【微课第二、三期】人教版选修3专题1---1.2基因工程的基本操作程序（老久讲生物-64张ppt）课件

1.2 基因工程的基本操作程序

一、基因的结构

人类基因组组由大约31.6亿个碱基对组成，已发现的基因约为2.0万--2.5万个。
人类染色体组图（23对）
基因组测序：24条


24条





22条常染色体
2条性染色体
（X+Y）


果蝇的染色体上基因的分布
基因间区：无遗传效应的DNA片段
人17号染色体hGH基因簇及表达产物








非编码区
非编码区
编码区（转录区）
编码区上游
编码区下游
与RNA聚合酶
结合位点
启动子
终止子



1. 原核基因的结构
结构特点：原核基因的编码区是连续的。
非编码区
编码区

信使RNA

蛋白质
信使RNA


调控基因表达


基 因


编码形成蛋白质

启动子、终止子VS起始密码子、终止密码子
比较 启动子 终止子 起始密码子 终止密码子
位置 基因前端的非编码区内 基因后端的非编码区内 mRNA上三个相邻的碱基AUG GUG mRNA上三个相邻的碱基 UAA UAG UGA
作用 RNA聚合酶识别并结合的位点。启动转录 终止转录 启动翻译 终止翻译
本质 属于基因的结构，但不能转录。其本质为双链DNA片段。 mRNA上的三个相邻碱基，单链结构，起始密码子对应氨基酸，终止密码子不对应氨基酸。






非编码区
非编码区
编码区（转录区）
启动子
终止子



原核基因的表达
mRNA


核糖体
多肽链
编码区碱基数：mRNA碱基数：氨基酸数=6：3：1
（不考虑终止密码子）

原核基因的表达
原核基因的表达特点：边转录边翻译
知识迁移

多聚核糖体
你还记得多聚核糖体的意义吗？
意义：利用少量的mRNA就能合成大量的蛋白质，提高翻译的效率。
每个核糖体上合成的多肽链最终是相同的。
转录的方向：
翻译的方向：
2、真核细胞的基因结构















编码区（转录区）
非编码区
非编码区
与RNA聚合酶
结合位点


内含子
外显子
启动子
终止子
编码区上游
编码区下游

编码区编码
蛋白质的序列
编码区不编码蛋白质的序列

2. 真核基因的结构
结构特点：真核基因的编码区是不连续的。
（外显子与内含子相间排列）
真核细胞 基因结构

编码区
非编码区

外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
：有调控作用的核苷酸序列，
包括位于编码区上游的RNA
聚合酶结合位点（启动子）。
基因内非编码序列：
包括非编码区和内含子

注：第一个外显子近靠编码区上游的非编码区
2、真核细胞的基因结构














编码区（转录区）
非编码区
非编码区


真核基因的表达






①
②
③
④
⑤
⑥
⑦
pre-mRNA
“剪”
①
③
⑤
⑦
“接”
①
③
⑤
⑦
成熟的mRNA


核糖体
剪 内含子转录形成的序列
接 外显子转录形成的序列
转录
2、真核细胞的基因结构

真核基因的表达
①
③
⑤
⑦
成熟的mRNA


核糖体
多肽链
外显子碱基数：mRNA碱基数：氨基酸数=6：3：1
（不考虑终止密码子）
深入思考：
1.提取真核细胞内的胰岛素mRNA逆转录得到的cDNA是否就是完整的胰岛素基因？为什么
否，相当于胰岛素基因的外显子，并非完整的基因，缺少启动子、终止子等非编码区序列和内含子
如果是原核的mRNA逆转录呢？
真核基因表达特点：先转录后翻译

知识回顾：
基因工程基本操作的四个步骤


1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用
载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。




一、目的基因的获取
1.什么是目的基因？
目的基因即被导入的外源基因；一般分为两类：

?编码某种蛋白质的基因 如：导入大肠杆菌的人的胰
岛素基因
?具有调控作用的基因 如：使白化病基因沉默的基因
2.目的基因的来源？
来源 目的基因 转基因生物
动物 比目鱼 抗冻基因 抗冻番茄
植物 黄瓜 抗青枯病基因 转基因甜椒
细菌 苏云金芽孢杆菌 Bt毒蛋白基因 抗虫棉
真菌 丝状真菌 淀粉酶基因 转基因酵母菌

一、目的基因的获取
获取目的基因的常用方法：

1、从基因文库中获取

2、利用PCR技术扩增

3、人工合成

1. 从基因文库中获取目的基因
1. 基因文库的概念:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的
群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。
2. 基因文库的种类:
基因组文库：含有一种生物的全部基因
cDNA文库：只包含了一种生物的部分基因，

基因文库的构建方法
① 基因组文库的构建
提取某种生物的全部DNA
用适当的限制酶酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接
重组载体


