土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、研究思路
1．筛选菌株
(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。
(2)选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。
2．统计菌落数目
(1)活菌计数法：常用稀释涂布平板法。
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M。
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M：代表稀释倍数。
③统计方法：为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。
(2)显微镜直接计数法：在显微镜下直接观察和计数微生物的数量。
3．设置对照
(1)对照实验：指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。
(2)主要目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
二、实验设计
1．土壤取样
从富含有机质、酸碱度接近中性且潮湿的土壤取样。先铲去表层土，在距地表约3～8 cm的土壤层取样。
2．样品的稀释
(1)稀释原因：样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。
(2)稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证获得菌落数在 30～300之间，便于计数。
3．微生物的培养与观察
(1)培养：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。
(2)观察：每隔 24_h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。
三、操作提示
1．无菌操作
(1)取土样的用具在使用前都需要灭菌。
(2)应在酒精灯火焰旁称取土壤，并在酒精灯火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。
(3)在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在酒精灯火焰旁操作。
2．做好标记：本实验使用的平板和试管比较多。为避免混淆，最好在使用前就做好标记。
3．制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先规划时间，以便提高工作效率。
四、菌种鉴定
1．原理：分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解为氨，使培养基的碱性增强。
2．方法：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌，若指示剂变红，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。
1．在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称做( )
A．鉴别培养基 B．加富培养基
C．选择培养基 D．基础培养基
解析：选C 选择培养基是在培养基中加入特殊营养物质或化学物质，抑制不需要微生物的生长，有利于所需微生物生长的培养基。
2．用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释度下一同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌株数真实值的是( )
A．菌落数目最多的平板
B．菌落数目最少的平板
C．菌落数目适中的平板
D．取若干个平板上菌落数目的平均值
解析：选D 用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌落数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板上菌落数目的平均值比较接近样品中菌株数的真实值。
3．用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目，其结果与实际值相比( )
A．比实际值高
B．比实际值低
C．和实际值一致
D．比实际值可能高也可能低
解析：选B 培养基上的一个菌落也可能由相连的两个或多个菌体繁殖而来，并且该方法测得的是活菌的菌落数目，未包括死细菌数，因此统计的活菌数要少于菌体实际值。
4．产生每个标准菌落的细菌的最初数目和培养基分别是( )
A．一个细菌，液体培养基
B．许多细菌，液体培养基
C．一个细菌，固体培养基
D．许多细菌，固体培养基
解析：选C 在微生物的培养中产生每个标准菌落的细菌的最初数目是一个细菌，使用的培养基为固体培养基。
5．用以尿素为唯一氮源加入酚红指示剂的培养基，培养尿素分解菌后，指示剂将( )
A．变蓝色 B．变红色
C．变黑色 D．变棕色
解析：选B 尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，会使培养基的碱性增强，pH升高，加入酚红指示剂将变红。
1．筛选菌株的原理
(1)原理：根据不同微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性不同而制备培养基。
(2)方法：
①在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。
②改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物；用含无机碳源的培养基分离自养型微生物。
③改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物；用普通培养基在无氧条件下分离厌氧型和兼性厌氧型微生物。
[名师点拨] 选择培养基上生长的微生物≠目的菌
原则上选择培养基只能允许特定种类的微生物生长，但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能在选择培养基上生长的微生物不一定都是所需的微生物，还需进一步鉴定。
