血红蛋白的提取和分离
一、蛋白质分离的原理和方法
1．分离原理
依据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。
2．凝胶色谱法
(1)概念：也称为分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。
(2)凝胶：微小的多孔球体，大多数由多糖类化合物构成，内部有许多贯穿的通道。
(3)原理：[填表]
蛋白质类型
能否进入凝胶内部
移动路程
移动速度
相对分子质量较小
能
较长
较慢
相对分子质量较大
不能
较短
较快
3．缓冲溶液
(1)作用：在一定范围内，抑制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。
(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。
4．电泳
(1)概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。
(2)原理：
①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。
②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。
③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
二、血红蛋白提取和分离的实验操作[填图]
1．凝胶色谱法中移动速度快的是( )
A．相对分子质量大的 B．相对分子质量小的
C．溶解度高的 D．溶解度低的
解析：选A 凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。当不同蛋白质通过凝胶时，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
2．下列各项中，不是电泳使样品中各种分子分离的原因的是( )
A．带电性质差异 B．分子的大小
C．分子的形状 D．分子的变性温度
解析：选D 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，而迁移速度与分子的变性温度无关。
3．蛋白质提取和分离的一般步骤是( )
①样品处理 ②凝胶色谱操作 ③粗分离 ④SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑤纯化 ⑥纯度鉴定
A．①②③④⑤⑥ B．①③⑤⑥
C．③④⑤⑥ D．①③④⑤
解析：选B 蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。凝胶色谱操作及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。
4．将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度 离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是( )
A．血红蛋白、 甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层
B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层
C．脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层
D．甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层
解析：选D 混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。
5．蛋白质的分离与提纯技术是蛋白质研究的重要技术，下列有关叙述错误的是( )
A．根据蛋白质分子不能通过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳分离蛋白质
C．根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
解析：选A 蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离；根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小，可通过电泳使带电分子产生不同的迁移速度而分离蛋白质；根据蛋白质相对分子质量的大小，可通过凝胶色谱法使相对分子质量较大的蛋白质先洗脱出来，较小的蛋白质后洗脱出来而分离蛋白质；根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法使不同密度的分子位于不同层次的离心液体中而分离蛋白质。
1．原理
根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。
2．凝胶色谱法
凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法：
蛋白质
项目
相对分子质量大
相对分子质量小
能否进入凝胶内部
不能进入
能进入
运动路径
凝胶颗粒之间
凝胶颗粒内部
运动方式
垂直向下
垂直向下和无规则扩散运动
运动路程
较短
较长
运动速度
较快
较慢
洗脱次序
先流出
后流出
3.电泳
(1)原理：
(2)常用方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。在凝胶中加入SDS，可使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，然后与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
[题组冲关]
1．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程(见下图)可表示为( )
解析：选B 用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较大的蛋白质迅速通过凝胶间隙，先被洗脱出来；相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部而被滞留，后被洗脱出来。
2．关于电泳的说法，错误的是( )
A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动
C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它所带净电荷的多少
D．用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小
解析：选C 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。
1．样品处理
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。
②过程：
(2)血红蛋白的释放
①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。
②过程：
a．将洗涤好的红细胞倒入烧杯中。
b．加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破。
c．加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜。
d．置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂。
