1．2 基因工程的基本操作程序
1．掌握目的基因获取的常见方法。(难点) 2.学会基因表达载体构建的方法和要求。(重、难点) 3．理解目的基因导入受体细胞的具体过程。(重点) 4.掌握目的基因检测与鉴定的具体操作。
一、目的基因的获取(阅读教材P8～P11)
.目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
.目的基因的获取方法
(1)从基因文库中获取
①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
②种类
③提取依据：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质等特性。
(2)利用PCR技术扩增目的基因
①PCR的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
②目的：短时间内大量扩增目的基因。
③原理：DNA双链复制。
④过程
第一步：加热至90～95 ℃，DNA解链；
第二步：冷却至55～60 ℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75 ℃，热稳定DNA聚合酶(Taq酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
⑤特点：指数形式扩增。
(3)人工合成
如果目的基因较小，核苷酸序列又已知，可通过DNA合成仪用化学方法人工合成。
二、基因表达载体的构建(阅读教材P11)
1．构建基因表达载体的目的
(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成
基因表达载体的组成
两子启动和终止；目的基因在中间；标记基因来筛选。
3．基因表达载体的功能：通过基因表达载体将目的基因导入受体细胞。
三、将目的基因导入受体细胞(阅读教材P11～P13)
.转化的概念：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
.将目的基因导入植物细胞
(1)农杆菌转化法：将目的基因导入双子叶植物和裸子植物。
(2)基因枪法：将目的基因导入单子叶植物常用的方法。
(3)花粉管通道法：我国科学家独创的一种方法。
将目的基因导入动物细胞
(1)方法：显微注射法。
(2)常用受体细胞：受精卵。
4．将目的基因导入微生物细胞
(1)方法
①用Ca2＋处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态(这种细胞称为感受态细胞)。
②感受态细胞吸收重组表达载体DNA分子。
(2)受体细胞：原核细胞(使用最广泛的是大肠杆菌细胞)。
(3)原核生物的特点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等。
四、目的基因的检测与鉴定(阅读教材P13～P15)
分子水平检测
(1)检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因。
方法：DNA分子杂交技术。
(2)检测目的基因是否转录出mRNA。
方法：分子杂交技术。
(3)检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：抗原—抗体杂交技术。
个体生物学水平鉴定：抗虫、抗病、抗逆性状的有无及程度。
连一连
判一判
(1)所有的目的基因都可从基因文库中直接获得。(×)
(2)基因工程操作程序的核心步骤是目的基因的获取。(×)
分析：核心步骤为基因表达载体的构建。
(3)标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。(√)
(4)目的基因导入双子叶植物一般采用农杆菌转化法。(√)
(5)基因工程常用的受体细胞都是动植物的体细胞。(×)
(6)(2018·西宁高二期末)基因工程是否成功需进行个体生物学水平上的鉴定。(√)
目的基因的获取
探究1 目的基因获取的方法
结合下面过程，探究获取目的基因的方法：
类型
(1)
(2)
(3)
(4)
过程
获取方法
基因组文库
部分基因文库(如cDNA文库)
PCR技术扩增
人工合成
探究2 比较PCR技术与DNA复制的不同点
项目
DNA复制
PCR技术
解旋方式
解旋酶催化
DNA在高温作用下变性解旋
场所
细胞内(主要在细胞核内)
细胞外(主要在扩增仪内)
酶
解旋酶、普通的DNA聚合酶等
耐热的DNA聚合酶(Taq酶)
温度条件
细胞内温和条件
需控制温度，在较高温度下进行
合成的对象
DNA分子
DNA片段或基因
四种获取目的基因方法的比较
方法
基因文库的构建
PCR技术扩增
人工合成
基因组文库
部分基因文库
(如cDNA文库)
优点
操作简单
专一性强
可在短时间内大量扩增目的基因
专一性强，可产生自然界中不存在的新基因
缺点
工作量大、盲目性大、专一性差
操作过程较麻烦，技术要求过高
需要严格控制温度、技术要求高
适用范围小
突破1 目的基因的获取方法
1．下列有关获取目的基因方法的叙述，错误的是( )
A．直接分离目的基因的方法的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性
B．由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法
C．目前人工合成基因的方法主要有两种，分别是反转录法和化学合成法
D．PCR技术的原理是DNA复制，需要RNA聚合酶催化DNA合成
解析：选D。PCR技术的原理是DNA分子的复制，需要耐高温的DNA聚合酶催化DNA合成，并以脱氧核苷酸等为原料。
2．(2018·湖北黄冈高二期中)如图表示基因工程中获取水稻某目的基因的不同方法。下列相关叙述中正确的是( )
A．三种方法都需要酶并均在体外进行
B．①②③碱基对的排列顺序均相同
C．三种方法均属于人工合成法
D．方法a不遵循中心法则
解析：选A。这三种方法都是在体外进行的，且都用到酶(方法a需要逆转录酶和DNA聚合酶；方法b需要限制酶；方法c需要DNA聚合酶)，A正确；通过方法a得到的目的基因不含有内含子，通过方法c得到的目的基因的碱基序列可能有多种，因此①②③碱基对的排列顺序不都相同，B错误；图示a和c属于人工合成法，而b是从供体细胞的DNA中直接分离目的基因的方法，C错误；方法a遵循中心法则，D错误。
认清基因组文库法与逆转录法获取目的基因的不同
(1)酶：前者需要限制酶；后者需要逆转录酶。
(2)原料：前者不需要原料；后者需要脱氧核苷酸。
(3)结构：前者基因中含有启动子，能转录；后者基因中没有启动子，只将编码序列导入受体细胞，故无法进行转录。
突破2 PCR扩增过程
3．(2018·广州高二检测)以下为形成cDNA(图中的单链DNA)过程和PCR扩增过程示意图。据图分析，下列说法正确的是( )
A．催化①过程的酶是RNA聚合酶
B．④过程发生的变化是引物与单链DNA结合
C．催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，都能耐高温
D．如果RNA单链中A与U之和占该链碱基含量的40%，则一个双链DNA中，A与U之和也占该DNA碱基含量的40%
解析：选B。由题意可知，①②③④⑤分别表示逆转录、DNA的复制、DNA解链、引物结合到互补DNA链及互补链的合成，B对；①过程由逆转录酶催化完成，A错；催化②⑤过程的酶都是DNA聚合酶，过程⑤是在70～75 ℃的高温条件下进行的，只有该过程中的酶需耐高温，C错；在DNA分子中有T无U，D错。
基因表达载体的构建和目的基因的导入
探究1 基因表达载体的组成及构建
(1)结合基因表达载体模式图分析其组成
①基因表达载体的组成：
[a]启动子＋[b]终止子＋[c]标记基因＋[d]复制原点＋[e]目的基因。