2．统计菌落数目的方法
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等方法，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者的比较如下表所示：
项目
直接计数法
间接计数法
原理
利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量
当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌
主要用具
显微镜、细菌计数板
培养基
计数数据
菌体本身
培养基上菌落数
优点
计数方便、操作简单
计数的是活菌
缺点
死菌、活菌都计算在内
操作较复杂，有一定误差
计算公式
每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数
每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积
[题组冲关]
1．(全国卷Ⅰ)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：
(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生__________。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是__________________________。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是__________________(答出两点即可)。
(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择________(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素＋NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是____________________________________________________。
(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有________________________________________________(答出两点即可)。
解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基只是允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO/HPO可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。
答案：(1)脲酶 分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物 为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料 (2)尿素 其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用 (3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定
2．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：步骤如下：
①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。
②为了得到更加准确的结果，应选用________________法接种样品。
③适宜温度下培养。
结果分析：
(1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是____________________________________。
A．涂布了1个平板，统计的菌落数为230
B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和256，取平均值235
(2)一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)_________________ _____。
(3)用这种方法测定的细菌数量要比实际活菌数量________(填“多”或“少”)，因为___________________________________________。
解析：若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(1)应选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)212÷0.2×106＝1.06×109(个)。(3)因为菌落可能由1个或多个细菌连在一起繁殖而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。
答案：步骤②：稀释涂布平板 (1)D (2)1.06×109个
(3)少 当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的是一个菌落
1．实验流程
稀释度
104
105
106
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
1
2
3
平均值
菌落数/平板
菌数/克土壤
2．实验设计原则
(1)设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布3个平板作重复组，以增强实验结果的说服力与准确性。
(2)设立两种对照组：
①判断培养基中是否有杂菌污染，需同时将未接种的选择培养基进行培养。
②判断选择培养基是否具有筛选作用，需同时设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上的菌落数目，进行对比得出结论。
3．结果分析与评价
内容
现象
结论
有无杂菌污染
的判断
对照的培养皿中无菌落生长
未被杂菌污染
培养基中菌落数偏高
