基因工程
1．(2018·湖南衡阳一模)科学家利用PCR定点突变技术改造某基因，从而提高其生理功能效率。请据所学知识，回答下列问题：
(1)PCR过程所依据的原理是______________，扩增过程需要加入________酶。
(2)可利用定点突变的DNA构建基因表达载体，常用________将基因表达载体导入植物细胞，还需用到植物细胞工程中的____________技术，才能最终获得转基因植物。
(3)重组质粒中抗生素抗性基因的作用是____________________。
(4)基因文库中cDNA文库与基因组文库相比，前者较小，原因是________________________________。
答案 (1)DNA双链复制 耐高温的DNA聚合(或Taq)
(2)农杆菌转化法 植物组织培养
(3)鉴别和筛选含有目的基因的细胞
(4)cDNA文库是通过生物发育的某个时期mRNA反转录产生的，这个时期并不是每个基因都进行转录，而基因组文库包含所有的基因
解析 (1)PCR的原理是DNA双链复制；扩增过程是在较高温度下进行的，因此需要加入耐高温的DNA聚合酶(或Taq酶)。
(2)基因工程中，常用农杆菌转化法将基因表达载体导入植物细胞；将转基因植物细胞培育成转基因植株还需要采用植物组织培养技术，原理是植物细胞具有全能性。
(3)重组质粒中抗生素抗性基因为标记基因，其作用是鉴别和筛选含有目的基因的细胞。
(4)cDNA文库是通过生物发育的某个时期mRNA反转录产生的，而这个时期并不是每个基因都进行转录，而基因组文库包含所有的基因，所以cDNA文库比基因组文库小。
2．(2018·安徽“皖南八校”三联)科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—，请据图回答：
(1)过程①所需要的酶是________。一般采用PCR技术扩增目的基因，前提要有一段已知目的基因的核苷酸序列，原因是______________________。
(2)在构建基因表达载体的过程中，用________切割质粒，获取目的基因时只能用一种限制酶，应用__________________切割目的基因所在的外源DNA。用限制酶切割目的基因和载体后形成的黏性末端在DNA连接酶的催化作用中通过________原则进行连接。人的基因之所以能与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是____________________________________。
(3)在过程③中一般将受体大肠杆菌用CaCl2溶液(Ca2＋)进行处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为____________。
答案 (1)逆转录酶 根据这一序列合成引物
(2)限制酶Ⅰ 限制酶Ⅱ 碱基互补配对 人的基因与大肠杆菌DNA分子的组成单位相同，结构相同，且具有相同的黏性末端
(3)感受态细胞
解析 (1)据图可知，题图中是通过逆转录法来获取目的基因的，所以过程①所需要的酶应是逆转录酶；利用PCR技术扩增目的基因的前提是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。
(2)结合图示可知，在构建基因表达载体过程中，应该用限制酶Ⅰ来切割质粒的，因为如果用限制酶Ⅱ切割质粒，会使两个标记基因都受到破坏；根据限制酶Ⅰ的识别序列和切点为“”、限制酶Ⅱ的识别序列和切点为“”，可知限制酶Ⅱ也能识别并切割限制酶Ⅰ的识别序列，所以应用限制酶Ⅱ切割目的基因所在的外源DNA。用限制酶切割目的基因和载体后形成的黏性末端在DNA连接酶的催化作用中通过碱基互补配对原则进行连接。人的基因与大肠杆菌DNA分子的组成单位、结构相同，且具有相同的黏性末端，所以人的基因能与大肠杆菌的DNA分子进行重组。
(3)图中过程③表示将目的基因导入大肠杆菌，该过程中一般将受体大肠杆菌用CaCl2溶液(Ca2＋)进行处理，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这种细胞称为感受态细胞。
3．(2018·广东佛山市质检)油菜籽中蛋白质和油脂的相对含量，与酶1和酶2对共同底物丙酮酸的竞争有关。酶1促进蛋白质的合成，酶2促进油脂的合成。通过生物工程技术对油菜进行改造，以得到含有基因A的油菜，流程图如下。请据图作答：
(1)上述改造过程中运用的生物工程技术是____________________。
(2)通过__________________、______________或人工化学合成等方法，都可获取目的基因A。过程①中的处理方法为________。
(3)过程④中要防止杂菌污染的原因是____________________________。通过过程④得到的油菜植株中，所有细胞________(填“一定”“不一定”或“一定不”)含有基因A。
(4)已知转录时基因A的模板链与酶1基因的模板链互补。相对普通油菜，含基因A的油菜籽粒油脂含量显著提高，请分析其机理：________________________。
答案 (1)基因工程、植物组织培养
(2)从基因文库中获取 利用PCR技术扩增 Ca2＋处理法
(3)杂菌会竞争培养基中的营养物质，还可能产生有毒有害物质 不一定
(4)基因A转录的mRNA与酶1基因转录的mRNA互补，阻碍了酶1基因的mRNA翻译，降低了酶1含量，酶2对丙酮酸的竞争增强，促进了油脂合成
解析 (1)据图可知，上述过程最终把外源基因A导入了油菜细胞，此过程用到了基因工程技术，上述过程还需要把油菜的下胚轴细胞培养成油菜植株，此过程需要植物组织培养技术。
(2)基因工程技术首先要获取目的基因，目前最常用的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增，此外如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以用化学方法直接人工合成。将基因导入微生物细胞时，需要用Ca2＋处理法，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，这样可以提高目的基因的导入率。
(3)过程④是植物组织培养过程，在此过程中，需要防止杂菌污染，否则杂菌会竞争培养基中的营养物质，还可能产生有毒有害物质，导致油菜幼苗的生长发育受到影响。将目的基因导入受体细胞时，不是所有的细胞都能成功导入目的基因，因此所有细胞不一定都含有基因A。
(4)已知转录时基因A的模板链与酶1基因的模板链互补。相对普通油菜，含基因A的油菜籽粒油脂含量显著提高，其机理是：基因A转录的mRNA与酶1基因转录的mRNA互补，阻碍了酶1基因的mRNA翻译，降低了酶1含量，酶2对丙酮酸的竞争增强，促进了油脂合成。
4．(2018·贵州黔东南州一模)2017年8月2日，中华人民共和国农业部官网发布《2017年农业转基因生物安全证书(进口)批准清单》包含耐除草剂大豆MON87705、耐除草剂油菜T45、耐除草剂玉米T25等10多个转基因生物系列，回答下列问题：
(1)耐除草剂玉米T25植株的培育用到了基因工程技术，该过程以耐除草剂基因作为________(填“目的基因”或“标记基因”)。
(2)如果将耐除草剂基因插入到Ti质粒的________上，通过农杆菌的转化作用，可使该基因转移进入玉米细胞，并将其插入到玉米细胞中染色体的DNA上，这种将耐除草剂基因导入玉米细胞的方法叫做________。
(3)基因表达载体构建时，需用到________酶将耐除草剂基因和Ti质粒结合在一起，在基因表达载体中位于耐除草剂基因的首端和尾端分别具有________和________(填结构名称)，以启动和停止基因的转录。
(4)在耐除草剂玉米T25植株的培育过程中________(填“能”或“不能”)用动物病毒作为耐除草剂基因导入玉米细胞的载体，原因是________________。
答案 (1)目的基因 (2)T－DNA 农杆菌转化法
(3)DNA连接 启动子 终止子
(4)不能 病毒是专性寄生的，以动物病毒作为载体无法将目的基因导入到植物细胞(或农杆菌细胞)中
解析 (1)根据题意分析，利用基因工程技术培育了耐除草剂玉米T25植株，则耐除草剂基因为目的基因。
(2)将目的基因导入植物细胞(玉米细胞)应该用农杆菌转化法，先将耐除草剂基因插入到Ti质粒的T－DNA上，通过农杆菌的转化作用，将目的基因导入玉米细胞，并将其插入到玉米细胞中染色体的DNA上。
(3)构建基因表达载体时，需要利用DNA连接酶将目的基因(耐除草剂基因)与Ti质粒结合在一起，且目的基因必须插入启动子与终止子之间，以启动和停止基因的转录。
(4)病毒是专性寄生的，以动物病毒作为载体无法将目的基因导入到植物细胞中，因此在耐除草剂玉米T25植株的培育过程中不能用动物病毒作为耐除草剂基因导入玉米细胞的载体。