e．红细胞破裂，释放出血红蛋白。
(3)分离血红蛋白溶液
2．粗分离——透析
(1)目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。
(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的烧杯中，透析12 h。
3．纯化——凝胶色谱操作
(1)凝胶色谱柱的制作
①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端用砂纸磨平。
②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。
③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。
④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。
(2)凝胶色谱柱的装填
(3)样品的加入和洗脱
4．纯度鉴定
在鉴定的方法中，使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
5．结果分析与评价
项目
分析
血液样品的处理
分层明显→样品处理完成
凝胶色谱柱的装填
放一支与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查(加入大分子有色物质，如蓝色葡聚糖－2 000或红色葡聚糖)→色带均匀、狭窄、平整→装填成功
血红蛋白的分离
血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功
[题组冲关]
3．下列有关“血红蛋白的提取和分离”实验的叙述，正确的是( )
A．用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白
B．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质
C．血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂
D．整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构
解析：选D 用生理盐水进行红细胞的洗涤，其目的是去除杂蛋白；将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质；血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白中的杂质溶于有机溶剂，以获得较为纯净的蛋白质。
4．如图为血红蛋白的提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：
(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有___________________________________________________功能。
(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是____________________________________；乙装置中，C溶液的作用是_______________________________________________。
(3)甲装置用于______，目的是_________________________________________。
用乙装置分离蛋白质的方法称为____________________，是根据_________________分离蛋白质的有效方法。
(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_________________________________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。
(5)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。其中样品处理包括__________________、____________________________、分离血红蛋白溶液。
解析：图甲为透析装置，图乙为样品的洗脱装置。(1)血红蛋白能运输氧气，体现了蛋白质的运输功能。(2)甲装置中用磷酸缓冲液来透析；乙装置中C溶液为磷酸缓冲液，其作用是洗脱蛋白质。(3)因透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，故透析能去除样品中相对分子质量较小的杂质。乙装置是利用凝胶色谱法分离血红蛋白，它是根据蛋白质相对分子质量的大小来分离蛋白质的。(4)洗脱时先流出的是相对分子质量与血红蛋白相比较大的蛋白质，血红蛋白呈红色，故待红色的蛋白质接近色谱柱底端时就可用试管收集流出液。(5)样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放和分离血红蛋白溶液。
答案：(1)运输 (2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白 (3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小 (4)红色的蛋白质接近色谱柱底端 (5)红细胞的洗涤 血红蛋白的释放
[随堂基础巩固]
1．在实验中，人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是( )
A．鸡的红细胞无血红蛋白，人的红细胞有血红蛋白
B．鸡的红细胞有线粒体，人的红细胞无线粒体
C．鸡的红细胞有细胞核，人的成熟红细胞无细胞核，含较多的血红蛋白
D．鸡的红细胞进行有氧呼吸，人的红细胞进行无氧呼吸
解析：选C 鸡(鸟类)的红细胞具有完整的细胞核，含有核DNA，便于进行DNA的提取；人的成熟红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。
2．用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质( )
A．路程较长，移动速度较慢
B．路程较长，移动速度较快
C．路程较短，移动速度较慢
D．路程较短，移动速度较快
解析：选D 在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只有在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。
3．下列有关缓冲溶液的说法，错误的是( )
A．缓冲溶液能够抵制外界任何酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变
B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成
C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液
D．生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的
解析：选A 缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，但其调节能力有一定的限度。
4．在血红蛋白的提取和分离中，将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液从上到下分为4层，其中第3层是( )
A．无色透明的甲苯层
B．脂溶性物质的沉淀层
C．血红蛋白的水溶液
D．其他杂质的暗红色沉淀
