第40讲 基因工程与转基因的安全性和生物武器（原卷版）
本模块为基因工程以及转基因技术的安全的基本知识，通过本模块的学习，了解基因工程诞生的基础理论和技术，基因工程操作工具的种类、功能，基因工程操作的基本程序，知道PCR技术的原理、条件、过程，蛋白质工程的概念及操作流程等。考纲对本模块内容的具体要求如下：
1．基因工程的诞生（理解水平）
2．基因工程的原理及技术（含PCR技术）（理解应用水平）
3．基因工程的应用（应用水平）
4．蛋白质工程（应用水平）
5．转基因生物的安全性（理解水平）
6．生物武器对人类的威胁（理解水平）
本部分内容在考试中考查角度新颖主要体现在试题的综合性上。可以是专题内综合，也可以是专题间综合，如细胞工程与基因工程的综合，还可以是选修和必修的综合，复习时要注意试题的综合性。
一、基因工程的基本工具及操作过程
1.基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(限制酶)
①来源：主要从 生物中分离纯化而来。
②作用：识别 并切开特定部位的两个核苷酸之间的 。
③结果：产生 末端或平末端。
如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是 ，切割位点在 之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是 ，切割位点在 之间；说明限制酶具有 。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段 。
②类型
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
T4噬菌体
功能
只“缝合”
“缝合”
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的
(3)载体
化学本质
能自我复制
①常用载体——质粒 特点 有一至多个
有特殊的
②其他载体：λ噬菌体衍生物、 等。
③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
2.基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要指编码 的基因，也可以是一些具 作用的因子。
从 中获取
人工 利用 合成
②获取方法 合成 通过 用化学方法人工合成
利用PCR技术扩增
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在 ，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
③构建过程
(3)将目的基因导入受体细胞
受体细胞种类不同，导入方法不同
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
法
法
法
受体细胞
体细胞或受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
【巧学助记】
(1)诠释基因组文库与部分基因文库
基因文库类型
基因组文库
部分基因文库(cDNA文库)
构建基因文库的过程
(2)诠释PCR技术
①原理：体外DNA复制
②需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
③过程：DNA受热(90～95 ℃)变性解旋为单链、冷却(55～60 ℃)后RNA引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下延伸(70～75 ℃)合成互补链。
(3)诠释基因表达载体
(4)农杆菌转化法原理
植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，则目的基因将被一起带入)
二、基因工程的应用及蛋白质工程
1.基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物 从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的 等。
(2)植物基因工程：培育 转基因植物(如抗虫棉)、 转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的 (如新花色矮牵牛)。
(3)比较基因治疗与基因诊断：
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用 导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定 与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
2.蛋白质工程
(1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因 或基因 。
③结果： 了现有蛋白质或制造出 。
④目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对 进行分子设计。
(2)操作过程
从预期的蛋白质 出发→设计预期的 →推测应有的 →找到相对应的 (基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。
其流程图如下：
【巧学助记】
蛋白质工程与基因工程的比较
项目
蛋白质工程
基因工程
实质
定向改造或生产人类所需蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果
生产自然界中没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
三、PCR技术
1.PCR技术原理： 原理，即：
2.PCR反应过程
过程
说明
图解
变性
当温度上升到 _℃以上时，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到 _℃左右，两种引物通过 与两条单链DNA结合
延伸
72 ℃左右时， 有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸
3.结果： 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子 ，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
【巧学助记】
生物体内DNA复制与PCR反应的区别
体内DNA复制
PCR反应
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至90 ℃，双链全部解开，不需要解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
Taq DNA聚合酶
不需要
需要
循环次数
受生物体自身控制
多次
相同点
生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行
四、生物技术的安全性和伦理问题
1．转基因生物的安全性
(1)转基因生物存在安全性问题的原因
①目前对 、基因间的相互作用及基因的调控机制等都了解得相当有限。
②目的基因往往是 的基因。
③外源基因插入宿主基因组的部位往往是 的。
(2)对安全性问题的担忧
①转基因生物与食物安全
a．反对“ ”。
b．担心出现 。
c．担心出现新的 。
d．担心 改变。
e．侵犯宗教信仰者或素食者的权益。
②转基因生物与生物安全
a．可能扩散到新的生态区域，破坏 。
b．成为“入侵的外来物种”，威胁 。
c．可能与某些细菌或病毒杂交，重组出有害的 。
d．可能通过花粉传播进入杂草，形成“ ”。
