专题十一 生物技术实践
[A卷·基础达标练]
1．下列关于大肠杆菌培养的叙述，错误的是( )
A．在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑pH、温度和渗透压等条件
B．若对大肠杆菌活菌进行计数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品的稀释度合适
C．在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行消毒
D．使用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃
解析：选C 微生物培养条件有营养、pH、温度、渗透压等；为计数活菌数，要多次实验求平均值、操作要严格，还要保证样品的稀释度合适，便于检测；为防止杂菌污染，对培养基和培养皿要进行灭菌；为防止对环境的污染，用过的培养基及其培养物必须经过灭菌处理后才能丢弃。
2．尿素是尿素分解菌的氮源，因此在配制培养基时( )
A．葡萄糖在培养基中含量越多越好
B．尿素在培养基中含量越少越好
C．尿素分解菌有固氮能力，故培养基中的尿素为无机氮
D．尿素分解菌无固氮能力，故培养基中的尿素为有机氮
解析：选D 尿素既可以作为尿素分解菌的氮源，也可以作为其碳源，葡萄糖在培养基中并不是越多越好，葡萄糖过多会使培养基的渗透压过高，影响尿素分解菌的繁殖；添加尿素的目的是筛选尿素分解菌，其他微生物不能很好地生活在该培养基上，尿素在培养基中不是越少越好，过少就失去了选择作用，过多又会使细胞失水死亡；尿素分解菌没有固氮能力，故培养基中需要添加尿素为氮源，尿素属有机氮源。
3．下列有关微生物培养的叙述，错误的是( )
A．获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
B．单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法
C．培养基都必须使用高压蒸汽灭菌法灭菌
D．倒置平板以防止培养皿盖上的冷凝水滴入培养基造成污染
解析：选C 微生物培养中获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染；通常可以采用涂布分离法或划线分离法进行单菌落的分离，以消除污染的杂菌；培养基通常可以进行高压蒸汽灭菌，但对于培养基中有遇高温易分解的成分，就不能用此方法，如培养基中的尿素等物质；划线接种结束后需要将培养皿倒置，以防止蒸发冷凝成的水滴入培养基而造成污染。
4．在做土壤中分解尿素的细菌的分离与计数实验时，甲组实验用以尿素为唯一氮源的培养基，乙组实验用氮源除尿素外还含硝酸盐的培养基，其他成分都相同，在相同条件下操作、培养与观察，则乙组实验属于( )
A．空白对照 B．标准对照
C．相互对照 D．条件对照
解析：选D 乙组和甲组实验的培养条件不同，形成了条件对照。
5．下列有关果胶酶及其实验探究的叙述，正确的是( )
A．探究果胶酶的用量时，pH、温度不影响实验结果
B．果胶酶包括多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和葡萄糖异构酶等
C．探究温度对果胶酶活性的影响时，温度、苹果泥、果胶酶的用量及反应时间等都是自变量
D．可以用相同时间内过滤得到的果汁体积来确定果胶酶的用量
解析：选D 探究果胶酶的用量时，pH、温度均会影响实验结果；葡萄糖异构酶不属于果胶酶；探究温度对果胶酶活性的影响实验中，温度为单一变量，其他因素保持不变。
6．下列关于固定化酶的说法，错误的是( )
A．固定化酶的不足之处是不能催化一系列反应
B．固定化酶可再次利用，降低了生产成本
C．固定后的酶既能与反应物接触，又能与产物分离
D．固定化酶易溶于水
解析：选D 由于酶具有专一性，因此固定化酶不能催化一系列反应；固定化酶可反复利用，降低了生产成本；固定后的酶既能与反应物接触，又能与产物分离；固定化酶不易溶于水，易与产物分离。
7．关于探究果胶酶最适用量的实验，下列叙述错误的是( )
A．各组需加入等量不同浓度的果胶酶溶液
B．要保证各组适宜并相同的pH和温度等条件
C．需要检测不同反应时间条件下的生成物量
D．几组实验之间可形成相互对照，不需单设空白对照
解析：选C 探究果胶酶最适用量的实验，自变量是果胶酶浓度，所以各组需加入等量不同浓度的果胶酶溶液；实验设置时，除自变量不同之外，其他无关变量应相同且适宜；需要检测相同反应时间条件下的生成物量；几组实验之间可形成相互对照，不需单设空白对照。
8．在用果胶酶处理苹果泥时，为了使果胶酶能够充分地催化反应，应采取的措施是( )
A．加大苹果泥用量
B．加大果胶酶用量
C．进一步提高温度
D．用玻璃棒不时地搅拌反应混合物
解析：选D 在用果胶酶处理苹果泥时，若让果胶酶充分地催化反应，则需扩大果胶酶和苹果泥的接触面积，尽量使果胶酶和苹果泥充分接触，因此可用玻璃棒不时地搅拌反应混合物。对苹果泥用量、酶用量及反应所需的温度和pH的调整，在一定范围内只能加快反应速度，而不能使果胶酶充分地催化反应。
9．下列不属于酶的固定方式的是( )
A．将酶包埋在细微网格中
B．将酶相互连接起来
C．将酶吸附在载体表面
D．将酶加上糖衣做成胶囊
解析：选D 将酶包埋在细微网格中属于酶固定方式中的包埋法；将酶相互连接起来属于酶固定方式中的共价偶联法或交联法；将酶吸附在载体表面属于酶固定方式中的吸附法；将酶加上糖衣是为了防止胃液里的胃蛋白酶分解酶制剂，不属于酶的固定方法。
10．下列关于植物组织培养中植物激素使用的说法，错误的是( )
A．植物组织培养中的关键性激素是生长素和细胞分裂素
B．先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂和分化
C．先使用细胞分裂素，后使用生长素，细胞既分裂又分化
D．同时使用生长素和细胞分裂素时，两者摩尔浓度的比例影响植物细胞的发育方向
解析：选B 用于植物组织培养的培养基中除营养成分外，还需添加植物激素，一般包括生长素和细胞分裂素；外植体脱分化、再分化的诱导方向取决于二者的比例。先使用生长素，后使用细胞分裂素，有利于细胞分裂，但细胞不分化；先使用细胞分裂素，后使用生长素，对细胞的分裂和分化均有利。
11．下列有关平板划线操作的叙述，正确的是( )
A．灼烧接种环后，为避免其他杂菌的干扰，应立即伸入菌液取菌种
B．划线结束后，为避免实验菌污染环境和感染操作者，必须再次灼烧接种环
C．在第一次划线前灼烧接种环和每次划线前灼烧接种环的目的相同
D．划线时最后一区域一定要与第一区域相连，达到首尾相接
解析：选B 灼烧接种环后要冷却，方能取菌种，以避免温度太高杀死菌种；第一次划线前灼烧接种环是为了杀死其他杂菌，保证实验菌的纯净，每次划线前灼烧接种环的目的是杀死残留在接种环上的实验菌；划线时最后一区域与第一区域不能相连。
12．下列与泡菜中亚硝酸盐含量测定相关的叙述，错误的是( )
A．测定用的对氨基苯磺酸溶液和N-1-萘基乙二胺溶液均需装入棕色瓶中并放于冰箱保存
B．测定用的显色剂其实是已配制好的对氨基苯磺酸溶液和N-1-萘基乙二胺溶液的等体积混合液
C．测定时所用的每毫升亚硝酸钠标准溶液相当于5.0 μg亚硝酸钠
D．绘制标准曲线时应以亚硝酸钠质量为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制
解析：选A 对氨基苯磺酸溶液应用棕色瓶室温保存，N-1-萘基乙二胺溶液应装入棕色瓶中放入冰箱保存。
13．下列关于分离以尿素为氮源的微生物的实验操作，错误的是( )
A．将土壤样品用无菌水进行一系列的梯度稀释
B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
C．对尿素固体培养基的灭菌应采用121 ℃(500 g/cm2压力)的高压蒸汽灭菌法
D．若要检测培养基是否被污染，可将未接种的培养基在相同条件下进行培养
解析：选C 将土壤样品用无菌水进行一系列的梯度稀释，便于统计样品中活菌的数目；同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板，这样求得的平均值更接近真实值；尿素遇高温会分解，因此不能采用高压蒸汽灭菌法灭菌，应用G6玻璃砂漏斗进行过滤；生物实验的原则之一是对照实验，将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照，排除非测试因素对实验的影响，可使结论更有说服力。
[B卷·强化提能练]
1．(2018·绍兴市适应性考试)为了从土壤中分离以尿素为氮源的微生物，某小组做了相关实验，其基本流程如下，请据图回答下列问题：
(1)实验流程中，物质甲是________。为了体现尿素培养基的分离效果，需设置对照组，对照组的培养基是________________，该培养基常用的灭菌方法是____________。
(2)下表中有四种培养基，为了分离出以尿素为氮源的微生物，应采用的培养基是____。(填编号)
培养基
蛋白胨
葡萄糖
NaCl
K2HPO4
酚红
琼脂糖
琼脂
水
尿素
A
－
＋
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
B
－
＋
＋
＋
＋
＋
－
＋
－
C
＋
－
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