②目的基因的表达需要调控序列，因而用作载体的质粒，在目的基因插入部位之前需要有启动子，之后需要有终止子。
③鉴别目的基因是否导入受体细胞中需要有筛选标记——标记基因。
(2)结合构建过程分析
图中①为同一种限制酶，②为DNA连接酶。
探究2 目的基因导入受体细胞
(1)农杆菌转化法的分析
①由图示可知，目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上形成基因表达载体。
②基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌细胞时，要用Ca2＋处理农杆菌细胞，使其处于感受态，利于重组质粒的导入。
③由导入目的基因的受体细胞培育到完整的植株要用到植物组织培养技术。
(2)目的基因在受体细胞中的位置不同会引起遗传上的差别
①图中b会使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达，原因是在进行细胞减数分裂时，细胞核上的DNA经复制后平均分配到两个子细胞中，保证了亲子代遗传性状的稳定性。
②图中a细胞减数分裂时，细胞质是不均分的，子细胞不一定含有目的基因。
怎样操作可促进单子叶植物受农杆菌的感染？
提示：可在单子叶植物受损处加涂酚类物质来吸引更多的农杆菌感染。
1．基因表达载体的组成
2．不同受体细胞的常用导入方法
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射法
Ca2＋处理法
受体细胞
体细胞
受精卵
原核细胞
转化过程
目的基因插入Ti质粒的T?DNA上→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA中→表达
目的基因表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
交汇点1 启动子、终止子和起始密码子、终止密码子
(1)启动子、终止子是基因表达载体上的具有特殊结构的____________片段。
(2)起始密码子、终止密码子是____________上的三个相邻碱基。
交汇点2 复制原点和启动子
(1)复制原点位于载体的开始端，驱动载体的________，若复制原点被破坏，则重组载体将不能得以复制。
(2)启动子则位于某基因的首端，负责驱动该基因的________。
答案：交汇点1
(1)DNA (2)mRNA
交汇点2
(1)自我复制 (2)转录
突破1 基因表达载体的构建
1．(2018·河北黄骅中学高二期中)如图是利用基因工程技术培育转基因植物，生产可食用疫苗的部分过程示意图，其中Pst Ⅰ、Sma Ⅰ、EcoR Ⅰ、Apa Ⅰ为四种限制性核酸内切酶。下列说法错误的是( )
A．图示过程是基因工程的核心步骤
B．表达载体构建时需要用到限制酶SmaⅠ
C．抗卡那霉素基因的存在有利于将含有抗原基因的细胞筛选出来
D．除图示组成外，表达载体中还应该含有启动子和终止子等结构
解析：选B。图示过程为基因表达载体的构建过程，是基因工程中的核心步骤。构建过程中需要将目的基因完整切割下来，此时要用到限制酶PstⅠ、EcoRⅠ。抗卡那霉素基因是标记基因，目的是便于鉴定和筛选含有目的基因的细胞。基因表达载体包括复制原点、启动子、目的基因、终止子和标记基因等。
突破2 将目的基因导入受体细胞
2．将目的基因导入玉米茎尖分生区细胞和小鼠受精卵，分别应采用的方法是( )
A．显微注射法、农杆菌转化法
B．基因枪法、花粉管通道法
C．农杆菌转化法、显微注射法
D．基因枪法、显微注射法
解析：选D。玉米是单子叶植物，对单子叶植物来说，将目的基因导入受体细胞常用的方法是基因枪法；对于动物细胞来说，常用的方法是显微注射法。
3．下列关于目的基因导入受体细胞的叙述，不正确的是( )
A．利用基因枪法将目的基因导入植物细胞的方法比较经济、有效
B．显微注射技术是转基因动物中采用最多的方法
C．大肠杆菌最常用的转化方法是：使细胞的生理状态发生改变
D．农杆菌转化法是将目的基因导入植物细胞最常用的方法
解析：选A。将目的基因导入植物细胞常用的方法是农杆菌转化法，该方法比较经济、有效。此外，将目的基因导入植物细胞的方法还有基因枪法和花粉管通道法；目的基因导入动物细胞常用的方法是显微注射技术；大肠杆菌细胞最常用的转化方法是用钙离子处理细胞，使细胞的生理状态发生改变，从而完成转化过程。
农杆菌转化法中两次拼接、两次导入的辨析
第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T-DNA的中间部位，第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T-DNA被拼接到受体细胞染色体的DNA上；第一次导入是将含目的基因的Ti质粒重新导入农杆菌，第二次导入(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA导入受体细胞。
目的基因的检测与鉴定
探究1 目的基因片段的检测
下图为目的基因的检测示意图，结合图示探究以下问题：
(1)由上图DNA分子杂交可知：M为目的基因片段；N为非目的基因片段。
(2)检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因：采用DNA分子杂交技术。主要做法是用标记了放射性同位素的目的基因片段作为探针，检测受体细胞的DNA中有无目的基因。显示出杂交带，说明目的基因已经插入染色体DNA中。
(3)检测目的基因是否转录出了mRNA：采用分子杂交技术。具体做法是用标记的目的基因作探针，与mRNA杂交，如果显示出杂交带，则表明目的基因转录出了mRNA。
探究2 目的基因的鉴定
下图为抗虫棉的接种实验，结合图示(左图为抗虫转基因棉使虫体发育不正常)探究以下问题：
(1)判断抗虫棉的接种实验属于个体生物学水平鉴定。
(2)检测方法是让害虫吞食棉叶，观察指标是害虫死亡。
目的基因的检测与鉴定的方法
1．(2018·长沙高二检测)DNA探针是利用放射性同位素等标记的特定DNA片段。当DNA探针与待测的非标记单链DNA(或RNA)按碱基顺序互补结合时，形成标记DNA—DNA(或标记DNA—RNA)的双链杂交分子，可检测杂交反应结果。用某人的胰岛素基因制成DNA探针，能与之形成杂交分子的是( )
①该人胰岛A细胞中的DNA
②该人胰岛B细胞中的mRNA
③该人胰岛A细胞中的mRNA
④该人肝细胞中的DNA
A．①③④ B．①②③
C．①②④ D．②③④
解析：选C。DNA单链能与其互补链及其转录产生的mRNA分子互补配对而形成杂交分子；人体细胞中都有胰岛素基因，但此基因只有在胰岛B细胞中才能得到表达。
2．在判断抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子检测的是( )
A．通过观察害虫吃棉叶是否死亡
B．检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带
C．检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带
D．检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带
解析：选A。A项属于个体生物学水平的鉴定，不是分子检测。B、C两项为分子检测，利用分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带；D项也为分子检测内容，利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带。
常见不同转基因生物在个体水平上鉴定、检测的方法
个体水平的鉴定实际上是检测目的基因是否表达出所控制的性状，不同的转基因生物检测方法不同。
转基因生物
检测方法
观察目标
抗虫植物
