微生物的培养与应用
1．(2018·成都龙泉二中月考)幽门螺杆菌简称Hp，主要寄生在胃幽门、胃窦等附近的黏膜上，是人类至21世纪初唯一的已知胃部细菌。Hp可产生高活性的脲酶，可将尿素分解成氨和CO2。
(1)制备幽门螺杆菌培养基时，需将培养基的pH调至________性。培养皿进行灭菌的常用方法是________。倒平板时要待平板冷凝后，将平板倒置，其主要原因是________________________。
(2)图①表示的是用________法接种培养后得到的结果。图②是在纯化过程中通过________法分离培养的结果，在培养基上接种时接种环需通过灼烧灭菌，完成图中划线操作，至少需要灼烧接种环________次。
(3)为检测某人体内是否感染了Hp，可让其服用14C标记的__________，定时收集呼出的气体，通过分析呼气中14C标记的CO2的含量即可判断。该检测方法和卡尔文研究光合作用的方法一样可称为________法。
答案 (1)酸 干热灭菌 防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染
(2)稀释涂布平板 平板划线 4
(3)尿素 同位素标记(或同位素示踪)
解析 (1)因为幽门螺杆菌生活在胃部，所以其培养基的pH应偏酸性。对培养皿玻璃器皿可以采用干热灭菌法。平板冷凝后，将平板倒置的目的是防止培养皿盖上的冷凝水落入培养基造成污染。
(2)由图①分析可知菌落均匀分布，所以是利用稀释涂布平板法接种的，而图②是利用平板划线法接种的，在每次接种前和最后接种后都要对接种环进行灭菌，由图可知划线3次，所以至少需要灼烧4次。
(3)因为Hp可产生高活性的脲酶，所以可以让病人服用14C标记的尿素，尿素会被分解为二氧化碳和氨，定时收集呼出的气体，通过分析呼气中14C标记的CO2的含量即可判断。该方法利用了同位素标记法。
2．(2018·四川双流中学月考)莠去津是一种含氮的有机除草剂，在土壤中不易降解。为修复被莠去津污染的土壤，科研人员通过如图所示过程选育可高效降解莠去津的细菌(目的菌)。结合所学知识，回答下列问题：
(1)培养皿中的培养基比培养瓶中的培养基多添加了____________作为凝固剂，从功能上讲，这两种培养基都属于____________培养基。若过程②使用的是平板划线法，则对接种环常用的灭菌方法是____________。
(2)分解莠去津的微生物属于____________(填“自养”或“异养”)微生物，培养若干天后，应选择培养液中莠去津含量____________的培养瓶进行过程②。为了避免杂菌污染，接种操作需要在____________________附近进行。图中培养过程重复多次的主要目的是____________。
(3)若要获得更高效分解莠去津的微生物，常用的方法是____________。
答案 (1)琼脂 选择 灼烧灭菌法
(2)异养 最少 酒精灯火焰 选择最高效的目的菌
(3)诱变育种
解析 (1)琼脂是固体培养基中的凝固剂，从功能上讲，这两种培养基都属于选择培养基，对培养基灭菌常用的方法是高压蒸汽灭菌法，对接种环常用的灭菌方法是灼烧灭菌法。
(2)莠去津是一种含氮的有机除草剂，只能利用现成的有机物作为碳源和能源的微生物属于异养型微生物。在选育过程中，因为目的菌能够分解莠去津，所以应该选择培养液中莠去津含量最少的培养瓶进行下一步接种，为了防止杂菌污染，接种操作应在酒精灯火焰旁进行，因为初选出来的培养瓶中可能不止一种微生物能够分解莠去津，所以要通过固体培养基进行纯化，而多次重复培养过程的目的就是选育最高效的目的菌。
(3)若要获得更高效分解莠去津的微生物，常用的方法是用诱变处理使其发生基因突变，即诱变育种。
3．(2018·安徽马鞍山质检)为了获得耐热耐辐射微生物资源，某生物兴趣小组在新疆库木塔格沙漠某区域取样，利用常规平板分离方法进行分离培养，定向筛选出耐高温耐辐射菌株，实验流程如下，分析并回答下列问题：
(1)生物兴趣小组选择在该区域取样的原因是______________________________。
(2)配制LB肉汤培养基需添加一定量的NaCl，其目的是____________________，对LB肉汤培养基一般采用________灭菌；驯化培养过程中，对活菌纯化并计数的方法是________，测得的活菌数往往比实际值________，原因是______________________________________。
(3)某同学为探究已纯化的菌株能否分解纤维素，他将此菌株接种在以纤维素为唯一碳源的培养基上，一段时间后，培养基上出现了菌落，该同学认为此菌株能分解纤维素，但其他的同学并不认同他的观点，你认为他们的理由是________________________________________________。
答案 (1)该区域温度较高、遭受辐射较强
(2)为微生物提供无机盐(或为微生物提供无机盐，调节渗透压) 高压蒸汽 稀释涂布平板法 低 当两个或多个细胞连在一起时，平板上只能观察到一个菌落
(3)实验缺少空白对照；操作不规范
解析 (1)根据筛选目的菌株的特点，生物兴趣小组之所以选择在该区域取样是因为该区域温度较高、遭受辐射较强。
(2)培养基中添加一定量的NaCl，其作用是为微生物提供无机盐，调节渗透压；对培养基一般采用高压蒸汽灭菌法灭菌；驯化培养过程中，对活菌纯化并计数的方法是稀释涂布平板法，这种方法测得的活菌数往往比实际值低，是因为涂布培养时常常存在两个或多个细胞连在一起，而平板上只能观察到一个菌落。
(3)为探究已纯化的菌株能否分解纤维素，将此菌株接种在以纤维素为唯一碳源的培养基上，一段时间后，培养基上出现了菌落。结合实验设计要遵循对照实验的原则分析，该同学的实验设计中缺乏空白对照组，即不接种该筛选菌株，培养基中是否会出现菌落产生。此外，该同学未设置重复组，也可能会由于操作不规范等偶然因素导致培养基上出现菌落。
4．(2018·齐鲁名校二联)大肠埃希菌，俗称大肠杆菌。是人和动物肠道中的正常栖居菌。自来水一旦被它污染，就有可能引发肠道传染病，甚至流行病。因此，必须对自来水进行严格的检测，以确保饮水安全。我国规定1000 mL自来水中的大肠杆菌数不得超过3个。某同学欲对家中自来水中大肠杆菌含量是否达标，对饮用水中大肠杆菌进行了培养、计数和鉴定。回答下列问题：
(1)实验前应进行无菌处理。将漏斗、培养皿、三角瓶和镊子等进行________灭菌。培养基进行________灭菌。对自来水龙头进行________灭菌。
(2)为测定大肠杆菌的数目，将已知________的水过滤后，将滤膜放在培养基上培养，注意滤膜与培养基完全贴紧，不能有________。可根据培养基上________的数目，计算出水样中大肠杆菌的数目。(取三份样品求平均值)
(3)为了鉴定大肠杆菌，在培养基中应加入________。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现________色。