D
－
＋
＋
＋
＋
－
＋
＋
＋
注：“＋”表示加入，“－”表示不加。
(3)制备菌液时，步骤乙的操作是________。
A．灭菌 B．稀释 C．过滤 D．扩大培养
(4)为了统计每克土壤样品中以尿素为氮源的微生物的数目，接种时宜采用________________法。将相同浓度的土壤稀释液分别接种在实验组和对照组培养基上，在______ ℃的恒温培养箱中培养24～48 h，观察比较菌落数，发现对照组培养基中菌落的数目比实验组________。
解析：(1)为了从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物，需要用无菌水制备土壤浸出液，为了体现尿素培养基的效果，需设置对照组，对照组的培养基为LB全营养固体培养基，以观察全营养培养基上生长细菌的菌落数。LB全营养培养基可以用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。(2)为了分离出以尿素为氮源的微生物，应用以尿素为唯一氮源并添加酚红指示剂的培养基，同时培养基中要加入葡萄糖提供碳源，用琼脂糖作为凝固剂。(3)为了获得单菌落，需要对土壤浸出液进行适度稀释。浓度太大，不能形成单菌落。(4)用于微生物计数时，接种方法可以采用涂布分离法，大多数细菌生长的温度是37 ℃左右。将相同浓度的土壤稀释液分别接种在实验组和对照组培养基上，在37 ℃的恒温培养箱中培养24～48 h发现对照组培养基中菌落的数目比实验组多。
答案：(1)无菌水 LB(全营养)固体培养基 高压蒸汽灭菌 (2)A (3)B (4)涂布分离 37 多
2．生活饮用水的微生物安全性日常检测是很重要的。请回答下列问题：
(1)培养大肠杆菌所用的LB培养基一般用__________法灭菌。检验大肠杆菌的含量时，通常将水样用________进行一系列的梯度稀释。
(2)将稀释后的水样分别用玻璃刮刀________到LB固体培养基，________于恒温培养箱，在__________ ℃条件进行培养。用该方法统计样本菌落数时________(填“需要”或“不需要”)设置对照组。
(3)如图表示培养和纯化大肠杆菌的部分操作步骤，下列相关叙述正确的是________。
A．步骤①倒平板操作时，倒好后应立即将其倒过来放置
B．步骤②将接种环在火焰上灼烧后迅速蘸取菌液划线
C．步骤③向多个方向划线，使接种物逐步稀释，培养后出现单个菌落
D．步骤④恒温培养箱培养后可用来对大肠杆菌进行计数
解析：(1)培养大肠杆菌所用的LB培养基一般用高压蒸汽灭菌法灭菌。检验大肠杆菌的含量时，通常将水样用无菌水进行一系列的梯度稀释。(2)将稀释后的水样用玻璃刮刀涂布到LB固体培养基，倒置于恒温培养箱，在37 ℃条件进行培养。用该方法统计样本菌落数时需要设置对照组。(3)培养和纯化大肠杆菌时尽可能使大肠杆菌细胞分散成单个，培养出单个菌落。步骤①倒平板操作时，应将平板冷却凝固5～10 min后再倒过来放置；步骤②接种环在火焰上灼烧后应冷却，再蘸取菌液划线；步骤③向多个方向划线，使接种物逐步稀释，培养后出现单个菌落；划线分离法经过步骤④恒温培养箱培养后不能对大肠杆菌进行计数，涂布分离法可用于菌落的计数。
答案：(1)高压蒸汽灭菌 无菌水 (2)涂布 倒置 37 需要 (3)C
3.如图是固定化酶反应柱，请回答下列问题：
(1)将α-淀粉酶溶于水中，再加入石英砂，不时搅拌，这样α-淀粉酶就可以固定在石英砂上。这种固定化的方法称为__________________。30 min后，装入如图所示的反应器中，构成固定化酶反应柱，并用10倍体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
洗涤时，蒸馏水流速__________(填“能”或“不能”)过快。
(2)实验时，将此反应柱固定在支架上，用滴管滴加可溶性淀粉溶液，并以0.3 mL/min的流速过柱，控制流速的目的是________________________________________________________________________
________________________。在流出5 mL淀粉溶液后接收0.5 mL流出液，加入1～2滴________________，观察颜色。为了使观察到的颜色变化明显，可__________后再观察。如果溶液呈红色，说明淀粉水解成为________。
(3)实验后，用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此反应柱，洗涤的目的是________________________________________________________________________。
洗涤后，放置在4 ℃冰箱中保存。几天后，可重复使用。
(4)一段时间后，某同学从冰箱中取出此反应柱，重复上述实验，却没有了相同的结果，试分析可能的原因。__________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：(1)固定化酶的制作方法有吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法，本题所用方法为吸附法。洗涤是除去未吸附的游离的酶，在洗涤时流速不能过快，为1 mL/min。(2)以相对较慢的流速使淀粉溶液流过反应柱，可以让吸附着的酶与底物充分反应。根据KI-I2溶液与淀粉反应呈蓝色，与糊精反应呈红色的原理来鉴定反应情况。(3)实验完成后还需要对反应柱进行洗涤，以除去未参与反应的反应物及生成的产物，以便重复使用。(4)一段时间后重复使用得不到相同的结果，应是酶出了问题，可能这些酶已经失活，或再次操作时相应的反应条件(如温度)不适合等。
答案：(1)吸附法 除去未吸附的游离α-淀粉酶 不能
(2)使淀粉溶液与α-淀粉酶充分接触充分反应 KI-I2溶液 稀释 糊精 (3)洗去残留的反应物和产物
(4)从酶的活性、酶的数量、反应条件等方面分析，合理答案均可
4．微生物与人类的生活有着密切的联系。请回答下列有关问题：
(1)在果醋、泡菜和果酒的制作过程中，均利用相应微生物的代谢特点进行条件控制，其中始终需要提供氧气的是________的制作；在杨梅酒的制备过程中，为了提高杨梅的出汁率，在压榨前可加入一定浓度的纤维素酶和果胶酶，其中果胶酶可来自________等微生物；泡菜腌制过程中________和乳酸菌等主要微生物利用菜中的糖和其他营养物质进行发酵。
(2)根据微生物的特点，可以利用相应的培养基进行分离或培养，例如用仅以尿素为氮源培养基可分离能产生________酶的微生物，在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，其中尿素用________________灭菌，经培养后菌落周围会出现________色环带。
(3)与LB全营养培养基中的菌落相比，以尿素为氮源的培养基中的菌落数________。
A．多 B．少 C．相等 D．几乎为零
(4)利用固体培养基可以进行微生物培养和植物组织培养，两者的培养基明显不同的是后者________。
A．需要添加琼脂 B．需要添加有机物
C．需要添加激素 D．需要灭菌处理
解析：(1)由于醋杆菌是需氧型生物，因此其中始终需要提供氧气的是果醋的制作；果胶酶可来自黑曲霉、苹果青霉等微生物；泡菜腌制过程中利用的微生物主要是假丝酵母和乳酸菌等。(2)用仅以尿素为氮源培养基可分离能产生脲酶的微生物，在配制培养基时，要加入尿素和酚红指示剂，其中尿素用G6玻璃砂漏斗灭菌，经培养后菌落周围会出现红色环带。(3)以尿素为氮源的培养基中菌落数少，因为不能分解尿素的微生物不能在该环境中生存。(4)利用固体培养基可以进行微生物培养和植物组织培养，但后者需要添加植物激素。
答案：(1)果醋 黑曲霉(或苹果青霉) 假丝酵母
(2)脲 G6玻璃砂漏斗过滤 红 (3)B (4)C
5．回答下列(一)、(二)小题：
(一)请回答下列有关微生物培养、发酵过程中的相关问题：
(1)在“分离以尿素为氮源的微生物”的实验中，配制好的尿素固体培养基加上封口膜后用____________________法灭菌，冷却后加入用G6玻璃砂漏斗过滤的尿素溶液。
(2)在“果汁中的果胶和果胶酶”实验中，可以用______(A.50%乙醇 B．70%乙醇 C．90%乙醇 D．95%乙醇)鉴别果胶。果胶酶可以从黑曲霉或______中提取。
(3)在“用果汁制作果酒”实验中，为了增加果酒的含糖量，可以在发酵瓶中加入一定量的________。
(二)如图中的①②③代表通过植物组织培养技术培育新植株的三条途径，请回答：
(1)外植体a、b、c来自同种植株，植株A、B、C中的细胞，全能性表达程度________(填“相同”或“可能不同”)。
(2)途径②和③需要用到____________和____________(填培养基的物理性质)两种培养基。将含B1的试管放在摇床上，通过____________培养可以分散成单细胞。
(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的________(A.甘露醇 B．盐酸 C．蒸馏水 D．氯化钠)以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着______________________技术又向前迈进了一步。