害虫吞食
害虫死亡
抗病毒(菌)植物
病毒(菌)感染
未侵染上病斑
抗盐植物
盐水浇灌
正常生长
抗除草剂植物
喷洒除草剂
正常生长
获取目的基因产物的转基因生物
提取细胞产物与天然产品进行功能活性比较
细胞产物功能活性正常
核心知识小结
[要点回眸]
[答题必备]
获取目的基因的常用方法有：从基因文库中获取目的基因和利用PCR技术扩增目的基因。
基因表达载体的构建是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。
一个基因表达载体的组成，除了目的基因外，还必须有启动子、终止子以及标记基因等。
将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法。
培育转基因动物时，受体细胞一般是受精卵，目的基因的导入方法常用显微注射技术。
检测目的基因是否导入和转录，常用分子杂交技术；检测是否翻译，常用抗原—抗体杂交技术。
[随堂检测]
1．(2018·淮安高二期中)图中甲、乙表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是( )
A．甲方法可建立该细菌的基因组文库
B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库
C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料
D．乙方法需要逆转录酶参与
解析：选C。甲方法是以细菌中的DNA为基础，用限制酶进行切割，它包括了细胞所有的基因，可以建立基因组文库，并且可以从中选出所需的目的基因，不需要模板和原料。而乙方法是用逆转录的方法人工合成目的基因，它只能得到生物的部分基因，基因中只有编码区，所以组成的是该细菌的cDNA文库。
2．下列关于PCR技术的叙述，正确的是( )
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术应用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
解析：选D。PCR技术扩增的目的基因序列不一定是已知的，A项错误；PCR技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B项错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链的末端进行碱基配对，其序列不是互补的，C项错误。
3．(2017·高考北京卷)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析：选C。目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来，A项正确；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法，B项正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素，C项错误；使用DNA分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上，D项正确。
4．(2018·枣庄高二检测)图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性原因。下列叙述正确的是( )
A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C．用PstⅠ和HindⅢ切割，可以保证重组DNA序列的唯一性
D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析：选C。图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，获得一个DNA片段，其只含有2个游离的磷酸基团，选项A错误；在构建重组质粒时，不能使用BamHⅠ切割外源DNA，因为用BamHⅠ切割会破坏目的基因的结构，但可以用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA，选项B错误；用PstⅠ和HindⅢ切割会得到2个DNA片段，再加入DNA连接酶，切开的质粒由于黏性末端不同，不会自身连接，从而保证重组质粒只能得到一种，即含有目的基因和标记基因neo的重组质粒，保证了重组DNA序列的唯一性，选项C正确；由于用PstⅠ切割质粒后，其中的氨苄青霉素抗性基因已被破坏，所以导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，选项D错误。
5．(2018·保定高二检测)如图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是( )
A．过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞壁的通透性
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定
解析：选D。题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，选项A错误；CaCl2处理只是提高农杆菌细胞的细胞壁的通透性，选项B错误；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，选项C错误；转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染的实验进行鉴定，选项D正确。
6．(2016·高考全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是_______________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_________和__________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
解析：(1)由图(a)可知，尽管BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ两种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端。
答案(1)Sau3A Ⅰ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
7．(2018·山东青岛二中高二段考)Ⅰ.右图a表示基因工程中经常选用的载体——pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上。得到如图b的结果(黑点表示菌落)。再将灭菌的绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果(空圈表示与b对照无菌落的位置)。据此分析并回答下列问题：
(1)pBR322质粒的基本组成单位是________。 该基因工程中，质粒上的Ampr、Tetr称为____________基因。
(2)与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型可以推知，目的基因插入了____________中。
Ⅱ.下图是转基因烟草的培育过程，据图回答下列问题：
(3)据图分析可知，重组Ti质粒载体，至少应该具备________个限制酶切点。
(4)从外源目的基因的获取到转基因成功，整个过程至少需要断开________个磷酸二酯键，根据所学知识推知T－DNA 上需要自带________酶所识别的基因。
答案：(1)脱氧核糖核苷酸 标记 (2)Tetr (3)4 (4)12 限制性核酸内切(限制)