被杂菌污染
菌落形态多样，菌落数偏高
培养基中混入其他氮源
选择培养基的筛选作用
牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目
选择培养基具有筛选作用
样品的稀释操作
得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板
操作成功
重复组的结果
若选取同一种土样，统计结果应接近
[题组冲关]
3．下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法，错误的是( )
A．因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离
B．测定土壤中不同微生物的数量，选用的稀释范围不同
C．如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数
D．牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
解析：选D 样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落数目。实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落在30～300之间适于计数的平板。土壤中不同类型的微生物的数量不同，因此在测定其数量时，选用的稀释范围也不同。将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，从而说明选择培养基的筛选作用。
4．如图表示研究者从土壤中筛选分解尿素的细菌并计数的相关实验，请据图回答下列问题：
(1)进行过程①和②的目的分别是________________和______________________；图中弧线箭头上“？”的具体操作是____________。
(2)进行培养基配制和灭菌时，灭菌与调节pH的先后顺序是____________________。倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底上标明培养微生物的名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及____________________等信息。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是__________________和________________。
(3)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入____________。培养后，若出现____________色就可以鉴定其中含有能够分解尿素的细菌。
(4)研究者可以通过观察培养形成的菌落的________________________、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。在实验中，研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止________________________________________。
解析：从土壤中分离尿素分解菌的一般步骤是土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养和筛选菌株。图中①过程是选择培养，②过程为梯度稀释，③过程是稀释涂布平板法接种培养。(1)结合分析可知，进行过程①和②的目的分别是选择培养和增加分解尿素的细菌的数量。图中弧线箭头上“？”的具体操作是挑出菌落。(2)进行培养基配制和灭菌时，为了减少培养过程被杂菌感染的机会，应先调节pH后灭菌。倒平板时，待平板冷却凝固后，应将平板倒过来放置，并用记号笔在皿底上表明培养微生物的名称、平板上培养样品的稀释度、制作者姓名、培养日期及培养基种类等信息。纯化菌种时为了得到单一菌落，常采用的接种方法是平板划线法和稀释涂布平板法。(3)根据尿素分解菌将尿素分解后产生碱性物质氨，氨与酚红指示剂相遇变红的原理，需要在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养后，若出现红色就可以鉴定其中含有能够分解尿素的细菌。(4)根据不同细菌形成的菌落特征不同，研究者可以通过观察培养形成的菌落的形状、大小、颜色、隆起程度等特征，来判断培养基上是否感染了其他细菌。研究者每隔24小时统计一次菌落数目，并选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足导致遗漏细菌数目。
答案：(1)选择培养 增加分解尿素的细菌的数量 挑出菌落 (2)先调节pH后灭菌 培养基种类 平板划线法 稀释涂布平板法 (3)酚红指示剂 红 (4)形状、大小、颜色 因培养时间不足导致遗漏细菌数目
[随堂基础巩固]
1．下列关于土壤取样的叙述，错误的是( )
A．土壤取样时，应选取肥沃、湿润的土壤
B．先铲去表层土3 cm左右，再取样
C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D．应在酒精灯火焰旁称取土壤
解析：选C 在“分解尿素的细菌的分离与计数”实验中，必须在含微生物丰富的湿润、肥沃土壤中取样，所用小铁铲和信封必须灭菌。
2．测定土壤中细菌的数量一般选104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释液，其原因是( )
A．细菌个体小，真菌个体大
B．细菌易稀释，真菌不易稀释
C．细菌在土壤中的含量比真菌高
D．随机的，没有原因
解析：选C 细菌在土壤中的含量多于真菌，因此稀释涂布时，细菌的稀释倍数要大于真菌的稀释倍数，这样才能使平板上培养出的菌落清晰易辨。
3．下列属于菌落特征的是( )
①菌落的形状 ②菌落的大小 ③菌落的多少 ④隆起程度 ⑤颜色 ⑥有无荚膜
A．①②③④ B．①②④⑤
C．②③④⑥ D．①②③④⑤⑥
解析：选B 菌落特征包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。
4．下列能分离出分解尿素的细菌的培养基是( )