(4)通过大量培养特定细胞系，可以实现能产生重要________________(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。
解析：(一)(1)由于尿素受热易分解，因此应将用G6玻璃砂漏斗过滤的尿素溶液加入经高压蒸汽灭菌冷却后的培养基中。(2)果胶不溶于95%的乙醇，据此可鉴定果胶，果胶酶可从黑曲霉和苹果青霉中提取。(3)在果汁中加入一定量的蔗糖，可提高果酒的含糖量。
(二)(1)外植体a、b、c来自同种植株，由于不同细胞的分化程度不同，因此植株A、B、C中的细胞全能性表达程度可能不同。(2)途径②中用到摇床，因此需要用液体培养基，而途径③需要用到固体(或半固体)培养基。将含B1的试管放在摇床上，通过液体悬浮培养可以分散成单细胞。(3)外植体c脱去细胞壁过程中需要加入适宜浓度的甘露醇以保持一定的渗透压。原生质体培养成功标志着植物细胞工程技术又向前迈进了一步。(4)通过大量培养特定细胞系，可以实现能产生重要次生代谢产物(如某些中药)的细胞的大量克隆和产物的工业化生产。
答案：(一)(1)高压蒸汽灭菌 (2)D 苹果青霉 (3)蔗糖
(二)(1)可能不同 (2)液体培养基 固体(或半固体)培养基 液体悬浮 (3)A 植物细胞工程 (4)次生代谢产物
6．下面是有关食醋和泡菜制作的实验，请回答：
(1)若以大米为原料经三步发酵可以制作食醋：
第一步：大米经蒸熟、冷却后加入淀粉酶，将原料中的淀粉水解成________(填中间产物)，然后进一步水解成葡萄糖，这一过程可用________(填淀粉指示剂)来检测，因为该试剂遇淀粉呈蓝色，遇上述中间产物呈红色。
第二步：用酵母菌将葡萄糖转化成乙醇，这一发酵过程中，玻璃发酵瓶不应完全密闭的主要原因是_______________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
第三步：用________菌将乙醇转化成乙酸，这一过程________(填“是”或“否”)需要氧气。
(2)若以葡萄为原料，将葡萄榨成汁后装入相应的发酵瓶中，在温度等适宜的条件下进行酒精发酵，如图所示。则图中实验操作的错误之处是________________________。
(3)借助显微镜对酵母菌进行计数，下列会影响计数准确性的操作是( )
A．压在方格线上的细胞只计左线和上线上的酵母菌数
B．用滴管取1滴培养液到血细胞计数板的方格区，盖上盖玻片，进行计数
C．如果酵母菌有芽体，因没有分离成两个子体，要以一个计数
D．方格内酵母菌总数量应不少于300个
(4)根据微生物的特点，下列有关控制微生物的发酵条件的各项内容都正确的是( )
A
B
C
食品
果酒
果醋
泡菜
主要
微生物
酵母菌
醋化醋杆菌
(醋杆菌)
醋杆菌
制作
装置
或
操作
步骤
解析：(1)淀粉在淀粉酶的作用下水解成糊精，糊精用KI-I2溶液检测呈红色。酒精发酵过程中会产生大量CO2，使瓶内压力升高，若完全密闭，则可能引起爆裂。醋化醋杆菌是一个需氧菌，发酵过程需要提供氧气。(2)观察该图，若以葡萄为原料，将葡萄榨成汁后装入相应的发酵瓶中，在温度等适宜的条件下进行酒精发酵，酒精发酵是厌氧发酵，需要夹住进气管酵母菌才能进行厌氧呼吸。(3)借助显微镜对酵母菌进行计数，对压在方格线上的细胞计数原则是“记上不记下，记左不计右”。如果酵母菌有芽体，若芽体体积超过二分之一，则要单独计数，方格内酵母菌总数量应不少于300个，太少则误差太大。(4)观察图示，A项错在酵母菌的发酵是厌氧发酵，排气管有误；C项泡菜的菌种不是醋杆菌，而是乳酸菌和假丝酵母。
答案：(1)糊精 KI-I2溶液 发酵过程中会产生大量CO2，使瓶内压力升高，若完全密闭，则可能引起爆裂 (醋化)醋杆 是 (2)未夹住发酵瓶的进气管 (3)C (4)B
7．某现代农业基地利用组织培养技术大量生产蓝莓，并将部分蓝莓进行培育和深加工。
(1)从自然生长的蓝莓上获得的幼芽在过程①中一般利用______________、________________进行消毒处理，经过无菌分割后，将组织块接种在A培养基中，以促进组织块的__________和____________。幼苗在C培养基中主要是通过控制________，进行锻炼。
(2)在幼苗培养过程中，B培养基的主要成分是________。
A．MS培养基
B．MS培养基＋蔗糖
C．MS培养基＋NAA＋蔗糖
D．MS培养基＋BA＋NAA＋蔗糖
(3)为提高蓝莓汁的品质和出汁率，可以在过程②中用________处理。
(4)与直接利用蓝莓匀浆相比，利用蓝莓汁生产产品2时添加了较多量的蔗糖，则产品2具有________________特点。
(5)在发酵罐甲、乙的发酵初期，均能从D和E处通入清洁的无菌空气。下列不属于该项操作目的的是________。
A．促进菌种大量繁殖
B．促进发酵液和菌体混合
C．抑制部分杂菌的繁殖
D．促进菌体产生相应产品
解析：(1)从自然生长的蓝莓上获得的幼芽即外植体，外植体在接种前的消毒剂是70%的乙醇和5%的次氯酸钠溶液。幼芽在生芽培养基上先脱分化，然后形成芽的顶端分生组织，最后形成丛壮苗。丛壮苗在生根培养基上长出幼根后就进行锻炼，锻炼的过程是通过不断降低湿度来完成的。(2)据图示可知B培养基是生根培养基，其成分应该是MS培养基、NAA、蔗糖。(3)榨取蓝莓汁的过程中，通过添加果胶酶来提高出汁率和澄清度，即提高果汁的品质。(4)与直接利用蓝莓匀浆相比，利用蓝莓汁生产产品2时添加了较多量的蔗糖，蔗糖的作用除了能提高果酒的含糖量外，还为酵母菌的厌氧呼吸提供了底物，能加大厌氧呼吸强度，提高果酒的酒精含量。(5)由图示可知，发酵罐甲是果酒发酵装置，发酵罐乙内进行果醋发酵。在发酵初期D和E处通入清洁的无菌空气，能促进菌种的大量繁殖；发酵液底部通入气体，能加速发酵液的对流，促进发酵液和菌体混合；通入无菌空气，增加了发酵液的氧气浓度，能抑制厌氧菌的生长；通入氧气对发酵罐甲内菌体(酵母菌)产生相应产品(酒精)是不利的。
答案：(1)70%乙醇 5%次氯酸钠 脱分化 芽的分化 湿度 (2)C (3)果胶酶 (4)酒精和糖含量高 (5)D
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“课下检测·双级提能”见“专题(十一)”
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专题十一生物技术实践
一、学前自检——对应考纲查缺漏
1．微生物的利用
(1)常见的灭菌方法及适用对象是什么？
(2)划线分离法和涂布分离法各有什么优点和不足？如何进行涂布分离操作？
(3)分离以尿素为氮源的微生物的原理是什么？
2．酶的应用
(1)果胶酶在果汁制取中的作用是什么？
(2)如何进行α-淀粉酶的固定化？如何检测其对淀粉的水解情况？
3．生物技术在食品加工中的应用
(1)果酒和果醋制作中起作用的微生物有哪些？发酵原理是什么？如何控制发酵条件？
(2)泡菜腌制中起作用的微生物有哪些？如何对泡菜中的亚硝酸盐进行定量测定？
4．浅尝现代生物技术
如何调控生根、发芽培养基中激素配比以诱导分化？菊花的组培基本程序如何？
二、构建体系——依据网络串知识
三、澄清误区——突破迷点强认知
判断下列叙述的正误
(1)消毒的原则是既能杀死材料表面的微生物，又要减少消毒剂对细胞的伤害(√)
(2)利用划线分离法分离菌种时每一次划线后都要将接种环灼烧(√)
(3)划线分离时除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端(×)
(4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(√)
(5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(×)
(6)制取果汁时，先用果胶酶将果胶水解成半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯等物质，再用果胶甲酯酶处理，可得到比较澄清的果汁(√)
(7)果胶起着将植物细胞粘合在一起的作用，它溶于乙醇(×)
(8)用固定化α-淀粉酶进行淀粉水解实验时不需考虑温度(×)
(9)醋化醋杆菌在无氧条件下能利用乙醇产生醋酸(×)
(10)常用光电比色法测定泡菜中亚硝酸盐含量(√)
(11)腌制泡菜时，间隔一段时间应将坛盖打开，放出CO2(×)
(12)培育草莓脱毒苗所采用的主要技术是植物组织培养(√)
(13)脱分化过程不需要植物激素，植物激素只有在再分化过程中发挥作用(×)
(14)发芽培养基中生长素的浓度大于细胞分裂素的浓度(×)
(15)由于植物细胞都具有全能性，所以菊花的组织培养实验中选材不会影响实验的结果(×)
考点一微生物的利用和酶的应用
一、微生物的培养与利用
(一)培养基的配制和微生物的培养、分离
1．培养基的配制
(1)计算→称量→溶化→调pH→灭菌(→倒平板)
(2)配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项
①倒平板的适宜温度是℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。
②平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
2．划线分离法和涂布分离法的比较
方法