5．(2018·贵州适应性考试)人抗凝血酶Ⅲ是人体血液中一种重要的抗凝血因子，具有抑制血液中凝血酶活性的作用，利用人工合成的人抗凝血酶Ⅲ对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果。下图表示利用乳腺生物反应器生产人抗凝血酶Ⅲ的过程。
回答下列问题：
(1)乳腺生物反应器是指将目的基因与________的启动子等调控组件重组在一起，通过显微注射导入哺乳动物受精卵，最终获得转基因动物。转基因动物进入哺乳期后，可以通过分泌乳汁来生产所需要的药品。若将上述过程中受体细胞改为大肠杆菌，生产出来的人抗凝血酶Ⅲ往往不具有生物活性，原因是____________________________________。
(2)人抗凝血酶Ⅲ基因导入受精卵需要“分子运输车”(载体)。“分子运输车”应具备的条件是_______________________________________ _____________________。
(3)完成过程②所需的技术是________；早期胚胎能够在代孕羊体内存活的原因是________________。
(4)为了能从乳汁中分离出人抗凝血酶Ⅲ，需要对转基因羊进行性别鉴定，在胚胎移植前，最好取囊胚中________的细胞进行性别鉴定。转基因羊只有乳腺细胞分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ，其根本原因是________________________。
答案 (1)乳腺蛋白基因 大肠杆菌不含内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工和修饰
(2)自我复制的能力；有一个或多个限制酶的切割位点；带有标记基因；分子大小适宜
(3)早期胚胎培养 受体对外来胚胎一般不发生免疫排斥反应
(4)滋养层 人抗凝血酶Ⅲ基因只能在乳腺细胞中选择性表达
解析 动物乳腺生物反应器是基于转基因技术平台，使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，利用动物乳腺天然、高效合成并分泌蛋白的能力，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品的转基因动物的总称。据图分析，图中人抗凝血酶Ⅲ属于目的基因，过程①表示将目的基因导入受体细胞(供体羊的受精卵)，常用的方法是显微注射法；过程②表示早期胚胎培养；过程③表示胚胎移植技术。
(1)根据以上分析已知，该过程中目的基因是人抗凝血酶Ⅲ基因，利用基因工程技术最终通过分泌乳汁来生产所需要的人抗凝血酶，因此应该将该目的基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。若将受体细胞改为大肠杆菌，由于大肠杆菌没有内质网和高尔基体，不能对蛋白质进行加工和修饰，因此生产出来的人抗凝血酶Ⅲ往往不具有生物活性。
(2)基因工程中，作为运输目的基因的载体必须具备的条件有：自我复制的能力、有一个或多个限制酶的切割位点、带有标记基因、分子大小适宜等。
(3)根据以上分析已知，过程②表示早期胚胎培养技术；由于受体细胞对外来胚胎一般不发生免疫排斥反应，因此早期胚胎能够在代孕羊体内存活。
(4)用囊胚期胚胎进行性别鉴定时，可用分割针分割部分滋养层细胞进行性别鉴定；由于人抗凝血酶Ⅲ基因只能在乳腺细胞中选择性表达，所以转基因羊只有乳腺细胞分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ。
6．材料一：人类可利用转基因番茄作为生物反应器生产人胰岛素。所用的人胰岛素基因是依据植物“偏爱”的密码子来设计所含的密码子，通过人工合成若干DNA片段，拼接而成，并且在胰岛素?COOH端加上KDEL内质网滞留序列，避免胰岛素在植物细胞中的降解。将该基因置于果实专一性启动子的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中，在番茄的果实中表达人胰岛素。
材料二：T4溶菌酶在温度较高时易失去活性，科学家对编码T4溶菌酶的基因进行改造，使其表达的T4溶菌酶的第3位的异亮氨酸变为半胱氨酸，在该半胱氨酸与第97位的半胱氨酸之间形成了一个二硫键，提高了T4溶菌酶的耐热性。
(1)材料一中基因工程操作是采用________方法获得目的基因的。获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因中编码氨基酸的碱基序列不同，但两者所编码的蛋白质中氨基酸序列相同，这是因为密码子具有________。要想在体外获得大量该目的基因的片段，可以采用________技术。
(2)根据上述描述，转基因操作时所用的载体是______________，载体上的________可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
(3)材料二属于__________工程范畴。该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对________进行改造，或制造一种________的技术。
答案 (1)人工合成 简并性 PCR
(2)农杆菌的Ti质粒 T?DNA
(3)蛋白质 现有蛋白质 新蛋白质
解析 (1)根据题干信息可知材料一中基因工程操作是采用人工合成的方法获得目的基因的。虽然获得的人胰岛素基因与人体细胞中胰岛素基因中编码氨基酸的碱基序列不同，但所编码的蛋白质的氨基酸序列却相同，是由于密码子具有简并性，目的基因可以采用PCR技术扩增产生大量的目的基因。
(2)根据“将该基因置于果实专一性启动子的驱动之下通过农杆菌介导的方法转入番茄中”可知该过程的载体是农杆菌的Ti质粒，质粒上的T?DNA可以转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体的DNA上。
(3)材料二中的技术属于蛋白质工程的范畴，该工程是指以分子生物学相关理论为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有的蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质的技术。
7．(2018·安徽马鞍山质检)L－肉碱具有参与脂肪氧化、抗疲劳、延迟患阿尔茨海默综合症等功能。据报道大肠杆菌能将巴豆甜菜碱转化成L－肉碱，但效率较低。科研人员通过基因工程将BCD基因、F基因以及T基因导入到大肠杆菌细胞内以提高L－肉碱的转化率。实验过程及结果如下图所示，分析并回答下列问题：
(1)实验过程中用PCR技术获得目的基因，PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和______________。实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入到大肠杆菌细胞内，而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌，原因是________________，并能遗传给下一代。图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7，T7是________识别和结合的部位，能驱动基因转录。
(2)将重组质粒1和重组质粒2导入大肠杆菌时，应用____________处理大肠杆菌，使细胞处于______________________的感受态。
(3)为了筛选出同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌，实验的思路是____________________________________________________________。
(4)研究发现巴豆甜菜碱转化成L－肉碱是一个可逆反应过程，得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后，L－肉碱的含量基本稳定，此时可以____________________，以提高产量。
答案 (1)(两种)引物 使目的基因在受体细胞中稳定存在，能够表达(使目的基因在受体细胞中完成转化) RNA聚合酶
(2)Ca2＋ 易于吸收周围环境中DNA分子
(3)在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上挑选单克隆大肠杆菌
(4)及时移除产物(更换培养液)，使反应向生成L－肉碱的方向进行
