1．1 DNA重组技术的基本工具
1．了解基因工程的概念、诞生及发展。 2.掌握限制酶及DNA连接酶的作用。(重、难点) 3．理解载体需具备的条件。(重点)
一、基因工程(阅读专题1前言部分)
基因工程的别名
DNA重组技术
操作环境
生物体外
操作对象
基因
操作水平
DNA分子水平
结果
新的生物类型和生物产品
二、基因工程的基本工具(阅读教材P4～P6)
1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”
(1)来源：主要来自于原核生物。
(2)特点：具有专一性。
①识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列。
②切割特定核苷酸序列中的特定位点。
(3)作用：断开每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
(4)结果：产生黏性末端和平末端。
2．DNA连接酶——“分子缝合针”
(1)种类
(2)作用：形成磷酸二酯键。
(3)结果：形成重组DNA分子。
3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”
(1)作用：将外源基因送入细胞中。
(2)种类：质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒等。
(3)
三、重组DNA分子的模拟操作(阅读教材P6～P7)
1．材料用具：剪刀代表EcoR Ⅰ，透明胶条代表DNA连接酶。
2．切割位点
(1)分别从两块硬纸板上的一条DNA链上找出G—A—A—T—T—C序列，并选G—A之间作切口进行“切割”。
(2)再从另一条链上互补的碱基之间寻找EcoRⅠ相应的切口剪开。
3．操作结果：若操作正确，不同颜色的黏性末端应能互补配对；否则，说明操作有误。
连一连
判一判
(1)通过基因工程产生的变异是不定向的。(×)
分析：该变异类型按人们的意愿进行，是定向的。
(2)通过基因工程改造成的生物为新物种。(×)
分析：通过基因工程改造成的生物，使该生物产生新的性状，不属于新物种。
(3)限制酶和DNA解旋酶的作用部位相同。(×)
分析：限制酶作用于磷酸二酯键，DNA解旋酶作用于氢键。
(4)(2018·洛阳高二期末)DNA连接酶起作用时不需要模板。(√)
(5)载体(如质粒)和细胞膜中的载体蛋白的成分相同。(×)
分析：前者为DNA，后者为蛋白质。
(6)(2018·大连二十四中高二检测)作为载体，必须要有标记基因。(√)
基因工程的工具酶
探究1 限制酶的切割方式
(1)上下交错切割：限制酶在DNA双链的不同位置切割DNA(即在识别序列的中轴线两侧切割)，产生的DNA片段末端不是平齐的，即黏性末端，如下图：
该EcoRⅠ限制酶的识别序列为—GAATTC—，切点是在G和A之间。
(2)上下对称切割：限制酶在DNA双链的相同位置切割DNA分子(即沿着识别序列的中轴线切割)，这样产生的DNA片段末端是平齐的，即平末端，如下图：
该SmaⅠ限制酶的识别序列为—CCCGGG—，切点是在C和G之间。
探究2 DNA连接酶的作用
E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶均可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来，相当于把梯子两边的扶手的断口连接起来。即：
(1)DNA连接酶的作用部位为①(填“①”或“②”)形成磷酸二酯键。
(2)与限制酶的关系
观察下图，讨论限制酶切割和DNA连接酶的位置在________(填“1”“2”“3”或“4”)处。
提示：2、4
与DNA分子相关的四种酶的比较
种类
项目
限制酶
DNA连接酶
DNA聚合酶
解旋酶
作用底物
DNA分子
DNA分子片段
脱氧核苷酸
DNA分子
作用部位
磷酸二酯键
磷酸二酯键
磷酸二酯键
碱基对间的氢键
作用特点
切割目的基因及载体，特异性识别核苷酸序列，使特定部位的磷酸二酯键断开
将双链DNA片段“缝合”起来，恢复磷酸二酯键
将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上
将DNA两条链之间的氢键打开
作用结果
形成黏性末端或平末端
形成重组DNA分子
形成新的DNA分子
形成单链DNA分子
应用
基因工程
DNA复制
突破1 限制酶的来源、特点及作用
1．下列有关基因工程中限制酶的描述，错误的是( )
A．一种限制酶只能识别一种特定的核糖核苷酸序列
B．限制酶的活性受温度、pH的影响，总有一个最合适的条件
C．限制酶能破坏相邻脱氧核苷酸之间的化学键
D．限制酶不只存在于原核生物中，其合成场所是核糖体
解析：选A。限制酶只能够识别双链DNA分子的某种特定的脱氧核苷酸序列，不能识别RNA分子的核糖核苷酸序列，A项错误；同其他的酶一样，限制酶同样受温度和pH的影响，而且具有发挥最大催化效率的最适温度和最适pH，B项正确；限制酶催化的是特定部位磷酸二酯键的断裂，属于水解反应，C项正确；限制酶主要从原核生物中分离纯化，也有来自真核细胞的，其本质是蛋白质，在核糖体上合成，D项正确。
2．下表为常用的限制性核酸内切酶(限制酶)及其识别序列和切割位点，以下说法中，推断正确的是( )
限制性核酸内切酶
识别序列和切割位点
限制性核酸内切酶
识别序列和切割位点
BamHⅠ
↓
GGATCC
KpnⅠ
↓
GGTACC
EcoRⅠ
↓
GAATTC
Sau3AⅠ
↓
GATC
HindⅡ
↓
GTYRAC
SmaⅠ
↓
CCCGGG
注：Y表示C或T，R表示A或G。
A．一种限制酶只能识别一种核苷酸序列
B．限制酶切割后一定形成黏性末端
C．不同的限制酶可以形成相同的黏性末端
D．限制酶的切割位点在识别序列内部
解析：选C。根据表格内容可以推知，每种限制酶都能识别特定的核苷酸序列，但不一定是一种序列，如限制酶HindⅡ，A项错误；限制酶切割后能形成黏性末端或平末端，B项错误；不同的限制酶切割后可能形成相同的黏性末端，如限制酶BamHⅠ和Sau3AⅠ切割后露出的黏性末端相同，C项正确；限制酶的切割位点可以位于识别序列的外侧，如Sau3AⅠ，D项错误。
限制酶的识别序列和切割末端的判断
(1)识别序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如图，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。如GC,CG))以中心线为轴，两侧碱基互补对称；CCAGG,GGTCC)以A,T)为轴，两侧碱基互补对称。
(2)同一种限制酶一定能切出相同的黏性末端，相同的黏性末端不一定来自同一种限制酶的切割，但同样能相互连接。
突破2 DNA连接酶的作用
3．下列关于DNA连接酶作用的叙述，正确的是( )
A．将单个核苷酸加到某个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键
B．将断开的2个DNA片段的骨架连接起来，重新形成磷酸二酯键
C．连接2条DNA链上碱基之间的氢键
