专题5 DNA和蛋白质技术
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填充：①0. 14 ②蛋白酶 ③80 ④二苯胺 ⑤DNA的热变性 ⑥Taq DNA聚合酶 ⑦复性 ⑧较大的分子 ⑨移动速度 ⑩纯化
课题1 DNA的粗提取与鉴定
1．破译生物基因组DNA的遗传信息或进行基因操作，首先要提取细胞核DNA。下列不可以作为DNA提取的实验材料是( )
A．鸡血细胞
B．蛙的红细胞
C．人的成熟红细胞
D．菜花
解析：鸡血细胞含有DNA，可作为DNA提取的实验材料，A正确；蛙的红细胞含有DNA，可作为DNA提取的实验材料，B正确；人的成熟的红细胞没有细胞核和众多细胞器，不含DNA，因此不适宜作为DNA提取的实验材料，C错误；菜花细胞含有DNA，可作为DNA提取的实验材料，D正确。
答案：C
2．下列有关“DNA粗提取与鉴定”实验的叙述，正确的是( )
A．新鲜猪血、菜花等动植物材料均可用于DNA的粗提取
B．植物材料需先用洗涤剂破坏细胞壁再吸水涨破
C．DNA不溶于95%的冷酒精而溶于2 mol?L－1的NaCl溶液
D．溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后即呈蓝色
解析：猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核和细胞器，不含DNA，不能用于提取DNA，故A错误；用植物材料提取DNA时，通过研磨法破坏细胞壁，用洗涤剂瓦解细胞膜，故B错误；DNA不溶于95%的冷酒精，但溶于2 mol?L－1的NaCl溶液，故C正确；溶有DNA的NaCl溶液中加入二苯胺试剂后需要沸水浴加热才能呈蓝色，故D错误。
答案：C
3．在生物实验中有关酒精用途的叙述不正确的是( )
A．DNA粗提取时，用冷却的酒精析出含杂质较少的DNA
B．植物组织培养时，用酒精棉球擦拭双手后再进行操作
C．脂肪的鉴定实验中，用酒精洗去被染玻片标本上的浮色
D．制作洋葱根尖细胞有丝分裂装片时，解离后用酒精漂洗
解析：由于DNA不溶于酒精，DNA粗提取时，用冷却的酒精析出含杂质较少的DNA，A正确；体积分数为70%的酒精可进行消毒，植物组织培养时，用酒精棉球擦拭双手后再进行操作，B正确；脂肪的鉴定实验中，用酒精洗去被染玻片标本上的浮色，C正确；制作洋葱根尖细胞有丝分裂装片时，解离后用清水进行漂洗，D错误。
答案：D
4．甲、乙两图为“DNA的粗提取与鉴定”实验中涉及的两个操作装置图。相关叙述正确的是( )
A．图甲的烧杯和图乙的试管中所用溶剂都为NaCl溶液，但两者浓度不同
B．图乙试管经稍稍加热后即可观察到一支试管中的溶液明显变蓝，另一支试管中的溶液不变蓝
C．图甲操作需用玻璃棒迅速搅拌以使DNA析出，并缠绕在玻璃棒上
D．图乙操作中所用的二苯胺需现配现用以达到较好的鉴定效果
解析：图甲烧杯中为酒精溶液，图乙试管中为NaCl溶液，A错误。图乙试管需要在沸水中加热5 min，B错误。图甲用玻璃棒沿一个方向轻轻搅拌，卷起丝状物，C错误。图乙操作中所用的二苯胺最好现配现用，否则二苯胺会变成浅蓝色，D正确。
答案：D
5．下图所示为DNA的粗提取与鉴定实验的实验步骤，请据图回答下列问题：
(1)请写出①②③④的实验步骤名称
①_________________________________________________；
②_________________________________________________；
③________________________________________________；
④_________________________________________________。
(2)A、B两支试管中，试管________中含有DNA，试管______起对照作用。
解析：在解答本题时，一定要先将图中的每一步操作都看清楚，然后根据图中的有关文字提示判断每一步实验操作的名称。
答案：(1)①提取细胞核物质 ②析出DNA的黏稠物 ③用冷却的酒精析出DNA ④DNA的鉴定 (2)B A
[A级 基础巩固]
1．蛋白酶能将蛋白质水解而使染色质中的DNA分离出来。下列药品可达到上述同一目的的是( )
A．蒸馏水 B．NaCl溶液
C．NaOH溶液 D．盐酸
解析：蛋白酶是利用酶的专一性将DNA和蛋白质分离，而NaCl溶液则是利用DNA和蛋白质在该溶液中的溶解度不同将其分离。
答案：B
2．DNA在下列浓度的NaCl溶液中，溶解度最低的是( )
A．2 mol·L－1 B．0.015 mol·L－1
C．0.14 mol·L－1 D．5 mol·L－1
答案：C
3．DNA的粗提取与鉴定实验，与下列哪项原理无关( )
A．DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中，溶解度最低
B．DNA易被龙胆紫溶液染成紫色
C．DNA溶液中加入二苯胺试剂，加热后产生蓝色
D．加入95%的冷酒精，DNA会从溶液中析出
解析：DNA在0. 14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。DNA鉴定选用的试剂为二苯胺试剂，加热后(沸水浴)产生蓝色。加入95%的冷却的酒精，由于DNA不溶于酒精，DNA会从溶液中析出。
答案：B
4．在DNA粗提取的实验中，先后两次向烧杯中加入蒸馏水的作用分别是( )
A．稀释血液；冲洗样品
B．使血细胞破裂；降低NaCl浓度，使DNA析出
C．使血细胞破裂；增大DNA溶解量
D．使血细胞破裂；提取含杂质较少的DNA
解析：在DNA粗提取的实验中，先后两次向烧杯中加入蒸馏水的作用分别是使血细胞吸水涨破，释放DNA；降低NaCl浓度，使DNA析出。
答案：B
5．向溶有DNA的物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水，在这个过程中DNA和杂质蛋白质等的溶解度变化情况分别是( )
A．减小 减小 B．先减小后增大 增大
C．增大 增大 D．减小 增大
解析：由于DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小，故向溶有DNA的物质的量浓度为2 mol/L的NaCl溶液中不断加入蒸馏水，在这个过程中DNA的溶解度先减小，0.14 mol/L时溶解度最小，后增大；而蛋白质在高浓度的盐溶液中会出现盐析，随浓度降低溶解度逐渐增大。