划线分离法
涂布分离法
特点
操作简单，但单菌落不易分离
操作复杂，但单菌落容易分离
工具
接种环
玻璃刮刀
原理
在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，在数次划线培养后，可以分离到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的单菌落
将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面进行培养，在稀释度足够高时菌液里聚集在一起的菌种被分散成单个细菌，从而能在培养基上形成单个菌落
目的
使培养基上形成由单个细菌细胞繁殖而来的子细胞群体——菌落(属生态上的种群)
[特别提醒] 细菌的扩大培养用LB液体培养基，划线分离用LB固体平面培养基。
(二)无菌操作
几种消毒和灭菌方法及其适用范围
类型
适用范围
操作方法
消毒
方法
煮沸消毒法
日常生活
100 ℃煮沸5～6 min
巴氏消毒法
不耐高温的液体
70～75 ℃煮30 min或80 ℃煮15 min
化学药剂
生物活体、水源等
擦拭(如用酒精擦拭双手)，用氯气消毒水源等
紫外线
房间、仪器设备
紫外线照射30 min
灭菌
方法
灼烧灭菌
接种工具、接种时用的试管口或瓶口等
直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧
干热灭菌
耐高温、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿和金属用具
物品放入干热灭菌箱内，160～170 ℃加热1～2 h
高压蒸汽灭菌
培养基、培养皿等，生产和实验室常用
高压蒸汽灭菌锅内，100 kPa，温度121 ℃，15～30 min
(三)大肠杆菌的培养和分离实验
1．实验内容
将大肠杆菌扩大培养和划线分离，即用LB液体培养基扩大培养大肠杆菌，培养后再在LB固体平面培养基上划线进行分离，随后培养基上就会形成一个个单独的菌落。
2．实验步骤
50 mL LB液体培养基和50 mL LB固体培养基及培养皿高压蒸汽灭菌
将培养基分别倒入4个灭菌后的培养皿中，水平放置，使之形成平面
在装有液体培养基的三角瓶中接种大肠杆菌，培养12 h
用接种环在接种有大肠杆菌的三角瓶中蘸菌液一次，在固体培养基的平板上连续划线，盖好培养皿
培养皿倒置(盖在下面)，放在℃恒温培养箱中培养12～24 h后，可看到划线的末端出现不连续的单个菌落
3.大肠杆菌分离的用途
单菌落的分离是消除污染杂菌的通用方法，也是用于筛选高表达量菌株的最简便方法之一。
(四)分离以尿素为氮源的微生物
1．菌种特点：含有脲酶，可以通过降解尿素作为其生长的氮源。
2．培养基：用以尿素为唯一氮源的培养基培养，以LB全营养培养基为对照。
3．实验原理
(1)筛选以尿素为氮源的微生物，可使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养选择。
(2)细菌合成的脲酶能将尿素分解成NH3，导致pH升高，使酚红指示剂变红。
4．实验步骤
5．反应的鉴定
在配制培养基时，加入指示剂酚红，培养时细菌将尿素分解产生碱性的氨，使培养基上菌落周围出现红色环带。
6．实验分析
(1)培养基中的酸碱指示剂产生颜色变化(变红)，标志着存在尿素分解菌分解尿素的现象，从而证明这一菌株能以尿素为氮源。红色环状区域的大小代表脲酶活性的强弱和含量的多少。红色区域越大，表明菌株利用尿素的能力越强。
(2)与全营养培养基上的菌落数比较，尿素培养基上只有少数菌落，这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占极少部分。
(3)本实验中配制固体培养基时应选用琼脂糖而不能选用琼脂作凝固剂。这是由于琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。
(4)由于尿素在高温下会分解，所以对尿素溶液的灭菌要采用G6玻璃砂漏斗过滤的方法。并且应在基本培养基经高压蒸汽灭菌后，冷却至60 ℃时再加入。
(5)土样应从有哺乳动物排泄物的地方取得，这是由于动物排泄物中有一定量的尿素，在这些土壤中一般含有较多的分解尿素的细菌。
(五)常见微生物在生物技术实践中的应用
菌种类型
原理
制作果汁
黑曲霉、苹果青霉等
不溶于水的果胶在果胶酶的作用下形成溶于水的产物，提高果肉的出汁率和果汁的澄清度
制作果酒
酵母菌
C6H12O6―→2C2H5OH＋2CO2
制作果醋
醋化醋杆菌
C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O
制作泡菜
假丝酵母、乳酸菌
糖→有机酸、醇
二、酶的应用
(一)果汁中的果胶和果胶酶
1．果胶
(1)果胶是植物细胞壁的主要成分，它由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成。
(2)果胶对果汁加工的影响：果胶不仅影响出汁率，还会使果汁浑浊。
2．果胶酶
(1)来源：黑曲霉、苹果青霉等。
(2)组成：果胶酶并不是特指某一种酶，而是分解果胶的一类酶的总称，主要包括果胶酶和果胶甲酯酶。
(3)作用：将果胶水解成可溶性的分子，使出汁率提高，也使浑浊的果汁变得澄清。
3．探究利用苹果或山楂匀浆制作果汁的最佳条件的实验
(1)实验原理
①果胶半乳糖醛酸＋半乳糖醛酸甲酯 。
②果胶酶的活性受温度(或pH)的影响，处于最适温度(或pH)时活性最高。果肉的出汁率、果汁的澄清度与果胶酶的活性大小成正比。
③果胶不溶于乙醇，这是鉴别果胶的一种简易方法。
(2)实验流程设计
第一步
制备水果匀浆
第二步
烧杯A
烧杯B
5 g匀浆液
5 g匀浆液
10 mL黑曲酶提取液
10 mL水
间歇搅拌20～30 min
第三步
试管1
试管2
试管3
试管4
A烧杯混合物4 mL
A烧杯混合物4 mL
B烧杯混合物4 mL
B烧杯混合物4 mL
沸水浴
不加热
沸水浴
不加热
浑浊
澄清
浑浊
浑浊
第四步
加入95%的乙醇4 mL
出现沉淀，果汁滤出量较少
澄清，果汁滤出量多
出现沉淀，果汁滤出量少
出现沉淀，果汁滤出量少
(二)α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测
1．α-淀粉酶的固定化
(1)固定化酶
①概念：将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
②方法：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。
③直接使用酶和固定化酶的比较
项目
直接使用酶
固定化酶
酶的种类
一种或几种
一种
制作方法
/
化学结合法固定化、物理吸附法固定化
是否需要营养物质
否
否
催化反应
单一或多种
单一
反应底物
各种物质(大、小分子)
各种物质(大、小分子)
缺点
①对环境条件非常敏感，易失活；②难回收，成本高，影响产品质量
不利于催化一系列的酶促反应
优点
催化效率、耗能、污染
①既能与反应物接触，又能与产物分离；②可以重复利用
(2)α-淀粉酶的作用及固定
①α-淀粉酶作用的最适条件：最适pH为5.5～7.5；最适温度为50～75 ℃。
②方法：吸附法。
③淀粉的水解作用
(遇碘显蓝色) (遇碘显红色) (遇碘不显色)
2．用固定化α-淀粉酶水解淀粉的实验过程
3．实验结果
对照组
实验组
0.5 mL淀粉液
0.5 mL流出液
几天后重复实验中0.5 mL流出液
加KI-I2
变蓝
红色
红色
再加水稀释1倍
浅蓝
浅红色
浅红色
4.实验结论：固定化α-淀粉酶能将淀粉水解成糊精。
题点(一) 直接考查微生物的培养和分离
[例1] (2018·杭州一模)速冻食品中金黄色葡萄球菌超标，熟卤制品的大肠杆菌超标，由此引发的“细菌门”事件引起公众普遍关注。金黄色葡萄球菌能分解卵黄中的卵磷脂，在含卵黄的固体培养基上形成的菌落周围会出现特有的乳白色的乳浊环。请回答下列问题：
(1)某生物兴趣小组欲检测某果汁类食品中是否含有金黄色葡萄球菌以及该菌的含量。
①配制培养基：称取适量的牛肉膏、蛋白胨、NaCl、琼脂等，加入蒸馏水，搅拌加热至完全溶解后____________，分装到锥形瓶后利用________________进行灭菌，在无菌状态下加入卵黄液(100 mL 10%灭菌NaCl溶液中加一个鸡蛋黄，振荡均匀)摇匀后立即倒平板。
②接种：该小组采用涂布分离法检测果汁样品中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是__________________________；然后，将1 mL果汁样品稀释10倍，在3个平板上用涂布分离法分别接入0.1 mL稀释液。
③培养及结果：将培养皿____________放入恒温培养箱中经适当培养，3个平板上的菌落数分别为19、18和17。据此可得出每升果汁样品中的活菌数为__________个。
(2)示意图A和B中____________表示的是用涂布分离法接种培养后得到的结果。
(3)下列有关常用涂布分离法的操作正确的是______。
A．在超净工作台中进行接种时应关闭紫外灯
B．接种前需先稀释，然后过滤除去杂菌
C．在每个固体培养基表面都可形成单菌落
D．玻璃刮刀浸泡在70%的酒精中灭菌，不用灼烧
(4)菌种保存：在无菌条件下将单菌落用接种环取出，再用划线法接种在________上，在37 ℃下培养24 h后，置于4 ℃冰箱中保存。