解析 (1)多聚酶链式反应(PCR)，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，它能以极少量的DNA为模板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。PCR反应体系需要加入的有机物有DNA模板、dNTP、耐高温DNA聚合酶和(两种)引物。由于目的基因无法直接在受体细胞中表达，因此为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，能够表达，并能遗传给下一代，实验过程中不能将BCD基因、F基因以及T基因直接导入到大肠杆菌细胞内，而是构建重组质粒后再导入大肠杆菌。图中两个重组质粒目的基因的首端都含有启动子T7，T7是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录。
(2)使体外重组的DNA分子转移到受体细胞内，主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。一般将受体大肠杆菌用Ca2＋处理，使细胞处于易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，使含有目的基因的重组质粒容易进入受体细胞。
(3)重组质粒1上含有BCD基因及卡那霉素抗性基因，重组质粒2上含有F基因、T基因及氯霉素抗性基因，因此在同时含有卡那霉素和氯霉素培养基上挑选得到的单克隆大肠杆菌，就是同时含有BCD基因、F基因以及T基因的大肠杆菌。
(4)研究发现巴豆甜菜碱转化成L－肉碱是一个可逆反应过程，在可逆反应中，减少生成物浓度，可使反应向正方向进行。因此得到的工程菌在含有巴豆甜菜碱培养基中培养2小时后，L－肉碱的含量基本稳定，此时可以及时移除产物(更换培养液)，使反应向生成L－肉碱的方向进行，以提高产量。
8．(2018·山东烟台二模)干扰素是动物和人体细胞受到病毒感染后产生的一种糖蛋白，具有抗病毒、抑制细胞增殖及抗肿瘤作用。利用基因工程技术培育能生产干扰素的植物流程如图所示。请回答下列问题：
(1)首先获取的动物干扰素基因称为________。利用PCR技术扩增干扰素基因时，设计引物序列的主要依据是________________________。
(2)过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是________和________。酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列________。
(3)过程②中将重组质粒导入根瘤农杆菌时，常用________处理根瘤农杆菌，其目的是__________________。
(4)在培育愈伤组织的固体培养基中，除了无机盐、有机营养物质、琼脂、植物激素外，还需添加卡那霉素。卡那霉素的作用是______________________。在分子水平上通常采用________________技术检测干扰素基因是否导入受体细胞。
答案 (1)目的基因 干扰素基因两端的部分核苷酸序列
(2)BamHⅠ EcoRⅠ 不相同
(3)Ca2＋ 使其成为感受态细胞，处于一种能吸收周围环境中DNA的状态
(4)筛选出导入重组质粒的植物细胞 DNA分子杂交
解析 (1)在基因工程中，获取的动物干扰素基因称为目的基因。利用PCR技术扩增干扰素基因时，需要依据干扰素基因两端的部分核苷酸序列设计引物序列。
(2)题图显示：干扰素基因中存在SmaⅠ的识别位点，若使用SmaⅠ切割质粒和外源DNA，则会破坏干扰素基因，因此过程①所示的构建重组质粒时不能使用SmaⅠ切割。BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点位于目的基因的两侧，质粒上也有BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点，因此，过程①中剪切质粒和目的基因时所需要的工具酶是BamHⅠ和EcoRⅠ。因BamHⅠ和EcoRⅠ的识别位点不同，所以酶切后，目的基因形成的两个黏性末端序列不相同。
(3)过程②中将重组质粒导入根瘤农杆菌时，常用Ca2＋处理根瘤农杆菌，使其成为感受态细胞，方便DNA分子进入。
(4)重组质粒中含有的抗卡那霉素基因属于标记基因，其作用是鉴别受体细胞是否含有目的基因，便于筛选。可见，在培育愈伤组织的固体培养基中添加卡那霉素的作用是筛选出导入重组质粒的植物细胞。在分子水平上检测干扰素基因是否导入受体细胞，通常采用DNA分子杂交技术。
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考点1 基因工程的操作工具
考点2 基因工程的基本程序
考点3 基因工程的应用及蛋白质工程
实验16 DNA的粗提取与鉴定
高考热点突破
第34讲 基因工程
[考纲明细] 1.基因工程的诞生(Ⅰ) 2.基因工程的原理及技术(含PCR技术)(Ⅱ) 3.基因工程的应用(Ⅱ) 4.蛋白质工程(Ⅰ) 5.实验：DNA的粗提取与鉴定
考点1 基因工程的操作工具
1．基因工程概念
2．限制酶
(1)存在：主要存在于原核生物中。
(2)作用：识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
3．DNA连接酶
(1)作用：将双链DNA片段“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸间的磷酸二酯键。
(2)种类
(3)DNA连接酶和限制酶的关系
4．载体
(1)条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切割位点；具有标记基因。
(3)作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
(4)特点：可在受体细胞中进行自我复制或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。
1．(选修3 P6寻根问底)DNA连接酶和DNA聚合酶的作用相同吗？试简要说明。
提示 不相同。DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶连接的是单个的脱氧核苷酸。
2．(选修3 P4寻根问底、P7思考与探究T2)限制酶主要来自于原核生物，为什么它不剪切自身的DNA？试推测其在原核生物中的作用。
提示 限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别特定的碱基序列，并在特定的位点上进行切割；限制酶不切割原核生物自身DNA的原因是原核生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制。限制酶就是原核生物的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，原核生物会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起切割外源DNA、使之失效的作用，从而达到保护自身的目的。
3．(选修3 P7思考与探究T3)天然的DNA分子是否可以直接用做基因工程载体？为什么？
提示 不可以。具有能自我复制、有一个或多个限制酶切割位点、有标记基因及对受体细胞无害等特点的DNA分子才可以直接用作基因工程的载体。实际上天然的DNA分子一般不完全具备上述条件，往往需要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
题组 基因工程工具酶分析
1．(2016·全国卷Ⅲ)图a中的三个DNA片段上依次表示出了EcoRⅠ、BamHⅠ和Sau3AⅠ三种限制性核酸内切酶的识别序列与切割位点，图b为某种表达载体的示意图(载体上的EcoRⅠ、Sau3AⅠ的切点是唯一的)。
根据基因工程的有关知识，回答下列问题：
(1)经BamHⅠ酶切后得到的目的基因可以与上述表达载体被________酶切后的产物连接，理由是_________________________________________ ___________________________________________________。
(2)若某人利用图b所示的表达载体获得了甲、乙、丙三种含有目的基因的重组子，如图c所示。这三种重组子中，不能在宿主细胞中表达目的基因产物的有________，不能表达的原因是____________________________________________ ____________________________________________________________________________________________________。
图c