[课时作业]
一、选择题
1．(2018·沈阳高二检测)基因工程技术也称DNA重组技术，其实施必须具备的4个必要条件是( )
A．目的基因、限制酶、载体、受体细胞
B．工具酶、目的基因、载体、受体细胞
C．模板DNA、mRNA、质粒、受体细胞
D．重组DNA、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶
解析：选B。基因工程的基本工具是限制酶、DNA连接酶和载体，前两者统称为工具酶；在实际操作中，载体上插入目的基因形成重组载体，然后导入受体细胞。
2．下列获取目的基因的方法中需要用到模板链的是( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③通过逆转录法获取目的基因 ④通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成目的基因
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
解析：选D。PCR技术利用的是DNA复制原理，将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。逆转录法是以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，先逆转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。①④均不需要模板。
3．在基因工程中，可依据受体细胞的类型及其生理特性来选择合适的载体，既能高效地携带目的基因进入受体细胞，又能方便地进行检测。已知有以下几类含有不同标记基因的质粒，不可作为侵入大肠杆菌的载体的是(已知青霉素可杀死细菌，四环素不能杀死大肠杆菌)( )
答案：B
4．(2018·郑州一中高二期中)我国上海研究所合成一种具有镇痛作用而又不会使病人上瘾的药物——脑啡呔多糖(类似人体中的糖蛋白)。如要采用基因工程和发酵技术让微生物来生产有生物活性的脑啡呔多糖，应选哪种微生物为受体细胞( )
A．大肠杆菌 B．大肠杆菌质粒
C．T4 噬菌体 D．酵母菌
答案：D
5．(2018·天津四十七中期中)如图为基因表达载体的模式图，下列有关说法错误的是( )
A．构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶
B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别
C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位
D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
解析：选B。构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确。用不同种类的载体构建基因表达载体时处理方法是有差别的，B错误。启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，C正确。抗生素抗性基因的作用就是作为标记基因，用于检测受体细胞中是否导入了目的基因，D正确。
6．(2018·河北武邑中学高二期中)据图分析，下列有关基因工程的说法不正确的是( )
A．用限制酶Ⅰ、Ⅱ同时切割质粒(假设切割完全)，会获得3种长度的DNA片段
B．用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割质粒和目的基因比只用限制酶Ⅰ更符合要求
C．与启动子结合的应该是RNA聚合酶
D．能够检测到标记基因表达产物的受体细胞中，不一定会有目的基因的表达产物
答案：A
7．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成表达的是( )
A．棉花细胞中检测到载体上的标记基因
B．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因
C．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA
D．酵母菌细胞中提取到人的干扰素
解析：选D。A、B、C三项都不能说明目的基因完成表达。人的干扰素基因导入酵母菌中，酵母菌合成了人的干扰素，说明目的基因表达成功。
8．(2018·河南郑州一中高二期中)下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，下列有关说法错误的是( )
A．A→B过程中用到的原料有4种，加入的引物有2种
B．A→B过程利用了DNA复制原理，需要使用耐高温的DNA聚合酶
C．B→C为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是卵母细胞
D．B→D为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法
答案：C
9．抗菌肽对治疗癌症有一定作用，如图表示抗菌肽的合成过程。下列相关说法正确的是( )
→→→→→
A．用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶
B．基因表达载体包含起始密码子和终止密码子
C．用显微注射法导入基因表达载体
D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质
解析：选A。PCR技术中采用高温变性使DNA解旋，因此用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶，A正确；基因表达载体包含启动子和终止子，而起始密码子和终止密码子在mRNA上，B错误；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法，C错误；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质，D错误。
10．(2018·吉林一中月考)如图表示科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。以下说法正确的是( )
A．图中Ⅰ是质粒，步骤①常需用到限制酶和DNA聚合酶
B．图中Ⅱ是含目的基因的重组Ti质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因会影响抗虫基因的表达
解析：选C。Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，常需用到限制酶和DNA连接酶，A错误；图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误；图中步骤③是将目的基因导入植物细胞，C正确；基因的表达具有独立性，剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D错误。
二、非选择题
11．(2016·高考全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_____________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__________________________；并且____________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自____________。