D．只能将双链DNA片段互补的黏性末端连接起来，而不能将两者之间的平末端进行连接
解析：选B。DNA连接酶和DNA聚合酶都是催化2个脱氧核苷酸分子之间形成磷酸二酯键。但DNA连接酶是在2个DNA片段之间形成磷酸二酯键，将2个DNA片段连接成重组DNA分子；DNA聚合酶是将单个的核苷酸分子加到已存在的核酸片段上形成磷酸二酯键，合成新的DNA分子。
DNA连接酶无识别的特异性，对于相同或互补的黏性末端以及平末端都能连接。所以，限制酶种类多，DNA连接酶种类少。
“分子运输车”——载体
下图为大肠杆菌及质粒载体的结构模式图，探究以下问题：
(1)a代表的物质和质粒的化学本质都是DNA，都能进行自我复制。
(2)若某目的基因切割末端为，则与之相连的质粒上至少有一段核苷酸序列为。该质粒DNA分子的切割末端为，可使用DNA连接酶把质粒和目的基因连接在一起。
(3)氨苄青霉素抗性基因，能控制某物质的合成，该物质能抵抗氨苄青霉素，使含有该基因的生物能在含氨苄青霉素的环境中存活。氨苄青霉素抗性基因在质粒DNA上称为标记基因，其作用是供重组DNA的鉴定和选择。
作为载体应具备的条件
(1)载体DNA必须有一个至多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入载体。这些供目的基因插入的限制酶的切点，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。
(2)载体DNA必须具备自我复制的能力，或能整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。
(3)载体DNA必须带有标记基因，便于重组DNA的鉴定和选择。
原理如下图所示：
高中生物学中的“载体”
(1)物质跨膜运输的载体：细胞膜上的一种____________。
(2)基因工程中目的基因的载体：种类有_______、λ噬菌体的衍生物和__________等。
(3)细胞中遗传信息的载体：细胞生物遗传信息的载体是____________。
(4)真核细胞中遗传物质的主要载体是____________。
(5)细胞间信息传递的载体：细胞释放的信号分子，如：激素、神经递质等。
答案：(1)蛋白质 (2)质粒 动植物病毒 (3)DNA (4)染色体
1．质粒是基因工程中最常用的目的基因运载工具。下列有关叙述正确的是( )
A．质粒是只存在于细菌细胞质中能自主复制的小型环状双链DNA分子
B．在所有的质粒上总能找到一个或多个限制酶切割位点
C．携带目的基因的重组质粒只有整合到宿主细胞的染色体DNA上才会随后者的复制而复制
D．质粒上的抗性基因常作为标记基因供重组DNA的鉴定和选择
解析：选D。质粒不只分布于原核生物中，在真核生物——酵母菌细胞内也有分布，A项错误；并不是所有的质粒都能找到限制酶的切割位点而成为合适的运载目的基因的工具，B项错误；重组质粒进入受体细胞后，可以在细胞内自我复制，也可以整合后复制，C项错误；质粒上抗性基因常作为标记基因，D项正确。
2．(经典题)质粒是基因工程中最常用的载体，它存在于许多细菌体内。某细菌质粒上有标记基因如右图所示，通过标记基因可以推知外源基因(目的基因)是否转入成功。外源基因插入的位置不同，细菌在培养基上的生长情况也不同，如图所示是外源基因插入位置(插入点有a、b、c)，请根据表中提供的细菌生长情况，推测①②③三种重组后细菌的外源基因插入点，正确的一组是( )
细菌在含氨苄青霉素的培养基上的生长状况
细菌在含四环素的培养基上的生长状况
①
能生长
能生长
②
能生长
不能生长
③
不能生长
能生长
A．①是c；②是b；③是a
B．①是a和b；②是a；③是b
C．①是a和b；②是b；③是a
D．①是c；②是a；③是b
答案：A
(1)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同，前者的实质是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞，后者是蛋白质，与细胞膜的选择透过性有关。
(2)一般来说，天然载体不能同时满足上述条件，要对其进行人工改造才可以使用。
核心知识小结
[要点回眸]
[答题必备]
基因工程突破了生殖隔离，实现了不同种生物间的基因重组。
不同生物基因能拼接在一起的理论基础是DNA分子都是由4种脱氧核苷酸构成的规则的双螺旋结构。
外源DNA导入受体细胞能成功表达的理论基础是密码子的通用性。
限制酶的作用特点是识别双链DNA分子特定的核苷酸序列，并在特定位点上切割。
限制酶和DNA连接酶的作用部位都是两个核苷酸间的磷酸二酯键。
在基因工程中使用的载体除质粒外，还有λ噬菌体的衍生物、动植物病毒等。
[随堂检测]
1．科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
解析：选D。基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就是定向地改造了生物的遗传性状。
2．下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是( )
A．甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C．DNA连接酶的作用位点是b处
D．切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段
解析：选C。据图可知，切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶识别序列与切割位点分别是—GAATTC—(在G与A之间切割)、—CAATTG—(在C与A之间切割)、—CTTAAG—(在C与T之间切割)，即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割产生的，A正确。甲、乙的黏性末端互补，所以甲、乙可以形成重组DNA分子；甲、丙的黏性末端不互补，所以甲、丙无法形成重组DNA分子，B正确。DNA连接酶可以恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，而b处是氢键，C错误。甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段为，其中没有切割产生甲的限制酶的识别序列及酶切位点，所以切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段，D正确。
3．(2018·辽宁沈阳模拟)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别作用于一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，同时对酶切产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，酶切产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是( )