(3)DNA连接酶是将两个DNA片段连接起来的酶，常见的有________________和________________，其中既能连接黏性末端又能连接平末端的是______________________。
答案 (1)Sau3AⅠ 两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端
(2)甲和丙 甲中目的基因插入在启动子的上游，丙中目的基因插入在终止子的下游，二者的目的基因均不能被转录(其他合理答案也可)
(3)E·coliDNA连接酶 T4DNA连接酶 T4DNA连接酶
解析 (1)分析图a可知，限制酶Sau3AⅠ与BamHⅠ切割DNA后形成的黏性末端相同，故经这两种酶切割得到的产物可以用DNA连接酶进行连接。
(2)构建基因表达载体时，为保证目的基因能在宿主细胞中成功表达，目的基因应插入在启动子和终止子之间，据此可判断甲、丙均不符合要求，目的基因均不能表达。
(3)常见的DNA连接酶有E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶，其中T4DNA连接酶既能连接黏性末端又能连接平末端。
知识拓展
归纳与DNA相关的六种酶
题组 载体的作用及特点
2．(2016·全国卷Ⅰ)某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活(Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因)。有人将此质粒载体用BamHⅠ酶切后，与用BamHⅠ酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌。结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。回答下列问题：
(1)质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有__________________________(答出两点即可)，而作为基因表达载体，除满足上述基本条件外，还需具有启动子和终止子。
(2)如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是______________________________________________；并且____________________________________和____________________________________的细胞也是不能区分的，其原因是____________________________________________________。
在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌单菌落，还需使用含有________________________的固体培养基。
(3)基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于______________________。
答案 (1)能自我复制、具有标记基因(答出两点即可)
(2)二者均不含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均不生长 含有质粒载体 含有插入了目的基因的重组质粒(或含有重组质粒) 二者均含有氨苄青霉素抗性基因，在该培养基上均能生长 四环素
(3)受体细胞
解析 (1)质粒作为载体，应具备的基本条件有：有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段(基因)插入其中；在受体细胞中能自我复制，或能整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制；有特殊的标记基因，供重组DNA的鉴定和选择等。
(2)在培养基中加入氨苄青霉素进行筛选，其中未被转化的大肠杆菌和仅含环状目的基因的大肠杆菌，因不含氨苄青霉素抗性基因而都不能在此培养基上存活，二者不能区分。含有质粒载体的大肠杆菌和含有插入了目的基因的质粒的大肠杆菌中都含有氨苄青霉素抗性基因，都能在此培养基上存活，二者也不能区分。若要将含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌进一步筛选出来，还需要使用含有四环素的固体培养基。
(3)某些噬菌体经改造后作为载体，导入受体细胞后，其DNA复制所需的原料来自于受体细胞。
考点2 基因工程的基本程序
1．目的基因的获取
(1)目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
(3)几种目的基因获取方法的比较
(4)PCR技术的原理和反应过程
①PCR原理：DNA双链复制
②PCR反应过程
③结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式扩增。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
2．基因表达载体的构建——基因工程的核心
(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
(2)基因表达载体的组成
(3)构建过程
深挖教材
(1)获取目的基因与切割载体时只能用同一种限制酶吗？
提示 不是。在获取目的基因和切割载体时通常用同种限制酶，以获得相同的黏性末端。但如果用不同限制酶切割后形成的黏性末端相同，在DNA连接酶的作用下目的基因与载体也可以连接起来。
(2)启动子与起始密码子、终止子与终止密码子是一回事吗？
提示 启动子与起始密码子、终止子与终止密码子看起来差不多，实际上却是两组不同的概念。简单地说，启动子和终止子都是一段有特殊结构的DNA片段，属于基因的非编码序列，负责调控基因的转录。而起始密码子和终止密码子都是mRNA上的三联体密码子，分别决定翻译的起始和终止。
3．将目的基因导入受体细胞
4．目的基因的检测与鉴定
(1)分子水平的检测
①利用DNA分子杂交技术检测目的基因的有无。
②利用分子杂交技术检测目的基因的转录。
③利用抗原—抗体杂交技术检测目的基因的翻译。
(2)个体生物学水平的鉴定，如抗虫、抗病的接种实验等。
1．(选修3 P11寻根问底)将生物所有DNA直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？
提示 有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射等方法导入受体植物，没有进行基因表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多。
2．(选修3 P15思考与探究T3)利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系细胞器知识，结合基因工程操作程序的基本思路，可以用大肠杆菌生产人的糖蛋白吗？
提示 不可以。糖蛋白上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌中不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。
3．(选修3 P15思考与探究T4)利用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的β－珠蛋白，应如何进行设计？
提示 基本操作如下。
(1)从小鼠中克隆出β－珠蛋白基因的编码序列(cDNA)。
(2)将cDNA前后分别接上在大肠杆菌中可以适用的启动子和终止子，然后用限制酶和DNA连接酶将其整合到含四环素抗性基因的载体上，构建一个基因表达载体。
(3)将基因表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有四环素抗性基因而死亡；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明β－珠蛋白基因已进入大肠杆菌。
(4)培养含有β－珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，从中提取β－珠蛋白。
题组 基因表达载体构建时限制酶的选择
1．(2016·江苏高考)下表是几种限制酶识别序列及其切割位点，图1、图2中标注了相关限制酶的酶切位点，其中切割位点相同的酶不重复标注。请回答下列问题：
(1)用图中质粒和目的基因构建重组质粒，应选用________两种限制酶切割，酶切后的载体和目的基因片段，通过________酶作用后获得重组质粒。为了扩增重组质粒，需将其转入处于________态的大肠杆菌中。