答案 (1)干热(或高压蒸汽) 高压蒸汽 灼烧
(2)体积 气泡 菌落
(3)伊红—美蓝 黑
解析 (1)微生物培养过程中要注意防止杂菌污染，培养基常用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，漏斗、培养皿、三角瓶和镊子等进行干热或高压蒸汽灭菌，而对自来水龙头进行灼烧灭菌。
(2)(3)欲测定饮用水中大肠杆菌数目，将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色，注意滤膜与培养基完全贴紧，不能有气泡；可根据培养基上菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数目。
5．(2018·湖南师大附中模拟)聚乙烯醇(PVA)是存在于化工污水中的一种难以降解的大分子有机物，PVA分解菌能产生PVA酶分解PVA，PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑，请回答下列问题：
(1)下表是筛选能高效分解PVA的细菌的培养基配方，X物质最可能为________。实验中还应设置完全培养液对照组，将菌液稀释相同的倍数，通过比较菌落数目，说明选择培养基具有筛选作用。
(2)若将100 mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中有PVA分解菌________个，该方法的测量值与实际值相比一般会________(填“偏大”“偏小”或“相等”)。
(3)要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，培养PVA分解菌的培养基中除了加入必需的营养物质外还需要加入________，用于鉴别PVA分解菌。若用上述培养基比较不同菌株降解PVA能力的大小，请用简洁的语言写出设计思路：____________________________________。
(4)对于挑选出的PVA分解菌，应当接种在________培养基上培养，长成菌落后，置于________℃冰箱中做临时保藏。若要长期保藏，则需采用________法。
答案 (1)琼脂 (2)1.6×109 偏小
(3)碘 配置相同PVA浓度的培养基来培养不同菌株，一定时间后通过测定白色透明圈大小来确定不同菌株降解PVA能力的大小
(4)固体斜面 4 甘油管藏
解析 (1)分析题意可知，表格是筛选出能高效分解PVA的细菌的培养基配方，应该是固体培养基，所以X物质最可能是琼脂；由于完全培养液中任何微生物都可以生长，因此对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。
(2)若将100 mL含有PVA分解菌的土壤样品溶液稀释104倍后，取0.1 mL稀释液均匀涂布在选择培养基表面，测得菌落数的平均值为160个，空白对照组平板上未出现菌落，则100 mL原菌液中PVA分解菌有：160÷0.1×104×100＝1.6×109个；由于两个或多个细菌聚集在一起只能观察到一个菌落，因此该方法的测量值与实际值相比一般会偏小。
(3)根据题意可知，“PVA与碘作用时能产生蓝绿色复合物，当PVA被分解时蓝绿色复合物消失，形成白色透明斑”，因此要鉴定分离出的细菌是否为PVA分解菌，可在培养PVA分解菌的培养基中加入碘用于鉴别PVA分解菌；若用上述培养基比较不同菌株降解PVA能力的大小，可以用含相同PVA浓度的上述培养基来培养不同菌株，一定时间后，通过测定白色透明斑的大小(或直径)来确定不同菌株降解PVA能力的大小。
(4)对于挑选出的PVA分解菌，应当接种在固体斜面培养基上培养，长成菌落后，置于4 ℃冰箱中做临时保藏。若要长期保藏，则需要采用甘油管藏法。
6．(2018·哈三中模拟)回答下列有关土壤中微生物分离的问题：
(1)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择__________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________。
(2)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有____________________________(答出两点即可)。
(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：
注：“＋”表示有，“－”表示无。
据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是__________________________________________________。
答案 (1)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用
(2)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
(3)不能 液体培养基不能用于分离单菌落 不能 培养基中没有纤维素，不会形成CR－纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌
解析 (1)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择尿素作为唯一氮源。不选择其他两组的原因是：其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用。
(2)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有：KH2PO4和Na2HPO4，可构成缓冲对维持培养基中的pH稳定，同时可作为无机营养提供给细菌(或为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定)。
(3)培养基甲中没有凝固剂琼脂，为液体培养基，而液体培养基不能用于分离单菌落，因此培养基甲不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。培养基乙中没有纤维素，不会形成CR－纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌，所以培养基乙不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。
7．(2018·安徽六安一中三模)石油是人类重要的化工原料之一，其在给人类生产生活带来便利的同时也对陆地和海洋造成污染，下图是科研工作者分离能分解石油污染物的假单孢杆菌的过程。请根据流程图回答下列问题：