③转基因生物与环境安全：转基因生物可能会对 的稳定性和 造成破坏。
(3)理性看待转基因技术
①正视转基因技术可能带来的安全性问题，要 ，不能因噎废食。
②制定 ，最大程度地保证转基因技术和产品的安全性。
2．关注生物技术的伦理问题
反 对
支 持
克隆人
伦理方面
违反了人类的伦理道德观念，中国禁止 克隆
中国不反对 克隆
技术方面
技术 ，重构胚胎成功率低，胚胎着床率低、流产率高、畸形率高、出生后死亡率高
可通过胚胎分级、基因诊断、
检查等方法解决技术问题
设计试
管婴儿
也是生命，杀死胚胎无异于“谋杀”
提供 并不会对试管婴儿造成损伤
基因检测
技术方面
很难用在 中
有一些遗传性疾病可以
通过 后在早期采取预防措施
道德方面
可能引起
通过正确的科学知识传播、
教育和立法，解决基因歧视现象
4.治疗性克隆与生殖性克隆
类型
项目
治疗性克隆
生殖性克隆
区别
目的
从胚胎中取出干细胞用于医学研究和治疗
用于生育，获得人的复制品
水平
水平
水平
联系
都属于 生殖；产生新个体或新组织，遗传信息
5.试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
①过程区别：设计试管婴儿比试管婴儿多出的过程是上图中的 。
②所用技术手段不同：设计试管婴儿胚胎移植前需要进行遗传学诊断，而试管婴儿无需进行遗传学诊断。
③应用不同：试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，而设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症的治疗。
④相同点：两者都是 受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是
生殖。
6．禁止生物武器
(1)生物武器的种类(连线)
(2)我国政府观点：在任何情况下 生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
判断下列说法的对错：
1.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用( )
2.携带链霉素抗性基因受体菌的筛选必须通过分子检测( )
3.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸( )
4.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程( )
5.构建人胰岛素基因表达载体，表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点( )
6.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接( )
7.应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达( )
8.动物的生长激素基因转入植物后不能表达( )
9.从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽( )
10.采用蛋白质工程进一步改造AFB1解毒酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列( )
一、 基因工程的工具
例1：下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是( )
A．HindⅢ B．EcoRⅠ
C．EcoB D．PstⅠ
【答案】C
【解析】A处有3处(BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ)限制酶的切点，只有使用EcoB限制酶切割时，才能让目的基因插入到A处且使原有基因失活。
变式训练1：下列关于限制酶的叙述中，错误的是( )
A．它能在特定位点切割DNA分子
B．同一种限制酶切割不同的DNA分子产生的黏性末端能够很好地进行碱基配对
C．它能任意切割DNA，从而产生大量DNA片段
D．每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列
【答案】 C
【解析】 限制酶是基因工程的重要工具之一；每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子；同一种限制酶切割不同的DNA分子产生的黏性末端能进行互补配对。
二、 基因工程操作程序
例2：真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是__________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有______________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________________________________________________________。
【答案】 (1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
【解析】(1)从人的基因组文库中获得的基因A中含有内含子，而大肠杆菌属于原核生物，不能切除基因A初始转录产物中与内含子对应的RNA序列，故基因A在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。(2)由于病毒对宿主细胞的感染具有特异性，噬菌体只能寄生在细菌细胞中，不能感染家蚕细胞，故应选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。(3)与真核生物相比，大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，一般用抗原—抗体杂交的方法，即用蛋白A的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交，观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是S型细菌的DNA进入R型细菌体内，并可在R型细菌体内完成表达，这证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，为基因工程奠定了基础。
变式训练2：2,4－D作为除草剂在农田中大量使用，研究认为它是某种淋巴癌的致病因子。为降低2,4－D的危害，科研人员通过基因工程技术构建了能高效降解2,4－D的基因工程菌。请回答下列问题：
(1)在农业生产上常会使用________浓度2,4－D对麦田进行除草，在杀死杂草的同时却不会对小麦生长造成损害，原因是_____________________________________________。
(2)从被2,4－D污染的土壤中得到能降解2,4－D的细菌，从该细菌中提取RNA，构建____________文库，进一步获得目的基因。
(3)PCR技术扩增目的基因的过程：含目的基因的DNA受热变性后解旋为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在________________酶作用下进行延伸，如此重复循环多次，使目的基因的量呈____________形式扩增。
(4)一个基因表达载体的组成中要有标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中__________________。欲知基因工程成功与否，需要进行________水平的检测，有时还需进行____________水平的鉴定。
