(2017·全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生______________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________，但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有____________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)细菌分解尿素是由于细菌体内合成脲酶的结果，尿素是有机物，分解尿素的细菌是分解者，而不是生产者，只有生产者才能利用CO2作为碳源合成有机物。葡萄糖通常既作为碳源，也可作为能源。
(2)筛选分解尿素的细菌，通常只能用尿素作为唯一氮源，对于“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”均含有无机氮源。
(3)KH2PO4和Na2HPO4为微生物提供P元素和无机盐离子如钾离子和钠离子，还可作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定。
答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养型生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生物生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料
(2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
11．某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中活菌数目，培养基配方如下表。将各种物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL，再经高温灭菌，制成固体培养基备用。
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·
7H2O
蛋白胨
葡萄糖
尿素
琼脂
1.4 g
2.1 g
0.2 g
1.0 g
10.0 g
1.0 g
15.0 g
(1) 根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？________(填“能”或“不能”)，原因是
_____________________________________________________。
(2) 培养基用________法灭菌，培养皿用________法灭菌，待培养基冷却到________℃(填“20”“30”“40”或“50”)左右时，在________附近倒平板，等平板冷却凝固后，将平板倒过来放置，可以防止________________________，以免造成污染。
(3) 培养分解尿素的细菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是
_______________________________________________________
_____________________________________________________。
(4) 实验中使用过的培养基及其培养物必须经过________处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
解析：(1) 据表分析，表中的蛋白胨可以为微生物的生存提供氮源，所以不能分离尿素分解菌，分离尿素分解菌需要用以尿素为唯一氮源的选择培养基培养。(2) 培养基常用高压蒸汽灭菌，培养皿常用干热灭菌。培养基要冷却到50 ℃左右时才能倒平板，倒平板时要在酒精灯火焰旁进行，以防止杂菌的污染。将平板倒过来放置可以防止培养皿盖上的水珠落入培养基对培养基造成污染。(3)培养分解尿素的细菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是将未接种的培养基在适宜的温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生。(4) 使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。
答案：(1)不能 培养基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物(培养基含蛋白胨，蛋白胨中含有氮元素) (2)高压蒸汽灭菌 干热灭菌 50 酒精灯火焰 培养皿盖上的水珠落入培养基 (3)将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生 (4)灭菌
课题3 分解纤维素的微生物的分离
1．纤维素酶可以将下列哪种物质分解( )
A．牛肉片 B．鱼片
C．滤纸条 D．塑料条
解析：纤维素酶只能使纤维素分解，本题中只有C项滤纸条的主要成分是纤维素，所以可以将滤纸条分解。