土壤取样→A→梯度稀释→涂布到培养基上→筛选目的菌株(假单孢杆菌)
(1)A过程为________，目的是增加假单孢杆菌的浓度，该培养基中应当以________为唯一碳源。该实验过程中需要设置完全培养液对照组，将菌液稀释相同的倍数，对照组培养基上生长的菌落数目应明显________(填“多于”或“少于”)选择培养基上的菌落数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。
(2)实验中需要用________对菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同浓度的菌液分别滴加到固体培养基的表面，用________(器具)涂布均匀并进行培养，以便获得单个菌落。
(3)若实验中用103倍的0.1 mL的稀释液分别涂布三个平板，培养后分别形成了98、100和102个菌落，则每毫升原样液中含有假单胞杆菌________个，实际值一般要比该测量值偏大的原因是__________________________________。
答案 (1)扩大培养(或选择培养) 石油 多于
(2)无菌水 涂布器
(3)1×106 当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
解析 (1)图中A过程为扩大培养(或选择培养)，以增加假单胞杆菌的浓度；由于要分离能分解石油污染物的假单孢杆菌，所以该培养基中应当以石油为唯一碳源。由于完全培养液中任何微生物都可以生长，因此对照组培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目，从而说明选择培养基具有筛选作用。
(2)根据流程图可知本实验采用稀释涂布平板法接种，包括系列稀释和涂布平板两个过程，涂布平板之前需要用无菌水将菌液进行一系列的浓度梯度稀释，然后将不同浓度的菌液分别滴加到固体培养基的表面，用涂布器涂布均匀并进行培养。
(3)根据题意可知，三个平板上生长的平均菌落数C＝(98＋100＋102)÷3＝100个，涂布平板时所用的稀释液的体积V＝0.1 mL，稀释倍数M＝103倍，所以每毫升原样液中含有假单胞杆菌数＝(C÷V)×M＝(100÷0.1)×103＝1×106个；当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，所以实际值一般要比该测量值偏大。
8．(2018·黑龙江大庆二模)某生物兴趣小组想通过以下两种方法来检测自来水中大肠杆菌的含量。请根据图中信息回答下列问题：
(1)方法一是通过____________(方法)、方法二是通过________(方法)来测定自来水中大肠杆菌的含量。
(2)方法一中从不同稀释液中分别取0.1 mL菌液滴加到____________培养基表面，通过统计培养基上__________的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。该方法理论上统计值比实际值________(填“偏高”或“偏低”)，理由是____________________。
(3)方法二中大肠杆菌大小要________(填“大于”或“小于”)滤膜的孔径。因此对血浆(某些不耐高温的试剂)可以怎样除菌？__________________。
答案 (1)稀释涂布平板法 滤膜法
(2)伊红美蓝 黑色菌落 偏低 两个或多个细胞(大肠杆菌)连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落
(3)大于 用滤膜过滤
解析 (1)据图所示，方法一是用移液管吸取1 mL的菌液注入101倍稀释的试管中，然后从101倍稀释液中吸取1 mL稀释液，注入102倍稀释的试管中、再将102倍稀释液中吸取1 mL稀释液，注入103倍稀释的试管中，此法为稀释涂布平板法；方法二是首先将一定量的水体样本注入滤膜过滤，经过过滤，水中的细菌则被留在滤膜上，将滤膜贴于伊红美蓝培养基上培养，通过统计培养基上的菌落数进而计算出单位样本中的大肠杆菌的数量，该办法为滤膜法。
(2)大肠杆菌在伊红美蓝培养基上培养，当大肠杆菌分解乳糖产酸时细菌带正电荷被染成红色，再与美蓝结合形成黑色菌落。方法一中从不同稀释液中分别取0.1 mL菌液滴加到伊红美蓝培养基表面，通过统计培养基上的黑色菌落数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。如果两个或多个大肠杆菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此该方法理论上统计值比实际值偏低。
(3)滤膜法是让水中大肠杆菌留在滤膜上，不能从孔中漏下去，故方法二中大肠杆菌要大于滤膜的孔径；因此对血浆(某些不耐高温的试剂)可以用滤膜法除菌。
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考点1 培养基及微生物的纯化培养技术
考点2 微生物的筛选和计数
高考热点突破
第38讲 微生物的培养与应用
[考纲明细] 1.微生物的分离和培养 2.某种微生物数量的测定 3.培养基对微生物的选择作用 4.微生物在其他方面的应用
考点1 培养基及微生物的纯化培养技术
1．培养基
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。
(3)种类
①按照物理性质可分为液体培养基、固体培养基、半固体培养基。
②按照成分的来源可分为天然培养基和合成培养基。
③按照功能用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。
1．(选修1 P14资料卡片)琼脂是一种从红藻中提取的多糖。琼脂在98 ℃以上熔化，在44 ℃以下凝固，在常规培养条件下呈现固态。
2．(选修1 P15资料卡片)牛肉膏和蛋白胨来源于动物原料，含有糖、维生素和有机氮等营养物质。
2．无菌技术
(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。
(2)关键：防止外来杂菌的入侵。
(3)不同对象的无菌操作方法(连线)
答案 ①、②、⑥—b—Ⅰ、Ⅱ ③、④、⑤—a—Ⅲ、Ⅳ
3．大肠杆菌的纯化培养
(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
①操作步骤
②倒平板的方法及注意事项
a．请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。
b．乙中的灭菌方法是灼烧灭菌。
c．丁中的操作需要等待平板冷却凝固后才能进行。
(2)纯化大肠杆菌的两种方法
1)平板划线法