解析：(1)作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，且含有特殊的标记基因。(2)未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分二者。根据题图，用BamH Ⅰ切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其DNA复制所需原料来自受体细胞。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
12．研究表明，油菜中蛋白质与油脂均由丙酮酸转化而来，丙酮酸羧化酶(PEP)能催化丙酮酸合成蛋白质。下表中甲株为正常油菜，乙、丙和丁株为转反义PEP基因的油菜。请回答：
组别
油脂含量(%)
蛋白质含量(%)
甲
40.02
24.12
乙
49.42
22.24
丙
48.69
22.50
丁
47.60
22.52
(1)利用PCR获取PEP基因时，根据PEP基因上游及下游的碱基序列，设计并人工合成____________，PCR的原料是____________。
(2)在构建PEP基因表达载体时，如果将PEP基因反向连接在____________和终止子之间，可构成反义PEP基因表达载体。若PEP基因在转录时，两条单链(a链、b链)中的a链为模板链，则反义PEP基因在转录时的模板链为____________。
(3)在检测反义PEP基因是否整合到油菜细胞的染色体DNA上时，拟用PEP基因做探针是否可行？请说明理由。__________________________________________________。
(4)分析上表数据，乙、丙和丁三株油菜细胞中与蛋白质合成相关的基因有________________________________________________________________________，
反义PEP基因提高油脂含量的原理是_______________________________________。
乙、丙和丁三株油菜的产油量差异较大，仅从反义PEP基因转化的角度考虑，可能的原因是_________________________________________________________________________。
答案：(1) 引物 dNTP(脱氧核苷三磷酸) (2)启动子 b链 (3)不行，PEP基因及反义PEP基因均能与PEP基因探针杂交，出现杂交带 (4)PEP基因、反义PEP基因 反义PEP基因通过抑制蛋白质的合成促进了油脂的合成 反义PEP基因插入染色体DNA的位置及数目不同
13．(2018·新疆四中高二期末)下图是从酵母菌中获取某植物需要的控制某种酶合成的基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：
(1)图中cDNA文库________(填“大于”“小于”或“等于”)基因组文库。
(2)①过程提取的DNA需要________________的切割，B过程是________________。
(3)为在短时间内大量获得目的基因，可用________________________扩增的方法，其原理是____________________________________________________________________。
(4)目的基因获取之后，需要进行________________。
(5)将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是__________________，其能否在此植物体内稳定遗传的关键是________________，可以用__________________技术进行检测。
答案：(1)小于 (2)限制酶 逆转录 (3)PCR技术 DNA复制 (4)基因表达载体的构建 (5)农杆菌转化法 目的基因是否整合到植物细胞的染色体上 DNA分子杂交
14．(2018·广东中山高二期末)如图1表示我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号”的主要培育流程，请据图回答：
图1
图2
(1)杀虫基因通过①～④，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做________；其中____(填标号)是转基因抗虫水稻的核心步骤，需要的工具酶是_____________、__________。
(2)“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有_____________、____________。
(3)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有T-DNA，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中________________上。
(4)图2是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(部分基因及部分限制酶作用位点)，组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造，据图分析：
①人工改造质粒时，要使抗虫基因表达，还应插入_______，其作用是___________。
②人工改造质粒时，先用限制酶Ⅰ处理，可以去除质粒上的________基因和________基因(填上图质粒上的基因名称)，保证重组质粒进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长；然后再用限制酶Ⅱ分别切割经过改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒，那么成功导入抗虫基因的水稻胚细胞将不能在含________(填抗生素名称)的培养基上生长。
解析：(1)杀虫基因通过①～④，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化；其中①过程表示基因表达载体的构建，这是转基因抗虫水稻的核心步骤，需要的工具酶是限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶。(2)分析图解可知，“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有基因工程技术(转基因技术)、植物组织培养技术。(3)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有T-DNA，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中染色体的DNA上。(4)①启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。②图中看出，tms基因能够编码吲哚乙酸，tmr基因能够编码细胞分裂素，这两种激素能够促进植物的生长。因此人工改造时用限制酶Ⅰ处理，其目的之一是除去或破坏质粒上的tmr、tms，保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；另外只有一个插入位点，也有利于目的基因(或外源DNA)准确插入。
答案：(1)转化 ① 限制性核酸内切酶(限制酶) DNA连接酶 (2)基因工程技术(转基因技术) 植物组织培养技术 (3)染色体的DNA (4)①启动子
为RNA聚合酶提供识别和结合的部位，驱动转录
②tms tmr 四环素
[随堂检测]
1．(2018·淮安高二期中)图中甲、乙表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是( )
A．甲方法可建立该细菌的基因组文库