解析：选C 从上到下第1层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。
5．下列关于凝胶色谱操作的说法不正确的是( )
A．干的凝胶要用蒸馏水充分溶胀后，才能装填
B．在装填凝胶柱时，不得有气泡产生
C．在操作过程中，不能让洗脱液流干
D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液
解析：选D 在分离时，要等到红色的蛋白质接近色谱柱底端时开始收集流出液。
6．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是( )
①防止血红蛋白被氧气氧化 ②血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和 ③防止色谱柱内产生气泡，影响洗脱效果 ④让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能
A．①② B．②③
C．②④ D．③④
解析：选D 在血红蛋白的提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是防止色谱柱内产生气泡，影响洗脱效果，同时也是为了让血红蛋白处在稳定的pH范围内，以维持其结构和功能。
7．随着人类基因组计划的进展和多种生物基因组测序工作的完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代。对蛋白质进行研究时，首先要获得纯度较高的蛋白质。如图是某生物兴趣小组在“蛋白质的提取和分离”实验中，准备从猪的血液中初步提取血红蛋白，设计的血红蛋白提取、分离流程图：
请回答下列有关问题：
(1)样品处理中红细胞的洗涤要用__________反复冲洗、离心。向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是________________________________________________________________________。
(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是__________________________________，若要尽快达到理想的透析效果，可以________________________________________(写出一种方法)。
(3)血红蛋白的纯化是通过____________法将相对分子质量大的杂质蛋白除去。
(4)电泳利用了待分离样品中各种分子的________________________等的差异，而产生不同迁移速度，实现各种分子的分离。
(5)
一同学通过血红蛋白醋酸纤维薄膜电泳，观察到正常人和镰刀型细胞贫血症患者的血红蛋白电泳结果如图所示。由图可知携带者有________种血红蛋白，从分子遗传学的角度作出的解释是_______________________________________________________________。
解析：(1)样品处理中红细胞的洗涤要用生理盐水反复冲洗、离心；向红细胞悬液中加入一定量的低浓度pH＝7.0的缓冲液并充分搅拌，可以破碎红细胞，破碎细胞的原理是渗透原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内溶液浓度时，细胞吸水涨破)。(2)血红蛋白粗分离阶段，透析的目的是除去小分子杂质。(4)电泳利用了待分离样品中各种分子的带电性质以及分子大小、形状等的差异，而产生不同的迁移速度，实现各种分子的分离。(5)由图可知携带者有2种血红蛋白，因为携带者具有(控制血红蛋白的)一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质。
答案：(1)生理盐水 渗透(作用)原理(当外界溶液浓度低于动物细胞内溶液浓度时，细胞吸水涨破) (2)除去小分子杂质 增加缓冲液的量或及时更换缓冲液 (3)凝胶色谱 (4)带电性质以及分子大小、形状 (5)2 携带者具有一对等位基因，可以控制合成两种不同的蛋白质
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一、选择题
1．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( )
A．具有相同的相对分子质量
B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子
C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子
D．相对分子质量不同，但都在一定范围之内
解析：选D 相对分子质量大小不同的多种成分在通过凝胶时，按照相对分子质量大小“排队”，从而将各种成分分开。在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
2．下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是( )
A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心
B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌
C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离
D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h
解析：选C 红细胞洗涤过程中应该用生理盐水，不能用蒸馏水；血红蛋白的释放应该加入蒸馏水和甲苯，使红细胞吸水涨破，释放其中的血红蛋白；将搅拌好的混合液通过离心、过滤后，用分液漏斗分离出血红蛋白溶液；透析所用的磷酸缓冲液的pH为7.0。
3．下列关于凝胶色谱法的原理及操作，错误的是( )
A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法
B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出；小分子因进入凝胶内部而流速缓慢，后流出
C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系
D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来
解析：选C 选用不同种凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离出的分子大小也不同。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所有要分离的物质都应该被洗脱出来，这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。
4．下列关于凝胶柱上加入样品和洗脱操作的叙述，错误的是( )
A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
B．让吸管管口沿管壁环绕移动贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面
C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱
D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液
解析：选C 样品完全进入凝胶层后，加入磷酸缓冲液到适当高度，再连接缓冲液洗脱瓶，开始洗脱。
5．凝胶色谱柱制作的程序一般是( )