解析：选C。A选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600 bp和200 bp两种长度的DNA分子，与题意不符，A错误；B选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600 bp和400 bp两种长度的DNA分子，与题意不符，B错误；C选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后得到的DNA分子长度是1 000 bp，用EcoR Ⅰ单独酶切会得到200 bp和800 bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后会得到200 bp和400 bp两种长度的DNA分子，与题意相符，C正确；D选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，与题意不符，D错误。
4．(2018·北京海淀区高二练习)如图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步骤需用到的工具酶是( )
A．DNA连接酶和解旋酶
B．DNA聚合酶和限制性核酸内切酶
C．限制性核酸内切酶和DNA连接酶
D．DNA聚合酶和RNA聚合酶
解析：选C。目的基因和载体结合需“分子手术刀”——限制性核酸内切酶和“分子缝合针”——DNA连接酶。此过程不涉及DNA复制，不需要DNA聚合酶和解旋酶。
5．(2018·江苏扬州中学质量检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性核酸内切酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是( )
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
解析：选D。用Bgl Ⅱ和Sau3A Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体会形成相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A正确；由于Sau3AⅠ的切割位点在EcoRⅠ的两个酶切位点之间，因此，用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体会形成相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。
6．(2018·广州高二检测)下图所示的酶M和酶N是两种限制酶，图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未作注明。请据图回答下列问题：
(1)酶M特异性切割的DNA片段是，则酶N特异性切割的DNA片段是______。
(2)多个片段乙和多个片段丁混合在一起，用DNA连接酶拼接得到环状DNA，其中只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有________种。
解析：限制酶识别的是DNA上特定的回文序列，切割的是特定部位的磷酸二酯键。既然酶M识别的是片段乙和丙相接后的特定序列，那么酶N识别的就一定是片段甲和乙相接后的特定序列，这两个序列都具有回文的特点。片段乙和片段丁是同种限制酶切割后形成的，二者存在相同的黏性末端，完全可以首尾相接，形成环状的DNA分子(乙—丁)；又由于是多个片段混合在一起，乙和丁本身也会发生“两两”连接，形成(乙—乙)和(丁—丁)两种环状的DNA分子。
答案：(1) (2)3
7．如表所示为几种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题：
(1)从表中四种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是________。
(2)将目的基因与质粒DNA缝合依靠的是____________酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过____________连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶_________切割，切割后的质粒含有__________个游离的磷酸基团。
(4)在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙______(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：____________________________________。
解析：(1)由表中四种限制酶的切割位点可知，SmaⅠ可切出平末端。(2)目的基因与质粒缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割，切割后形成链状DNA，有2个游离的磷酸基团。(4)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
答案：(1)SmaⅠ (2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ 2
(4)能 二者具有相同的黏性末端
[课时作业]
一、选择题
1．下列有关基因工程诞生的说法，不正确的是 ( )
A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的
B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能
C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
D．基因工程必须在同物种间进行
答案：D
2．下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的( )
A．1种 B．2种
C．3种 D．4种
解析：选C。图中③④为相同的平末端，可能由同一种限制酶切割所得，故图示四种末端至少是由3种限制酶作用产生的。
3．针对下图的叙述，错误的是( )
A．限制酶将a处切断，一定形成相同的黏性末端
B．DNA连接酶将a处连接会脱去一分子水
C．DNA复制时需要解旋酶切断b处，基因工程操作中不需要
D．b处的化学键是氢键
解析：选A。限制酶会将DNA切出具有黏性末端或平末端的两个片段，A项错误；磷酸二酯键的形成是一个脱水缩合的反应，B项正确；DNA复制需要解旋酶，而基因工程不需要，C项正确；观察该图，可以确定b处为碱基对之间形成的氢键，D项正确。
4．质粒是基因工程中最常用的载体，其主要特点是( )
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构简单 ④是蛋白质 ⑤是环状RNA ⑥是环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