B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库
C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料
D．乙方法需要逆转录酶参与
解析：选C。甲方法是以细菌中的DNA为基础，用限制酶进行切割，它包括了细胞所有的基因，可以建立基因组文库，并且可以从中选出所需的目的基因，不需要模板和原料。而乙方法是用逆转录的方法人工合成目的基因，它只能得到生物的部分基因，基因中只有编码区，所以组成的是该细菌的cDNA文库。
2．下列关于PCR技术的叙述，正确的是( )
A．PCR技术建立在对扩增的目的基因序列完全已知的基础上
B．该技术需要解旋酶和热稳定的DNA聚合酶
C．该技术需要一对特异性的引物，要求一对引物的序列是互补的
D．该技术应用体内DNA双链复制原理，也需要模板、原料、能量、酶等条件
解析：选D。PCR技术扩增的目的基因序列不一定是已知的，A项错误；PCR技术是通过高温来使DNA解旋的，不需要解旋酶，B项错误；该技术需要的一对引物，分别能与模板DNA的两条链的末端进行碱基配对，其序列不是互补的，C项错误。
3．(2017·高考北京卷)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用DNA分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
解析：选C。目的基因C和质粒都有可被EcoRⅠ切割的酶切位点，另外需要DNA连接酶将切好的目的基因和质粒连接起来，A项正确；愈伤组织全能性较高，是理想的植物受体细胞，将目的基因导入植物受体细胞的方法通常为农杆菌转化法，B项正确；质粒中含有潮霉素抗性基因，因此选择培养基中应该加入潮霉素，C项错误；使用DNA分子杂交方法可检测目的基因是否整合到受体染色体上，D项正确。
4．(2018·枣庄高二检测)图甲、乙中的箭头表示三种限制性核酸内切酶的酶切位点，ampr表示氨苄青霉素抗性基因，neo表示新霉素抗性原因。下列叙述正确的是( )
A．图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，含有4个游离的磷酸基团
B．在构建重组质粒时，可用PstⅠ和BamHⅠ切割质粒和外源DNA
C．用PstⅠ和HindⅢ切割，可以保证重组DNA序列的唯一性
D．导入目的基因的大肠杆菌可在含氨苄青霉素的培养基中生长
解析：选C。图甲中的质粒用BamHⅠ切割后，获得一个DNA片段，其只含有2个游离的磷酸基团，选项A错误；在构建重组质粒时，不能使用BamHⅠ切割外源DNA，因为用BamHⅠ切割会破坏目的基因的结构，但可以用PstⅠ和HindⅢ切割质粒和外源DNA，选项B错误；用PstⅠ和HindⅢ切割会得到2个DNA片段，再加入DNA连接酶，切开的质粒由于黏性末端不同，不会自身连接，从而保证重组质粒只能得到一种，即含有目的基因和标记基因neo的重组质粒，保证了重组DNA序列的唯一性，选项C正确；由于用PstⅠ切割质粒后，其中的氨苄青霉素抗性基因已被破坏，所以导入目的基因的大肠杆菌不能在含氨苄青霉素的培养基中生长，选项D错误。
5．(2018·保定高二检测)如图表示培育转基因抗植物病毒番茄的过程示意图。下列叙述正确的是( )
A．过程A需要限制酶和DNA聚合酶的参与
B．过程B需要用CaCl2处理，以提高番茄细胞壁的通透性
C．抗植物病毒基因一旦整合到番茄细胞的染色体上，就能正常表达
D．转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过抗病毒接种实验进行鉴定
解析：选D。题图中过程A为构建基因表达载体，需要用到限制酶和DNA连接酶，不需要DNA聚合酶，选项A错误；CaCl2处理只是提高农杆菌细胞的细胞壁的通透性，选项B错误；抗植物病毒基因整合到番茄细胞的染色体上，不一定能表达，选项C错误；转基因抗植物病毒番茄是否培育成功可通过接种特定病毒，观察番茄是否被感染的实验进行鉴定，选项D正确。
6．(2016·高考全国卷Ⅲ)图(a)中的三个DNA片段上依次表示出了EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ三种限制性内切酶的识别序列与切割位点，图(b)为某种表达载体的示意图(载体上的EcoR Ⅰ、Sau3A Ⅰ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被____________酶切后的产物连接，理由是____________。
(2)若某人利用图(b)所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图(c)所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有____________，不能表达的原因是_______________________________________________________。
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有_________和__________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是____________。
解析：(1)由图(a)可知，尽管BamH Ⅰ和Sau3A Ⅰ两种限制酶的识别位点不相同，但两种酶切割后产生的DNA片段具有相同的黏性末端，故被BamH Ⅰ酶切后得到的目的基因可以与图(b)中表达载体被Sau3A Ⅰ酶切后的产物连接。(2)运载体上的启动子和终止子具有调控目的基因表达的作用，由于甲和丙的目的基因分别插入在启动子的上游和终止子的下游，故这两个运载体上的目的基因都不能被转录和翻译。(3)常见的DNA连接酶是E·coli DNA连接酶和T4DNA连接酶，但作用有所差别，T4DNA连接酶既能连接黏性末端，又能连接平末端，而E·coli DNA连接酶只能连接黏性末端。
答案(1)Sau3A Ⅰ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录
(3)E·coli DNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
7．(2018·山东青岛二中高二段考)Ⅰ.右图a表示基因工程中经常选用的载体——pBR322质粒，Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因。目的基因如果插入某抗性基因中，将使该基因失活，而不再具有相应的抗性。为了检查载体是否导入原本没有Ampr和Tetr的大肠杆菌，将大肠杆菌培养在含氨苄青霉素的培养基上。得到如图b的结果(黑点表示菌落)。再将灭菌的绒布按到图b的培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布平移按到含四环素的培养基上培养，得到如图c的结果(空圈表示与b对照无菌落的位置)。据此分析并回答下列问题：
(1)pBR322质粒的基本组成单位是________。 该基因工程中，质粒上的Ampr、Tetr称为____________基因。
(2)与图c空圈相对应的图b中的菌落表现型可以推知，目的基因插入了____________中。
Ⅱ.下图是转基因烟草的培育过程，据图回答下列问题：
(3)据图分析可知，重组Ti质粒载体，至少应该具备________个限制酶切点。
(4)从外源目的基因的获取到转基因成功，整个过程至少需要断开________个磷酸二酯键，根据所学知识推知T－DNA 上需要自带________酶所识别的基因。
答案：(1)脱氧核糖核苷酸 标记 (2)Tetr (3)4 (4)12 限制性核酸内切(限制)
[课时作业]