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、琼脂、水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H2O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
解析：选A 要想分离尿素分解菌，应把尿素作为培养基中的唯一氮源，而B项中无氮源，C项中无碳源，D项中牛肉膏、蛋白胨都可作为氮源。
5．用来判断选择培养基是否起到了选择作用，需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基
解析：选C 将菌液稀释相同的倍数并接种，牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目应明显多于选择培养基上的菌落数目，因此，应选择接种菌种的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照实验遵循的原则是单一变量原则。
6．某同学对101、102、103倍稀释液计数的平均菌落数分别为2 760、295和16，则菌落总数为(所用稀释液体积为0.1 mL)( )
A．2.76×104个/mL B．2.95×105个/mL
C．4.6×104个/mL D．3.755×104个/mL
解析：选B 菌落计数法是计算不同稀释度的平均菌落数。首先选择平均菌落数在30～300之间的平板，以该平均菌落数与体积之比乘以稀释倍数即为该样品的细菌总数。若所有稀释倍数的菌落数均不在30～300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数进行计算。
7．尿素是一种重要的农业氮肥，不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的微生物将尿素分解后才能被植物吸收利用。因此，对土壤中分解尿素的微生物进行分离和鉴定具有重要意义。回答下列问题：
(1)对土壤中分解尿素的微生物的分离过程如下：
第一步：土壤取样。取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要________(填“消毒”或“灭菌”)。
第二步：样品稀释。通常分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度，原因是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
第三步：微生物的培养与观察。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养。分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，而____________________________________则不能生长繁殖。
(2)若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释，用稀释倍数为104的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数____________。
(3)若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在如表所示培养基配方中添加的物质是________、________。若分离得到的是尿素分解菌，则培养基中pH升高使酚红指示剂变为红色，pH升高的原因是____________________________________。
成分
KH2PO4
Na2HPO4
MgSO4·
7H2O
酚红
指示剂
尿素
蒸馏水
培养基
(含量)
1.4 g
2.1 g
0.2 g
0.01 g
1.0 g
1 000 mL
解析：(1)取土样用的工具和盛土样的信封等在使用前都需要灭菌。由于土壤中不同生物的数量不同，因此分离不同种类的微生物要采用不同的稀释度。将一定稀释度的样品接种在以尿素为唯一氮源的培养基上，并在适宜的条件下培养，分解尿素的微生物能在该培养基上生长繁殖，不能利用尿素的微生物则不能生长繁殖。(2)若对土壤悬液进行梯度稀释时，未经振荡而直接取上层悬液进行梯度稀释。由于此种细菌属于需氧型细菌，主要分布在上层培养液，因此用稀释倍数为104的样液涂布到平板上进行培养和计数，统计出的菌落数往往比正确操作统计出的菌落数偏高。(3)培养基的成分应包括碳源、氮源、水和无机盐等。若要对上述初步筛选出的分解尿素的微生物作进一步的鉴定，需在表中培养基配方中添加的物质是葡萄糖(作为碳源)、琼脂(固体培养基中的凝固剂)。若分离得到的是尿素分解菌，则尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基中的pH升高，酚红指示剂变为红色。
答案：(1)灭菌 土壤中各类微生物的数量不同 不能利用尿素的微生物 (2)偏高 (3)葡萄糖 琼脂 尿素分解菌合成的脲酶将尿素分解成氨
[课时跟踪检测]
一、选择题
1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，错误的是( )
A．土壤取样时应选取距地表约3～8 cm的土壤层
B．测定细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液
C．土壤中能合成脲酶的细菌能分解尿素
D．向以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红溶液可以鉴定出分解尿素的细菌
解析：选D 鉴定分解尿素的细菌时需向以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
2．分离土壤中分解尿素的细菌时，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
解析：选C 土壤中分解尿素的细菌能够合成脲酶，将尿素分解生成氨，利用尿素中的氮合成自身有机物。培养基中尿素作为唯一氮源，分解尿素的细菌能生长，其他微生物不能生长；分离微生物要用固体培养基，需要加琼脂；土壤中分解尿素的细菌属于异养微生物，需要加葡萄糖作为碳源。
3．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