A．①③⑤⑦ B．①④⑥
C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦
解析：选C。质粒存在于细菌和酵母菌等微生物中，是一种很小的独立于拟核之外的环状DNA分子，上面有标记基因，便于在受体细胞中检测。质粒在受体细胞中能“友好”地“借居”，并能随受体细胞DNA的复制而复制，能进行目的基因的扩增和表达。
5．(2018·衡水高二检测)一环状DNA分子，设其长度为1，限制酶A在其上的切点位于0.0处；限制酶B在其上的切点位于0.3处；限制酶C的切点未知，但C单独切或与A或与B同时切的结果如下表，请确定C在该环状DNA分子上的切点应位于图中的哪处( )
C单独切
长度为0.8和0.2的两个片段
C与A同时切
长度为2个0.2和1个0.6的片段
C与B同时切
长度为2个0.1和1个0.8的片段
A．0.2和0.4处 B．0.4和0.6处
C．0.5和0.7处 D．0.6和0.9处
解析：选A。据图表信息可知：限制酶C单独切割环状DNA分子，获得长度为0.8和0.2的两个片段，可推知限制酶C有2个切割位点。限制酶A只有1个切割位点，且位于0.0处，又知限制酶C与限制酶A同时切割时，获得2个0.2和1个0.6的片段，因此以限制酶A切割点向左或向右推测，可得知限制酶C的切割位点可能为0.2、0.4或0.6、0.8处。再根据限制酶C与限制酶B同时切割时，获得2个0.1和1个0.8片段，可推知限制酶C的切割位点可能为0.1、0.2或0.4、0.5处。综上分析，只有0.2和0.4两处与之前推测相吻合，选项A正确。
6．(2018·河北巨鹿高二期中)下图表示某种质粒和人的胰岛素基因，其中a表示标记基因，b表示胰岛素基因，E1表示某限制酶的酶切位点，现用该种限制酶分别切割质粒和胰岛素基因，后用DNA连接酶连接切割后的质粒和胰岛素基因，下列选项中不可能出现的是( )
答案：C
7．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图判断下列操作正确的是( )
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
解析：选D。解此题要明确目的基因要切下，质粒只要切开。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，单独使用时可以把目的基因和质粒都切断；限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，只能把它们切开，单独使用时不能切断，所以目的基因用限制酶Ⅱ切割，质粒用限制酶Ⅰ切割；因为用限制酶Ⅰ切割质粒时破坏了GeneⅡ，所以只能用GeneⅠ作为标记基因。
8．如图所示为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
解析：选C。图示中①表示该酶切割DNA分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性核酸内切酶，②是黏性末端连接的过程，用到的酶是DNA连接酶，③是DNA分子解旋的过程，要用解旋酶，④是DNA分子复制时子链的形成过程，需要DNA聚合酶。
9．某线性DNA分子含有3 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )
a酶切割产物(bp)
b酶再次切割产物(bp)
1 600；1 100；300
800；300
A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
B．a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接
C．a酶与b酶切断的化学键不同
D．用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，序列会明显增多
解析：选D。根据以上分析可知在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列都是2个，A错误。图中显示两个酶的识别序列不同，但是切割后露出的黏性末端相同，a酶与b酶切出的黏性末端可以相互连接，B错误。a酶与b酶切断的化学键都是磷酸二酯键，C错误。a酶和b酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可连接形成。所以用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，所得DNA分子中序列会明显增多，D正确。
10．(2018·广州高二模拟)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列叙述正确的是( )
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
解析：选C。如果将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，那么酶切后二者的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有三种，只有一种符合基因工程的需求；DNA连接酶的作用是将酶切后的目的基因和质粒的黏性末端连接起来形成重组质粒，该过程形成4个磷酸二酯键；为了防止目的基因和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ，这样切割后得到的DNA片段两侧的黏性末端不同；由于受体细胞为无任何抗药性的原核细胞，因此能在含青霉素的培养基中生长，可能是受体细胞成功导入了目的基因，也可能是只导入了不含目的基因的载体。
二、非选择题
11．下图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列，并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图，请回答以下问题：
(1)图中甲和乙代表___________________________________________________。
(2)EcoRⅠ、HpaⅠ代表_______________________________________________。
(3)图中甲和乙经过相应操作均形成两个片段，切口的类型分别为________________、________________。甲中限制酶的切点是________________之间，乙中限制酶的切点是________之间。
(4)由图解可以看出，限制酶的作用特点是__________________________________。
(5)如果甲中G碱基发生基因突变，可能发生的情况是_________________________。