一、选择题
1．(2018·沈阳高二检测)基因工程技术也称DNA重组技术，其实施必须具备的4个必要条件是( )
A．目的基因、限制酶、载体、受体细胞
B．工具酶、目的基因、载体、受体细胞
C．模板DNA、mRNA、质粒、受体细胞
D．重组DNA、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶
解析：选B。基因工程的基本工具是限制酶、DNA连接酶和载体，前两者统称为工具酶；在实际操作中，载体上插入目的基因形成重组载体，然后导入受体细胞。
2．下列获取目的基因的方法中需要用到模板链的是( )
①从基因文库中获取目的基因 ②利用PCR技术扩增目的基因 ③通过逆转录法获取目的基因 ④通过DNA合成仪利用化学方法直接人工合成目的基因
A．①②③④ B．①②③
C．②③④ D．②③
解析：选D。PCR技术利用的是DNA复制原理，将双链DNA之间的氢键打开，变成单链DNA，作为聚合反应的模板。逆转录法是以目的基因转录成的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，先逆转录形成互补的单链DNA，再合成双链DNA。①④均不需要模板。
3．在基因工程中，可依据受体细胞的类型及其生理特性来选择合适的载体，既能高效地携带目的基因进入受体细胞，又能方便地进行检测。已知有以下几类含有不同标记基因的质粒，不可作为侵入大肠杆菌的载体的是(已知青霉素可杀死细菌，四环素不能杀死大肠杆菌)( )
答案：B
4．(2018·郑州一中高二期中)我国上海研究所合成一种具有镇痛作用而又不会使病人上瘾的药物——脑啡呔多糖(类似人体中的糖蛋白)。如要采用基因工程和发酵技术让微生物来生产有生物活性的脑啡呔多糖，应选哪种微生物为受体细胞( )
A．大肠杆菌 B．大肠杆菌质粒
C．T4 噬菌体 D．酵母菌
答案：D
5．(2018·天津四十七中期中)如图为基因表达载体的模式图，下列有关说法错误的是( )
A．构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶
B．任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别
C．图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位
D．抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因
解析：选B。构建基因表达载体需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确。用不同种类的载体构建基因表达载体时处理方法是有差别的，B错误。启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，C正确。抗生素抗性基因的作用就是作为标记基因，用于检测受体细胞中是否导入了目的基因，D正确。
6．(2018·河北武邑中学高二期中)据图分析，下列有关基因工程的说法不正确的是( )
A．用限制酶Ⅰ、Ⅱ同时切割质粒(假设切割完全)，会获得3种长度的DNA片段
B．用限制酶Ⅰ、Ⅱ切割质粒和目的基因比只用限制酶Ⅰ更符合要求
C．与启动子结合的应该是RNA聚合酶
D．能够检测到标记基因表达产物的受体细胞中，不一定会有目的基因的表达产物
答案：A
7．利用外源基因在受体细胞中表达，可生产人类所需的产品。下列选项中能说明目的基因完成表达的是( )
A．棉花细胞中检测到载体上的标记基因
B．山羊乳腺细胞中检测到人生长激素基因
C．大肠杆菌中检测到人胰岛素基因的mRNA
D．酵母菌细胞中提取到人的干扰素
解析：选D。A、B、C三项都不能说明目的基因完成表达。人的干扰素基因导入酵母菌中，酵母菌合成了人的干扰素，说明目的基因表达成功。
8．(2018·河南郑州一中高二期中)下图为利用生物技术获得生物新品种的过程，下列有关说法错误的是( )
A．A→B过程中用到的原料有4种，加入的引物有2种
B．A→B过程利用了DNA复制原理，需要使用耐高温的DNA聚合酶
C．B→C为转基因绵羊的培育过程，常选用的受体细胞是卵母细胞
D．B→D为转基因植物的培育过程，其中④过程常用的方法是农杆菌转化法
答案：C
9．抗菌肽对治疗癌症有一定作用，如图表示抗菌肽的合成过程。下列相关说法正确的是( )
→→→→→
A．用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶
B．基因表达载体包含起始密码子和终止密码子
C．用显微注射法导入基因表达载体
D．筛选菌种时用基因探针检测相关蛋白质
解析：选A。PCR技术中采用高温变性使DNA解旋，因此用PCR技术克隆目的基因不需要DNA解旋酶，A正确；基因表达载体包含启动子和终止子，而起始密码子和终止密码子在mRNA上，B错误；将基因表达载体导入酵母菌细胞时应用感受态细胞法，C错误；筛选菌种时用基因探针检测相关基因或mRNA，不能用基因探针检测蛋白质，D错误。
10．(2018·吉林一中月考)如图表示科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金芽孢杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中与棉花的DNA分子结合起来而发挥作用的过程示意图。以下说法正确的是( )
A．图中Ⅰ是质粒，步骤①常需用到限制酶和DNA聚合酶
B．图中Ⅱ是含目的基因的重组Ti质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞
C．图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞
D．剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因会影响抗虫基因的表达
解析：选C。Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，常需用到限制酶和DNA连接酶，A错误；图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌细胞，B错误；图中步骤③是将目的基因导入植物细胞，C正确；基因的表达具有独立性，剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D错误。
二、非选择题
11．(2016·高考全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamH Ⅰ酶切后，与用BamH Ⅰ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_____________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__________________________；并且____________和______________的细胞也是不能区分的，其原因是__________________。在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有____________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自____________。