①概念：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。
②注意事项：
b．灼烧接种环，待其冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种。
c．第二次及其以后的划线操作总是从上一次划线末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少，最终得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
d．划线时最后一区不要与第一区相连。
e．划线用力大小要适当，防止用力过大将培养基划破。
2)稀释涂布平板法
①概念：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。
②操作过程
(3)菌种的保存方法
①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。
②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。
1．(选修1 P15旁栏思考)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？
提示 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。
2．(选修1 P18旁栏小资料改编)微生物的接种方法只有平板划线法和稀释涂布平板法吗？微生物接种的核心是什么？
提示 不是。微生物的接种技术还包括斜面接种、穿刺接种等方法，其核心是防止杂菌污染，保证培养物的纯度。
3．(选修1 P17讨论T2)倒平板操作时为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？
提示 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。
4．(选修1 P17讨论T3)平板冷凝后，为什么要将平板倒置？
提示 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
5．(选修1 P17讨论T4)在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？
提示 不能。因为空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，可能会造成污染。
题组 培养基及其制备方法分析
1．下列关于制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( )
A．操作的顺序为计算→称量→溶化→倒平板→灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．待培养基冷却到50 ℃左右时倒平板
D．待平板冷却凝固后将平板倒置
答案 A
解析 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算→称量→溶化→灭菌→倒平板，不能颠倒，A错误；牛肉膏比较黏稠，所以将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，待牛肉膏溶化并与称量纸分离后用玻璃棒取出称量纸，B正确；待培养基冷却到50 ℃左右时倒平板，此时不烫手且为液体状态，C正确；平板冷却凝固后才能将平板倒置，D正确。
2．下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是( )
A．从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基
B．该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨
C．该培养基缺少提供生长因子的物质
D．该培养基调节合适的pH后就可以接种使用
答案 B
解析 从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于鉴别培养基，A错误；微生物的营养物质主要包括氮源、碳源、水和无机盐等，培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨，B正确；生长因子主要包括维生素、氨基酸和碱基等，它们一般是酶和核酸的组成成分，蛋白胨可以提供生长因子，C错误；该培养基调节合适的pH后经灭菌后才可以接种使用，D错误。
知识拓展
1．培养基的配制原则
(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。
(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。
(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需的pH不同。
2．不同微生物对主要营养物质的需求特点
(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。
(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。
题组 无菌技术的操作
3．下列对灭菌和消毒的理解不正确的是( )
A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子
B．消毒和灭菌实质上是完全相同的
C．接种环用灼烧法灭菌
D．常用灭菌方法有灼烧灭菌法、干热灭菌法、高压蒸汽灭菌法
答案 B
解析 消毒是使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物(不包括芽孢和孢子)，灭菌则是使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，B错误。
4．(2014·江苏高考)为了获得β－胡萝卜素产品，某小组开展了产β－胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。请回答下列问题：
(1)实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是________________________________________；为了减少灭菌后器皿被污染，灭菌前应该__________________________________________________。
(2)为了筛选出酵母菌，培养基中添加了青霉素，其目的是______________________________。