(2)为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加________，平板上长出的菌落，常用PCR鉴定，所用的引物组成为图2中________________________。
(3)若BamHⅠ酶切的DNA末端与BclⅠ酶切的DNA末端连接，连接部位的6个碱基对序列为________，对于该部位，这两种酶________(填“都能”“都不能”或“只有一种能”)切开。
(4)若用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得________种大小不同的DNA片段。
答案 (1)BclⅠ和HindⅢ DNA连接 感受
(2)四环素 引物甲和引物丙
(3) 都不能 (4)7
解析 (1)由题图可知，质粒的两个标记基因中都含有BamHⅠ的切点，因此不能用BamHⅠ进行切割，结合题干及表中信息可知也不能用Sau3AⅠ进行切割，所以只能用质粒和目的基因中都含有切点的BclⅠ和HindⅢ这两种限制酶来切割目的基因和质粒。酶切后的载体和目的基因片段，通过DNA连接酶作用后获得重组质粒。要将重组质粒转入大肠杆菌，要先用CaCl2处理大肠杆菌，使其处于感受态。
(2)重组质粒中只含有四环素抗性基因这一个标记基因，所以为了筛选出转入了重组质粒的大肠杆菌，应在筛选平板培养基中添加四环素，含有重组质粒的大肠杆菌能在该平板上长出菌落。要用PCR扩增目的基因，所用的引物组成为图2中引物甲和引物丙，因为从图2中可以看出，引物甲与引物丙与模板链结合后能完成目的基因的复制。
(3)BamHⅠ酶切的DNA末端是，BclⅠ酶切的DNA末端是，这两个末端连接后的连接部位的6个碱基对序列为，由于连接后的6个碱基对序列不是BamHⅠ和BclⅠ的识别序列，故对于该部位BamHⅠ和BclⅠ都不能将其切开。
(4)因为质粒的BamHⅠ和BclⅠ识别序列中都有Sau3AⅠ的识别序列和切割位点，所以用Sau3AⅠ切图1质粒最多可能获得7种大小不同的DNA片段。Sau3AⅠ切点及得到的7种大小不同的DNA片段情况如下：①切点在1或2或3的位置可以分别得到1种DNA分子，但其大小相同；②切点在1和2的位置可以得到2种DNA分子；③切点在1和3的位置可以得到2种DNA分子；④切点在2和3的位置可以得到2种DNA分子，故最多可能获得7种大小不同的DNA片段。
技法提升
选择限制酶的方法
(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能会丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后将不能自主复制。
题组 PCR技术的原理及应用
2．(2017·江苏高考)金属硫蛋白(MT)是一类广泛存在的金属结合蛋白，某研究小组计划通过多聚酶链式反应(PCR)扩增获得目的基因，构建转基因工程菌，用于重金属废水的净化处理。PCR扩增过程示意图如下，请回答下列问题：
(1)从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过________获得________用于PCR扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便构建重组质粒，在引物中需要增加适当的____________________位点。设计引物时需要避免引物之间形成______________________，而造成引物自连。
(3)图中步骤1代表________，步骤2代表退火，步骤3代表延伸，这三个步骤组成一轮循环。
(4)PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度过高会破坏________的碱基配对。退火温度的设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但________的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，则可以采取的改进措施有________(填序号：①升高退火温度 ②降低退火温度 ③重新设计引物)。
答案 (1)逆转录 cDNA
(2)限制性核酸内切酶 碱基互补配对
(3)变性 (4)引物与模板 GC含量高 (5)②③
解析 (1)目的基因的获取：从高表达MT蛋白的生物组织中提取mRNA，通过逆转录获得cDNA用于PCR的扩增。
(2)设计一对与MT基因两端序列互补配对的引物(引物1和引物2)，为方便基因与载体相连构建重组质粒，在引物中需要增加适当的限制性核酸内切酶位点。为了避免引物自连，设计引物时需要避免引物之间形成碱基互补配对。
(3)根据PCR的过程可知，图中步骤1为变性，步骤2为退火，步骤3为延伸，这三个步骤构成一轮循环。
(4)退火温度过高，会破坏引物与模板的碱基配对。因A、T之间形成两个氢键，G、C之间形成三个氢键，形成G、C碱基对需要更多的能量，故需要更高的温度。
(5)如果PCR反应得不到任何扩增产物，可能的原因是退火温度过高，或者设计的引物不合适，不能与模板结合。因此可采取的改进措施有降低退火温度、重新设计引物等。
知识拓展
生物体内DNA复制与PCR反应的区别
题组 基因工程操作程序及实例
3．(2017·北京高考)为了增加菊花花色类型，研究者从其他植物中克隆出花色基因C(图1)，拟将其与质粒(图2)重组，再借助农杆菌导入菊花中。
下列操作与实验目的不符的是( )
A．用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和连接酶构建重组质粒
B．用含C基因的农杆菌侵染菊花愈伤组织，将C基因导入细胞
C．在培养基中添加卡那霉素，筛选被转化的菊花细胞
D．用分子杂交方法检测C基因是否整合到菊花染色体上
答案 C
解析 C基因两端有EcoRⅠ酶切位点，可用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和(DNA)连接酶构建重组质粒，A正确；一般用农杆菌等作为媒介去侵染植物的愈伤组织等，将含有目的基因的质粒导入细胞，B正确；据图可知，质粒中含有潮霉素抗性基因，不含卡那霉素抗性基因，故无法用卡那霉素来筛选被转化的菊花细胞，C错误；检测C基因是否整合到菊花染色体上，常采用DNA分子杂交技术，即在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素等作为标记，以此作为探针，使探针与C基因杂交，若显示出杂交带，则表明目的基因已插入染色体DNA中，D正确。
4．(2018·全国卷Ⅱ)某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因(简称为甲)，并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题：
(1)据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是____________。使用这两种酶进行酶切是为了保证______________，也是为了保证__________________。
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。
(3)为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________________________中、体外培养、胚胎移植等。
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定。在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________(填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。
答案 (1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译
(3)细胞核 去核卵母细胞
(4)核DNA
解析 (1)甲是将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端而获得的L1－GFP融合基因，据此结合题意并分析图示可知：该团队在将甲插入质粒P0时，如果用E2或E3，则目的基因不完整，而使用E1和E4这两种限制酶进行酶切保证了甲的完整，而且也保证了甲与载体正确连接，因此，使用的两种限制酶是E1和E4。