答案：B
6．关于DNA粗提取和鉴定实验的叙述，不正确的是( )
A．香蕉、鱼卵、猪血都是适宜的实验材料
B．DNA在0.14 mol/L的NaCl溶液中溶解度最小
C．析出DNA时使用冷酒精的效果更好
D．沸水浴条件下二苯胺与DNA反应呈蓝色
解析：猪属于哺乳动物，其成熟的红细胞中没有细胞核和细胞器，因此不含DNA，A错误；DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14 mol/L溶解度最低，B正确；DNA不溶于酒精溶液，所以析出DNA时使用冷酒精的效果更好，C正确；在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂，D正确。
答案：A
B级 能力训练
7．关于DNA粗提取的实验材料的选择，也经过了多次实验效果的比较，最终选择鸡血做实验材料的原因是什么？请回答下列问题：
(1)鸡血细胞中红细胞__________，家鸡属于鸟类，新陈代谢旺盛，因而血液中_______细胞数目较多，可以提供丰富的________。
(2)实验前由老师制备血细胞液供同学们做实验材料，而不用鸡全血，主要原因是__________ 。
(3)生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是________，这是因为这些动物和人一样，成熟红细胞中____________，但若改用动物肝脏做实验材料，实验能顺利进行，这是因为______________________。
解析：(1)鸡红细胞中含有成形的完整的细胞核，而且红细胞数量比较多，因而DNA量也较丰富。
(2)鸡的全血包括血浆和血细胞，血浆中无DNA，全血中除去血浆后即是浓缩的血细胞液，DNA的相对含量提高了。
(3)(1)鸡红细胞中含有成形的完整的细胞核，而且红细胞数量比较多，因而DNA量也较丰富。
(2)鸡的全血包括血浆和血细胞，血浆中无DNA，全血中除去血浆后即是浓缩的血细胞液，DNA的相对含量提高了。
(3)生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，若他们按实验要求完成实验步骤后，结果是很难提取到DNA，这是因为这些动物和人一样，成熟的红细胞中无细胞核，但肝细胞含有细胞核，并且肝组织易破坏，有利于DNA的提取。
答案：(1)含细胞核 红 DNA
(2)鸡血细胞中DNA相对含量高
(3)很难提取到DNA 无细胞核 肝细胞有细胞核
8．DNA在NaCl溶液中的溶解度随着NaCl浓度的变化而变化。
(1)请在下列NaCl溶液中选出能使DNA析出最彻底的一种( )和溶解度最高的一种( )(在括号内填选项)。
A．0.14 mol/L B．2 mol/L
C．0.15 mol/L D．0.3 mol/L
(2)DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些物质却可以溶于酒精溶液，利用这一原理可以________，可以推测溶于酒精的物质可能有________。
(3)利用DNA遇________呈蓝色的特性，将该物质作为鉴定________的试剂。其实验过程中要向放有________的试管中加入4 mL的________。混合均匀后，将试管置于______5 min，待试管______，观察试管中溶液颜色的变化。
答案：(1)A B (2)除去杂质 某些脂质、蛋白质等
(3)二苯胺 DNA DNA 二苯胺试剂 沸水中水浴加热 冷却后
9实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
类别
A
B
1
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
加2 mol/L的NaCl溶液5 mL
2
不加
加入提取的DNA丝状物并搅拌
3
加4 mL二苯胺，混匀
加4 mL二苯胺，混匀
4
沸水浴5 min
沸水浴5 min
实验现象
实验结论
(1)根据上图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何？
_____________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是___________________________，
同时说明DNA对高温有较强的_______________________。
(4)A试管在实验中的作用是_____________________________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与_____________________
________________________________________________有关。
解析：A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
答案：(1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会逐渐变成蓝色 (2)溶液颜色基本不变(不呈浅蓝色) (3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照 (5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
10．某生物兴趣小组开展DNA粗提取的相关探究活动。具体步骤如下：
材料处理：称取新鲜的菜花、辣椒和蒜黄各2份，每份10 g。剪碎后分成两组，一组置于20 ℃，另一组置于－20 ℃条件下保存24 h。
DNA粗提取：
第一步，将上述材料分别放入研钵中，各加入15 mL研磨液，充分研磨。用两层纱布过滤，取滤液备用。
第二步，先向6只小烧杯中分别注入10 mL滤液，再加入20 mL体积分数为95%的冷酒精溶液，然后用玻璃棒缓缓地沿一个方向搅拌，使絮状物缠绕在玻璃棒上。
第三步，取6支试管，分别加入等量的2 mol/L NaCl溶液溶解上述絮状物。
DNA检测：在上述试管中各加入4 mL二苯胺试剂，混合均匀后，置于沸水中加热5 min，待试管冷却后比较溶液颜色的深浅，结果如下表。