答案：C
2．下列环境中，纤维素分解菌含量最高的是( )
A．热带雨林中的土壤 B．寒带森林中的土壤
C．花盆中 D．荒漠地区
解析：生物与环境是相互依存的，纤维素含量高的环境，纤维素分解菌含量较多。
答案：A
3．纤维素、纤维素酶和控制纤维素酶合成的物质，它们的基本组成单位依次是( )
A．葡萄糖、葡萄糖和氨基酸
B．葡萄糖、氨基酸和核苷酸
C．氨基酸、氨基酸和核苷酸
D．淀粉、蛋白质和核酸
解析：纤维素是多糖，其基本组成单位是葡萄糖；纤维素酶是蛋白质，其基本组成单位是氨基酸；控制酶合成的物质是DNA，其基本组成单位是核苷酸。
答案：B
4．在从土壤中分享出分解纤维素的微生物的实验中，先进行选择培养，再进行刚果红染色法分离。先选择培养的目的是( )
A．浓缩目标菌种
B．除去杂菌，获得能分解纤维素的纯菌种
C．杀灭不需要的微生物
D．在微生物的菌落上获得纤维素分解菌种
解析：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到浓缩目标菌种的作用，但是不能得到单一菌种。该培养基中的化学成分不能杀灭微生物。选择培养时用液体培养基，微生物在培养液中繁殖，不能获得目标菌落。
答案：A
5．现在大力提倡无纸化办公，但是每年仍然不可避免地产生大量的废纸。废纸的主要成分是木质纤维，人类正努力将其转化为一种新的资源——乙醇。如下图是工业上利用微生物由纤维素生产乙醇的基本工艺流程，请回答相关问题：
(1)自然界中①环节需要的微生物大多分布在____________的环境中。将从土壤中获得的微生物培养在以________为唯一碳源、并加入________的培养基上，筛选周围有________的菌落。
(2)在如上所述的筛选过程中获得了三个菌落，对它们分别培养，并完成环节②，且三种等量酶液中酶的浓度相同，则你认为三种酶液的活性________(填“一定相同”“不一定相同”或“一定不同”)，可以通过__________________进行定量测定。
(3)根据测定结果，①环节常选择木霉，则②中获得的酶是________酶。
(4)生产中可以满足④环节的常见菌种是________，为了确保获得产物乙醇，⑤环节要注意__________________。
解析：(1)富含纤维素的土壤中，含有大量以纤维素为碳源的纤维素分解菌。刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素分解后，复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，通过此方法来筛选纤维素分解菌。(2)酶液中蛋白质的浓度相同，酶的活性不一定相同，可通过检测分解纤维素后所产生的葡萄糖量是否相等来鉴定其活性是否相同。(3)木霉能产生纤维素酶，可以将纤维素分解。(4)在酒精发酵中常用的微生物是酵母菌，在接种过程中一定要避免杂菌污染。乙醇是酵母菌无氧发酵的产物，发酵过程中一定要保持无氧的环境。
答案：(1)富含纤维素(其他答案合理也可，如落叶较多等) 纤维素 刚果红 透明圈
(2)不一定相同 对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖
(3)纤维素
(4)酵母菌 发酵装置的密闭性(或保证无氧条件等)
A级 基础巩固
1．微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是( )
A．C1酶和Cx酶
B．C1酶和葡萄糖苷酶
C．Cx酶和葡萄糖苷酶
D．C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶
解析：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，其中C1酶和Cx酶能将纤维素分解成纤维二糖，而葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。
答案：A
2．当纤维素被纤维素酶分解后，会在培养基中出现一些透明圈，这些透明圈是( )
A．刚果红与纤维素形成的复合物
B．纤维素分解后的葡萄糖
C．由纤维素酶聚集在一起形成的
D．以纤维素分解菌为中心形成的
解析：刚果红与纤维素反应形成红色复合物，当有纤维素分解菌生长时，菌落周围的纤维素被分解，形成透明圈。
答案：D
3．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在( )
A．加入指示剂的鉴别培养基上
B．含有蛋白胨的固体培养基上
C．只含纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上
D．含四大营养要素的培养基上
解析：选择纤维素分解菌的培养基中应含有该种菌生长发育所需的营养条件，其他菌种在这种培养基中不能生存。
答案：C
4．通过分离分解纤维素的微生物实验，对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，这只是分离提纯的第一步，还需要进行( )
A．发酵产纤维素酶的实验
B．提取纤维二糖的实验
C．浓缩纤维素分解菌的实验