[解析] (1)①培养基配制好后要调节酸碱度(pH)，分装到锥形瓶后利用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌。②涂布接种前，将灭菌后的空白平板先培养一段时间，目的是检测培养基平板灭菌是否合格。③接种后，培养皿需要倒置培养，防止皿盖上凝集的水滴滴落造成污染；0.1 mL稀释液(稀释10倍)含细菌数约为18个，得出每升果汁含有活菌数为1.8×106个。(2)图中A为划线分离得到的结果，B为涂布分离得到的结果。(3)在超净工作台进行接种操作时应关闭紫外灯；涂布分离前需稀释，但不能过滤除菌；稀释度较大的溶液涂布分离不一定出现菌落；玻璃刮刀浸泡后需要灼烧灭菌。(4)纯化的菌种保存在斜面上。
[答案] (1)①调节pH 高压蒸汽灭菌锅 ②检测培养基平板灭菌是否合格 ③倒置 1.8×106 (2)B (3)A (4)斜面
[针对训练]
1．(2016·浙江10月选考)请回答从土壤中分离产脲酶细菌和脲酶固定化实验的有关问题：
(1)LB固体培养基：取适量的蛋白胨、酵母提取物、NaCl，加入一定量的蒸馏水溶解，再加________，灭菌备用。
(2)尿素固体培养基：先将适宜浓度的尿素溶液用______________灭菌过的G6玻璃砂漏斗过滤，因为G6玻璃砂漏斗__________________________，故用于过滤除菌。然后将尿素溶液加入到已经灭菌的含有酚红的培养基中，备用。
(3)取适量含产脲酶细菌的10－4,10－5两种土壤稀释液，分别涂布接种到LB固体培养基和尿素固体培养基上，培养48 h，推测固体培养基上生长的菌落数量最少的是_____________(A.10－5稀释液＋尿素固体培养基 B．10－5稀释液＋LB固体培养基 C．10－4稀释液＋尿素固体培养基 D．10－4稀释液＋LB固体培养基)。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现________________，其原因是细菌产生的脲酶催化尿素分解产生________________所致。
(4)制备固定化脲酶时，用石英砂吸附脲酶，装柱。再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是________________________________________________________________________。
解析：(1)本实验中的LB培养基是要与尿素培养基作对比的，所以要用琼脂糖替换琼脂。(2)尿素培养基的灭菌要分开进行，除尿素外的其他成分仍用高压蒸汽灭菌，尿素溶液用G6玻璃砂漏斗过滤除菌，再将除菌的尿素加到已灭菌的其他成分中。G6玻璃砂漏斗由于孔径小，细菌不能滤过，可用于过滤除菌，但需要在使用前进行高压蒸汽灭菌。(3)由于在土壤中产脲酶的细菌远少于普通细菌，所以在尿素培养基上的菌落数相对少得多，另外稀释倍数高的土壤稀释液中细菌数量更少，在培养基上菌落数也更少。在尿素固体培养基上产脲酶细菌菌落周围出现红色环带，这是因为脲酶催化尿素分解产生氨，使培养基呈碱性，酚红指示剂在碱性下呈红色。(4)用石英砂吸附法固定化酶，装柱完成后，要再用蒸馏水洗涤固定化酶柱，其作用是洗去未被吸附的酶，以免影响产物的纯度。
答案：(1)琼脂糖 (2)高压蒸汽 孔径小、细菌不能滤过 (3)A 红色环带 氨(或NH3) (4)洗去未被固定的脲酶
题点(二) 直接考查果胶和果胶酶的应用
[例2] (2016·浙江4月选考)请回答与“果汁中的果胶和果胶酶”实验有关的问题：
(1)果胶是细胞壁的重要组成成分，其化学本质是________(A.蛋白质 B．脂质 C．核酸 D．多糖)。它在细胞壁的形成过程中的主要作用是将相邻的细胞________在一起。
(2)制取果汁时，先用果胶酶将果胶分解成__________和半乳糖醛酸甲酯等物质，再用______________酶处理，可得到比较澄清的果汁。用适量且浓度适宜的上述两种酶处理时，果汁的出汁率、澄清度与酶的________高低呈正相关。
(3)由于果胶不溶于乙醇，故可用乙醇对果胶粗提物(经酶处理后的混合物)进行________处理，从而得到干制品。
[解析] (1)果胶与纤维素是细胞壁的重要组成成分，果胶由半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯组成，其本质是一种多糖。它在细胞壁的形成过程中的主要作用是将相邻的细胞粘合在一起。(2)果胶在果胶酶的作用下分解为半乳糖醛酸和半乳糖醛酸甲酯等物质，再用果胶甲酯酶分解，可以得到澄清的果汁。酶是生物催化剂，酶作用的强弱可以用酶活性表示，活性越高则果汁的出汁率与澄清度越好。(3)由题意知，果胶不溶于乙醇，为了得到干制品，可以用乙醇对果胶混合物进行脱水处理。
[答案] (1)D 粘合 (2)半乳糖醛酸 果胶甲酯 活性 (3)脱水(沉淀)
[针对训练]
2．(2018·稽阳联谊学校联考)果胶酶能够催化果胶分解，瓦解植物的细胞壁及胞间层，使榨取果汁更容易，也使浑浊的果汁变得澄清。请回答下列有关果胶酶的问题：
探究温度对果胶酶活性影响的实验步骤：
①用搅拌器制苹果泥。
②取6个烧杯编号1、2、3、4、5、6，依次注入适量的30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃的水，恒温水浴。
③每一烧杯中放入两支试管，分别装有等量苹果泥和果胶酶，保温3 min。
④向每组烧杯中的苹果泥试管中加入相应的等量的果胶酶，振荡试管，反应一段时间。
⑤过滤，比较获得苹果汁的体积。
(1)步骤③中将苹果泥和果胶酶分别装在不同试管中，用相同温度恒温处理后再混合，这样处理的目的是_______________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)有人认为该实验缺乏对照，应补充一组果汁和蒸馏水相混合的实验，你认为有没有必要？原因是_________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(3)若继续探究果胶酶的最适用量，则在实验过程中温度、________________________________等因素应保持不变。(列举两例)
(4)有关果胶酶和纤维素酶的叙述，错误的是______。
A．二者都是蛋白质
B．催化果胶酶水解的酶是淀粉酶
C．二者都是在核糖体上合成的
D．构成纤维素酶的基本单位是氨基酸
解析：(1)苹果泥和果胶酶分别恒温处理再混合，目的是保证底物和酶混合时的温度是相同的，不会发生温度的变化。(2)实验的不同温度梯度之间可形成相互对照，无须补充果汁和蒸馏水混合的实验。(3)若探究果胶酶的最适用量，果胶酶的量是自变量，其他是无关变量，应加以控制，如 pH、温度、果泥量、果胶酶浓度等。(4)果胶酶和纤维素酶的化学本质均为蛋白质，二者都是在核糖体上合成的，催化果胶酶水解的酶是蛋白酶，构成纤维素酶的基本单位是氨基酸。
答案：(1)保证底物和酶在混合时的温度是相同的
(2)没有必要；实验的不同温度梯度之间可形成相互对照
(3)pH、果胶酶浓度、果泥量 (4)B
题点(三) 考查微生物的培养、分离和酶的固定化
[例3] (2018·新高考研究联盟联考)酶经过固定化后，不仅能提高酶的稳定性，而且容易与产物分开，具有可反复使用等优点。如图1为利用枯草杆菌生产α-淀粉酶及酶固定化实验流程图，请回答有关问题：
(1)筛选高表达菌株的最简便方法之一是______________。一般通过______________、________________实现。筛选出的菌株在发酵生产之前还需利用__________培养基进行扩大培养。
(2)利用物理或化学的方法将α-淀粉酶固定在____________的介质上成为固定化酶。
(3)如图2是实验室中α-淀粉酶的固定化装置示意图。实验过程涉及两次蒸馏水洗涤反应柱的操作，所用的蒸馏水体积为装填体积的______，第二次洗涤的目的是除去________________。
(4)若图2中的液体X为淀粉溶液，从反应柱下端接取少量流出液进行KI-I2颜色测试，结果未呈现红色。下列有关此现象的解释错误的是( )
A．反应柱中没有α-淀粉酶被固定
B．流速过快淀粉未被水解
C．接取的流出液是蒸馏水
D．流速过慢淀粉被水解成葡萄糖
[解析] (1)筛选高表达菌株的最简便方法之一就是单菌落分离，常用的方法是划线分离法和涂布分离法；用于扩大培养的培养基通常是液体培养基。(2)固定化酶就是利用物理或化学的方法将α-淀粉酶固定在非水溶性的介质上。(3)实验中两次用蒸馏水洗涤反应柱的目的分别是除去未吸附的游离的淀粉酶和残留的淀粉溶液。(4)淀粉在α-淀粉酶的作用下，不会被水解成葡萄糖。
[答案] (1)单菌落分离 划线分离法 涂布分离法 液体 (2)非水溶性 (3)10倍 残留的淀粉溶液 (4)D
实验过程中两次洗涤的目的不同
α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测实验过程中，涉及两次对固定化酶柱的洗涤。第一次是α-淀粉酶固定时，目的是用于洗去未吸附的游离的α-淀粉酶；第二次洗涤是实验结束时，对未反应的淀粉和产物的洗涤，目的是清除上述物质，以便于下次固定化酶柱的继续使用。两次洗涤过程，都使用10倍柱体积的蒸馏水对固定化酶柱进行洗涤。