基因组文库

导入受体菌中储存
② cDNA文库的构建-----逆转录法：
提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA
单链DNA
双链cDNA片段
重组载体
与载体连接




cDNA文库
反（逆）转录酶
DNA聚合酶

















导入受体菌中储存















IMN
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
基因组DNA文库与cDNA文库的比较
文库类型 cDNA文库 基因组文库
文库大小
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
基因中内含子(位于编码蛋白质序列的非编码DNA片段）
基因多少
物种间的基因交流
小
大
无
有
无
有
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
可以
部分基因可以
思考1
分别从同一个体的口腔上皮细胞和胰岛B细胞内
提取mRNA，构建cDNA文库，两个cDNA文库
是否相同？
否，虽然两种细胞内的DNA相同，但由于基因的选择性表达，不同细胞中的mRNA是不同的，构建形成的cDNA文库也是不同的。
思考2
真核生物的基因用逆转录法得到的
cDNA与原基因相同吗？如果作为目的
基因需要进行什么改造？
真核细胞的cDNA的获取


编码区
非编码区
非编码区



























DNA聚合酶
剪接有关的酶
RNA聚合酶
mRNA前体
mRNA
单链DNA
cDNA
逆转录酶
转录
剪接
逆转录
复制
启动子
终止子
基因
不含非编码序列。即不含非编码区和内含子




真核基因转录形成的mRNA,逆转录形成的cDNA相当于真核基因的外显子，不能直接作为目的基因，如需作为目的基因，需在cDNA两侧分别添加启动子和终止子。

2.利用PCR技术扩增目的基因
1
概念：
PCR全称为_______________，是一项
在生物____复制___________的核酸合成技术。
多聚酶链式反应
体外
特定DNA片段
3
前提：
已知目的基因的一段核苷酸序列

（便于合成引物）（便于找到酶切位点）
2
人物：
穆里斯（美国） 钱嘉韵（台湾省）rTaq

4
原理：DNA复制
原料：模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；rTaq酶（耐高温的DNA聚合酶）

引物通常是人工合成的核苷酸单链序列，引物成对使用，分别与目的基因两端碱基互补配对。
引物设计注意事项：
①引物的产物大小不要太大，80～150 bp最合适
②避免单个引物首位碱基配对，自身环化
③避免一对引物碱基配对，无法与目的基因配对

PCR技术的操作过程
a、高温变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成________
b、低温退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。
c、适温延伸（74℃左右）：在Taq酶的作用下，合成与模板互补的________。
氢键
单链DNA
双链
DNA链
DNA复制 PCR技术
场所
原理
条件

解旋方式
酶

特点

结果
PCR技术扩增与DNA复制的比较
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则
四种脱氧核苷酸、模板、酶、ATP
四种脱氧核苷酸、模板、酶、引物
DNA在高温下变性解旋
解旋酶催化解旋
半保留复制、边解旋变复制
半保留复制、全解旋再复制
体外复制
主要在细胞核内
大量的DNA片段
形成整个DNA分子
热稳定的DNA聚合酶
细胞内的DNA聚合酶、解旋酶、DNA连接酶等
PCR技术的操作过程
PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增



PCR每循环一次即DNA复制一次
思考？
1个DNA分子进行PCR扩增,循环4次，
理论上至少需要几个引物？
目的基因
模板1
模板2
引物A
引物B
3，
5，
5，
3，

（2n-2）
（1）
（1）


总结
DNA
(2n个)

只含引物A的DNA
只含引物B的DNA
同时含引物A和引物B的DNA
1个
1个
（ 2n -2）个
引物A的数量
引物B的数量
（ 2n -1）个
（ 2n -1）个

3. 人工合成法
在基因较小，核苷酸序列已知的情况下，可以利用DNA合成仪人工合成
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
基因的核苷酸序列
目的基因
化学合成



推测
推测
思考：化学法合成的目的基因含内含子、启动子和终止子吗？
3.人工合成法（真核生物）

反转录法
目的基因的信使RNA
目的基因
化学合成法
基因的核苷酸序列
目的基因
合成


单链DNA
合成

在基因较小，核苷酸序列已知的情况下

课堂小结
目的基因的获取
1、从基因文库中获取
2、利用PCR技术扩增
3、人工合成
种类
基因组文库：含有一种生物的全部基因
部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因，
如：cDNA文库




二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心
1
目的：
使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可
以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达
和发挥作用。
2
基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子
+终止子+标记基因
表达载体
启动子：基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质
终止子：基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录
标记基因的是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来


质粒
DNA分子

限制酶处理


两个切口
获得目的基因
DNA连接酶
重组DNA分子（重组质粒）

同种?
一个切口
两个黏性末端

基因表达载体的构建过程

对目的基因进行改造
1.不能切坏目的基因，其结构完整性是正常表达的必要条件
2.从目的基因两侧选择酶切位点，最好选择双酶切（防止目的基因自身环化）
3.双酶切时注意，不同的限制酶也有可能切出相同的末端