D．提取葡萄糖的实验
解析：为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后产生的葡萄糖进行定量测定。
答案：A
5．从土壤中筛选纤维素分解菌的实验设计正确的是( )
A．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→发酵培养
B．土壤取样→选择培养→稀释涂布平板→挑选菌落
C．土壤取样→梯度稀释→选择培养→挑选菌落
D．土壤取样→梯度稀释→稀释涂布平板→选择培养→挑选菌落
解析：土壤取样之后，应先经过选择培养，以增大目的菌株的浓度，然后为避免一个培养基上的菌落太多，需进行稀释涂布平板。
答案：B
6．关于纤维素酶的叙述中，错误的是( )
A．牛、羊等草食动物可以合成纤维素酶，从而利用纤维素
B．纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种组分
C．纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质
D．分解纤维素的细菌、真菌、放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的
解析：牛、羊等草食动物不能合成纤维素酶，它们之所以能利用纤维素是因为它们的瘤胃中有许多微生物可分泌纤维素酶；纤维素被纤维素酶分解后的产物是葡萄糖，葡萄糖可作为微生物的营养物质；能分解纤维素的微生物都能产生纤维素酶，它们通过纤维素酶来分解纤维素。
答案：A
B级 能力训练
7．纤维素是自然界分布最广、含量最多的一种多糖，马、牛等食草动物具有消化纤维素的能力，请回答有关问题：
(1) 与培养土壤中分离的纤维素分解菌相比，培养马胃中分离出的纤维素分解菌要调整培养基的pH，还要保证________条件。配制好的培养基培养前应采用________________法进行灭菌处理。从功能上看，该培养基是________培养基。
(2) 给锥形瓶内的培养液接种时应在酒精灯火焰附近进行，防止____________污染培养基。对无菌操作时用到的玻璃器皿要用____________的方法彻底灭菌。
(3) 某同学使用划线法分离纯化菌株，经一段时间培养，发现有的线上长满了菌，有的线上无菌落，造成这种情况的原因可能是划线操作时________。
(4) 将筛选培养的纤维素分解菌破碎后，用________的方法可将纤维素酶溶液与其他细胞成分分离开。纤维素酶能催化纤维素分解为还原性的葡萄糖，根据这一特性，可用________试剂判断提取物是否起到了降解纤维素的作用。
答案：(1)无氧 高压蒸汽灭菌 选择 (2)杂菌 干热灭菌 (3)接种环灼烧后未冷却 (4)离心 斐林
8．发酵工程是通过大量培养微生物以生产某种产品。请回答下列问题：
(1) 欲从多种微生物中分离某种细菌并抑制其他微生物的生长，应使用________培养基。纯化菌种时可采用比较简单的________法进行接种，接种操作应在________进行。
(2) 纯化的菌种常采用固体斜面培养基临时保藏，该方法保存的时间较__________，而且菌种易______________。常用的凝固剂是__________________。
(3) 从培养基所含的成分来看，从土壤中分离出固氮菌的培养基特点是__________，从土壤中分离出纤维素分解菌的培养基特点是__________________________________________________________。
解析：(1)分离微生物常用选择培养基。纯化菌种常用平板划线法。为保证无菌操作，接种应在酒精灯火焰旁进行。(2)采用临时保藏法时，菌种容易被污染或产生变异，因此该方法保存的时间不长。培养基常用的凝固剂是琼脂。(3) 分离土壤中的自身固氮菌选用选择培养基，该培养基中不应该含有氮源。要分离土壤中的纤维素分解菌，经常用以纤维素为唯一碳源的选择培养基，若要鉴别是否分离出了纤维素分解菌则应使用加入了刚果红的鉴别培养基，观察是否有透明圈产生。
答案：(1) 选择 平板划线 酒精灯火焰旁 (2) 短 被污染和发生变异 琼脂 (3) 不含有氮源 以纤维素为唯一碳源并含有刚果红染液
9．植物的秸秆、枝叶等纤维物质是可再生资源，以纤维素类物质生成燃料乙醇的研究越来越受重视。纤维素酶糖化法是目前常用的方法，其操作过程如图所示：
(1)该方法中，微生物X与微生物Y不同，微生物Y是________，若从土壤中获得微生物X，请写出分离的流程________________
_____________________________________________________。
为了鉴别微生物X，培养基的成分为CMC-Na、酵母膏、KH2PO4、琼脂、土豆汁等。在该培养基中，CMC-Na的作用是______________。
(2)若经选择，微生物X为木霉，则其内分解纤维素的酶至少包括________________三种组分，这三种酶协同作用，将纤维素分解为葡萄糖。
(3)在操作过程中，过程③需________以保证乙醇的产生。
(4)操作发现，糖液浓度过高时，葡萄糖的产生会受到抑制，其原因是_______________________________________________