解析：选D 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数。
4．下列操作需要在火焰旁进行的是( )
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液
④涂布平板 ⑤微生物的培养
A．①②③④⑤ B．②③④⑤
C．③④⑤ D．②③④
解析：选D 实验操作过程要进行严格的无菌操作，除实验空间必须消毒外，每个操作步骤都必须在无菌区进行。土壤的称取、溶液的稀释、涂布平板都需要在酒精灯火焰旁的无菌区(或接种箱内的酒精灯火焰旁)完成，以防止杂菌污染。
5．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分离出的是( )
A．大肠杆菌 B．霉菌
C．放线菌 D．固氮细菌
解析：选A 固氮微生物的生长不需要从培养基上获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长；加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放线菌，则可收获霉菌；加入酚的培养基使细菌和霉菌不能正常生长，而放线菌却能利用酚作为原料合成自身产物。
6．在做分离分解尿素的细菌实验时，一同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。该同学的结果产生的原因可能有( )
①土样不同 ②培养基被污染 ③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
解析：选A 实验结果不同，最可能的原因是土样不同，其次是操作失误或培养基被污染，而与是否设置对照没有关系。
7．三个培养皿中分别加入10 mL不同的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36 h后，计算菌落数，结果如下表。下列相关叙述正确的是( )
培养皿
培养基成分
菌落数
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A．该实验采用的是液体培养基
B．该实验采用平板划线法接种
C．Ⅰ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子
D．Ⅱ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖
解析：选D 该培养基加入了琼脂，故为固体培养基；对微生物进行计数时宜采用稀释涂布平板法接种，而不是平板划线法接种；Ⅰ与Ⅲ中有葡萄糖、生长因子两种变量，不能得出相应结论；Ⅱ和Ⅲ对照，自变量是有无葡萄糖，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖。
8．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( )
A．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
B．如果要测定②中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法
C．若图中④为对照实验，则其中应以苯酚作为唯一的碳源
D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落
解析：选C 用苯酚作为选择培养基中的碳源，也是微生物的能源物质，会影响其他微生物生长。测定培养液中细菌数目常采用稀释涂布平板法。若④为对照实验，则④中应含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚作为唯一碳源。使用稀释涂布平板法或平板划线法都可以在⑥上获得单菌落。
9．关于土壤中细菌的分离，下列正确的操作步骤是( )
①土壤取样 ②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1 mL进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107倍的稀释液
A．①→②→③→④ B．①→③→②→④
C．①→②→④→③ D．①→④→②→③
解析：选C 在分离土壤中某种细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。
10．下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是( )
A．可采用干热灭菌法对微生物培养基进行灭菌
B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法
C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度
D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
解析：选A 培养基灭菌通常用的是高压蒸汽灭菌法，而干热灭菌法通常适用于玻璃器皿、金属用具等耐高温且不适合其他方法的物品；分离能分解尿素的细菌，用的选择培养基里尿素是唯一的氮源，这样才能分离出分解尿素的细菌。
二、非选择题
11．多氯联苯是一种对人体有很大危害的有机物，呈油状液体，污染土壤后，很难清除。研究发现部分酵母菌具有分解多氯联苯的作用。为消除这种污染，科研人员计划从受污染的土壤中筛选出高效分解多氯联苯的菌株。
(1)筛选分解多氯联苯的菌株时，应将土壤样品______________，接种到以____________为唯一碳源的培养基上，从功能上讲，该培养基属于____________。
(2)对初步提取到的菌株要进行____________，一般操作方法有两种，如图是____________法。
(3)若要测定培养液酵母菌的菌体数，可在显微镜下直接计数。若用________法统计菌落数，在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板进行培养一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________。
(4)将1 mL酵母菌溶液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57、58，据此可得出每升溶液中酵母菌活菌数为____________。