(3)如图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图中甲、乙、丙指示的依次是________(填序号)。
①安全阀、放气阀、压力表
②放气阀、安全阀、压力表
③安全阀、放气阀、温度表
④放气阀、安全阀、温度表
(4)为了将分离到的菌株纯化，挑取了菌落在3块相同平板上划线，结果其中一块平板的各划线区均未见菌生长，最可能的原因是______________________________。
答案 (1)干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌) 用牛皮纸(报纸)包扎器皿
(2)抑制细菌(放线菌)的生长
(3)①
(4)接种环温度过高，菌种被杀死
解析 (1)实验用的培养皿常用的灭菌方法是干热灭菌和湿热灭菌(高压蒸汽灭菌)，在实验前应用牛皮纸或干净的报纸包扎器皿。
(2)酵母菌是真菌，对青霉素具有抵抗能力，青霉素主要抑制细菌、放线菌的生长。
(3)图中甲为安全阀，乙为放气阀，丙为压力表。
(4)该接种过程中的3块平板相同，菌种来源相同，只有一块平板接种培养后无菌落，对比知，问题最可能出现在接种过程中，最可能的原因是接种环灼烧后未充分冷却，菌种被杀死。
题后归纳
全面比较消毒和灭菌
题组 微生物的培养与纯化
5．用平板划线法或稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时( )
①可以用相同的培养基 ②都需要使用接种针进行接种 ③都需要在火焰旁进行接种 ④都可以用来计数活菌
A．①② B．③④ C．①③ D．②④
答案 C
解析 平板划线法或稀释涂布平板法都使用固体培养基，①正确；平板划线法采用接种环进行操作，而稀释涂布平板法采用涂布器进行操作，②错误；纯化时，要进行无菌操作，需要在火焰旁接种，避免空气中的微生物污染培养基，③正确；平板划线法一般用于分离而不能用于计数，④错误。
6．为了调查某河流的水质状况，某研究小组测定了该河流水样中的细菌含量，并进行了细菌分离等工作。回答下列问题：
(1)该小组采用稀释涂布平板法检测水样中的细菌含量。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先行培养了一段时间，这样做的目的是______________________；然后，将1 mL 水样稀释100倍，在3个平板上用涂布法分别接入0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为39、38和37。据此可得出每升水样中的活菌数为________。
(2)该小组采用平板划线法分离水样中的细菌。操作时，接种环通过________灭菌，在第二次及以后的划线时，总是从上一次划线的末端开始划线，这样做的目的是________________________________________。
(3)示意图A和B中，________表示的是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
答案 (1)检测培养基平板灭菌是否合格 3.8×107
(2)灼烧 将聚集的菌体逐步稀释以便获得单个菌落
(3)B
解析 (1)涂布接种前，灭菌后的空白平板先培养一段时间，若空白平板上无菌落形成，则说明培养基平板灭菌合格；平均每个平板上的菌落数目为38，稀释了100倍，取样为0.1 mL，则每毫升水中的活菌数目为38×100÷0.1＝38000个，则每升水中的活菌数目为38000×1000＝3.8×107个。
(2)用平板划线法分离微生物的过程中，应对接种环进行灼烧灭菌；每次划线都要从上一次划线的末端开始，这样做可将聚集的菌体逐步稀释以便最终得到单个菌落。
(3)示意图A是用平板划线法接种培养后得到的结果；示意图B是用稀释涂布平板法接种培养后得到的结果。
题后归纳
两种纯化细菌方法的比较
考点2 微生物的筛选和计数
1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
?选修1 P26资料卡片?细菌的数目还可以通过滤膜法来测定?以测定饮用水中大肠杆菌的数目为例?。将已知体积的水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养。在该培养基上，大肠杆菌的菌落呈现黑色。可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出水样中大肠杆菌的数量。
2．分解纤维素的微生物的分离
②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。
④实验流程
(3)分离纤维素分解菌所用的两种培养基比较
分离纤维素分解菌的实验中先用选择培养基，再用鉴别培养基。
①选择培养基为液体培养基，以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长。
②鉴别培养基含琼脂，为固体培养基，细菌可在培养基上形成肉眼可见的菌落。刚果红染色法应用的就是鉴别培养基。
3．结果分析与评价
深挖教材
在进行微生物计数实验时除设置对照组外，设置重复组的作用是什么？应如何设置重复组？
提示 设置重复组的作用是为排除偶然因素对实验结果的干扰；在每一稀释度下宜设置3个平板作重复组，选择菌落数均在30～300且数目相差不大的三个平板，用“平均值”代入计数公式予以计算菌落数。
1．(选修1 P22旁栏思考)想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
提示 统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板上的菌落数的平均值，然后按教材旁栏的公式即每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M进行计算。
2．(选修1 P28旁栏思考)为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
提示 由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。
3．(选修1 P29旁栏思考T1)常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红，这两种方法各有哪些优点与不足？
提示 方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分；方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。
4．(选修1 P29旁栏思考T2)为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