【答案】(1)高 不同植物对2,4－D的敏感程度不同 (2)cDNA(部分基因) (3)热稳定DNA聚合酶(或Taq) 指数 (4)是否含有目的基因 分子 个体生物学(个体)
【解析】(1)2,4－D是生长素类似物，利用不同植物对其敏感程度不同，可用其除去麦田杂草。(2)从工程菌中提取RNA构建成的基因文库是部分基因文库(cDNA文库)。(3)PCR技术用热稳定DNA聚合酶(Taq酶)延伸，多次循环，目的基因的量呈指数(2n)增长。(4)标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，欲知基因工程成功与否，需要进行分子水平的检测，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。
三、 基因工程与蛋白质的关系
例3：已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的____________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因，所获得的基因表达是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括______________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_____________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________________________________________________________________
和____________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
【答案】 (1)氨基酸序列(或结构)(其他答案合理也可)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、反转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
【解析】 (1)由题干信息可知，改造蛋白质的功能可以通过改变蛋白质的结构来实现。(2)依据蛋白质工程的定义及题中信息可知，获得P1基因的途径有修饰现有(P)基因或合成新(P1)基因。中心法则的全部内容包括DNA的复制，RNA的复制、转录、反转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径：从预期蛋白质功能出发―→设计预期的蛋白质结构―→推测应有的氨基酸序列―→找到相对应的脱氧核苷酸序列。通过蛋白质工程合成的蛋白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。
变式训练3：胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，并要经过较长的时间才能进入血液中，而进入血液的胰岛素又容易被分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：
(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是________________________________________________________________________。
(2)人工合成的DNA与________结合后，被转移到________________________中才能得到准确表达。
(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有____________、____________和发酵工程。
(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】 (1)蛋白质的预期功能 (2)载体 大肠杆菌等受体细胞 (3)蛋白质工程 基因工程 (4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因
【解析】 (1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素，即速效胰岛素的功能。(2)人工合成的目的基因与载体结合后，被导入受体细胞中才能得以表达。(3)利用蛋白质工程生产自然界中原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，得到目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程将其导入受体细胞获得工程菌，再利用工程菌进行发酵，从而获取大量产品，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中的氨基酸序列，推测出基因中的脱氧核苷酸序列，然后用DNA合成仪直接合成出新的基因。
四、 转基因技术的安全性和生物武器
例4：转基因生物的安全性引起人们争论的技术原因是( )
①转移基因的功能往往未知
②转移基因的结构往往未知
③外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的
④外源基因往往是异种生物的基因
A．①② B．②③ C．③④ D．①③
【答案】 C
【解析】由于科学水平的限制，目前科学家对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制了解有限；转移的基因虽然功能已知，但不少是异种生物的基因；外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的。因此，在转基因生物中，有时候会出现意想不到的后果，引起人们在食物安全、生物安全和环境安全三个方面的激烈争论。
变式训练4：生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是( )
A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质
B．当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，但不反对治疗性克隆
C．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
【答案】D
【解析】 培育转基因植物时，要根据目的基因的产物是否对人类有害来确定该目的基因能否用于转基因植物的培育，A项正确；克隆人会给社会带来伦理上的问题，所以当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验；治疗性克隆对于一些重大疾病的治疗具有积极的意义，所以并不反对治疗性克隆，B项正确；科学地设计试管婴儿对于治疗不孕不育及一些难治之症具有积极的意义，但有人却滥用此技术选择性设计婴儿，所以设计试管婴儿遭到反对，C项正确；干扰素并不能用于制造生物武器，多用于治疗一些病毒性疾病，D项错误。
1.根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有
和 。?
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下:
为使运载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,还可用另一种限制性核酸内切酶切割,该酶必须具有的特点是? 。?
(3)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即 DNA连接酶和 DNA连接酶。?