解析：(1)依题意可知：筛选分解多氯联苯的菌株时，应将土壤样品稀释(溶解)接种到以多氯联苯为唯一碳源的培养基上。在该培养基中，只有能降解多氯联苯的微生物才能生长，而其他微生物则不能生长，所以从功能上讲，该培养基属于选择培养基。(2)对初步提取到的菌株要进行纯化。图中采用的操作方法是平板划线法。(3)若要测定培养液酵母菌的菌体数，既可在显微镜下用血细胞计数板直接计数，也可选用稀释涂布平板法统计活菌数目。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板进行培养一段时间，其目的是检验培养基平板灭菌是否成功(或倒平板是否感染杂菌或是否彻底灭菌)。(4)将1 mL酵母菌溶液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57、58，据此可得出每升溶液中酵母菌活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×100×103＝5.7×107个/L。
答案：(1)稀释(溶解) 多氯联苯 选择培养基 (2)纯化 平板划线 (3)稀释涂布平板 检验培养基平板灭菌是否成功(倒平板是否感染杂菌或是否彻底灭菌) (4)5.7×107个/L
12．蛋白酶在生物医药和日用化工等生产领域具有重要的经济价值。某同学为筛选产蛋白酶的高产菌株，做了如下实验步骤(配制了下列培养基，在适宜条件下培养)：
步骤
取样
培养基
培养结果
Ⅰ
土壤
样品
葡萄糖、(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O，加水定容
培养液a
Ⅱ
1mL
培养液a
同上
菌落
Ⅲ
挑取
单菌落
细菌培养基
培养液b
(1)为实现筛选目的，步骤Ⅰ所使用的培养基配方中，应去除____________并加入高浓度的____________。
(2)为实现目的菌的分离和计数，步骤Ⅱ所使用的培养基中还应加入____________制成平板，采用的接种方法是__________________，实验结果如图A。
(3)步骤Ⅲ应挑取图A中____________处的菌落，本步骤的目的是________________________________________________________________________。
(4)图B是该蛋白酶和其他酶的热稳定性数据，即酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其酶活性。在该蛋白酶的工业化生产过程中，通常需对发酵液在60～70 ℃条件下保温一定时间，其作用是_________________________________________。
解析：(1)培养基中添加特定的成分以促进需要的微生物生长而抑制其他微生物生长，用于进行微生物筛选。根据题意，为筛选产蛋白酶的高产菌株，步骤Ⅰ所使用的培养基配方中，应去除葡萄糖并加入高浓度的蛋白质。(2)为实现目的菌的分离和计数，步骤Ⅱ所使用的培养基中还应加入琼脂(凝固剂)制成平板，采用的接种方法是稀释涂布平板法。(3)图A中a处的菌落透明圈最大，故其菌种分解蛋白质的能力最强，所以步骤Ⅲ应挑取图A中a处的菌落，本步骤的目的是快速增加目的菌的种群数量(即扩大培养)。(4)图B曲线表明，60～70 ℃条件下，蛋白酶的活性很高，而此时其他酶的活性很低，因此在该蛋白酶的工业化生产过程中，通常需对发酵液在60～70 ℃条件下保温一定时间，可大幅度降低发酵液中其他酶的活性。
答案：(1)葡萄糖 蛋白质 (2)琼脂 稀释涂布平板法 (3)a 快速增加目的菌的种群数量(扩大培养)
(4)大幅度降低发酵液中其他酶的活性
13．(四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以__________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加__________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为______________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
解析：(1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。
答案：(1)尿素 酚红 红 (2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115
课件47张PPT。当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量原理间接计数法直接计数法项目每毫升原液含菌数＝培养基上平均菌落数×稀释倍数÷涂布液体积每毫升原液含菌数＝每小格平均菌体数×400×10 000×稀释倍数计算公式操作较复杂，有一定误差死菌、活菌都计算在内缺点计数的是活菌计数方便、操作简单优点培养基上菌落数菌体本身计数数据培养基显微镜、细菌计数板主要用具间接计数法直接计数法项目若选取同一种土样，统计结果应接近重复组
的结果操作成功得到2个或2个以上菌落数目在30～300的平板样品的
稀释操作 选择培养基具有筛选作用牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数目大于选择培养基上的数目选择培养基的筛选作用 培养基中混入其他氮源菌落形态多样，菌落数偏高被杂菌污染培养基中菌落数偏高未被杂菌污染对照的培养皿中无菌落生长有无杂
菌污染
的判断结论现象内容土壤中分解尿素的细菌的分离和计数
一、选择题
1．下列关于“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的叙述，错误的是( )
A．土壤取样时应选取距地表约3～8 cm的土壤层
B．测定细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液
C．土壤中能合成脲酶的细菌能分解尿素
D．向以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红溶液可以鉴定出分解尿素的细菌
解析：选D 鉴定分解尿素的细菌时需向以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