①橡皮塞打孔 ②挖凹穴 ③装玻璃管 ④盖尼龙网 ⑤盖尼龙纱 ⑥将橡皮塞插入玻璃管 ⑦接尼龙管、装螺旋夹 ⑧柱顶插入安装了玻璃管的橡皮塞
A．①→③→④→⑤→⑥→⑧→⑦→②
B．①→②→③→④→⑤→⑥→⑦→⑧
C．①→②→③→④→⑥→⑤→⑧→⑦
D．①→②→③→⑦→⑥→⑤→⑧→④
解析：选B 凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管→选择合适的橡皮塞→打孔→挖凹穴→装玻璃管→盖尼龙网→盖尼龙纱→将橡皮塞插入玻璃管→接尼龙管→装螺旋夹→柱顶插入安装了玻璃管的橡皮塞。
6．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述错误的是( )
A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质
C．可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
解析：选A 蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此透析可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。
7．在提取和分离猪血红蛋白的实验中，应使用( )
A．柠檬酸钠溶液洗涤红细胞，防止红细胞破裂
B．蒸馏水和甲苯处理红细胞，使其释放出血红蛋白
C．生理盐水透析血红蛋白溶液，保持血红蛋白活性
D．生理盐水洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动
解析：选B 柠檬酸钠可与血浆中的钙离子结合，防止血液凝固；在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白；透析用的是磷酸缓冲液；磷酸缓冲液有利于血红蛋白在凝胶柱中移动。
8．以下关于猪血红蛋白的分离与提取的描述，正确的是( )
A．透析的目的是去除样品中分子量较大的杂质
B．血红蛋白释放后应进行低速短时间离心
C．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢
D．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
解析：选D 透析可以除去分子量较小的杂质；血红蛋白释放后，以2 000 r/min的高速离心10 min，从而分离血红蛋白溶液；凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较大的在凝胶外部移动，移动速度快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况。
9．下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离实验的叙述，错误的是( )
A．可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质
B．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质
C．透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜
D．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法
解析：选A 猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，不能从其红细胞中提取出DNA。
10．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、所带电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关该样品中蛋白质的分离的叙述，正确的是( )
A．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内
B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中
D．若用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远
解析：选A 分子甲的相对分子质量最小，会进入凝胶内部通道而移动速度慢；若分子乙留在透析袋内，说明其相对分子质量比较大，分子丙比分子乙相对分子质量大，所以分子丙也留在袋内；分子戊比分子甲的相对分子质量大，分子戊存在于沉淀中分子甲可能不在沉淀物中；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的样品，其电泳迁移率完全取决于分子的大小，相对分子质量相差越大，形成的电泳带相距越远，故分子甲和分子丙形成的电泳带相距最远。
二、非选择题
11．对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：
(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________________________________________、
____________、____________和纯度鉴定。
(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前要在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是________________。
(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、________和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶液时需要用到____________(仪器)分出下层红色透明液体。
(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。
①透析的目的是________________________________________________；
②透析的原理是_______________________________________________。
(5)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是_____________________________；
②血红蛋白的特点是_______________________________________；
这一特点对分离血红蛋白的意义是_____________________________________。
解析：透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内，所以透析可以除去相对分子质量较小的杂质；样品纯化的目的是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去；血红蛋白呈现红色，在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时期；同时，通过观察颜色，使血红蛋白的分离过程更直观，大大简化了实验操作。
答案：(1)样品处理 粗分离 纯化 (2)防止血液凝固 (3)血红蛋白的释放 分液漏斗 (4)①去除相对分子质量较小的杂质 ②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内 (5)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去 ②呈现红色 在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