材料保存温度
菜花
辣椒
蒜黄
20 ℃
＋＋
＋
＋＋＋
－20 ℃
＋＋＋
＋＋
＋＋＋＋
注：“＋”越多表示蓝色越深。
分析上述实验过程，回答下列问题：
(1)该探究性实验课题的名称是___________________________
_____________________________________________________。
(2)第二步中“缓缓地”搅拌，这是为了减少__________。
(3)根据实验结果，得出结论并分析。
①结论1：与20 ℃相比，相同实验材料在－20 ℃条件下保存，DNA的提取量较多。
结论2：________________________________________________
_____________________________________________________。
②针对结论1，请提出合理的解释：
_____________________________________________________。
解析：(1)据题意，该探究实验的自变量是实验材料的种类和温度，因变量是DNA提取量，则该探究性实验课题的名称是探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响。(2)搅拌过程中常常会发生DNA的断裂，因而该步骤需要“缓缓地”进行。(3)①据表分析不同自变量条件下的因变量情况，可得结论2：等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多。②低温使DNA酶的活性受到抑制，从而降低了DNA的降解速率，使DNA提取量增多。
答案：(1)探究不同材料和不同保存温度对DNA提取量的影响
(2)DNA断裂 (3)①等质量的不同实验材料，在相同的保存温度下，从蒜黄中提取的DNA量最多
②低温抑制了相关酶的活性，DNA降解速度慢
课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
1．PCR技术控制DNA的解聚与结合是利用DNA的( )
A．特异性 B．稳定性
C．热变性 D．多样性
解析：DNA分子在80～100 ℃的温度范围内变性，双链解开成单链，当温度慢慢降低时，又能重新结合形成双链。
答案：C
2．下图表示PCR扩增的产物，请分析它是哪次循环的产物( )
A．第一次循环 B．第二次循环
C．第三次循环 D．第四次循环
解析：在PCR反应中以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合，并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以，形成的每个子代DNA中只有一种引物。
答案：A
3．PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时将( )
A．仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸
B．与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸
C．同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链延伸
D．无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链
解析：当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物Ⅱ结合延伸DNA的子链。
答案：B
4．关于DNA片段PCR扩增实验的描述中不正确的是( )
A．加入的Taq DNA聚合酶耐高温
B．不同大小DNA在电场中迁移速率不同
C．此过程需要DNA连接酶
D．扩增区域由2个引物来决定
解析：PCR是体外DNA扩增技术，该技术是在高温条件下进行的，因此需要耐高温Taq DNA聚合酶，故A正确；DNA大小不同，在电场中的迁移速率不同，故B正确；PCR不需要DNA连接酶，但需要热稳定DNA聚合酶，故C错误；PCR技术需要一定的条件，其中一对引物就是条件之一，故D正确。
答案：C
5．随着研究的不断深入，PCR技术被不断改进，从原先只能扩增几个kb(千碱基对)的基因到目前已能扩增长达几十个kb的DNA片段。PCR的简要过程如下图所示，请分析回答下列有关问题：
(1)通过分析得出新合成的DNA分子中，A＝T，C＝G，这个事实说明DNA分子的合成遵循________。
(2)若将1个DNA分子拷贝10次，则需要在缓冲液中至少加入________个引物。
(3)DNA子链复制的方向是________，这是由于____________。
解析：(1)分析得出新合成的DNA分子中，A＝T，C＝G，这个事实说明DNA分子的合成遵循碱基互补配对原则。
(2)在DNA分子扩增时，需要两种引物，由于新合成的子链都需要引物作为复制的起点，故所需的引物数目等于新合成的DNA子链数目，即2×210－2＝(211－2)个。
(3)引物是一种单链DNA或RNA分子，它能与解开的DNA母链的3′端结合，为DNA聚合酶提供延伸位点，使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸，从而决定了DNA子链复制的方向是从5′端到3′端。
答案：(1)碱基互补配对原则
(2)211－2
(3)5′端到3′端 DNA聚合酶只能从引物的3′端拼接单个脱氧核苷酸分子
A级 基础巩固
1．下列有关PCR过程的叙述中不正确的是( )
A．受热变性破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，也可利用解旋酶实现
B．引物与单链相应互补序列结合是依靠碱基互补配对原则完成
C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸
D．PCR与细胞内DNA复制相比所需酶的最适温度较高
解析：DNA解成单链可用热变性方法或解旋酶处理，受热变性破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，A正确；引物为一段DNA序列，引物与单链相应互补序列结合是依靠碱基互补配对原则完成，B正确；延伸过程中需要热稳定DNA聚合酶、ATP、四种脱氧核糖核苷酸，C错误；PCR技术需要高温解成单链，故PCR与细胞内DNA复制相比所需酶的最适温度较高，D正确。