2．分离土壤中分解尿素的细菌时，对培养基的要求是( )
①加尿素 ②不加尿素 ③加琼脂 ④不加琼脂 ⑤加葡萄糖 ⑥不加葡萄糖 ⑦加硝酸盐 ⑧不加硝酸盐
A．①③⑤⑦ B．②④⑥⑧
C．①③⑤⑧ D．①④⑥⑦
解析：选C 土壤中分解尿素的细菌能够合成脲酶，将尿素分解生成氨，利用尿素中的氮合成自身有机物。培养基中尿素作为唯一氮源，分解尿素的细菌能生长，其他微生物不能生长；分离微生物要用固体培养基，需要加琼脂；土壤中分解尿素的细菌属于异养微生物，需要加葡萄糖作为碳源。
3．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是( )
A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板
B．取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL分别涂布于各组平板上
C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48 h
D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数
解析：选D 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，一般选择菌落数在30～300的实验组平板进行计数。
4．下列操作需要在火焰旁进行的是( )
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液
④涂布平板 ⑤微生物的培养
A．①②③④⑤ B．②③④⑤
C．③④⑤ D．②③④
解析：选D 实验操作过程要进行严格的无菌操作，除实验空间必须消毒外，每个操作步骤都必须在无菌区进行。土壤的称取、溶液的稀释、涂布平板都需要在酒精灯火焰旁的无菌区(或接种箱内的酒精灯火焰旁)完成，以防止杂菌污染。
5．通过选择培养基可以从混杂的微生物群体中分离出所需的微生物。在缺乏氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述方法不能从混杂的微生物群体中分离出的是( )
A．大肠杆菌 B．霉菌
C．放线菌 D．固氮细菌
解析：选A 固氮微生物的生长不需要从培养基上获得氮源，可在缺乏氮源的培养基上正常生长；加入青霉素的培养基上不能生长细菌和放线菌，则可收获霉菌；加入酚的培养基使细菌和霉菌不能正常生长，而放线菌却能利用酚作为原料合成自身产物。
6．在做分离分解尿素的细菌实验时，一同学从对应稀释倍数为106的培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只筛选出大约50个菌落。该同学的结果产生的原因可能有( )
①土样不同 ②培养基被污染 ③操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②④
解析：选A 实验结果不同，最可能的原因是土样不同，其次是操作失误或培养基被污染，而与是否设置对照没有关系。
7．三个培养皿中分别加入10 mL不同的培养基，然后接种相同的大肠杆菌样液。培养36 h后，计算菌落数，结果如下表。下列相关叙述正确的是( )
培养皿
培养基成分
菌落数
Ⅰ
琼脂、葡萄糖
35
Ⅱ
琼脂、葡萄糖、生长因子
250
Ⅲ
琼脂、生长因子
0
A．该实验采用的是液体培养基
B．该实验采用平板划线法接种
C．Ⅰ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长不需要生长因子
D．Ⅱ和Ⅲ对照，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖
解析：选D 该培养基加入了琼脂，故为固体培养基；对微生物进行计数时宜采用稀释涂布平板法接种，而不是平板划线法接种；Ⅰ与Ⅲ中有葡萄糖、生长因子两种变量，不能得出相应结论；Ⅱ和Ⅲ对照，自变量是有无葡萄糖，说明大肠杆菌的生长需要葡萄糖。
8．苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。下列相关叙述错误的是( )
A．图中②培养目的菌株的选择培养基中应加入苯酚作为碳源
B．如果要测定②中活细菌数量，常采用稀释涂布平板法
C．若图中④为对照实验，则其中应以苯酚作为唯一的碳源
D．使用平板划线法可以在⑥上获得单菌落
解析：选C 用苯酚作为选择培养基中的碳源，也是微生物的能源物质，会影响其他微生物生长。测定培养液中细菌数目常采用稀释涂布平板法。若④为对照实验，则④中应含除苯酚外的其他碳源，⑤以苯酚作为唯一碳源。使用稀释涂布平板法或平板划线法都可以在⑥上获得单菌落。
9．关于土壤中细菌的分离，下列正确的操作步骤是( )
①土壤取样 ②称取10 g土壤，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中 ③吸取0.1 mL进行平板涂布 ④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107倍的稀释液
A．①→②→③→④ B．①→③→②→④
C．①→②→④→③ D．①→④→②→③
解析：选C 在分离土壤中某种细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。
10．下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是( )
A．可采用干热灭菌法对微生物培养基进行灭菌
B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法
C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度
D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中唯一的氮源
解析：选A 培养基灭菌通常用的是高压蒸汽灭菌法，而干热灭菌法通常适用于玻璃器皿、金属用具等耐高温且不适合其他方法的物品；分离能分解尿素的细菌，用的选择培养基里尿素是唯一的氮源，这样才能分离出分解尿素的细菌。
二、非选择题
11．多氯联苯是一种对人体有很大危害的有机物，呈油状液体，污染土壤后，很难清除。研究发现部分酵母菌具有分解多氯联苯的作用。为消除这种污染，科研人员计划从受污染的土壤中筛选出高效分解多氯联苯的菌株。