12．如图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：
(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是______________________________。
(2)图甲表示________________过程，该操作目的是去除样品中____________________的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以________________________________________________________________________
(写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：______________________________________________。
(3)图乙是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是________________。在进行④操作时要________(填“打开”或“关闭”)下端出口。
(4)图丙为用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法________(填“可靠”或“不可靠”)，理由是__________________________________________________。
解析：(1)生理盐水与红细胞内液为等渗溶液，故用其洗涤红细胞主要是防止红细胞吸水破裂。(2)图甲表示血红蛋白粗提取过程，也称为透析过程。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质；若要尽快达到理想的透析效果，可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法。透析袋是一种半透膜，双缩脲试剂可以透过半透膜，进入袋内与血红蛋白反应，生成紫色物质。(3)根据教材中往色谱柱中加样的顺序可知，正确的排序为②③④①；图中进行④操作是在样品上部添加缓冲液，此时要关闭下端出口。(4)电泳的原理是利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的大小、形状等的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，本实验只能判断肽链的大小，而不能判断其条数。
答案：(1)防止红细胞吸水破裂
(2)透析(粗分离) 相对分子质量较小 增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液) 出现紫色，因为双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血红蛋白反应，生成紫色物质
(3)②③④① 关闭 (4)不可靠 只能得出提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链，不一定是两条
13.凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前该技术不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是_________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由____________________________________________________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是__________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体______(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是___________________________________________。
(5)若选用SephadexG-75，则“G”表示_____________________________________，“75”表示_______________________________________________________________________。
解析：(1)原理：不同蛋白质的相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的蛋白质则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。(2)凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。(3)凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(4)样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶时所用的液体均是物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。
答案：(1)a a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快
(2)尼龙网和尼龙纱 (3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 (4)相同 保持稳定 (5)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g
课件43张PPT。能不能较长较短较慢较快后流出先流出洗脱次序较慢较快运动速度较长较短运动路程垂直向下和无规则扩散运动垂直向下运动方式凝胶颗粒内部凝胶颗粒之间运动路径能进入不能进入能否进入
凝胶内部相对分子质量小相对分子质量大 蛋白质
项目 血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功血红蛋白的分离放一支与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查(加入大分子有色物质，如蓝色葡聚糖－2 000或红色葡聚糖)→色带均匀、狭窄、平整→装填成功凝胶色谱柱的装填分层明显→样品处理完成
血液样
品的处理分析项目血红蛋白的提取和分离
一、选择题
1．凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可用此方法进行分离。能分离的蛋白质分子之间必须( )
A．具有相同的相对分子质量
B．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子
C．相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子
D．相对分子质量不同，但都在一定范围之内
解析：选D 相对分子质量大小不同的多种成分在通过凝胶时，按照相对分子质量大小“排队”，从而将各种成分分开。在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。
2．下列关于血红蛋白提取和分离实验中样品处理步骤的描述，正确的是( )
A．红细胞的洗涤：加入蒸馏水，缓慢搅拌，低速短时间离心