答案：C
2．PCR技术最突出的优点是( )
A．原理简单
B．原料易找
C．Taq DNA聚合酶有耐热性
D．快速、高效、灵活、易于操作
答案：D
3．PCR技术的操作步骤依次是( )
A．高温变性、中温延伸、低温复性
B．高温变性、低温复性、中温延伸
C．中温延伸、高温变性、低温复性
D．中温延伸、低温复性、高温变性
答案：B
4．聚合酶链式反应(PCR技术)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于PCR技术的叙述，不正确的是( )
A．PCR技术是在实验室中以少量DNA制备大量DNA的技术
B．反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板
C．PCR技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增
D．应用PCR技术与探针杂交技术可以检测基因突变
解析：PCR技术是人工合成DNA的方法，原料是脱氧核苷酸，不是核糖核苷酸。
答案：C
5．“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物(注：引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸)，两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如图乙所示，其中第⑤种DNA分子有几个( )
A．8 B．6 C．4 D．2
解析：由图分析可知：X基因第一次复制得到2个两种DNA分子：①和②；X基因第二次复制得到4个四种DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④；X基因第三次复制得到8个五种DNA分子：①复制得①和③，③复制得③和⑤，②复制得②和④，④复制得④和⑤；X基因第四次复制得到16个五种DNA分子：①复制得①和③，②复制得②和④，2个③复制得2个③和2个⑤，2个④复制得2个④和2个⑤，2个⑤得到4个⑤。从上面的推测可知，第四轮循环产物中有8个⑤。
答案：A
6．在PCR扩增DNA的实验中，预计一个DNA分子经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么出现该现象的原因不可能是( )
A．Taq DNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制
B．系统设计欠妥
C．循环次数不够
D．引物不能与母链结合
解析：如果TaqDNA聚合酶活力不够或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少，A正确。如果PCR系统设计欠妥，则达不到预期的结果，B正确。如果循环次数过少，产物的量比预期的少，C正确。如果引物设计不合理，若不能与模板DNA结合，将造成无法进行扩增，而结果得到了210个DNA分子，D错误。
答案：D
B级 能力训练
7．PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行研究的问题，被广泛应用。此过程需要一种Taq DNA聚合酶。请回答有关问题：
(1)体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中应用_______________________________________________。
(2)Taq DNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中分离的。
①为什么Taq细菌能从热泉中被筛选出来呢？______________
_____________________________________________________。
②Taq DNA聚合酶的功能是____________________________。
③为了使Taq DNA聚合酶能够多次反复利用，可采用________技术，常用的方法为___________________________________。
(3)与体内DNA复制相比，PCR反应要在________中才能进行，并且要严格控制________条件。
(4)PCR中加入的引物有________种，加入引物的作用是
_____________________________________________________。
答案：(1)高温使双链DNA分子解聚为单链
(2)①热泉70～80 ℃的高温条件淘汰了绝大多数微生物
②催化脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键
③固定化酶 化学结合法、物理吸附法
(3)一定的缓冲溶液 温度
(4)2 作为DNA复制的起点
8．H7N9型禽流感是全球首次发现的新亚型RNA流感病毒，目前最为快速有效的检测手段是RT－PCR核酸检测。RT－PCR的过程包括反转录作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增，过程如下图所示。据此分析下列问题：
(1)传统PCR技术的原理是________，过程中低温退火的含义是_________________________________________________________。
(2)在RT－PCR中每一步都有酶的参与，上图中过程1中的关键酶是________；PCR中的关键酶是________，该酶的作用特点是________、__________________。
(3)在对病毒核酸进行检测时，主要通过RT－PCR扩增其关键的基因序列，这时引物的设计就非常关键，根据下图分析，请你选择合适的引物：________。
答案：(1)DNA复制 引物与模板链互补配对
(2)反转录酶 Taq DNA聚合酶(DNA聚合酶) 耐高温
不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链
(3)引物Ⅰ和引物Ⅱ