[针对训练]
3．(2014·浙江自选)下面是关于固定化酶和细菌培养实验的问题。请回答：
(1)某兴趣小组欲利用固定化酶进行酶解淀粉的实验，分组见下表。
组别
固定化酶柱长度(cm)
淀粉溶液的流速(mL·min－1)
甲
10
0.3
乙
10
0.5
丙
15
0.3
丁
15
0.5
将吸附了α-淀粉酶的石英砂装入柱中后，需用蒸馏水充分洗涤固定化酶柱，以除去__________________。按表中分组，将配制好的淀粉溶液加入到固定化酶柱中，然后取一定量的流出液进行KI-I2检测。若流出液呈红色，表明有________生成；若各组呈现的颜色有显著差异，则流出液中淀粉水解产物浓度最高的是________组。
(2)下列关于上述固定化酶实验的叙述，错误的是( )
A．固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量
B．淀粉溶液流速过快会导致流出液中含有淀粉
C．各组实验所用的淀粉溶液浓度应相同
D．淀粉溶液的pH对实验结果有影响
(3)现有一份汗水样品，某兴趣小组欲检测其中的细菌数，进行以下实验：将一定量的汗水样品进行梯度稀释，取适量不同稀释度的稀释液，用________分别接种于固体平面培养基上，经培养后进行计数，该实验应注意，接种前，从盛有____________________的容器中将玻璃刮刀取出，放在酒精灯火焰上灼烧，冷却后待用；分组时，需用________________作为对照。
(4)在上述细菌培养实验中进行计数时，应计数的是接种了________。
A．各个稀释度样品的培养基上的细菌数
B．合理稀释度样品的培养基上的细菌数
C．各个稀释度样品的培养基上的菌落数
D．合理稀释度样品的培养基上的菌落数
解析：(1)利用固定化酶进行酶解淀粉的实验时，先要将酶固定化。此题中利用石英砂吸附α-淀粉酶，装入固定化酶柱时有些酶没有完全吸附在石英砂上，需用蒸馏水充分洗涤固定化酶柱，以除去未吸附的游离的α-淀粉酶。α-淀粉酶可使淀粉水解成糊精，如果用淀粉指示剂(KI-I2)检测糊精，则呈现红色。酶的量不同，水解的效果也不同，丙组固定化酶柱的长度较长，其固定化酶的总量较多，且柱中淀粉溶液的流速也较慢，反应充分，故产物浓度高，颜色最深。(2)固定化酶柱的长度决定了酶的含量，反应是否充分与淀粉溶液的流速有关，从而决定了产物的浓度。如果淀粉溶液的流速过快，则淀粉与酶接触不充分，从而使淀粉不能被充分水解。各组淀粉溶液的浓度是实验的无关变量，故各组实验所用的淀粉溶液浓度应该相同。温度、pH会影响酶的活性，从而对实验结果造成影响。(3)细菌的分离与计数常采用涂布分离法，即用玻璃刮刀(涂布器)将一定体积的稀释液涂布到固体平面培养基上。玻璃刮刀在使用前需要进行灭菌处理，即将其浸在体积分数为70%的酒精中，随后取出放在酒精灯火焰上灼烧，待其冷却后使用。为排除其他因素的影响，提高实验的可信度，实验要设置空白对照。(4)将菌液涂布到固体平面培养基上后，倒置放置在适宜条件的恒温箱中培养，培养一段时间后，统计菌落数。在适当的稀释度下，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，这样通过统计菌落数就可估算出待测样品的细菌数目，所以要选择合理稀释度的样品。
答案：(1)未吸附的α淀粉酶 糊精 丙 (2)A (3)涂布器 体积分数为70%的酒精 未接种的培养基 (4)D
题点(四) 考查微生物利用与基因工程、酶的应用
[例4] (2018·台州质量评估)常见的酿酒酵母只能利用葡萄糖而不能利用木糖来进行酒精发酵，而自然界中某些酵母菌能分解木糖产生酒精，但是对酒精的耐受能力差。科学家利用基因工程培育了能利用这两种糖进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。请分析回答下列问题：
(1)制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板________，然后做无菌检查。
(2)取从自然界中采集的葡萄，用无菌水将葡萄皮上的微生物冲洗到无菌的三角瓶中，然后按图甲所示过程进行酵母菌的纯化培养。
①图乙是经过图甲过程A 纯化培养的结果，在培养基上接种时划线的顺序依次是________。
②接种环通过灼烧灭菌，完成图中划线操作，共需灼烧接种环________次。
③研究者在图甲过程C的操作培养过程中，得到了一个经培养后菌落分布如图丙所示的平板，推测接种时可能的操作失误是____________________________________。
(3)将培养基上的酵母菌菌株转接到仅以________为碳源的培养基中，无氧条件下培养一周后，有些酵母菌死亡，说明这些酵母菌不能利用木糖发酵。
(4)将目的基因连接到具有尿嘧啶合成酶基因作为标记基因的质粒上，然后将所得的重组质粒导入酵母菌时，应选择缺乏________________能力的酿酒酵母作为受体菌。
(5)将经上述流程培育获得的转基因酿酒酵母接种在含______________的培养基中进行酒精发酵能力测试。随着发酵的持续进行，若该酿酒酵母能够存活，说明它能__________________________________________________________，即说明所需菌株培育成功。
[解析] (1)制备酵母菌培养基要进行倒平板操作，待平板冷凝后，要将平板倒置，防止皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染，然后做无菌检查。(2)从图乙看，a处菌落最密，b处最稀，所以图甲过程A纯化培养接种时划线的顺序依次是a→c→b；划线分离时接种环在每次划线前都要灼烧，划线操作结束后还要灼烧，所以需要灼烧4次；观察图丙平板所示的结果，菌落分布很不均匀，推测接种时可能的操作失误是涂布不均匀。(3)要想选择出能利用木糖进行酒精发酵的酵母菌必须要以木糖为唯一碳源。(4)质粒上的标记基因是尿嘧啶合成酶基因，受体菌应该是缺乏尿嘧啶合成能力的酿酒酵母，这样才能在不含尿嘧啶的培养基上将成功导入重组DNA的酿酒酵母筛选出来。(5)实验的目的是培育能利用这两种糖(葡萄糖、木糖)进行发酵且对酒精耐受能力强的酿酒酵母。因此，目的基因是否成功表达的筛选就需要转基因酿酒酵母接种在含葡萄糖和木糖的培养基中进行酒精发酵能力测试。
[答案] (1)倒置 (2)a→c→b 4 涂布不均匀
(3)木糖 (4)尿嘧啶合成 (5)葡萄糖和木糖 利用葡萄糖和木糖产生酒精，且对酒精的耐受能力比较强(合理即可)
平板划线操作的注意事项
(1)操作第一步即取菌液之前及每次划线之前都需要进行灼烧灭菌，划线操作结束后，仍需灼烧接种环，每次灼烧的目的如下表：
第一步操作
每次划线之前
(除第一次)
划线结束
目
的
杀死接种环上原有微生物
杀死上次划线结束后接种环上残留的菌种，使每次划线的菌种来源于上次划线的末端
杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者
(2)灼烧接种环后，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
(3)第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，目的是使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(4)划线时最后一区不要和第一区相连。
(5)划线用力大小要适当，防止用力过大把培养基划破。
[针对训练]
4．请分析回答有关微生物及其应用的问题：
(一)生物柴油是一种可再生的清洁能源，其应用在一定程度上能够减缓人类对化石燃料的消耗。科学家发现，在微生物M产生的脂肪酶作用下，植物油与甲醇反应能够合成生物柴油(如图1)。
(1)欲分离筛选出能分泌脂肪酶的微生物M，应选择下列固体培养基(仅列出了碳氮源)中的________。(填编号)
A．蛋白胨、柠檬酸铁铵 B．橄榄油、硫酸铵
C．乳糖、酵母膏 D．葡萄糖、蛋白胨
(2)微生物M分离提取的脂肪酶通常需要检测酶活性来确定其应用价值。为降低生物柴油生产成本，可利用______________技术使脂肪酶能够重复使用。
(二)急性肠胃炎、手足口病分别是由细菌、病毒通过消化道进入人体导致的，因此检验饮用水的细菌含量和病毒含量是有效监控疾病发生的必要措施。
(3)检验大肠杆菌的含量时，通常将水样进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的水样分别涂布到________培养基的表面进行培养。
(4)分别取0.1 mL已稀释了103倍的水样分别涂布到三个培养基的表面进行培养，培养基记录到大肠杆菌的菌落数分别为55、56、57，则每升原水样中大肠杆菌数为________个。
解析：(一)(1)分离筛选出能分泌脂肪酶的微生物M，要使用以脂质为唯一碳源的选择培养基。(2)为降低生物柴油生产成本，可采用固定化酶技术，使脂肪酶重复使用。(二)(3)菌落的计数应使用固体培养基。(4)根据题意，每升原水样中大肠杆菌数为(55＋56＋57)÷3÷0.1×1 000×103＝5.6×108(个)。
答案：(1)B (2)固定化酶 (3)固体 (4)5.6×108
考点二生物技术在食品加工中的应用和植物的组织培养
一、生物技术在食品加工中的应用
(一)果酒及果醋的制作
1．用葡萄制作葡萄酒