提示 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
题组 土壤中分解尿素细菌的分离与计数
1．下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中正确的是( )
A．只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素
B．筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质
C．统计样品中的活菌数目时一般用平板划线法
D．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌
答案 A
解析 酶具有专一性，故只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，A正确；筛选分解尿素的细菌的实验中，采用的是以尿素为唯一氮源的培养基，B错误；统计样品中的活菌数目时一般采用稀释涂布平板法，平板划线法不能用于统计样品中的细菌数，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，这样就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素，D错误。
2．人和哺乳动物的尿液中含有尿素，大量尿素的存在会对环境造成污染，土壤中有些细菌含有脲酶，可通过降解尿素作为其生长的氮源。某研究小组开展土壤中分解尿素的细菌的分离和培养实验，请回答下列问题：
(1)该实验中，在以________为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，能产生脲酶的细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在接种前需要添加空白对照组以检测培养基是否被污染，该空白对照组应采取的操作要求和观察指标是_________________________________________ _______________________________。
(3)某同学在五个培养基平板下均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是______________，每克土壤样品中的细菌数量为______________个。
答案 (1)尿素 酚红 红
(2)将已灭菌、未接种的培养基在适宜温度下放置相应的时间，观察培养基上是否有菌落产生
(3)稀释涂布平板法 1.75×108
解析 (1)分解尿素的细菌能合成脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强，在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。
(2)在接种前需要添加空白对照组以检测培养基是否被污染，该空白对照组应采取的操作要求和观察指标是将已灭菌、未接种的培养基在适宜温度下放置相应的时间，观察培养基上是否有菌落产生。
(3)某同学在五个培养基平板上均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是稀释涂布平板法，统计的菌落数应介于30～300之间，故选择细菌菌落数为156、178和191的平板计数，所以每克土壤样品中的细菌数量为÷0.1×105＝1.75×108个。
知识拓展
统计菌落数目的两种方法
(1)显微镜直接计数法
(2)间接计数法(活菌计数法)
题组 分解纤维素的微生物的分离
3．分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是( )
A．经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上
B．富集培养这一步可省略，但培养的纤维素分解菌少
C．经稀释培养后，用刚果红染色
D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上
答案 A
解析 经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上，A错误；富集培养可省略，B正确；经稀释培养后，用刚果红染色，C正确；设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物，D正确。
4．(2018·重庆市一中月考)纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物产生的纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，因为它们能产生纤维素酶。根据相关知识回答问题：
(1)在微生物培养时，要获得纯净培养物的关键是__________________；实验室中常用的灭菌方法有灼烧灭菌、________和________。
(2)纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，其中________酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。
(3)在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前可以通过________增加纤维素分解菌的浓度。
(4)在含纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红可以与纤维素形成________复合物。当纤维素被分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，用含刚果红的该培养基培养纤维素分解菌时，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的________。常用的刚果红染色法有两种，其中一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，这种方法的缺点之一是加入刚果红溶液会使________。
答案 (1)防止外来杂菌的入侵 干热灭菌 高压蒸汽灭菌
(2)葡萄糖苷 (3)选择培养
(4)红色 透明圈 菌落之间发生混杂
解析 (1)在微生物培养时，要获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵；实验室中常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。