(4)反转录作用的模板是 ,产物是 。若要在体外获得大量反转录产物,常采用 技术。?
(5)基因工程中除质粒外, 和 也可作为运载体。?
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是? 。?
2.含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶,这两种酶对DNA分子有相同的作用序列,但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰,使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题:
(1)目前,基因工程中使用的限制酶主要是从 生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“DNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是 (填“基因组文库”“DNA文库”或“基因组文库和cDNA文库”)。?
(2)含有某种限制酶的细胞,可以利用限制酶切割外源DNA,但不破坏细胞自身的DNA,其原因可能有① ;② ? 。?
(3)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90～95 ℃)、低温复性(55～60 ℃)、适温延伸(70～75 ℃)三个步骤构成一个循环,为使得DNA聚合酶能够重复利用,选用的酶应在 ℃处理后仍然具备催化活性。?
(4)在PCR扩增目的基因时,为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记,反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的 (填“腺嘌呤核糖核苷酸”“dATP”或“ATP”)。?
3.回答下列问题:
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了?? (答出两点即可)。?
(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的 方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与 组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞,在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是
。?
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用 的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加 的抑制剂。?
4.某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达,某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端,获得了L1GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题:
(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是 。使用这两种酶进行酶切是为了保证 ,也是为了保证 ? 。?
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 和 过程。?
(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的 移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。?
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 (填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。?
5.黑麦草中含有拮抗除草剂草甘膦的基因，该基因编码抗草甘膦酶，从而使草甘膦失去对植物的毒害作用。2015年8月，中国科学院和北京奥瑞金种业有限公司通过转基因技术获得了抗除草剂草甘膦的玉米新品种。培育新品种过程中用到了PCR技术(如图所示)，请回答下列问题：
(1)应从______________(填“cDNA文库”或“基因组文库”)中选取拮抗除草剂草甘膦的基因，体外获得大量拮抗除草剂草甘膦基因要利用PCR技术，其中的物质A为__________。?
(2)基因工程操作的核心是____________________________。若需要对转入拮抗除草剂草甘膦基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做________实验。?
(3)若实验现象不理想，为提高抗草甘膦酶活性需利用________工程设计和改造抗除草剂草甘膦的________。?
6.香港大学的研究人员将某印度芥菜的HMGS基因编码的蛋白质的第359位氨基酸“丝氨酸”替换成“丙氨酸”后形成s359a蛋白,通过一定的方法获得新HMGS基因,然后将其导入番茄细胞,获得类胡萝卜素增加111%的转基因番茄,该番茄具有强抗氧化性。请回答下列问题:
(1)请按照蛋白质工程的原理写出获得新HMGS基因的基本途径:?
? 。?
(2)下图的4种质粒中,E表示EcoRⅠ的切割位点,将这些质粒用EcoRⅠ充分切割后,产生的线性双链DNA片段的种类分别为 个,接着将新HMGS基因分别与这4组酶切产物、DNA连接酶在适宜环境下混合,编号为1、2、3、4组,结果发现除第 组外,其余3组都有含新HMCS基因的基因表达载体(重组质粒)出现。基因表达载体的组成除目的基因和标记基因外,还包括 及复制原点。?
(3)若质粒3是农杆菌的Ti质粒,则图示E所处的位置在Ti质粒上的 ,将含新HMGS基因的重组Ti质粒的农杆菌导入番茄细胞,成功获得含新HMGS基因的转基因番茄,将其果实色素提取法分离后,用 法分离,可发现滤纸条上 (填颜色)的条带比第4组的宽。?
7.人抗凝血酶Ⅲ是人体血液中一种重要的抗凝血因子,具有抑制血液中凝血酶活性的作用,利用人工合成的人抗凝血酶Ⅲ对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果。下图表示利用乳腺生物反应器生产人抗凝血酶Ⅲ的过程。
回答下列问题:
(1)乳腺生物反应器是指将目的基因与 的启动子等调控组件重组在一起,通过显微注射导入哺乳动物受精卵,最终获得转基因动物。转基因动物进入哺乳期后,可以通过分泌乳汁来生产所需要的药品。若将上述过程中受体细胞改为大肠杆菌,生产出来的人抗凝血酶Ⅲ往往不具有生物活性,原因是 ? 。?