对天然质粒进行改造
1.不能切坏标记基因（多为抗性基因）。
（辩证来看）
（1）只有一个抗性基因---------------保留
（2）有两个或以上抗性基因------------切坏一个
（可作为筛选方式）
?转化未成功------无抗性
?转化空质粒------抗氨苄青霉素抗四环素
?转化表达载体------抗氨苄青霉素，不抗四环素
EcoR I
EcoR I
Hind III
BamH I
Bgl II


EcoR I
Bgl II
EcoR I
Hind III
思考：
怎样的酶切策略才能保证对目的基因和天然质粒进行切割，并成功拼接？
目的基因：
Hind III + BamH I

天然质粒：
Hind III + Bgl II

Why ?

连接后的产物分析（以单酶切为例）
+

自身环化


两两结合


注意：
①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构
②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键
③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少
④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。

三、将目的基因导入受体细胞
1
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞
内维持稳定和表达的过程。
2
常用的受体细胞：
大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌
和动植物细胞等。
3
目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。

1、目的基因导入植物细胞的方法
（1）农杆菌转化法
①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。
②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。
注：将目的基因嵌入到Ti质粒的T-DNA序列

三、目的基因导入受体细胞
③过程：

转基因一代不能稳定遗传的原因

目的基因A
嵌入1个目的基因
嵌入2个目的基因



Aa
AaBb
(A=B)
AA
Aa
四种细胞所属个体自交后代具有目的性状的个体所占比例？
3/4
15/16
100%
3/4





Aa
AaBb
(A=B)
AA
Aa
四种细胞所属个体后代测交具有目的性状的个体所占比例？
1/2
3/4
100%
1/2

1、目的基因导入植物细胞的方法
（2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞
①操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。
② 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um 。
③适用：单子叶植物

1、目的基因导入植物细胞的方法
（3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞
①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞
例：转基因抗虫棉

2、将目的基因导入动物细胞
①方法：显微注射法
①程序
目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物




3、将目的基因导入微生物细胞
①微生物作受体细胞原因：
繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少
②常用菌：大肠杆菌
③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞（原理:增加细胞壁的通透性）







Ca2+处理
大肠杆菌
感受态
细胞
感受态细胞
吸收DNA
表达载体
与感受态
细胞混合

小结：将目的基因导入受体细胞

生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞
常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2+处理法
受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞
转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子


四、目的基因的检测与鉴定
导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？
1
真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。
2
目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？
不一定，需要检测





培养
培养
导入
含目的基因的重组质粒导入大肠杆菌


含有氨苄青霉素 的完全培养基







完成转化可能含有目的基因的菌株


1、鉴定——分子水平的鉴定














转基因生
物的DNA
探针
15N
15N
14N
14N
（1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了
目的基因
基因探针：
放射性同位素等标记的DNA分子
方法——
DNA分子杂交技术
变性
变性
DNA杂交双链

1、鉴定——分子水平的鉴定

变性










方法——
分子杂交技术
（2）检测目的基因是否转录出了mRNA
探针
15N
15N
转基因生物
的mRNA
14N
DNA-mRNA杂交双链

1、鉴定——分子水平的鉴定



提取
（3）检测目的基因是否翻译成蛋白质
方法——抗原-抗体杂交




苏云金杆菌

Bt毒素蛋白





将Bt毒蛋白注射小鼠体内
从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体

抗体











蛋白质



出现杂交带
脱分化

组织培养

2、鉴定——个体水平的鉴定

抗虫、抗病接种实验，活性比较实验
　　例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
思考？
不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。
受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？

课堂练习
1.有关基因工程的叙述中，错误的是( )
A.DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来
B.限制性内切酶用于目的基因的获得
C.目的基因须由运载体导入受体细胞
D.人工合成目的基因不用限制性内切酶
A

课堂练习
2、下列属于获取目的基因的方法的是( )
①利用mRNA反转录形成
②从基因组文库中提取
③从受体细胞中提取
④利用PCR技术
⑤利用DNA转录
⑥人工合成
A.①②③⑤ B.①②⑤⑥
C.①②③④ D.①②④⑥
D

课堂练习
3.基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ）
A.人工合成目的基因
B.目的基因与运载体结合
C.将目的基因导入受体细胞
D.目的基因的检测和表达
C

课堂练习
4.下列关于基因工程的叙述，错误的是(　　)
A.目的基因和受体细胞均可来自动、植物或微生物
B.限制性核酸内切酶和DNA连接酶是两类常用的工具酶
C.人胰岛素原基因在大肠杆菌中表达的胰岛素原无生物活性
D.载体上的抗性基因有利于筛选含重组DNA的细胞和促进目的基因的表达
D