解析：(1)由图示看出，甲和乙代表由脱氧核苷酸构成的不同的DNA片段。(2)EcoRⅠ和HpaⅠ能切割DNA分子，说明它们是限制酶。(3)甲中切点在G、A之间，切口在识别序列中轴线两侧，形成黏性末端；乙中切点在A、T之间，切口在识别序列中轴线处，形成平末端。(4)(5)限制酶能识别DNA分子的特定核苷酸序列，并从特定位点切割DNA分子。当特定核苷酸序列变化后，就不能被相应限制酶识别。
答案：(1)有特定脱氧核苷酸序列的DNA片段
(2)两种不同的限制酶
(3)黏性末端 平末端 G、A A、T
(4)能识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并从特定的位点将DNA分子切开
(5)限制酶不能识别切割位点
12．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
该酶识别的序列为__________________，切割的部位是_________________。
(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是_________________________________。
(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。
(5)基因工程中除质粒外，____________和________也可作为载体。
解析：(1)限制酶切割DNA分子后可产生两种类型的末端，即平末端和黏性末端。(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—，互补链是—CTTAAG—，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶切割，说明该酶与限制酶X切割产生的黏性末端相同或者是互补。(4)基因工程使用的DNA连接酶，按来源可分为E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E·coli DNA连接酶。(5)基因工程的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。
答案：(1)黏性末端 平末端
(2)—GAATTC—或—CTTAAG— G和A之间的磷酸二酯键
(3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同或互补
(4)T4 E·coli
(5)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
13．如图所示，质粒pZHZ9上含有X抗生素抗性基因(XR)和Y抗生素抗性基因(YR)。其中，XR内部含有限制酶KasⅠ识别序列，YR内部含有限制酶FseⅠ、HpaⅡ、NaeⅠ、Ngo MIV识别序列，五种酶的识别序列如图B(?表示切割位点)，且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。请回答下列有关遗传信息传递与表达的问题：
(1)若要将结构如图C所示的目的基因直接插入YR内形成重组质粒pZHZ10，则pZHZ9需用限制酶________切开。
(2)将上述切开的质粒溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作。之后，受体细胞的类型(对两种抗生素表现出抗性R或敏感性S)包含________(多选)。
A．XR、YR B．XR、YS
C．XS、YR D．XS、YS
解析：(1)图B中的限制酶NgoMIV识别并切割形成的黏性末端与目的基因两端的黏性末端序列相同，所以pZHZ9需用限制酶Ngo MIV切割。(2)将切开的质粒溶液与目的基因溶液混合后，加入DNA连接酶，构建基因表达载体，培养液中会出现三类情况：第一类是目的基因和质粒结合，这种基因表达载体上的YR抗性基因破坏，成为XR、YS类型质粒；第二类是质粒自身将切口处连接起来，恢复为正常质粒，具有XR、YR两个抗性基因；第三类是目的基因和目的基因连接。进行大肠杆菌受体细胞导入的操作后，若导入了第一类基因表达载体，则细菌的类型为XR、YS，若导入了第二种类型的质粒，则细菌的类型为XR、YR，若没有导入质粒，则细菌的类型为XS、YS。
答案：(1)Ngo MIV (2)ABD
14．通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示这一技术的基本过程。在该工程中所用的基因“分子手术刀”能识别的序列和切点是—G↓GATCC—，请回答下列问题：
(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是________。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是________________。
(2)请在图中画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，是因为
________________________________________________________________________。
解析：在基因工程中用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。在对载体和目的基因进行切割时，一定要用同一种限制酶，才能切出相同的黏性末端。当插入目的基因时，常用DNA连接酶使二者之间形成磷酸二酯键而连接起来。
答案：(1)限制酶 DNA连接酶
(2)
(3)人的遗传物质(基因)与羊的遗传物质都为DNA，其物质组成和空间结构相同
[随堂检测]
1．科学家们经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。实施该工程的最终目的是( )
A．定向提取生物体的DNA分子
B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”
C．在生物体外对DNA分子进行改造
D．定向地改造生物的遗传性状
解析：选D。基因工程的内容就是在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞内进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出人类所需的基因产物，也就是定向地改造了生物的遗传性状。
2．下列有关如图所示的黏性末端的说法，错误的是( )
A．甲、乙、丙黏性末端分别是由不同的限制酶切割产生的
B．甲、乙具有相同的黏性末端，可形成重组DNA分子，但甲、丙之间不能
C．DNA连接酶的作用位点是b处
D．切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段