(1)实验原理：葡萄酒是酵母菌利用葡萄糖进行酒精发酵的产物。酵母菌只有在无氧条件下才能进行酒精发酵即将葡萄糖氧化成乙醇，而且当培养液中乙醇的浓度超过16%时，酵母菌就会死亡。葡萄糖氧化成乙醇的反应式：C6H12O6―→2CO2＋2C2H5OH。
(2)实验步骤
2．用果汁制作果酒
(1)实验原理：用葡萄制作的葡萄酒不含糖，酒精含量也低(平均的体积分数为8%)，而用果汁制作的果酒，其酒精含量较高(体积分数约为15%)，含糖量也较高。
(2)实验步骤：选择材料(最好选择苹果)→制取果汁→配料(200 g蔗糖＋1 L果汁＋酵母悬液)→发酵→静置→用虹吸法取出。
3．用果酒制作果醋
(1)实验原理：醋化醋杆菌在有氧条件下将乙醇氧化为醋酸，反应式为C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O。
(2)实验步骤：连接发酵装置→加入醋化醋杆菌→发酵并检测pH→调节活塞，控制流量→测定pH，监控发酵情况。
4．酒精发酵和醋酸发酵的区别与联系
区别
酒精发酵
醋酸发酵
微生物
酵母菌
醋化醋杆菌
温度
25～30_℃
30～35 ℃
氧气
前期需氧，后期不需氧
一直需氧
发酵时间
2～3 d
7～8 d
联系
酒精发酵为醋酸发酵提供营养物质(乙醇)，流程如下：
(二)泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
1．泡菜的制作
(1)泡菜制作时起主要作用的微生物：假丝酵母和乳酸菌。
(2)泡菜制作原理：在无氧的条件下，微生物利用菜中的糖和其他营养物进行发酵，发酵产物有有机酸和醇类物质等。
(3)实验步骤
①各种菜洗净并切成3～4 cm长的小块。
②将泡菜坛洗净，并用热水洗坛内壁两次。
③将各种蔬菜、盐水、糖及调味品放入坛中，混合均匀。
④将坛口用水封好，防止外界空气进入。
⑤腌制1周左右即可开坛食用，也可随时加入新鲜蔬菜，不断取用。
2．亚硝酸盐的测定
(1)测定原理
亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物，可用光电比色法定量测定。
(2)亚硝酸盐的定量测定流程
①样品处理：泡菜25 g制匀浆过滤后调pH8.0→加硫酸锌溶液25 mL→加氢氧化钠溶液至产生白色沉淀→水浴加热至60 ℃→过滤取滤液定容至500 mL。
②测定：10 mL样品溶液＋4.5 mL氯化铵缓冲液＋2.5 mL60%乙酸溶液＋5 mL显色液→定容至25 mL→暗处静置25 min→550 nm处测定光密度值(OD值)(以10 mL水为空白对照)。
③标准曲线的绘制：以亚硝酸钠质量为横坐标，以光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。
④计算及公式：X1＝(m2×V1)/(m1×V2)
X1：样品中亚硝酸盐含量，单位 mg/kg；
m1：样品质量，单位 g；
m2：通过标准曲线得到的亚硝酸盐质量，单位 μg；
V1：样品处理液总体积；
V2：测定用样品液体积。
3．泡菜制作的关键点
(1)防止杂菌污染：每次取样用具要洗净，要迅速封口。
(2)氧气需求
①泡菜坛要选择气密性好的容器，以创造无氧环境，有利于乳酸菌发酵，防止蔬菜腐烂。
②泡菜坛内要注满水，以保证乳酸菌发酵所需要的无氧环境，并注意在发酵过程中经常补水。
(3)温度：发酵过程温度控制在室温即可。温度过高，则易滋生杂菌；温度过低，则发酵时间延长。
二、植物的组织培养
1．组织培养的概念
取一部分植物组织，在无菌的条件下接种在三角瓶中的琼脂培养基上，给予一定的温度和光照，使之产生愈伤组织，或进而生根发芽。
2．原理：植物细胞的全能性。
3．培养基
(1)发芽培养基：细胞分裂素摩尔浓度大于生长素摩尔浓度的培养基。
(2)生根培养基：生长素摩尔浓度大于细胞分裂素摩尔浓度的培养基。
用人工合成的萘乙酸(NAA)代替生长素，人工合成的苄基腺嘌呤(BA)代替细胞分裂素。
4．基本过程
a脱分化,b再分化,c―→d
(1)a表示离体的组织、器官或细胞，它能被培养成d的根本原因是植物细胞具有全能性。
(2)b表示愈伤组织，它与a相比分化程度低，全能性高。
(3)若a是花药，则d是单倍体植株，继续对其使用秋水仙素处理可获得染色体加倍的可育植株。
5．菊花组织培养的实验步骤
(1)配制MS培养基：由大量元素、微量元素和有机成分组成。
(2)取外植体：超净台上将无菌培养的菊花幼苗切段，每段至少有1张叶片。
(3)生芽培养：在生芽培养基中放入2～3段幼茎切段，日光灯下保持18～25 ℃的温度培养，每天的光照时间不少于14.5 h。
(4)生根培养：2～3周后，将丛状苗在无菌条件下转入生根培养基中，在上述条件下继续培养。
(5)适应锻炼：将苗转移至草炭土或蛭石中，用玻璃罩或塑料布保持80%以上的湿度，2～3天后打开玻璃罩逐渐降低湿度进行锻炼，直至将罩全部打开处于自然湿度下为止。
(6)定植：将苗转移到中培养。
(7)自然生长的茎进行组织培养的步骤：可取一段茎在70%乙醇中浸泡10 min，再放入5%次氯酸钠溶液中浸泡5 min，然后用另一5%次氯酸钠溶液浸泡5 min，最后在超净台中用无菌水清洗，将茎的切段培养在生芽培养基中。
题点(一) 直接考查果酒、果醋的制作
[例1] 杨梅是浙江省的特色水果之一，为对其进行深加工，某厂进行了杨梅酒和杨梅醋的研制，基本工艺流程如下：
请回答问题。
(1)在制备杨梅酒过程中，为了提高杨梅的出汁率，在压榨前可加入一定浓度的纤维素酶和________酶。甲罐顶上弯管中加水的主要目的是________________。发酵一定时间后，观察到发酵罐内液面不再有______________，说明发酵基本完毕。
(2)在制备杨梅醋过程中，乙罐内先填充经________处理的木材刨花，然后加入含________菌的培养液，使该菌________在刨花上，再让甲罐中发酵完毕的杨梅酒流入乙罐进行杨梅醋发酵，杨梅醋的pH可通过控制杨梅酒的________来调节。
(3)若甲罐中的杨梅酒全部流经乙罐制成杨梅醋，则乙罐中CO2的产生量是________。
A．甲罐的两倍 B．与甲罐的相等
C．甲罐的一半 D．几乎为零
(4)在杨梅酒和杨梅醋发酵的整个过程中，某物质浓度随时间变化的示意图如下，该物质是________。
[解析] (1)由于细胞壁的主要成分为纤维素和果胶，所以在压榨前用一定浓度的纤维素酶和果胶酶处理，可提高出汁率。酒精发酵为厌氧呼吸过程，需要提供无氧环境，所以弯管处加水的目的是防止空气进入。发酵完成后，CO2的生成结束，所以发酵罐内液面不再有气泡冒出。(2)制备醋酸过程中需要避免其他杂菌干扰，所以乙罐内填充经灭菌处理的木材刨花。制备醋酸需要的菌种为醋杆菌，加刨花的目的是让醋杆菌附着在刨花上，使醋杆菌与培养液充分接触。杨梅醋的产生量与流入乙罐的杨梅酒的量有关，所以杨梅醋的pH可通过控制杨梅酒的流速来调节。(3)当缺少糖源时，醋杆菌将乙醇变为乙醛，再将乙醛变为醋酸(C2H5OH＋O2―→CH3COOH＋H2O)。该过程并没有CO2产生，所以乙罐中CO2产生量几乎为零。(4)在酿制杨梅酒的过程中，酵母菌能进行酒精发酵，所以酒精浓度先升高，后期酒精产量减少，同时醋杆菌又消耗酒精，所以酒精浓度在整个过程中的变化如题图所示。
[答案] (1)果胶 防止空气进入 气泡冒出 (2)灭菌 醋杆 附着 流速 (3)D (4)酒精
对果酒和果醋发酵装置的解读
(1)装置设计思路
①因酵母菌的繁殖需要O2，且醋杆菌是好氧菌，所以在果酒制作的前期和果醋制作的整个过程中都需要通氧气。因酵母菌产生酒精时需要无氧环境应控制充入氧的量，故应在充气口设置开关。
②由于在果酒发酵过程中产生CO2，因此需要设排气口；为防止空气中微生物的污染，排气口应连接一个长而弯的玻璃管。
③因要对发酵的情况进行及时监测，应设置出料口便于取料。
(2)各部位的作用
①充气口：在醋酸发酵时连接充气泵进行充气。
②排气口：排出酒精发酵时产生的CO2，与排气管相连的长而弯曲的管道：加水后防止空气中微生物的污染。
③出料口：用来取样。
(3)装置的使用方法：使用该装置制酒时，应该关闭充气口；制醋时，应将充气口接气泵，输入O2。
题点(二) 考查泡菜的腌制和亚硝酸盐的测定
[例2] (2017·浙江4月选考)回答与泡菜腌制和亚硝酸盐测定有关的问题：
(1)制作泡菜时，为缩短发酵周期，腌制前可加入乳酸菌。取适量酸奶，用无菌蒸馏水稀释后，再用________蘸取少量的稀释液，在MRS乳酸菌专用培养基的平板上划线，以获得乳酸菌单菌落。下图所示的划线分离操作，正确的是________。
(2)泡菜腌制过程中，会产生有机酸、醇类和亚硝酸盐，其中醇类是由________进行厌氧呼吸产生。亚硝酸盐对人体有害，为测定泡菜中亚硝酸盐的含量，从泡菜中提取亚硝酸盐，与______________发生重氮化反应，再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物。然后用光程1 cm的______，在550 nm光波下测定光密度值，与由已知浓度梯度亚硝酸钠制作的________比对，计算样品中亚硝酸盐的含量。
(3)已知乳酸菌中的亚硝酸还原酶能降解亚硝酸盐。在一定的腌制时间内，随着腌制时间的延长，泡菜中亚硝酸盐含量逐渐降低，是由于在厌氧和________环境下亚硝酸盐被亚硝酸还原酶降解。