(2)构建的真核表达载体P1中含有GFP基因，而GFP基因的表达产物“某种荧光蛋白(GFP)”在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光。若在导入P1的牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了表达，基因的表达过程包括转录和翻译。
(3)若要获得含有甲的牛，可采用核移植技术，即将能够产生绿色荧光细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中获得重组细胞，并将该重组细胞在体外培养成重组胚胎，再经过胚胎移植等获得含有甲的牛。
(4)PCR是多聚酶链式反应的缩写，是一种在生物体外复制特定DNA片断的核酸合成技术。若利用PCR方法检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，则应分别以该牛不同组织细胞中的核DNA作为PCR模板。
考点3 基因工程的应用及蛋白质工程
1．基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速率，从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如抗烟草花叶病毒的转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。
(3)比较基因治疗与基因诊断
2．蛋白质工程
(1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因修饰或基因合成。
③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
④目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。
(2)操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)。其流程图如下：
1．(选修3 P26旁栏思考)对天然蛋白质进行改造，你认为应该直接对蛋白质分子进行操作，还是通过对基因的操作来实现？
提示 毫无疑问应该从对基因的操作来实现对天然蛋白质改造，主要原因如下：①任何一种天然蛋白质都是由基因编码的，改造了基因即对蛋白质进行了改造，而且改造过的基因可以遗传下去。如果对蛋白质直接改造，即使改造成功，被改造过的蛋白质分子还是无法遗传的。②对基因进行改造比对蛋白质直接改造要容易操作，难度要小得多。
2．(选修3 P24拓展视野)基因芯片的原理、检测方法、应用分别是什么？
提示 原理：DNA分子杂交技术。检测方法：荧光标记法。应用：基因诊断、新药筛选、临床用药指导等方面。
3．(选修3 P27讨论T2)确定目的基因的碱基序列后，怎样才能合成或改造目的基因？
提示 确定目的基因的碱基序列后，可以根据人类的需要改造它，通过人工合成的方法或从基因文库中获取。
4．(选修3 P27异想天开)能否应用蛋白质工程，让细菌生产人类所需要的蛋白质食品？
提示 理论上讲可以，但目前还没有真正成功的例子。一些报道利用细菌生产人类需要的蛋白质往往都是自然界已经存在的蛋白质，并非完全由人工设计出来而自然界不存在的。主要原因是蛋白质的高级结构非常复杂，人类对蛋白质的高级结构和蛋白质在生物体内如何行使功能知之甚少，很难设计出一个崭新而又具有生命功能的蛋白质，而且一个崭新的蛋白质会带来什么危害也是人们所担心的。
5．(选修3 P28思考探究T3)绝大多数酶是蛋白质，那么酶工程与蛋白质工程有什么区别？
提示 通常所说的酶工程是用工程菌生产酶制剂，而没有经过由酶的功能来设计酶的分子结构，然后由酶的分子结构来确定相应基因的碱基序列等步骤。因此，酶工程的重点在于对已存在的酶的合理充分利用，而蛋白质工程的重点则在于对已存在的蛋白质分子的改造。当然，随着蛋白质工程的发展，其成果也会应用到酶工程中，使酶工程成为蛋白质工程的一部分。
辨析乳腺生物反应器与工程菌生产药物
题组 基因工程应用及实例
1．(2018·天津高考)甲型流感病毒为RNA病毒，易引起流感大规模流行。我国科学家在2017年发明了一种制备该病毒活疫苗的新方法，主要环节如下。
(1)改造病毒的部分基因，使其失去在正常宿主细胞内的增殖能力。以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用________技术扩增，并将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列。与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的________，因此不能产生子代病毒。将该改造基因、表面抗原基因等其他基因分别构建重组质粒，并保存。
(2)构建适合改造病毒增殖的转基因宿主细胞。设计合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)。将该基因与________连接后导入宿主细胞。提取宿主细胞的________进行分子杂交鉴定，筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)利用转基因宿主细胞制备疫苗。将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加________的培养基中进行培养，则该宿主细胞能利用上述特殊tRNA，翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。特殊tRNA基因转录时，识别其启动子的酶是________(单选)。
A．病毒的DNA聚合酶 B．宿主的DNA聚合酶
C．病毒的RNA聚合酶 D．宿主的RNA聚合酶
(4)上述子代病毒不能在正常宿主细胞中增殖，没有致病性，因此不经灭活或减毒即可制成疫苗。与不具侵染性的流感病毒灭活疫苗相比，该病毒活疫苗的优势之一是可引起________免疫，增强免疫保护效果。
答案 (1)PCR 多肽(或蛋白质)
(2)载体 总RNA
(3)非天然氨基酸(Uaa) D
(4)细胞
解析 (1)PCR技术是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。因此以病毒RNA为模板，逆转录成对应DNA后，利用PCR技术扩增，由于将其中某些基因(不包括表面抗原基因)内个别编码氨基酸的序列替换成编码终止密码子的序列，因此肽链合成提前终止，这样与改造前的基因相比，改造后的基因表达时不能合成完整长度的多肽(或蛋白质)，因此不能产生子代病毒。
(2)基因工程的核心步骤为基因表达载体的构建，将该基因与载体连接后才能导入宿主细胞，检测目的基因是否成功表达上述tRNA时，利用核酸分子杂交技术，即用相应的DNA探针与宿主细胞的总RNA分子进行杂交鉴定，进而筛选获得成功表达上述tRNA的转基因宿主细胞。
(3)因为设计的宿主细胞具有能合成一种特殊tRNA的基因，其产物的反密码子能与(1)中的终止密码子配对结合，并可携带一个非天然氨基酸(Uaa)，因此将(1)中的重组质粒导入(2)中的转基因宿主细胞，并在补加非天然氨基酸(Uaa)的培养基中进行培养，则该宿主细胞可翻译出改造病毒基因的完整蛋白，产生大量子代病毒，用于制备疫苗。因为转录在宿主细胞内进行，且启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，因此需要使用宿主细胞的RNA聚合酶。故选D。
(4)不具侵染性的流感病毒灭活疫苗，不能侵入细胞内部，只能引起体液免疫，产生相应的抗体与记忆细胞，而该疫苗能够侵入细胞，引起的免疫属于细胞免疫。
题组 蛋白质工程
2．(2015·全国卷Ⅱ)已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因。所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过__________________和__________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
答案 (1)氨基酸序列(或结构)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、逆转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
解析 (1)从题中所述资料可知，将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸后，该蛋白质的功能发生了改变，此过程是通过对构成蛋白质的氨基酸序列进行改造，进而改变了蛋白质的结构，从而改变了蛋白质的功能。