9．多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。请回答下列有关PCR技术的基本原理及应用问题。
(1)DNA的两条链是反向平行的，通常将__________的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的__________开始延伸DNA链。
(2)PCR利用DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到____________________，它的发现和应用解决了上述问题。要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫__________。
(3)PCR的每次循环可以分为__________三步。假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有__________个这样的DNA片段。
(4)请用简图表示出一个DNA片段在PCR反应中第二轮的产物。
(5)简述PCR技术的主要应用。
解析：(2)因PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，所以用于催化DNA复制过程的DNA聚合酶要具有耐高温的特性。用选择培养基可将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来。(3)DNA复制两条链均作为模板，进行半保留复制，所以复制5次后得到的子代DNA分子数为25＝32个。(4)新合成的DNA链带有引物，而最初的模板DNA的两条链中只有一条带有引物。(5)PCR技术可以对DNA分子进行扩增，所以可用于遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等方面。
答案：(1)磷酸基团 3′端
(2)耐高温的Taq DNA聚合酶 选择培养基
(3)变性、复性和延伸 32 (4)如图所示：
(5)遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。
10．近20年来，PCR技术(多聚酶链式反应)成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制(如下图)，在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。
(1)加热使DNA双链间的________键完全打开，称为________；而在细胞中是在________酶的作用下进行的。
(2)如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入________种特定的引物。当温度降低至55 ℃时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的______端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是_______。
(3)PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的__________和__________，前者由________自动调控，后者则靠________来维持。
(4)通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是________。
解析：(1)PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。(2)PCR分为三个基本反应步骤：变性(95 ℃)、复性(55 ℃)、延伸(72 ℃)，其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。(3)PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境(稳定的缓冲溶液)，每一个步骤需要适宜的温度和酸碱度等。(4)一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。
答案：(1)氢 解旋 解旋 (2)两 3′ 从子链的5′端向3′端延伸 (3)温度 酸碱度 PCR仪 缓冲液 (4)1/8
课题3 血红蛋白的提取和分离
1．下列试剂可用于血红蛋白释放的是( )
①0.9%的生理盐水 ②甲苯 ③磷酸缓冲液 ④蒸馏水 ⑤柠檬酸钠
A．②④ B．①④
C．④⑤ D．①③
解析：0.9%的生理盐水是洗涤红细胞是应用的试剂，不能用于血红蛋白释放；甲苯的作用是溶解细胞膜的磷脂，加速血红蛋白的释放；磷酸缓冲液用于粗分离蛋白质，不能用于释放血红蛋白；蒸馏水作用是使红细胞吸水胀破，释放其中的血红蛋白；柠檬酸钠的作用是采血时，防止血液凝固，不能用于血红蛋白的释放。
答案：A
2．在血红蛋白分离过程中如果红色带区歪曲、散乱、变宽，与其有关的是( )
A．凝胶色谱柱的制作 B．色谱柱的装填
C．洗脱过程 D．样品的处理
解析：在血红蛋白分离过程中如果红色带区歪曲、散乱、变宽，说明色谱柱制作不成功，可能是凝胶装填不紧密、不均匀，或者存在气泡，打乱了洗脱次序所致。
答案：B
3．下列有关“血红蛋白提取和分离”实验的正确叙述是( )
A．用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白
B．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质
C．血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂
D．整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构
解析：对红细胞洗涤时应该用生理盐水，不能用蒸馏水，A错误；将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质，B错误；血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是溶解磷脂，加速血红蛋白的释放，C错误；整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持pH相对稳定，防止和血红蛋白的结构发生改变，D正确。