[解析] (1)划线分离时用接种环蘸取菌液并在专用培养基上划线多个区域，除第一区域外，其他区域均要从上一区域划线的末端开始划线。(2)泡菜腌制过程中起作用的主要是假丝酵母和乳酸菌，假丝酵母进行厌氧呼吸可以产生乙醇。亚硝酸盐可与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，这一产物再与N-1-萘基乙二胺偶联，形成紫红色产物。然后用光程为1 cm的比色杯在550 nm光波下测定光密度值，与由已知浓度梯度亚硝酸钠制作的标准曲线比对，计算样品中亚硝酸盐的含量。(3)在泡菜腌制过程中，随腌制时间的延长，乳酸不断积累，而在厌氧和酸性环境下亚硝酸盐被亚硝酸还原酶降解，其含量逐渐降低。
[答案] (1)接种环 B (2)假丝酵母 对氨基苯磺酸 比色杯 标准曲线 (3)酸性
泡菜腌制过程中，乳酸菌、乳酸和亚硝酸盐的变化
发酵时期
乳酸菌数量
乳酸含量
亚硝酸盐含量
发酵初期
少(有O2，乳酸菌活动受抑制)
少
增加(硝酸盐还原菌的作用)
发酵中期
最多(乳酸抑制其他菌的活动)
积累、增多、
pH下降
下降(硝酸盐还原菌受抑制，部分亚硝酸盐被分解)
发酵
后期
减少(乳酸继续积累，pH继续下降，抑制乳酸菌的活动)
继续增多，pH继续下降
下降至相对稳定(硝酸盐还原菌被完全抑制)
[针对训练]
1．(2018·湖州仿真考)下图是泡菜的制作及测定亚硝酸盐含量的实验流程示意图，请据图回答下列问题：
(1)制作泡菜时加入已腌制过的泡菜汁的目的是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)泡菜在腌制时，抑制有害菌繁殖是关键。下列与此无关的叙述是( )
A．白菜在开水中浸1 min，热水洗坛内壁两次
B．加入适量糖和调味品
C．坛口用水封好，防止空气进入
D．加入适量的盐水、白酒
(3)亚硝酸盐与显色剂会生成____________色产物。对亚硝酸盐的定量测定可以用____________法测出光密度值，利用预先建立的______________估算出样品中的亚硝酸盐含量。在进行样品测定时，要取等量水进行同样的测定，目的是__________________________________。分析下图的曲线可知，食用泡菜的最佳时间是______点。
(4)若要分离出变质泡菜中的细菌，下列叙述错误的是( )
A．取变质泡菜汁用无菌水配制成悬液
B．用划线分离法更易获得单菌落
C．需要配制合适的培养基
D．培养用具、培养基必须是无菌的
答案：(1)接种已经扩增的发酵菌，加速发酵过程 (2)B (3)紫红 光电比色 标准曲线 作为空白对照 C (4)B
题点(三) 直接考查植物组织培养
[例3] (2018·浙江3月十校联盟)铁皮石斛是一种名贵的中药材，有生津养胃、降血糖和增强免疫力等作用，有效成分为石斛多糖、石斛碱等，温州雁荡山素有“中国铁皮石斛之乡”的美誉。请回答下列问题：
(1)用优良品种自然生长的茎快速繁殖铁皮石斛时，给茎消毒时无须使用的是______(A.乙醇 B．无菌水 C．甘露醇 D．次氯酸钠)。在细胞分裂素相对较多和生长素相对较少的培养基中培养茎的切段，待长出较多的_______，将其进行_________(处理)后再转入________培养基中继续培养，直至长成幼苗。这种通过组织培养技术快速繁殖植物的方法，也称为____________。
(2)研究发现，铁皮石斛的生长发育与其体内的内生菌密切相关。为进一步研究内生菌的作用，需要大量内生菌进行相关实验。分离内生菌时最好采用________(A.G6玻璃砂漏斗过滤法 B．血细胞计数法 C．划线分离法 D．涂布分离法)，再将纯化的内生菌转移到液体培养基中进行__________。
(3)研究发现，200 mg/L浓度的卡那霉素能有效抑制铁皮石斛细胞的增殖与分化。科学家欲利用卡那霉素，采用农杆菌转化法对现有铁皮石斛品种进行基因改良。在基因工程操作中，导入受体细胞的__________________分子应同时带有目的基因和________________________基因，这样才能利用含有卡那霉素的培养基将成功导入目的基因的受体细胞筛选出来。
(4)鉴定铁皮石斛的品质，可通过苯酚－浓硫酸法测定石斛多糖的含量。其原理是：石斛多糖水解成单糖并脱水生成糖醛衍生物后，与苯酚缩合生成橙黄色化合物，在490 nm处测定光密度值，以不同浓度的葡萄糖溶液为标准溶液建立标准曲线，便可知道样品的石斛多糖含量。这种方法类似于泡菜汁中________________含量的测定，称之为________________法。
(5)为高效提取石斛多糖，可在提取液中加入________________________________，以提高铁皮石斛的出汁率。
[解析] (1)植物组织培养需要使用乙醇、次氯酸钠和无菌水。细胞分裂素与生长素比值偏高，有利于生芽，将其分株后转入生根培养基。这种快速繁殖植物的方法，称为植物克隆。(2)由题意分离内生菌最好采用涂布分离法，对分离的菌种可转移至液体培养基中扩大培养。(3)重组DNA分子应具有目的基因和标记基因，据题意标记基因是卡那霉素抗性基因。(4)由题中信息可知测定石斛多糖含量与亚硝酸盐含量测定方法相似，应用光电比色法。(5)为高效提取石斛多糖，可在提取液中加入纤维素酶和果胶酶，分解细胞壁，以提高出汁率。
[答案] (1)C 丛状苗 分株/分株培养 生根 植物克隆 (2)D 扩大培养 (3)重组DNA/重组质粒 卡那霉素抗性/抗卡那霉素 (4)亚硝酸盐 光电比色
(5)果胶酶/果胶酶和果胶甲酯酶/果胶酶和纤维素酶/果胶酶、果胶甲酯酶和纤维素酶
关注实验操作中易错的几个问题
(1)材料的选取：菊花的组织培养实验中，应选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。
(2)外植体消毒：所用消毒剂为体积分数为70%的酒精和5%的次氯酸钠溶液，所使用的清洗液是无菌水。
(3)培养过程：菊花的组织培养每天光照不少于14.5 h。
[针对训练]
2．请回答黄花蒿植物组织培养的有关问题：
(1)黄花蒿的植物组织培养研究在我国已有数年历史。选取黄花蒿的茎段后，通常用体积分数为70%的酒精等药品对茎段进行________________，然后再放入__________溶液中浸泡，最后用无菌水冲冼。若外植体不慎被细菌感染，采用划线分离法纯化细菌，在4个区域内划线需要将接种环灼烧灭菌________次。
(2)植物组织培养的培养基可采用________________法灭菌。组织培养的过程中，除需无菌、营养和激素外，____________等外界条件也很重要。
(3)2～3周后将生长健壮的丛状苗在________(A.LB培养基＋适宜浓度BA B．LB培养基＋适宜浓度NAA C．MS培养基＋适宜浓度BA D．MS培养基＋适宜浓度NAA)上继续生根，形成完整植株。定植前，还需逐渐________________进行炼苗。
解析：(1)选取黄花蒿的茎段进行组织培养时，通常用体积分数为70%的酒精等药品对茎段进行消毒，然后再放入5%次氯酸钠溶液中浸泡，最后用无菌水冲冼。若外植体不慎被细菌感染，采用划线分离法纯化细菌，因在操作的每次划线之前和划线操作结束时都需要将接种环灼烧灭菌，所以在4个区域内划线，需要将接种环灼烧灭菌5次。(2)通常采用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌。组织培养的过程中，除需无菌、营养和激素外，光照、温度等外界条件也很重要。(3) 2～3周后将生长健壮的丛状苗在D即MS培养基＋适宜浓度NAA的培养基上继续生根，形成完整植株。定植前，还需逐渐降低湿度进行炼苗。
答案：(1)消毒 5%次氯酸钠 5 (2)高压蒸汽灭菌 光照、温度 (3)D 降低湿度
题点(四) 综合考查生物技术实践
[例4] (2018·长兴中学全真模拟)蓝莓中富含的花青素能有效地改善视力。蓝莓可以制成清香的蓝莓酒，如蓝莓冰酒、蓝莓干红和蓝莓果酒，也可以制作蓝莓果醋，下图是利用植物组织培养的方法，大量培养蓝莓的具体流程的文字图解。请回答下列问题：
(1)图中蓝莓组织要经过消毒处理后，才能进行培养。在Ⅰ过程中，细胞的分化程度会________(填“升高”“降低”或“不变”)。
(2)培养基中生长素与细胞分裂素的用量比会影响细胞分化的方向。其比值较高的过程是________。
A．Ⅰ B．Ⅱ
C．Ⅲ D．Ⅳ
(3)为提高成品蓝莓酒的澄清度和纯度，除必要的过滤操作外，可在酒精发酵阶段和澄清阶段分别加入事先经____________处理后的酵母菌和________酶。
(4)经此工艺制成的成品蓝莓酒的酒精浓度明显高于葡萄酒但仍不超过________，原因是酒精浓度一旦超过该值时酵母菌就会死亡。
(5)在实际制酒的过程中，下列哪项除外，其余均是决定酿制的蓝莓酒的口感和品质的主要因素( )
A．蓝莓品种 B．酵母菌菌种
C．酿造工艺 D．灭菌方法
(6)某同学在自酿蓝莓酒的发酵后期向发酵液中通入一定量的空气，并将发酵液置于30～35 ℃环境中，结果发现发酵液中散发出醋香，其中挥发性醋酸的来源过程主要为________________________________(用反应式表示)，该同学在果醋酿造中为避免杂菌污染，向果酒中加入了适量的青霉素，结果发酵实验反而失败，其原因是____________________________________。
[答案] (1)降低 (2)C (3)固定化技术 果胶 (4)16% (5)D (6)C2H5OH＋O2→CH3COOH＋H2O 青霉素抑制了醋化醋杆菌的增殖甚至会杀死醋化醋杆菌