B．血红蛋白的释放：加入生理盐水和甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌
C．分离血红蛋白：将搅拌好的混合液离心、过滤后，用分液漏斗分离
D．透析：将血红蛋白溶液装入透析袋，然后置于pH为4.0的磷酸缓冲液中透析12 h
解析：选C 红细胞洗涤过程中应该用生理盐水，不能用蒸馏水；血红蛋白的释放应该加入蒸馏水和甲苯，使红细胞吸水涨破，释放其中的血红蛋白；将搅拌好的混合液通过离心、过滤后，用分液漏斗分离出血红蛋白溶液；透析所用的磷酸缓冲液的pH为7.0。
3．下列关于凝胶色谱法的原理及操作，错误的是( )
A．是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法
B．在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而最先流出；小分子因进入凝胶内部而流速缓慢，后流出
C．凝胶内部有很微细的多孔网状结构，其孔隙大小与被分离的物质分子的大小无相应关系
D．一般情况下，凝胶对要分离的物质没有吸附作用，因此所有要分离的物质都应该被洗脱出来
解析：选C 选用不同种凝胶，其立体网状结构不同，孔隙大小不同，因此可分离出的分子大小也不同。凝胶一般对分离的物质无吸附作用，所有要分离的物质都应该被洗脱出来，这是凝胶色谱法与一般层析法的不同。
4．下列关于凝胶柱上加入样品和洗脱操作的叙述，错误的是( )
A．加样前要使柱内凝胶面上的缓冲液下降到与凝胶面平齐
B．让吸管管口沿管壁环绕移动贴壁加样至色谱柱顶端，不要破坏凝胶面
C．打开下端出口，待样品完全进入凝胶层后，直接连接缓冲液洗脱瓶开始洗脱
D．待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，每5 mL收集一管，连续收集流出液
解析：选C 样品完全进入凝胶层后，加入磷酸缓冲液到适当高度，再连接缓冲液洗脱瓶，开始洗脱。
5．凝胶色谱柱制作的程序一般是( )
①橡皮塞打孔 ②挖凹穴 ③装玻璃管 ④盖尼龙网 ⑤盖尼龙纱 ⑥将橡皮塞插入玻璃管 ⑦接尼龙管、装螺旋夹 ⑧柱顶插入安装了玻璃管的橡皮塞
A．①→③→④→⑤→⑥→⑧→⑦→②
B．①→②→③→④→⑤→⑥→⑦→⑧
C．①→②→③→④→⑥→⑤→⑧→⑦
D．①→②→③→⑦→⑥→⑤→⑧→④
解析：选B 凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管→选择合适的橡皮塞→打孔→挖凹穴→装玻璃管→盖尼龙网→盖尼龙纱→将橡皮塞插入玻璃管→接尼龙管→装螺旋夹→柱顶插入安装了玻璃管的橡皮塞。
6．蛋白质的分离与纯化技术是蛋白质研究的重要技术。下列有关叙述错误的是( )
A．根据蛋白质分子不能透过半透膜的特性，可将样品中各种不同的蛋白质分离
B．根据蛋白质所带电荷性质的差异及分子大小等，可通过电泳分离蛋白质
C．可通过凝胶色谱法分离蛋白质
D．根据蛋白质的分子大小、密度不同，可通过离心沉降法分离蛋白质
解析：选A 蛋白质分子不能透过半透膜，而溶液中的小分子物质则可以透过半透膜，因此透析可以将蛋白质和溶液中的小分子物质分离。
7．在提取和分离猪血红蛋白的实验中，应使用( )
A．柠檬酸钠溶液洗涤红细胞，防止红细胞破裂
B．蒸馏水和甲苯处理红细胞，使其释放出血红蛋白
C．生理盐水透析血红蛋白溶液，保持血红蛋白活性
D．生理盐水洗脱，有利于血红蛋白在凝胶柱中移动
解析：选B 柠檬酸钠可与血浆中的钙离子结合，防止血液凝固；在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白；透析用的是磷酸缓冲液；磷酸缓冲液有利于血红蛋白在凝胶柱中移动。
8．以下关于猪血红蛋白的分离与提取的描述，正确的是( )
A．透析的目的是去除样品中分子量较大的杂质
B．血红蛋白释放后应进行低速短时间离心
C．蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较大的移动速度慢
D．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测
解析：选D 透析可以除去分子量较小的杂质；血红蛋白释放后，以2 000 r/min的高速离心10 min，从而分离血红蛋白溶液；凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较大的在凝胶外部移动，移动速度快；血红蛋白的颜色可用于观察红色区带的移动情况。
9．下列关于DNA和血红蛋白的提取与分离实验的叙述，错误的是( )
A．可用蒸馏水涨破细胞的方法从猪的红细胞中提取到DNA和蛋白质
B．用不同浓度的NaCl溶液反复溶解与析出DNA可除去部分杂质
C．透析法分离蛋白质的依据是蛋白质不能通过半透膜
D．凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小来分离蛋白质的有效方法
解析：选A 猪是哺乳动物，哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核和线粒体，不能从其红细胞中提取出DNA。
10．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，其分子大小、所带电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关该样品中蛋白质的分离的叙述，正确的是( )
A．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子丙也保留在袋内
B．若用凝胶色谱柱分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快
C．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊存在于沉淀中，则分子甲也存在于沉淀中
D．若用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最远
解析：选A 分子甲的相对分子质量最小，会进入凝胶内部通道而移动速度慢；若分子乙留在透析袋内，说明其相对分子质量比较大，分子丙比分子乙相对分子质量大，所以分子丙也留在袋内；分子戊比分子甲的相对分子质量大，分子戊存在于沉淀中分子甲可能不在沉淀物中；SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中的样品，其电泳迁移率完全取决于分子的大小，相对分子质量相差越大，形成的电泳带相距越远，故分子甲和分子丙形成的电泳带相距最远。
二、非选择题
11．对蛋白质进行研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：
(1)蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________________________________________、
____________、____________和纯度鉴定。
(2)在血红蛋白的提取与分离实验中，采集新鲜血液前要在采血容器中加入柠檬酸钠溶液的目的是________________。
(3)样品的处理过程又可以细分为：红细胞的洗涤、________和分离血红蛋白溶液。其中分离血红蛋白溶液时需要用到____________(仪器)分出下层红色透明液体。
(4)收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析进行粗分离。
①透析的目的是________________________________________________；
②透析的原理是_______________________________________________。