答案：D
4．凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1.6 cm，有关说法中，不正确的是( )
A．一般凝胶色谱柱直径的大小不会影响分离的效果
B．凝胶色谱柱过高，超过1 m，不影响分离的效果
C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度
D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大
解析：一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果，但是直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此应选择直径不超过2 cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关，一般不超过1 m。
答案：B
5．下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图分析回答下列问题：
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有________功能。
(2)甲装置用于________，目的是去除样品中__________的杂质，图中A是__________。B是__________溶液。
(3)用乙装置分离蛋白质的方法叫________________，是根据________________分离蛋白质的有效方法。
(4)乙装置中，C是____________，其作用是_______________。
(5)用乙装置分离血红蛋白时，待__________________________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集6管，图中试管序号表示收集的先后。经检测发现，试管②和试管⑤中蛋白质含量最高，则试管⑤中的蛋白质相对分子质量比血红蛋白________(填“大”或“小”)。
解析：(1)血红蛋白能携带氧气，体现了蛋白质具有运输功能。(2)甲装置为透析装置，目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质。其中A是磷酸缓冲液，B是血红蛋白溶液。(3)乙装置分离蛋白质的方法叫凝胶色谱法，是根据蛋白质的相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。(4)乙装置中，C溶液为磷酸缓冲液，作用是洗脱血红蛋白。(5)待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。最先收集到的蛋白质是血红蛋白分子，则试管②内的大量蛋白质为血红蛋白。由于试管⑤晚于试管②收集得到，因此其内收集到的蛋白质比血红蛋白分子移动速度慢，其相对分子质量比血红蛋白小。
答案：(1)运输 (2)透析(粗分离) 相对分子质量较小 磷酸缓冲液 血红蛋白 (3)凝胶色谱法 相对分子质量的大小 (4)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 (5)红色的蛋白质接近色谱柱底端 小
A级 基础巩固
1．使用凝胶色谱法分离蛋白质实验中，相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程，可表示为下图中( )
解析：凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。
答案：B
2．使用SDS—聚丙烯酰胺电泳的过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于( )
A．电荷的多少 B．分子的大小
C．肽链的多少 D．分子形状的差异
解析：SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带的负电荷量大大超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
答案：B
3．下图是用除去DNA的滤液进行血红蛋白的提取和分离实验的装置，下列有关叙述不正确的是( )
A．首先用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较大的杂质
B．图乙装置的试管中收集到的液体中最先得到的是相对分子质量较大的蛋白质
C．用图乙装置分离血红蛋白时，待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每管收集5 mL，连续收集
D．图丙装置中电泳法分离提纯血红蛋白的原理是血红蛋白带有一定量的电荷，在电场的作用下向一极移动
解析：用图甲装置对滤液进行处理，其目的是去除相对分子质量较小的杂质。图乙装置表示通过凝胶色谱法分离蛋白质的过程。蛋白质的相对分子质量较大，被排阻在凝胶颗粒的外面，在颗粒之间迅速通过。
答案：A
4．下列是关于血红蛋白的提取和分离实验中关键步骤，其中正确的是( )
A．蛋白质的提取和分离一般可分为粗分离、样品处理、纯化、纯度鉴定等4步
B．蛋白质的提取和分离实验可以以猪、牛、鸡、蛙等动物的血液为材料分离血红蛋白
C．对样品的处理过程分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、透析和分离血红蛋白等
D．对蛋白质的纯化和纯度鉴定的方法使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
解析：蛋白质提取和分离的实验步骤一般包括样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定等4步，A错误；蛋白质的提取和分离实验一般用哺乳动物的成熟的红细胞作为实验材料分离血红蛋白，一般不要鸡、蛙等动物血液为材料分离血红蛋白，B错误；样品处理的一般步骤分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白、透析等，C错误；对蛋白质的纯化和纯度鉴定的方法使用最多的是SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳，D正确。