____________________________________________________。
解析：(1)微生物Y能发酵糖液产生乙醇，故微生物Y是酵母菌。鉴别纤维素分解菌的培养基中，CMC-Na能被Cx酶和C1酶分解为纤维二糖，可使被刚果红染色的培养基的红色褪去，便于鉴别，也为微生物的生长提供碳源。(2)纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶三种组分。(3)酵母菌发酵产生乙醇是无氧呼吸的过程，在操作过程中应密闭发酵。(4)随着产物(葡萄糖)的增多，反应将会受到抑制，其机理为酶的活性受到反馈抑制。
答案：(1)酵母菌 土壤取样→选择培养→梯度稀释→将菌液涂布到特定的选择培养基上→挑选产生透明圈的菌落 提供碳源(或便于鉴别)
(2)C1酶、Cx酶、葡萄糖苷酶
(3)密闭发酵
(4)产物(葡萄糖)过多，反馈抑制了分解秸秆的酶的活性
10．某实验小组欲从土壤中筛选出能高效分解纤维素的微生物，设计了下列实验流程。请回答相关问题：
→→→→
(1)选择培养使用的培养基是以__________为唯一碳源，该培养基是__________(固体或液体)培养基。
(2)鉴别纤维素分解菌的培养基中应加入________染料，它可以与纤维素形成________色复合物，最终应挑选透明圈________(大或小)的菌落进行纯化培养。
(3)实验中对培养基进行灭菌常用方法是________________。挑选菌落前，对接种环的灭菌方法是____________________。
(4)上述实验中，接种操作都应在火焰附近进行，以防止_______。
答案：(1)纤维素 液体 (2)刚果红 红 大 (3)高压蒸汽灭菌 灼烧灭菌 (4)杂菌污染
11．利用纤维素解决能源问题的关键是高性能纤维素酶的获取。请完善实验方案，并回答相关问题：
【实验目的】比较三种微生物所产生的纤维素酶的活性。
【实验原理】纤维素酶催化纤维素分解为葡萄糖，用葡萄糖的产生速率表示酶活性大小；用呈色反应表示葡萄糖的生成量。
【实验材料】三种微生物(A～C)培养物的纤维素酶提取液，提取液中酶蛋白浓度相同。
【实验步骤】
(1)取四支试管，分别编号。
(2)在下表各列的一个适当位置，填写相应试剂的体积，并按表内要求完成相关操作。
试管号
1
2
3
4
蒸馏水/mL
1.4
1.4
1.4
pH 7.5的缓冲液/mL
0.2
0.2
0.2
纤维素悬浮液/mL
0.3
0.3
0.3
微生物A提取液/mL
0.1
微生物B提取液/mL
微生物C提取液/mL
0.1
总体积/mL
2.0
2.0
2.0
2.0
(3)将上述四支试管放入37 ℃的水中，保温1 h。
(4)在上述四支试管中分别加入_______试剂，摇匀后，进行__________处理。
(5)观察比较实验组的三支试管与对照组试管的颜色及其深浅。
【实验结果】
物质
微生物A提取物
微生物B提取物
微生物C提取物
颜色深浅程度
＋
＋＋＋
＋＋
【分析讨论】
(1)该实验中的对照组是__________号试管。
(2)实验组试管中呈现的颜色均是__________，但深浅不同。
(3)上述结果表明：不同来源的纤维素酶，虽然酶蛋白浓度相同，但活性不同。若不考虑酶的最适pH和最适温度的差异，其可能原因是______________________。
(4)你认为上述三种微生物中，最具有应用开发价值的是______。
(5)从解决能源问题的角度考虑，开发这种纤维素酶的意义在于
_______________________________________________________
_______________________________________________________
______________________________________________________。
解析：本题实验目的是比较三种微生物所产生的纤维素酶的活性。根据实验目的确定自变量为不同微生物提取液，因变量为葡萄糖的生成量，其余为无关因素(如不同微生物的提取液量、pH 7.5的缓冲液量和纤维素悬浮液量)，应该等量。4号试管为空白对照组，其未加入微生物提取液，故应该加入1.5 mL的蒸馏水以保证总体积为2.0 mL。实验结果通过与斐林试剂共热生成砖红色沉淀的颜色深浅程度进行判断，分析实验结果可知，微生物B提取液与斐林试剂反应颜色最深，最具有研究价值。不同来源的纤维素酶，虽然酶蛋白浓度相同，但活性不同。若不考虑酶的最适pH和最适温度的差异，其可能原因是不同酶的空间结构不同。开发纤维素酶的意义在于葡萄糖可用作制取酒精的原料或用纤维素代替化学能源。
答案：【实验步骤】(2)
试管号
1
2
3
4
蒸馏水/mL
1.5
pH 7.5的缓冲液/mL
0.2
纤维素悬浮液/mL
0.3
微生物A提取液/mL
微生物B提取液/mL
0.1
微生物C提取液/mL
总体积/mL
(4)斐林 水浴加热
【分析讨论】(1)4 (2)砖红色 (3)不同酶的氨基酸序列不同(不同酶的空间结构不同) (4)微生物B (5)葡萄糖可用作制取酒精的原料或用纤维素代替化学能源(言之有理即可)