解析：选C。据图可知，切割形成甲、乙、丙黏性末端的限制酶识别序列与切割位点分别是—GAATTC—(在G与A之间切割)、—CAATTG—(在C与A之间切割)、—CTTAAG—(在C与T之间切割)，即甲、乙、丙是由不同的限制酶切割产生的，A正确。甲、乙的黏性末端互补，所以甲、乙可以形成重组DNA分子；甲、丙的黏性末端不互补，所以甲、丙无法形成重组DNA分子，B正确。DNA连接酶可以恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，而b处是氢键，C错误。甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段为，其中没有切割产生甲的限制酶的识别序列及酶切位点，所以切割产生甲的限制酶不能识别由甲、乙黏性末端形成的重组DNA分子片段，D正确。
3．(2018·辽宁沈阳模拟)用限制酶EcoRⅠ、KpnⅠ和二者的混合物分别作用于一个1 000 bp(1 bp即1个碱基对)的DNA分子，同时对酶切产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，酶切产物分开，凝胶电泳结果如图所示。该DNA分子的酶切图谱(单位：bp)正确的是( )
解析：选C。A选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600 bp和200 bp两种长度的DNA分子，与题意不符，A错误；B选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切会得到600 bp和400 bp两种长度的DNA分子，与题意不符，B错误；C选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后得到的DNA分子长度是1 000 bp，用EcoR Ⅰ单独酶切会得到200 bp和800 bp两种长度的DNA分子，用EcoRⅠ、KpnⅠ同时酶切后会得到200 bp和400 bp两种长度的DNA分子，与题意相符，C正确；D选项中的DNA用KpnⅠ单独酶切后得到400 bp和600 bp两种长度的DNA分子，与题意不符，D错误。
4．(2018·北京海淀区高二练习)如图是基因工程主要技术环节的一个基本步骤，这一步骤需用到的工具酶是( )
A．DNA连接酶和解旋酶
B．DNA聚合酶和限制性核酸内切酶
C．限制性核酸内切酶和DNA连接酶
D．DNA聚合酶和RNA聚合酶
解析：选C。目的基因和载体结合需“分子手术刀”——限制性核酸内切酶和“分子缝合针”——DNA连接酶。此过程不涉及DNA复制，不需要DNA聚合酶和解旋酶。
5．(2018·江苏扬州中学质量检测)基因工程利用某目的基因(图甲)和P1噬菌体载体(图乙)构建重组DNA。限制性核酸内切酶BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ的酶切位点分别如图所示。下列分析错误的是( )
A．构建重组DNA时，可用BglⅡ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
B．构建重组DNA时，可用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体
C．图乙中的P1噬菌体载体只用EcoRⅠ切割后，含有两个游离的磷酸基团
D．用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体载体，再用DNA连接酶连接，只能产生一种重组DNA
解析：选D。用Bgl Ⅱ和Sau3A Ⅰ切割目的基因和P1噬菌体载体会形成相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，A正确；由于Sau3AⅠ的切割位点在EcoRⅠ的两个酶切位点之间，因此，用EcoRⅠ和Sau3AⅠ切割目的基因和P1噬菌体载体会形成相同的黏性末端，因此它们可构成重组DNA，B正确；P1噬菌体载体为环状DNA，其上只含有一个EcoRⅠ的酶切位点，因此用EcoRⅠ切割后，该环状DNA分子变为双链DNA分子，因每条链各含有一个游离的磷酸基团，故切割后含有两个游离的磷酸基团，C正确；由图甲可知，用EcoRⅠ切割目的基因所在片段和P1噬菌体后形成的黏性末端相同，可任意连接，不止产生一种重组DNA，D错误。
6．(2018·广州高二检测)下图所示的酶M和酶N是两种限制酶，图中DNA片段只注明了黏性末端处的碱基种类，其他碱基的种类未作注明。请据图回答下列问题：
(1)酶M特异性切割的DNA片段是，则酶N特异性切割的DNA片段是______。
(2)多个片段乙和多个片段丁混合在一起，用DNA连接酶拼接得到环状DNA，其中只由两个DNA片段连接成的环状DNA分子有________种。
解析：限制酶识别的是DNA上特定的回文序列，切割的是特定部位的磷酸二酯键。既然酶M识别的是片段乙和丙相接后的特定序列，那么酶N识别的就一定是片段甲和乙相接后的特定序列，这两个序列都具有回文的特点。片段乙和片段丁是同种限制酶切割后形成的，二者存在相同的黏性末端，完全可以首尾相接，形成环状的DNA分子(乙—丁)；又由于是多个片段混合在一起，乙和丁本身也会发生“两两”连接，形成(乙—乙)和(丁—丁)两种环状的DNA分子。
答案：(1) (2)3
7．如表所示为几种限制酶的识别序列及其切割位点，请回答下列问题：
(1)从表中四种酶的切割位点看，可以切出平末端的酶是________。
(2)将目的基因与质粒DNA缝合依靠的是____________酶，它的作用是形成磷酸二酯键；两条链间的碱基对通过____________连接起来。
(3)图1中的质粒分子可被表中限制酶_________切割，切割后的质粒含有__________个游离的磷酸基团。
(4)在相关酶的作用下，图1中的甲与图2中的乙______(填“能”或“不能”)拼接起来。请说明理由：____________________________________。
解析：(1)由表中四种限制酶的切割位点可知，SmaⅠ可切出平末端。(2)目的基因与质粒缝合时用DNA连接酶进行连接，形成磷酸二酯键；两条链之间的碱基依据碱基互补配对原则形成氢键。(3)根据质粒的碱基序列可知，质粒分子可被限制酶EcoRⅠ切割，切割后形成链状DNA，有2个游离的磷酸基团。(4)由图可知，甲和乙的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可以拼接起来。
答案：(1)SmaⅠ (2)DNA连接 氢键 (3)EcoRⅠ 2
(4)能 二者具有相同的黏性末端
[课时作业]
一、选择题
1．下列有关基因工程诞生的说法，不正确的是 ( )
A．基因工程是在生物化学、分子生物学和微生物学等学科的基础上发展起来的
B．工具酶和载体的发现使基因工程的实施成为可能
C．遗传密码的破译为基因的分离和合成提供了理论依据
D．基因工程必须在同物种间进行
答案：D
2．下列所示的末端至少是由几种限制酶作用产生的( )
A．1种 B．2种
C．3种 D．4种
解析：选C。图中③④为相同的平末端，可能由同一种限制酶切割所得，故图示四种末端至少是由3种限制酶作用产生的。
3．针对下图的叙述，错误的是( )
A．限制酶将a处切断，一定形成相同的黏性末端
B．DNA连接酶将a处连接会脱去一分子水