答案：D
5．从细胞中提取某种特定的蛋白质比提取DNA难度大，其原因不是( )
A．蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件更敏感，更易失活
B．蛋白质的空间结构多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有统一的方法
C．提取某种特定的蛋白质需据其特性摸索提取的程序
D．提取血红蛋白程序可分为样品处理、粗分离、纯化、纯度的鉴定四大步
解析：蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件更敏感，更易失活，是提取某种特定的蛋白质比提取DNA难度大的原因，A错误； 蛋白质的空间结构多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有统一的方法，是提取某种特定的蛋白质比提取DNA难度大的原因，B错误；提取某种特定的蛋白质需据其特性摸索提取的程序是提取某种特定的蛋白质比提取DNA难度大的原因，C错误；提取血红蛋白程序可分为样品处理、粗分离、纯化、纯度的鉴定四大步，这只是某一种蛋白质的提取步骤，不是难度大的原因，D正确。
答案：D
6．生物产品的分离、纯化是现代生物技术中一种常见的技术。下列关于物质提取、纯化原理的叙述中，不正确的是( )
A．采用凝胶色谱法分离果胶酶的原理是蛋白质分子的相对分子质量不同，在色谱柱中的移动速度不同
B．使用透析法可以去除样品中相对分子质量较大的杂质
C．电泳法是利用样品中各种分子带电性质和数量以及样品分子大小不同，产生的迁移速度不同而实现样品中各种分子的分离
D．离心法分离蛋白质的依据是不同大小的分子离心时沉降速度不同
解析：透析的原理是小分子能够通过半透膜，利用透析法可以去除样品中相对分子质量较小的杂质。
答案：B
B级 能力训练
7．(1)同学甲利用琼脂糖凝胶电泳技术将得到的蛋白质进行分离，在电泳过程中，影响蛋白质迁移速率的因素包括蛋白质分子的________、________以及分子的形状等。
(2)同学乙利用凝胶色谱法进行血红蛋白分离(如图一)，他在操作中加样的正确顺序是________，在执行图一中②所示操作时，色谱柱下端连接的尼龙管应该________(填“打开”或“关闭”)。
① ② ③ ④
图一 加样示意图
(3)图二、图三分别是同学甲、乙利用同一种样品分离得到的结果，则在图三中与图二中蛋白质P对应的是________。
图二 图三
解析：(1)进行琼脂糖凝胶电泳时，影响蛋白质迁移速率的因素有蛋白质分子大小、带电性质及分子的形状等。
(2)正确的加样顺序可依据样品在色谱柱及凝胶层中的渗入量进行分析，可以得出是④①②③；同时进行②所示加样时，应关闭下出口。
(3)SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳装置是垂直的装置，此种电泳方法主要取决于蛋白质相对分子质量的大小，与电荷无关，同时在“－”极加样，通电后，样品蛋白质向“＋”极移动，相对分子质量小的，移动距离大，因此从图二的电泳结果分析，P比N、M移向“＋”极距离大，说明P相对分子质量比较小，因此洗脱出来的时间比较长，符合图三中的丙。
答案：(1)大小 带电性质
(2)④①②③ 关闭 (3)丙
8．动物血液常常被选作提取DNA和提取血红蛋白的实验材料，请回答下列有关问题：
(1)提取DNA和提取血红蛋白，猪血都是适宜材料吗？___________________。原因是_______________________________
_____________________________________________________。
(2)无论是提取DNA还是提取血红蛋白，都需要先用________对红细胞进行洗涤，其目的是________________________。
(3)电泳是分离鉴定蛋白质的常规方法。下图为几种蛋白质通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的图谱，据图，你认为相对分子质量最大的蛋白质是________，依此推理该样品在凝胶色谱法中最后流出的蛋白质应该是________________。
解析：(1)猪血是提取血红蛋白的适宜材料，不是提取DNA的适宜材料，因为猪成熟的红细胞没有细胞核，提取DNA可用鸡血。
(2)提取DNA和血红蛋白，需要先用生理盐水对红细胞进行洗涤，其目的是去除血浆蛋白(杂蛋白)。
(3)图为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的图谱，γ球蛋白离点样处最近，说明相对分子质量最大，清蛋白离点样处最远，说明相对分子质量最小；在凝胶色谱法中相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶颗粒内部的通道，路程长，移动速度慢；而相对分子质量大的蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，路程较短，移动速度快，所以最后流出的蛋白质应该是相对分子质量最小的清蛋白。
答案：(1)猪血是提取血红蛋白的适宜材料，不是提取DNA的适宜材料 猪成熟的红细胞没有细胞核
(2)生理盐水 去除血浆蛋白(杂蛋白)
(3)γ球蛋白 清蛋白
9．如今人类已跨入了蛋白质时代，对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：
(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________、_______、__________和纯度鉴定。
(2)如果要从红细胞中分离出血红蛋白，实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠檬酸钠，这样做的目的是________________。