(2)人抗凝血酶Ⅲ基因导入受精卵需要“分子运输车”(载体)。“分子运输车”应具备的条件是?? 。?
(3)完成过程②所需的技术是 ;早期胚胎能够在代孕羊体内存活的原因是 ? 。?
(4)为了能从乳汁中分离出人抗凝血酶Ⅲ,需要对转基因羊进行性别鉴定,在胚胎移植前,最好取囊胚中 的细胞进行性别鉴定。转基因羊只有乳腺细胞分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ,其根本原因是 ? 。?
8.苜蓿是目前我国种植最广的豆科牧草,但是病菌往往威胁着苜蓿的生长。为提高产量,研究人员将溶菌酶基因(LYZ基因)和绿色荧光蛋白基因(GFP基因)连接为LYZ—GFP基因,利用农杆菌转化法将其导入苜蓿细胞中,并通过组织培养成功获得了抗病植株。图1表示Ti质粒,其中Vir区的基因产物是TDNA转移的必备条件;图2表示含有LYZ—GFP基因的DNA片段。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。回答下列问题:
(1)构建含有LYZ—GFP基因的重组质粒时,应选用限制酶 进行切割,原因是 。?
(2)据图分析,在培育转基因苜蓿植株过程中,应选择LYZ—GFP基因中的GFP基因为标记基因,而不选择质粒中原有的卡那霉素抗性基因为标记基因,这种做法的优点是? 。?
(3)在组织培养过程中,对愈伤组织进行显微检测,若 ,则表明细胞中GFP基因存在并表达。?
(4)选择含有GFP基因的愈伤组织为材料,用PCR技术扩增并检测LYZ基因,需选用一段 合成引物,该过程所用到的酶必须具有 的特性。?
(5)对该苜蓿植株进行病菌接种实验,通过观察其抗病程度可以进行个体生物学水平的鉴定,原因是? 。?
第40讲 基因工程与转基因的安全性和生物武器（解析版）
本模块为基因工程以及转基因技术的安全的基本知识，通过本模块的学习，了解基因工程诞生的基础理论和技术，基因工程操作工具的种类、功能，基因工程操作的基本程序，知道PCR技术的原理、条件、过程，蛋白质工程的概念及操作流程等。考纲对本模块内容的具体要求如下：
1．基因工程的诞生（理解水平）
2．基因工程的原理及技术（含PCR技术）（理解应用水平）
3．基因工程的应用（应用水平）
4．蛋白质工程（应用水平）
5．转基因生物的安全性（理解水平）
6．生物武器对人类的威胁（理解水平）
本部分内容在考试中考查角度新颖主要体现在试题的综合性上。可以是专题内综合，也可以是专题间综合，如细胞工程与基因工程的综合，还可以是选修和必修的综合，复习时要注意试题的综合性。
一、基因工程的基本工具及操作过程
1.基因工程的基本工具
(1)限制性核酸内切酶(限制酶)
①来源：主要从原核生物中分离纯化而来。
②作用：识别特定的核苷酸序列并切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。
③结果：产生黏性末端或平末端。
如下图所示，EcoRⅠ限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切割位点在G和A之间；SmaⅠ限制酶识别的碱基序列是CCCGGG，切割位点在G和C之间；说明限制酶具有专一性。
(2)DNA连接酶
①作用：将限制酶切割下来的DNA片段拼接成DNA分子。
②类型
常用类型
E·coli DNA连接酶
T4 DNA连接酶
来源
大肠杆菌
T4噬菌体
功能
只“缝合”黏性末端
“缝合”黏性末端和平末端
结果
恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键
(3)载体
化学本质 双链环状DNA分子
能自我复制
①常用载体——质粒 特点 有一至多个限制酶切割位点
有特殊的标记基因
②其他载体：λ噬菌体衍生物、动植物病毒等。
③载体的作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
2.基因工程的基本操作程序
(1)目的基因的获取
①目的基因：主要指编码蛋白质的基因，也可以是一些具调控作用的因子。
从基因文库中获取
人工 利用mRNA反转录合成
②获取方法 合成 通过DNA合成仪用化学方法人工合成
利用PCR技术扩增
(2)基因表达载体的构建——基因工程的核心
①目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。
②基因表达载体的组成
③构建过程
(3)将目的基因导入受体细胞
受体细胞种类不同，导入方法不同
生物种类
植物细胞
动物细胞
微生物细胞
常用方法
农杆菌转化法
显微注射法
转化法
受体细胞
体细胞或受精卵
受精卵
原核细胞
转化过程
将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上→导入农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物
Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子
(4)目的基因的检测与鉴定
【巧学助记】
(1)诠释基因组文库与部分基因文库
基因文库类型
基因组文库
部分基因文库(cDNA文库)
构建基因文库的过程
(2)诠释PCR技术
①原理：体外DNA复制
②需要条件：模板DNA、引物、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
③过程：DNA受热(90～95 ℃)变性解旋为单链、冷却(55～60 ℃)后RNA引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下延伸(70～75 ℃)合成互补链。
(3)诠释基因表达载体
(4)农杆菌转化法原理
植物受损伤时伤口处分泌物可吸引农杆菌→农杆菌中Ti质粒上的T－DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA上(若将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上，则目的基因将被一起带入)
二、基因工程的应用及蛋白质工程
1.基因工程的应用
(1)动物基因工程：用于提高动物生长速度从而提高产品产量；用于改善畜产品品质；用转基因动物生产药物；用转基因动物作器官移植的供体等。
(2)植物基因工程：培育抗虫转基因植物(如抗虫棉)、抗病转基因植物(如转基因烟草)和抗逆转基因植物(如抗寒番茄)；利用转基因改良植物的品质(如新花色矮牵牛)。
(3)比较基因治疗与基因诊断：
原理
操作过程
进展
基因治疗
基因表达
利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中，以表达出正常性状来治疗(疾病)
临床实验
基因诊断
碱基互补配对
制作特定DNA探针与病人样品DNA混合，分析杂交带情况
临床应用
2.蛋白质工程
(1)概念理解
①基础：蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系。
②操作：基因修饰或基因合成。
③结果：改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。
④目的：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计。
(2)操作过程
从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因)→基因表达→产生需要的蛋白质。其流程图如下：
【巧学助记】
蛋白质工程与基因工程的比较
项目
蛋白质工程
基因工程
实质
定向改造或生产人类所需蛋白质
定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品(基因的异体表达)
结果
生产自然界中没有的蛋白质
生产自然界中已有的蛋白质
联系
蛋白质工程是在基因工程的基础上延伸出来的第二代基因工程，因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
三、PCR技术
1.PCR技术原理：DNA复制原理，即：
2.PCR反应过程
过程
说明
图解
变性
当温度上升到90__℃以上时，双链DNA解聚为单链
复性
温度下降到50__℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合
延伸
72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸
3.结果： 上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子 ，随着重复次数的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR扩增仪中完成的。
【巧学助记】
生物体内DNA复制与PCR反应的区别
体内DNA复制
PCR反应
解旋
在解旋酶作用下，细胞提供能量，部分解开
加热至90 ℃，双链全部解开，不需要解旋酶
引物
一小段RNA
可以是RNA或单链DNA分子片段
合成子链
在引物基础上，一条链连续合成，另一条链不连续合成
分别从两条链的引物端开始，都是连续合成，控制温度72 ℃
特点
边解旋边复制，半保留复制
体外迅速扩增
Taq DNA聚合酶
不需要
需要
循环次数
受生物体自身控制
多次
相同点
生物体内的DNA复制和PCR体外DNA扩增都需要模板、四种脱氧核苷酸，且都需要在一定的缓冲溶液中进行
四、生物技术的安全性和伦理问题
1．转基因生物的安全性
(1)转基因生物存在安全性问题的原因
①目前对基因的结构、基因间的相互作用及基因的调控机制等都了解得相当有限。