(2)在蛋白质工程中，目的基因可以以P基因序列为基础，对生物体内原有P基因进行修饰，也可以通过人工合成法合成新的P1基因。所获得的基因表达时遵循中心法则，中心法则的全部内容包括DNA和RNA复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即DNA→RNA，RNA→DNA，RNA→蛋白质。
(3)蛋白质工程的基本途径是从预期蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到对应的脱氧核苷酸序列，据此得到的蛋白质，还需要对其生物功能进行鉴定，以保证其发挥正常作用。
知识拓展
蛋白质工程与基因工程的比较
(1)区别
(2)联系
①蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。
②基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
实验16 DNA的粗提取与鉴定
1．DNA粗提取和鉴定的原理
(1)提取思路：利用DNA和其他物质在理化性质方面的差异，提取DNA。
(2)DNA的性质：(提取和鉴定原理)
①DNA在不同浓度的NaCl溶液中的溶解度不同
②DNA不溶于酒精；
③对酶、高温和洗涤剂的耐受性强；
④DNA＋二苯胺试剂蓝色。
2．DNA粗提取和鉴定的操作流程
1．(2018·扬州江都中学段考)下列有关“DNA的粗提取与鉴定”实验的叙述，错误的是( )
A．DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水
B．向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了释放出DNA
C．向浓盐溶液中加蒸馏水是为了析出DNA
D．用菜花替代鸡血做实验，其实验操作步骤相同
答案 D
解析 DNA既溶于2 mol/L的NaCl溶液也溶于蒸馏水，A正确；向鸡血细胞液中加蒸馏水是为了让鸡血细胞吸水涨破，从而释放出DNA，B正确；向溶解DNA的浓盐溶液中加蒸馏水是为了降低DNA的溶解度，进而析出DNA，C正确；用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤不完全相同，如植物细胞有细胞壁，破碎细胞时需要研磨并加入食盐和洗涤剂，D错误。
2．实验中对DNA进行鉴定时，做如下操作：
(1)根据下图，完成表格空白处的实验内容。
(2)对于B试管，完成1、2、3的操作后溶液颜色如何变化？_____________________________________________________________________。
(3)在沸水浴中加热的目的是______________，同时说明DNA对高温有较强的________。
(4)A试管在实验中的作用是________。
(5)B试管中溶液颜色的变化程度主要与__________________________有关。
答案 (1)溶液不变蓝色 溶液逐渐变蓝色 DNA在沸水浴的情况下遇二苯胺会被染成蓝色
(2)溶液颜色基本不变
(3)加快颜色反应速度 耐受性 (4)对照
(5)加入试管中的DNA(丝状物)的多少
解析 A、B两试管形成对照，B试管中含DNA丝状物，A试管中不含，起对照作用，其他条件均完全相同。本实验强调反应条件是沸水浴加热5 min，这样可加快颜色反应的速度，观察对比两试管的颜色时要等到冷却以后。
题后归纳
DNA的粗提取与鉴定实验中的“2、4、4”
高考热点突破
1．(2018·全国卷Ⅰ)回答下列问题：
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了__________________________________________________________________ ________(答出两点即可)。
(2)体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆菌细胞，而体外重组的噬菌体DNA通常需与______________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞。在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是____________。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解，在实验中应选用__________________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。
答案 (1)体外重组的质粒可以进入受体细胞；真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化 外壳蛋白(或噬菌体蛋白) 细菌
(3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
解析 (1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该过程证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞，真核生物基因可在原核细胞中表达等。
(2)用Ca2＋处理大肠杆菌细胞，可以增大细胞膜的通透性，使重组的质粒更容易导入到受体细胞内，因此体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的转化方法导入大肠杆菌细胞。体外重组的噬菌体DNA通常需与蛋白质外壳组装成完整的噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组噬菌体DNA导入受体细胞。噬菌体侵染的是细菌，而不能寄生在其他细胞中，因此可作为重组噬菌体宿主细胞的是细菌。
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解，为防止蛋白质被降解，可以选用不能产生该蛋白酶的缺陷细菌以及使用能够抑制蛋白酶活性的药物，因此为防止蛋白质被降解，在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加蛋白酶的抑制剂。
2．(2017·全国卷Ⅰ)真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_____________________________________ ___________________________________________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用__________作为载体，其原因是
________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有____________________________________________________________ ___________________________________________________________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________。
答案 (1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A
(2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕
(3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
解析 (1)人是真核生物，从人的基因组文库中获得的基因A有内含子，而受体细胞大肠杆菌是原核生物，原核生物基因中没有内含子，相应的就没有切除内含子对应的RNA序列的机制，故无法表达出蛋白A。
(2)噬菌体是专一性侵染细菌的病毒，以细菌为宿主细胞，而昆虫病毒侵染的是昆虫，以昆虫为宿主细胞。家蚕属于昆虫，故应选用昆虫病毒作为载体。
(3)与家蚕相比，大肠杆菌具有繁殖快、容易培养等优点，故要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。
(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，可用抗原—抗体杂交法。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验中，S型细菌的DNA可以使R型细菌发生转化，说明可调控多糖荚膜产生的基因整合到了R型细菌的DNA分子中并成功得以表达。也就是说DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体并进行表达，这就为基因工程理论的建立提供了启示。