(3)血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、_________、分离血红蛋白溶液和__________。其中分离血红蛋白溶液时需要用到__________(仪器)分离出下层红色透明液体。
(4)装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。这是因为
_____________________________________________________。
(5)欲探究色谱柱的高度是否影响蛋白质分离的因素，应把______________________作为自变量，把_______________________
__________作为无关变量，把________________作为因变量。
答案：(1)样品处理 粗分离 纯化
(2)防止血液凝固
(3)血红蛋白的释放 透析 分液漏斗
(4)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果
(5)色谱柱的高度变化 缓冲液的用量和pH、样品的用量、温度等因素 大小不同的蛋白质分子的间距
10．红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成的。我们可以选用猪、牛、羊等动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：
(1)实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。
①其中加入柠檬酸钠的目的是____________________________
_____________________________________________________。
②此过程即是样品处理，它应包括红细胞洗涤、___________、分离血红蛋白溶液。
③洗涤红细胞的目的是__________________________________
_____________________________________________________。
(2)收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这就是样品的粗分离。
①透析的目的是_______________________________________。
②透析的原理是______________________________________
_____________________________________________________。
(3)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。其中通过凝胶色谱法将样品纯化的目的是____________________________________________________
_____________________________________________________。
解析：(1)柠檬酸钠是一种抗凝剂，加入柠檬酸钠可以防止血液凝固；样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液；洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。(2)透析袋一般是用硝酸纤维素制成的，透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，透析可以去除样品中分子量较小的杂质或用于更换样品的缓冲液。(3)凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法，因此，通过用凝胶色谱法去除相对分子质量较大的杂质。
答案：(1)①防止血液凝固 ②血红蛋白的释放 ③去除杂蛋白
(2)①去除相对分子质量较小的杂质
②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则保留在袋内
(3)通过凝胶色谱法去除相对分子质量较大的杂质
11．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题：
(1)将实验流程补充完整。
(2)凝胶色谱法的基本原理是根据________________________分离蛋白质。
(3)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤干净的标志是
_____________________________________________________。
(4)分离血红蛋白时，由上到下第________层是血红蛋白水溶液。
(5)下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是________。
(6)如果红色区带________________，说明色谱柱制作成功。
解析：(1)样品处理包括：红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、分离血红蛋白溶液。凝胶色谱操作包括：凝胶色谱柱的制作、凝胶色谱柱的装填、样品的加入和洗脱。(2)凝胶色谱法的基本原理是根据相对分子质量的大小分离蛋白质。(3)洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，洗涤干净的标志是上清液中没有黄色。(4)分离血红蛋白时，可明显看到试管中的溶液分为4层：第一层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层；第3层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液；第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。(5)加样顺序是：调整缓冲液面、滴加透析样品、样品渗入凝胶床、再调整缓冲液面。(6)如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。
答案：(1)血红蛋白的释放 凝胶色谱柱的装填
(2)相对分子质量的大小 (3)杂蛋白(或血浆蛋白) 离心后的上清液中没有黄色 (4)三 (5)④①②③
(6)均匀一致地移动