(2)纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，其中葡萄糖苷酶能将纤维二糖分解成葡萄糖。
(3)在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前可以通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度。
(4)在含纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红可以与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，刚果红—纤维素的复合物就无法形成，用含刚果红的该培养基培养纤维素分解菌时，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。常用的刚果红染色法有两种，其中一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，这种方法的缺点之一是加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂。
技法提升
微生物的筛选与鉴别方法
(1)微生物的筛选方法
(2)微生物的鉴别方法
高考热点突破
1．(2018·全国卷Ⅱ)在生产、生活和科研实践中，经常通过消毒和灭菌来避免杂菌的污染。
回答下列问题：
(1)在实验室中，玻璃和金属材质的实验器具________(填“可以”或“不可以”)放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)牛奶的消毒常采用巴氏消毒法或高温瞬时消毒法，与煮沸消毒法相比，这两种方法的优点是________________________________。
(3)密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒，其原因是紫外线能__________________，在照射前，适量喷洒____________，可强化消毒效果。
(4)水厂供应的自来水通常是经过________(填“氯气”“乙醇”或“高锰酸钾”)消毒的。
(5)某同学在使用高压蒸汽灭菌锅时，若压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度，最可能的原因是____________________。
答案 (1)可以
(2)在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少
(3)破坏DNA结构 消毒液
(4)氯气 (5)未将锅内冷空气排尽
解析 (1)能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培养皿)和金属用具等可以放入干热灭菌箱中进行干热灭菌。
(2)煮沸消毒法即在100 ℃煮沸5～6 min可以杀死微生物细胞和一部分芽孢；巴氏消毒法即在70～75 ℃煮30 min或在80 ℃煮15 min，可以杀死微生物，并且保证营养物质不被破坏。因此，与煮沸消毒法相比，牛奶消毒常采用的巴氏消毒法或高温瞬时消毒法的优点是在达到消毒目的的同时，营养物质损失较少。
(3)因紫外线能破坏DNA结构，所以密闭空间内的空气可采用紫外线照射消毒。在照射前，适量喷洒消毒液，可强化消毒效果。
(4)通常乙醇消毒有气味，影响水质，不适宜消毒自来水；高锰酸钾本身有颜色，消毒后溶液呈紫红色，无法使用；因此水厂供应的自来水通常是经过氯气消毒的。
(5)采用高压蒸汽灭菌时，锅内的水加热煮沸，将其中原有的冷空气彻底排除后才能将锅密闭。如果未将锅内冷空气排尽，则会出现压力达到设定要求，而锅内并没有达到相应温度的现象。
2．(2018·全国卷Ⅲ)回答下列与酵母菌有关的问题：
(1)分离培养酵母菌通常使用______________(填“牛肉膏蛋白胨”“MS”或“麦芽汁琼脂”)培养基，该培养基应采用________灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后会观察到菌落，菌落的含义是____________________________________________。
(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，可促进______________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)；若进行厌氧培养，可促进________________(填“菌体快速增殖”“乙醇产生”或“乳酸产生”)。
(3)制作面包时，为使面包松软通常要在面粉中添加一定量的酵母菌，酵母菌引起面包松软的原因是____________________________________。
答案 (1)麦芽汁琼脂 高压蒸汽 由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体
(2)菌体快速增殖 乙醇产生
(3)酵母菌分解葡萄糖会产生CO2，CO2使面包松软
解析 (1)麦芽汁琼脂培养基的碳氮比较高，而且含糖量高，更适合培养酵母菌，该培养基应采用高压蒸汽灭菌法灭菌。若将酵母菌划线接种在平板上，培养一段时间后可观察到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落。
(2)酵母菌液体培养时，若通入氧气，进行有氧呼吸产生H2O和CO2，释放能量多，细胞增殖快；若进行厌氧培养，进行无氧呼吸，产生酒精和CO2，释放能量少，增殖慢。
(3)制作面包时，在面粉中添加一定量的酵母菌，因酵母菌可以分解面粉中的葡萄糖，产生二氧化碳，二氧化碳是气体，遇热膨胀而形成小孔，使得面包松软多孔。
3．(2018·全国卷Ⅰ)将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。
回答下列问题：
(1)M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制________的生长，加入了链霉素的培养基属于__________培养基。
(2)M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有________________(答出两点即可)。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有________________(答出两点即可)。
(3)若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是________，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是______________________________________。