C．DNA复制时需要解旋酶切断b处，基因工程操作中不需要
D．b处的化学键是氢键
解析：选A。限制酶会将DNA切出具有黏性末端或平末端的两个片段，A项错误；磷酸二酯键的形成是一个脱水缩合的反应，B项正确；DNA复制需要解旋酶，而基因工程不需要，C项正确；观察该图，可以确定b处为碱基对之间形成的氢键，D项正确。
4．质粒是基因工程中最常用的载体，其主要特点是( )
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构简单 ④是蛋白质 ⑤是环状RNA ⑥是环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
A．①③⑤⑦ B．①④⑥
C．①③⑥⑦ D．②③⑥⑦
解析：选C。质粒存在于细菌和酵母菌等微生物中，是一种很小的独立于拟核之外的环状DNA分子，上面有标记基因，便于在受体细胞中检测。质粒在受体细胞中能“友好”地“借居”，并能随受体细胞DNA的复制而复制，能进行目的基因的扩增和表达。
5．(2018·衡水高二检测)一环状DNA分子，设其长度为1，限制酶A在其上的切点位于0.0处；限制酶B在其上的切点位于0.3处；限制酶C的切点未知，但C单独切或与A或与B同时切的结果如下表，请确定C在该环状DNA分子上的切点应位于图中的哪处( )
C单独切
长度为0.8和0.2的两个片段
C与A同时切
长度为2个0.2和1个0.6的片段
C与B同时切
长度为2个0.1和1个0.8的片段
A．0.2和0.4处 B．0.4和0.6处
C．0.5和0.7处 D．0.6和0.9处
解析：选A。据图表信息可知：限制酶C单独切割环状DNA分子，获得长度为0.8和0.2的两个片段，可推知限制酶C有2个切割位点。限制酶A只有1个切割位点，且位于0.0处，又知限制酶C与限制酶A同时切割时，获得2个0.2和1个0.6的片段，因此以限制酶A切割点向左或向右推测，可得知限制酶C的切割位点可能为0.2、0.4或0.6、0.8处。再根据限制酶C与限制酶B同时切割时，获得2个0.1和1个0.8片段，可推知限制酶C的切割位点可能为0.1、0.2或0.4、0.5处。综上分析，只有0.2和0.4两处与之前推测相吻合，选项A正确。
6．(2018·河北巨鹿高二期中)下图表示某种质粒和人的胰岛素基因，其中a表示标记基因，b表示胰岛素基因，E1表示某限制酶的酶切位点，现用该种限制酶分别切割质粒和胰岛素基因，后用DNA连接酶连接切割后的质粒和胰岛素基因，下列选项中不可能出现的是( )
答案：C
7．基因工程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。根据下图判断下列操作正确的是( )
A．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
B．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
C．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
D．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
解析：选D。解此题要明确目的基因要切下，质粒只要切开。限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，单独使用时可以把目的基因和质粒都切断；限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，只能把它们切开，单独使用时不能切断，所以目的基因用限制酶Ⅱ切割，质粒用限制酶Ⅰ切割；因为用限制酶Ⅰ切割质粒时破坏了GeneⅡ，所以只能用GeneⅠ作为标记基因。
8．如图所示为DNA分子在不同酶的作用下所发生的变化，图中依次表示限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、解旋酶作用的正确顺序是( )
A．①②③④ B．①②④③
C．①④②③ D．①④③②
解析：选C。图示中①表示该酶切割DNA分子双链产生黏性末端的过程，用到的酶是限制性核酸内切酶，②是黏性末端连接的过程，用到的酶是DNA连接酶，③是DNA分子解旋的过程，要用解旋酶，④是DNA分子复制时子链的形成过程，需要DNA聚合酶。
9．某线性DNA分子含有3 000个碱基对(bp)，先用限制酶a切割，再把得到的产物用限制酶b切割，得到的DNA片段大小如下表。限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示。下列有关说法正确的是( )
a酶切割产物(bp)
b酶再次切割产物(bp)
1 600；1 100；300
800；300
A．在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列分别有3个和2个
B．a酶与b酶切出的黏性末端不能相互连接
C．a酶与b酶切断的化学键不同
D．用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，序列会明显增多
解析：选D。根据以上分析可知在该DNA分子中，a酶与b酶的识别序列都是2个，A错误。图中显示两个酶的识别序列不同，但是切割后露出的黏性末端相同，a酶与b酶切出的黏性末端可以相互连接，B错误。a酶与b酶切断的化学键都是磷酸二酯键，C错误。a酶和b酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下可连接形成。所以用这两种酶和DNA连接酶对该DNA分子进行反复切割、连接操作，若干循环后，所得DNA分子中序列会明显增多，D正确。
10．(2018·广州高二模拟)如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列叙述正确的是( )
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞
解析：选C。如果将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，那么酶切后二者的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下，由两个DNA片段之间连接形成的产物有三种，只有一种符合基因工程的需求；DNA连接酶的作用是将酶切后的目的基因和质粒的黏性末端连接起来形成重组质粒，该过程形成4个磷酸二酯键；为了防止目的基因和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ，这样切割后得到的DNA片段两侧的黏性末端不同；由于受体细胞为无任何抗药性的原核细胞，因此能在含青霉素的培养基中生长，可能是受体细胞成功导入了目的基因，也可能是只导入了不含目的基因的载体。
二、非选择题
11．下图表示两种限制酶识别DNA分子的特定序列，并在特定位点对DNA分子进行切割的示意图，请回答以下问题：