(5)然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
①样品纯化的目的是_____________________________；
②血红蛋白的特点是_______________________________________；
这一特点对分离血红蛋白的意义是_____________________________________。
解析：透析袋能使小分子物质自由进出，而大分子物质被保留在袋内，所以透析可以除去相对分子质量较小的杂质；样品纯化的目的是通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去；血红蛋白呈现红色，在用凝胶色谱法分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时期；同时，通过观察颜色，使血红蛋白的分离过程更直观，大大简化了实验操作。
答案：(1)样品处理 粗分离 纯化 (2)防止血液凝固 (3)血红蛋白的释放 分液漏斗 (4)①去除相对分子质量较小的杂质 ②透析袋能使小分子自由进出，而大分子则被留在袋内 (5)①通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂蛋白除去 ②呈现红色 在用凝胶色谱法分离血红蛋白时，可以通过观察颜色来判断什么时期该收集洗脱液，这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作
12．如图表示血红蛋白提取和分离实验的部分装置或操作方法，请回答下列问题：
(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是______________________________。
(2)图甲表示________________过程，该操作目的是去除样品中____________________的杂质。现有一定量的血红蛋白溶液，进行上述操作时若要尽快达到理想的实验效果，可以________________________________________________________________________
(写出一种方法)。一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色，并说明判断的依据：______________________________________________。
(3)图乙是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品的加入示意图，正确的加样顺序是________________。在进行④操作时要________(填“打开”或“关闭”)下端出口。
(4)图丙为用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血浆某白蛋白的结果。根据电泳结果，某同学得出“提取的血浆某白蛋白有两条肽链”的结论，这种说法________(填“可靠”或“不可靠”)，理由是__________________________________________________。
解析：(1)生理盐水与红细胞内液为等渗溶液，故用其洗涤红细胞主要是防止红细胞吸水破裂。(2)图甲表示血红蛋白粗提取过程，也称为透析过程。透析可以去除样品中相对分子质量较小的杂质；若要尽快达到理想的透析效果，可采用增加缓冲液的量或及时更换缓冲液等方法。透析袋是一种半透膜，双缩脲试剂可以透过半透膜，进入袋内与血红蛋白反应，生成紫色物质。(3)根据教材中往色谱柱中加样的顺序可知，正确的排序为②③④①；图中进行④操作是在样品上部添加缓冲液，此时要关闭下端出口。(4)电泳的原理是利用待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子的大小、形状等的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，本实验只能判断肽链的大小，而不能判断其条数。
答案：(1)防止红细胞吸水破裂
(2)透析(粗分离) 相对分子质量较小 增加缓冲液的量(或及时更换缓冲液) 出现紫色，因为双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血红蛋白反应，生成紫色物质
(3)②③④① 关闭 (4)不可靠 只能得出提取的血浆某白蛋白含有两种大小不同的肽链，不一定是两条
13.凝胶色谱技术是一种快速而又简单的分离技术，设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前该技术不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答问题：
(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是________，原因是_________________________________________________________。
(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由____________________________________________________替代。
(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是__________________________________________________________。
(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体______(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是___________________________________________。
(5)若选用SephadexG-75，则“G”表示_____________________________________，“75”表示_______________________________________________________________________。
解析：(1)原理：不同蛋白质的相对分子质量不同，相对分子质量较大的蛋白质不能进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程短，速度快，易洗脱；相对分子质量较小的蛋白质则进入凝胶内部通道，路程长，速度慢。(2)凝胶色谱柱的制作：底部橡皮塞的凹穴上覆盖尼龙网和100目的尼龙纱，相当于多孔板。(3)凝胶色谱柱的装填：装填时尽量紧密，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。(4)样品的加入和洗脱：洗脱时和浸泡凝胶时所用的液体均是物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液，洗脱时，对洗脱液的流速要求保持稳定。
答案：(1)a a相对分子质量较大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快
(2)尼龙网和尼龙纱 (3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果 (4)相同 保持稳定 (5)凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围 凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5 g