(4)甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：
甲同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是110、140和149，取平均值133；
乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。
有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是________________________________________________________________________________________________________________________________________________。
答案 (1)细菌 选择
(2)碳源、无机盐 蛋白质、核酸
(3)碘液 淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈
(4)乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差
解析 (1)M培养基若用于真菌的筛选，说明M培养基能满足真菌的生长并抑制其他微生物的生长，链霉素是一种抗生素，可抑制细菌的生长；加入链霉素的培养基能筛选出真菌，该培养基属于选择培养基。
(2)微生物生长所需要的营养成分除氮源外，还需要碳源、水、无机盐及特殊营养物质；氮元素是蛋白质、核酸等生物大分子的组成元素，因此氮源进入细胞后，可参与蛋白质、核酸等生物大分子的合成。
(3)淀粉遇碘液会变成蓝色，筛选产淀粉酶的微生物，依据淀粉遇碘液变蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈，根据透明圈筛选产生淀粉酶的微生物。
(4)设计实验时一定要涂布至少3个平板作为重复组，才能增强实验的说服力和准确性，在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否相当，结果差距太大，意味着操作有误，乙结果不合理。
4．(2016·全国卷Ⅰ)空气中的微生物在重力等作用下，可以一定程度地沉降。某研究小组欲用平板收集教室空气中的微生物，以了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况。实验步骤如下：
①配制培养基(成分：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、X、H2O)；
②制作无菌平板；
③设置空白对照组和若干实验组，进行相关操作；
④将各组平板置于37 ℃恒温箱中培养一段时间，统计各组平板上菌落的平均数。
回答下列问题：
(1)该培养基中微生物所需的氮来源于____________________。若要完成步骤②，该培养基中的成分X通常是__________。
(2)步骤③中，实验组的操作是____________________________________________。
(3)若在某次调查中，某一实验组平板上菌落平均数为36个/平板，而空白对照组的一个平板上出现了6个菌落，这种结果说明在此次调查中出现了__________现象。若将30(即36－6)个/平板作为本组菌落数的平均值，该做法______________(填“正确”或“不正确”)。
答案 (1)牛肉膏、蛋白胨 琼脂
(2)将各实验组平板分别放置在教室不同高度的位置上，开盖暴露一段时间
(3)污染 不正确
解析 (1)培养基中的牛肉膏和蛋白胨可为培养基中的微生物提供氮源；制备固体培养基需加入琼脂。
(2)该实验的目的是了解教室内不同高度空气中微生物的分布情况，所以需在教室不同高度的位置分别用平板收集微生物即开盖暴露一段时间。
(3)该实验中空白对照组不应出现菌落，若空白对照组出现了菌落，则说明此次调查中出现了污染现象，实验组的污染情况不能确定，故不能用实验组与空白对照组菌落数的差值作为实验结果，而应重新进行实验。
5．(2017·江苏高考)苯酚及其衍生物广泛存在于工业废水中，对环境有严重危害。小明同学准备依据下图操作步骤，从处理废水的活性污泥中分离筛选酚降解高效菌株。请回答下列问题：
(1)酚降解菌富集培养基含有蛋白胨、K2HPO4、MgSO4、苯酚和水，其中可作为碳源的有________。
(2)将采集到的样品接种培养，苯酚用量应随转接次数增加而逐渐________，以达到富集酚降解菌的目的。若上图平板中菌落过于密集，应进一步________，以便于菌落计数与分离。制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加________。
(3)如图为连续划线法示意图，在图中________(填图中序号)区域更易获得单菌落。
(4)采用比色测定法(使用苯酚显色剂)检测降解后的废水中苯酚残留量。先制作系列浓度梯度并进行显色反应，下表中1～5号比色管的苯酚浓度应分别为________。
管号 1 2 3 4 5 6
苯酚浓度(mg/L) 1
如果废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，则需将残留液稀释________(填序号：①5 ②10
③20)倍后，再进行比色。
答案 (1)蛋白胨、苯酚 (2)增加 稀释涂布 凝固剂
(3)③ (4)0、0.2、0.4、0.6、0.8 ③
解析 (1)分析富集培养基的成分可知，培养基中蛋白胨、苯酚中含C，可作为碳源。
(2)在接种培养时，随转接次数的增加，应逐渐增加培养基中苯酚(碳源)的含量，以达到富集酚降解菌的目的。若接种培养后平板中菌落过于密集，应继续稀释涂布，以降低平板上菌落密度，便于菌落计数与分离。稀释涂布时所用的培养基为固体培养基，制备平板培养基时除了需要水、营养物质外，还必须添加琼脂等物质作为凝固剂。
(3)利用连续划线法接种时，越在最后划线区域，菌落的密度越小，越容易获得单菌落，所以，图中③区域更易获得单菌落。
(4)根据表中6号比色管中苯酚浓度为1 mg/L可以推知，1～5 号比色管的苯酚浓度应分别为0 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L。根据题意，废水为50 mg/L苯酚溶液，降解后约有21%的苯酚残留，要使稀释后的苯酚残留液浓度介于0～1 mg/L之间，需将残留液稀释20倍左右，再进行比色。
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