(1)筛选分解多氯联苯的菌株时，应将土壤样品______________，接种到以____________为唯一碳源的培养基上，从功能上讲，该培养基属于____________。
(2)对初步提取到的菌株要进行____________，一般操作方法有两种，如图是____________法。
(3)若要测定培养液酵母菌的菌体数，可在显微镜下直接计数。若用________法统计菌落数，在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板进行培养一段时间，这样做的目的是________________________________________________________________________。
(4)将1 mL酵母菌溶液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57、58，据此可得出每升溶液中酵母菌活菌数为____________。
解析：(1)依题意可知：筛选分解多氯联苯的菌株时，应将土壤样品稀释(溶解)接种到以多氯联苯为唯一碳源的培养基上。在该培养基中，只有能降解多氯联苯的微生物才能生长，而其他微生物则不能生长，所以从功能上讲，该培养基属于选择培养基。(2)对初步提取到的菌株要进行纯化。图中采用的操作方法是平板划线法。(3)若要测定培养液酵母菌的菌体数，既可在显微镜下用血细胞计数板直接计数，也可选用稀释涂布平板法统计活菌数目。在涂布接种前，随机取若干灭菌后的空白平板进行培养一段时间，其目的是检验培养基平板灭菌是否成功(或倒平板是否感染杂菌或是否彻底灭菌)。(4)将1 mL酵母菌溶液稀释100倍，在3个平板上用稀释涂布平板法分别接入0.1 mL稀释液，经适当培养后，3个平板上的菌落数分别为56、57、58，据此可得出每升溶液中酵母菌活菌数为(56＋57＋58)÷3÷0.1×100×103＝5.7×107个/L。
答案：(1)稀释(溶解) 多氯联苯 选择培养基 (2)纯化 平板划线 (3)稀释涂布平板 检验培养基平板灭菌是否成功(倒平板是否感染杂菌或是否彻底灭菌) (4)5.7×107个/L
12．蛋白酶在生物医药和日用化工等生产领域具有重要的经济价值。某同学为筛选产蛋白酶的高产菌株，做了如下实验步骤(配制了下列培养基，在适宜条件下培养)：
步骤
取样
培养基
培养结果
Ⅰ
土壤
样品
葡萄糖、(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、KH2PO4、NaCl、CaCl2、MgSO4·7H2O，加水定容
培养液a
Ⅱ
1mL
培养液a
同上
菌落
Ⅲ
挑取
单菌落
细菌培养基
培养液b
(1)为实现筛选目的，步骤Ⅰ所使用的培养基配方中，应去除____________并加入高浓度的____________。
(2)为实现目的菌的分离和计数，步骤Ⅱ所使用的培养基中还应加入____________制成平板，采用的接种方法是__________________，实验结果如图A。
(3)步骤Ⅲ应挑取图A中____________处的菌落，本步骤的目的是________________________________________________________________________。
(4)图B是该蛋白酶和其他酶的热稳定性数据，即酶在不同温度下保温足够长的时间，再在酶活性最高的温度下测其酶活性。在该蛋白酶的工业化生产过程中，通常需对发酵液在60～70 ℃条件下保温一定时间，其作用是_________________________________________。
解析：(1)培养基中添加特定的成分以促进需要的微生物生长而抑制其他微生物生长，用于进行微生物筛选。根据题意，为筛选产蛋白酶的高产菌株，步骤Ⅰ所使用的培养基配方中，应去除葡萄糖并加入高浓度的蛋白质。(2)为实现目的菌的分离和计数，步骤Ⅱ所使用的培养基中还应加入琼脂(凝固剂)制成平板，采用的接种方法是稀释涂布平板法。(3)图A中a处的菌落透明圈最大，故其菌种分解蛋白质的能力最强，所以步骤Ⅲ应挑取图A中a处的菌落，本步骤的目的是快速增加目的菌的种群数量(即扩大培养)。(4)图B曲线表明，60～70 ℃条件下，蛋白酶的活性很高，而此时其他酶的活性很低，因此在该蛋白酶的工业化生产过程中，通常需对发酵液在60～70 ℃条件下保温一定时间，可大幅度降低发酵液中其他酶的活性。
答案：(1)葡萄糖 蛋白质 (2)琼脂 稀释涂布平板法 (3)a 快速增加目的菌的种群数量(扩大培养)
(4)大幅度降低发酵液中其他酶的活性
13．(四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。
(1)图中选择培养基应以__________为唯一氮源；鉴别培养基还需添加__________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成________色。
(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是________________，每克土壤样品中的细菌数量为________×108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________。
(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为______________，突变基因表达的蛋白含________个氨基酸。
解析：(1)脲酶能够催化尿素水解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30～300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156＋178＋191)÷3＝175个。每克土壤样品中的细菌数为175÷0.1×105＝1.75×108个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA……对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有273＋72个碱基，因此突变基因表达的蛋白含115个氨基酸。
答案：(1)尿素 酚红 红 (2)稀释涂布平板法 1.75 少 (3)UGA 115