3．(2017·全国卷Ⅱ)几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。回答下列问题：
(1)在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是________________________。提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是____________________。
(2)以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
(3)若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________(答出两点即可)。
(4)当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是________________________。
(5)若获得的转基因植株(几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中)抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是________________________________________________________________________。
答案 (1)嫩叶比老叶生命活动旺盛，mRNA含量高，且易破碎 防止RNA降解
(2)在逆转录酶的作用下，以mRNA为模板按照碱基互补配对的原则可以合成cDNA
(3)目的基因无复制原点；目的基因无表达所需启动子
(4)磷酸二酯键
(5)目的基因的转录或翻译异常
解析 (1)与老叶相比，嫩叶生命活动旺盛，mRNA含量高，且易破碎，容易提取到几丁质酶的mRNA。提取RNA时，提取液中添加RNA酶抑制剂可防止RNA被RNA酶催化降解。
(2)以mRNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，通过逆转录(反转录)可以获得cDNA。
(3)因该目的基因是通过逆转录形成的，无表达所需的启动子，也无在受体细胞内进行复制所需的复制原点等，所以在受体细胞内不能稳定存在和表达，也不能遗传下去。
(4)构建基因表达载体时，DNA连接酶能催化目的基因和质粒载体这两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。
(5)转基因植株的基因组中含有几丁质酶基因，但该植株抗真菌的能力并没有提高，可能是由于转录或翻译异常，即几丁质酶基因未能正常表达。
4．(2017·全国卷Ⅲ)编码蛋白甲的DNA序列(序列甲)由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。
回答下列问题：
(1)现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是________________________________________________________________________。
(2)某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为______________，加入了______________作为合成DNA的原料。
(3)现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。
①由图2可知：当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是__________________。细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是______________________。
②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少________(填“A”“B”“C”“D”或“E”)片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
答案 (1)编码乙的DNA序列起始端无ATG，转录出的mRNA无起始密码子
(2)模板 dNTP
(3)①进行细胞传代培养 维持培养液的pH ②C
解析 (1)若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列(TTCGCTTCT……CAGGAAGGA)，则基因表达载体中编码乙的DNA序列起始端无ATG，无论以DNA的哪条链为模板，转录出的mRNA都无起始密码子AUG，使所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙。
(2)在PCR技术中，除了引物和耐高温的DNA聚合酶外，还需要序列甲(DNA片段)作为模板，dNTP(脱氧核苷酸)作为原料。
(3)①当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，可能是由于发生了接触抑制，可用胰蛋白酶处理贴壁生长的细胞，制成细胞悬液分瓶继续传代培养。动物细胞培养中，CO2的作用是维持培养液的pH。
②对照分析图1和图2可知，能刺激T淋巴细胞增殖的甲和乙中都含有C片段，而对T淋巴细胞增殖促进作用很弱的丙中没有C片段，据此可知，若缺少C片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。
5．(2018·江苏高考)为生产具有特定性能的α－淀粉酶，研究人员从某种海洋细菌中克隆了α－淀粉酶基因(1656个碱基对)，利用基因工程大量制备α－淀粉酶，实验流程见图。请回答下列问题：
(1)利用PCR技术扩增α－淀粉酶基因前，需先获得细菌的________。
(2)为了便于扩增的DNA片段与表达载体连接，需在引物的________端加上限制性酶切位点，且常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点，主要目的是________________________________________________。
(3)进行扩增时，反应的温度和时间需根据具体情况进行设定，下列选项中________的设定与引物有关，________的设定与扩增片段的长度有关。(填序号)
①变性温度 ②退火温度 ③延伸温度 ④变性时间
⑤退火时间 ⑥延伸时间
(4)下图表示筛选获得的工程菌中编码α－淀粉酶的mRNA的部分碱基序列：
图中虚线框内mRNA片段包含________个密码子，如虚线框后的序列未知，预测虚线框后的第一个密码子最多有________种。
(5)获得工程菌表达的α－淀粉酶后，为探究影响酶活性的因素，以浓度为1%的可溶性淀粉为底物测定酶活性，结果如下：
根据上述实验结果，初步判断该α－淀粉酶活性最高的条件为____________________________________________________。
答案 (1)基因组DNA
(2)5′ 使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连
(3)② ⑥ (4)8 13
(5)pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris－HCl
解析 (1)α?淀粉酶基因来自于海洋细菌，因此为了利用PCR技术扩增α?淀粉酶基因，必须先获得细菌的基因组DNA。
(2)目的基因与载体结合前需要用限制酶对两者进行切割，延伸是在引物的3′端延伸，为了保证目的基因的完整性，因此需在引物的5′端加上限制性酶切位点，且为了使DNA片段能定向插入表达载体，减少自连，常在两条引物上设计加入不同的限制性酶切位点。
(3)进行扩增时，退火温度的设定与引物有关，延伸时间的设定与扩增片段的长度有关。
(4)根据题意分析，虚线框内mRNA片段内含有24个碱基，每3个碱基构成一个密码子，因此包含24÷3＝8个密码子；构成mRNA的碱基有4种，因为虚线外第一个密码子已固定为U，且三个终止密码子皆为U开头，所以预测虚线框后的第一个密码子最多有4×4－3＝13种。
(5)根据表格数据分析可知，在pH为8.5，缓冲液为50 mmol/L Tris－HCl的条件下，α?淀粉酶相对活性为99.5%，活性最高。
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