解析：(1)作为运载体的质粒上应有一个至多个限制酶切割位点，在细胞中能够自我复制，且含有特殊的标记基因。(2)未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌中均未导入质粒载体，而质粒上含有氨苄青霉素抗性基因，因此这样的大肠杆菌在含有氨苄青霉素的培养基中不能生长。含有质粒载体和含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，二者在含有氨苄青霉素的培养基中都能生长，因此无法区分二者。根据题图，用BamH Ⅰ切割质粒后将四环素抗性基因破坏，因此可将经氨苄青霉素培养基筛选出的菌落置于含有四环素的培养基上再次筛选，能在含四环素培养基上生存的是含有质粒载体的大肠杆菌，不能生存的是含有插入目的基因的重组质粒的大肠杆菌。(3)噬菌体为病毒，经改造后作为载体时，其DNA复制所需原料来自受体细胞。
答案：(1)能自我复制、具有标记基因 (2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或答含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素 (3)受体细胞
12．研究表明，油菜中蛋白质与油脂均由丙酮酸转化而来，丙酮酸羧化酶(PEP)能催化丙酮酸合成蛋白质。下表中甲株为正常油菜，乙、丙和丁株为转反义PEP基因的油菜。请回答：
组别
油脂含量(%)
蛋白质含量(%)
甲
40.02
24.12
乙
49.42
22.24
丙
48.69
22.50
丁
47.60
22.52
(1)利用PCR获取PEP基因时，根据PEP基因上游及下游的碱基序列，设计并人工合成____________，PCR的原料是____________。
(2)在构建PEP基因表达载体时，如果将PEP基因反向连接在____________和终止子之间，可构成反义PEP基因表达载体。若PEP基因在转录时，两条单链(a链、b链)中的a链为模板链，则反义PEP基因在转录时的模板链为____________。
(3)在检测反义PEP基因是否整合到油菜细胞的染色体DNA上时，拟用PEP基因做探针是否可行？请说明理由。__________________________________________________。
(4)分析上表数据，乙、丙和丁三株油菜细胞中与蛋白质合成相关的基因有________________________________________________________________________，
反义PEP基因提高油脂含量的原理是_______________________________________。
乙、丙和丁三株油菜的产油量差异较大，仅从反义PEP基因转化的角度考虑，可能的原因是_________________________________________________________________________。
答案：(1) 引物 dNTP(脱氧核苷三磷酸) (2)启动子 b链 (3)不行，PEP基因及反义PEP基因均能与PEP基因探针杂交，出现杂交带 (4)PEP基因、反义PEP基因 反义PEP基因通过抑制蛋白质的合成促进了油脂的合成 反义PEP基因插入染色体DNA的位置及数目不同
13．(2018·新疆四中高二期末)下图是从酵母菌中获取某植物需要的控制某种酶合成的基因的流程，结合所学知识及相关信息回答下列问题：
(1)图中cDNA文库________(填“大于”“小于”或“等于”)基因组文库。
(2)①过程提取的DNA需要________________的切割，B过程是________________。
(3)为在短时间内大量获得目的基因，可用________________________扩增的方法，其原理是____________________________________________________________________。
(4)目的基因获取之后，需要进行________________。
(5)将该目的基因导入某双子叶植物细胞，常采用的方法是__________________，其能否在此植物体内稳定遗传的关键是________________，可以用__________________技术进行检测。
答案：(1)小于 (2)限制酶 逆转录 (3)PCR技术 DNA复制 (4)基因表达载体的构建 (5)农杆菌转化法 目的基因是否整合到植物细胞的染色体上 DNA分子杂交
14．(2018·广东中山高二期末)如图1表示我国自主研发的转基因抗虫水稻“华恢1号”的主要培育流程，请据图回答：
图1
图2
(1)杀虫基因通过①～④，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做________；其中____(填标号)是转基因抗虫水稻的核心步骤，需要的工具酶是_____________、__________。
(2)“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有_____________、____________。
(3)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有T-DNA，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中________________上。
(4)图2是天然土壤农杆菌Ti质粒结构示意图(部分基因及部分限制酶作用位点)，组建理想的载体需要对天然的质粒进行改造，据图分析：
①人工改造质粒时，要使抗虫基因表达，还应插入_______，其作用是___________。
②人工改造质粒时，先用限制酶Ⅰ处理，可以去除质粒上的________基因和________基因(填上图质粒上的基因名称)，保证重组质粒进入水稻细胞后不会促进细胞的分裂和生长；然后再用限制酶Ⅱ分别切割经过改造的理想质粒和带有抗虫基因的DNA分子，并构成重组Ti质粒，那么成功导入抗虫基因的水稻胚细胞将不能在含________(填抗生素名称)的培养基上生长。
解析：(1)杀虫基因通过①～④，最终在宿主细胞内维持稳定和表达的过程叫做转化；其中①过程表示基因表达载体的构建，这是转基因抗虫水稻的核心步骤，需要的工具酶是限制性核酸内切酶(限制酶)、DNA连接酶。(2)分析图解可知，“华恢1号”的培育过程应用的主要生物技术有基因工程技术(转基因技术)、植物组织培养技术。(3)构建重组质粒时，常用Ti质粒作为载体，是因为Ti质粒上具有T-DNA，它能把目的基因整合到受体细胞(植株细胞)中染色体的DNA上。(4)①启动子是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。②图中看出，tms基因能够编码吲哚乙酸，tmr基因能够编码细胞分裂素，这两种激素能够促进植物的生长。因此人工改造时用限制酶Ⅰ处理，其目的之一是除去或破坏质粒上的tmr、tms，保证T-DNA进入水稻细胞后不会引起细胞的无限分裂和生长；另外只有一个插入位点，也有利于目的基因(或外源DNA)准确插入。
答案：(1)转化 ① 限制性核酸内切酶(限制酶) DNA连接酶 (2)基因工程技术(转基因技术) 植物组织培养技术 (3)染色体的DNA (4)①启动子
为RNA聚合酶提供识别和结合的部位，驱动转录
②tms tmr 四环素
课件58张PPT。专题1 基因工程专题1 基因工程编码蛋白质受体菌的群体基因在染色体上的位置所有的一部分特定DNA片段DNA双链复制DNA解链引物热稳定DNA聚合酶化学方法受体细胞遗传表达启动子终止子标记基因目的基因维持稳定和表达农杆菌转化花粉管通道Ca2＋显微注射法受精卵感受态细胞重组表达载体DNA分子DNA分子杂交分子杂交抗原—抗体部分基因文库基因组文库扩增人工合成解旋酶高温细胞内细胞外解旋酶耐热的DNA聚合酶温和启动子终止子标记基因启动子终止子标记基因同一种限制酶DNA连接酶Ti质粒的T-DNACa2＋感受态植物组织培养目的基因维持和表达目的基因非目的基因DNA分子杂交标记了放射性同目的基因染色体DNA分子杂交标记的目的基因mRNA位素的目的基因片段个体生物学水平让害虫吞食棉叶害虫死亡