(1)图中甲和乙代表___________________________________________________。
(2)EcoRⅠ、HpaⅠ代表_______________________________________________。
(3)图中甲和乙经过相应操作均形成两个片段，切口的类型分别为________________、________________。甲中限制酶的切点是________________之间，乙中限制酶的切点是________之间。
(4)由图解可以看出，限制酶的作用特点是__________________________________。
(5)如果甲中G碱基发生基因突变，可能发生的情况是_________________________。
解析：(1)由图示看出，甲和乙代表由脱氧核苷酸构成的不同的DNA片段。(2)EcoRⅠ和HpaⅠ能切割DNA分子，说明它们是限制酶。(3)甲中切点在G、A之间，切口在识别序列中轴线两侧，形成黏性末端；乙中切点在A、T之间，切口在识别序列中轴线处，形成平末端。(4)(5)限制酶能识别DNA分子的特定核苷酸序列，并从特定位点切割DNA分子。当特定核苷酸序列变化后，就不能被相应限制酶识别。
答案：(1)有特定脱氧核苷酸序列的DNA片段
(2)两种不同的限制酶
(3)黏性末端 平末端 G、A A、T
(4)能识别双链DNA分子的特定脱氧核苷酸序列，并从特定的位点将DNA分子切开
(5)限制酶不能识别切割位点
12．根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)限制酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒载体用限制酶X(识别的序列由6个核苷酸组成)切割后产生的片段如下：
AATTC……G
G……CTTAA
该酶识别的序列为__________________，切割的部位是_________________。
(3)为使切割后的载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用限制酶X切割外，还可用限制酶Y切割，两种酶共同的特点是_________________________________。
(4)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶，其中后者只能连接一种末端。
(5)基因工程中除质粒外，____________和________也可作为载体。
解析：(1)限制酶切割DNA分子后可产生两种类型的末端，即平末端和黏性末端。(2)将图中片段两端的黏性末端对接后可以看出限制酶X识别的序列为6个核苷酸组成的—GAATTC—，互补链是—CTTAAG—，切割的位点为G和A之间的磷酸二酯键。(3)质粒载体可以用限制酶X切割，也可以用另一种限制酶切割，说明该酶与限制酶X切割产生的黏性末端相同或者是互补。(4)基因工程使用的DNA连接酶，按来源可分为E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶，其中只能连接黏性末端的是E·coli DNA连接酶。(5)基因工程的载体有质粒、λ噬菌体的衍生物和动植物病毒。
答案：(1)黏性末端 平末端
(2)—GAATTC—或—CTTAAG— G和A之间的磷酸二酯键
(3)两种限制酶切割后形成的黏性末端相同或互补
(4)T4 E·coli
(5)λ噬菌体的衍生物 动植物病毒
13．如图所示，质粒pZHZ9上含有X抗生素抗性基因(XR)和Y抗生素抗性基因(YR)。其中，XR内部含有限制酶KasⅠ识别序列，YR内部含有限制酶FseⅠ、HpaⅡ、NaeⅠ、Ngo MIV识别序列，五种酶的识别序列如图B(?表示切割位点)，且这些识别序列在整个质粒上均仅有一处，目的基因内部不存在这些识别序列。请回答下列有关遗传信息传递与表达的问题：
(1)若要将结构如图C所示的目的基因直接插入YR内形成重组质粒pZHZ10，则pZHZ9需用限制酶________切开。
(2)将上述切开的质粒溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，进行大肠杆菌受体细胞导入操作。之后，受体细胞的类型(对两种抗生素表现出抗性R或敏感性S)包含________(多选)。
A．XR、YR B．XR、YS
C．XS、YR D．XS、YS
解析：(1)图B中的限制酶NgoMIV识别并切割形成的黏性末端与目的基因两端的黏性末端序列相同，所以pZHZ9需用限制酶Ngo MIV切割。(2)将切开的质粒溶液与目的基因溶液混合后，加入DNA连接酶，构建基因表达载体，培养液中会出现三类情况：第一类是目的基因和质粒结合，这种基因表达载体上的YR抗性基因破坏，成为XR、YS类型质粒；第二类是质粒自身将切口处连接起来，恢复为正常质粒，具有XR、YR两个抗性基因；第三类是目的基因和目的基因连接。进行大肠杆菌受体细胞导入的操作后，若导入了第一类基因表达载体，则细菌的类型为XR、YS，若导入了第二种类型的质粒，则细菌的类型为XR、YR，若没有导入质粒，则细菌的类型为XS、YS。
答案：(1)Ngo MIV (2)ABD
14．通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示这一技术的基本过程。在该工程中所用的基因“分子手术刀”能识别的序列和切点是—G↓GATCC—，请回答下列问题：
(1)从羊染色体中“剪下”羊蛋白质基因的酶是________。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是________________。
(2)请在图中画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。
(3)人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，是因为
________________________________________________________________________。
解析：在基因工程中用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。在对载体和目的基因进行切割时，一定要用同一种限制酶，才能切出相同的黏性末端。当插入目的基因时，常用DNA连接酶使二者之间形成磷酸二酯键而连接起来。
答案：(1)限制酶 DNA连接酶
(2)
(3)人的遗传物质(基因)与羊的遗传物质都为DNA，其物质组成和空间结构相同
课件43张PPT。专题1 基因工程专题1 基因工程DNA重组技术基因DNA分子水平生物类型原核生物特定核苷酸序列特定位点磷酸二酯键黏性末端和平末端大肠杆菌互补的黏性末端T4噬菌体黏性末端平末端磷酸二酯键外源基因质粒自我复制限制酶切割位点标记基因EcoR ⅠDNA连接酶G—A—A—T—T—CG—A互补的碱基互补配对—GAATTC—G和A之间—CCCGGG—C和G之间磷酸二酯键①DNA标记基因供重组DNA的鉴定和选择