②目的基因往往是异种生物的基因。
③外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的。
(2)对安全性问题的担忧
①转基因生物与食物安全
a．反对“实质性等同”。
b．担心出现滞后效应。
c．担心出现新的过敏原。
d．担心营养成分改变。
e．侵犯宗教信仰者或素食者的权益。
②转基因生物与生物安全
a．可能扩散到新的生态区域，破坏生态平衡。
b．成为“入侵的外来物种”，威胁其他生物的生存。
c．可能与某些细菌或病毒杂交，重组出有害的病原体。
d．可能通过花粉传播进入杂草，形成“超级杂草”。
③转基因生物与环境安全：转基因生物可能会对生态系统的稳定性和人类生活环境造成破坏。
(3)理性看待转基因技术
①正视转基因技术可能带来的安全性问题，要趋利避害，不能因噎废食。
②制定政策和法规，最大程度地保证转基因技术和产品的安全性。
2．关注生物技术的伦理问题
反 对
支 持
克隆人
伦理方面
违反了人类的伦理道德观念，中国禁止生殖性克隆
中国不反对治疗性克隆
技术方面
技术不成熟，重构胚胎成功率低，胚胎着床率低、流产率高、畸形率高、出生后死亡率高
可通过胚胎分级、基因诊断、染色体检查等方法解决技术问题
设计试
管婴儿
胚胎也是生命，杀死胚胎无异于“谋杀”
提供骨髓造血干细胞并不会对试管婴儿造成损伤
基因检测
技术方面
很难用在具体医疗中
有一些遗传性疾病可以通过基因检测后在早期采取预防措施
道德方面
可能引起基因歧视
通过正确的科学知识传播、伦理道德教育和立法，解决基因歧视现象
4.治疗性克隆与生殖性克隆
类型
项目
治疗性克隆
生殖性克隆
区别
目的
从胚胎中取出干细胞用于医学研究和治疗
用于生育，获得人的复制品
水平
细胞水平
个体水平
联系
都属于无性生殖；产生新个体或新组织，遗传信息不变
5.试管婴儿和设计试管婴儿的异同点
①过程区别：设计试管婴儿比试管婴儿多出的过程是上图中的d。
②所用技术手段不同：设计试管婴儿胚胎移植前需要进行遗传学诊断，而试管婴儿无需进行遗传学诊断。
③应用不同：试管婴儿主要解决不孕夫妇的生育问题，而设计试管婴儿主要用于白血病、贫血症的治疗。
④相同点：两者都是体外受精，并进行体外早期胚胎培养，都要经过胚胎移植，都是有性生殖。
6．禁止生物武器
(1)生物武器的种类(连线)
(2)我国政府观点：在任何情况下不发展、不生产、不储存生物武器，并反对生物武器及其技术和设备的扩散。
判断下列说法的对错：
1.启动子和终止密码子均在胰岛素基因的转录中起作用( )
【答案】×
【解析】启动子在转录过程中起作用，终止密码子在翻译过程中起作用
2.携带链霉素抗性基因受体菌的筛选必须通过分子检测( )
【答案】×
【解析】携带链霉素抗性基因受体菌的筛选，可用含链霉素的培养基进行培养，能存活的受体菌即含有相应的抗性基因
3.用限制性核酸内切酶切割烟草花叶病毒的核酸( )
【答案】×
【解析】限制性核酸内切酶只能切割特定的脱氧核苷酸序列，而烟草花叶病毒的核酸是核糖核苷酸
4.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上，属于基因工程( )
【答案】×
【解析】噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上属于基因重组
5.构建人胰岛素基因表达载体，表达载体的复制和胰岛素基因的表达均启动于复制原(起)点( )
【答案】×
【解析】表达载体的复制启动于复制原点，胰岛素基因的表达启动于启动子。
6.重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子脱氧核糖和磷酸交替连接( )
【答案】×
【解析】重组质粒与探针能进行分子杂交是因为DNA分子的碱基能够互补配对
7.应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达( )
【答案】×
【解析】应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在，但不能检测基因的表达
8.动物的生长激素基因转入植物后不能表达( )
【答案】×
【解析】不同生物共用一套遗传密码，所以动物生长激素基因转入植物后也能表达
9.从某海洋动物中获得一基因，其表达产物为一种抗菌性和溶血性均较强的多肽P1。目前在P1的基础上研发抗菌性强但溶血性弱的多肽药物，首先要做的是依据P1氨基酸序列设计多条模拟肽( )
【答案】√
【解析】蛋白质的结构不同决定功能不同
10.采用蛋白质工程进一步改造AFB1解毒酶的基本途径是：从提高酶的活性出发，设计预期的蛋白质结构，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的脱氧核苷酸序列( )
【答案】√
【解析】蛋白质工程就是中心法则的反向操作
一、 基因工程的工具
例1：下图是表达新基因用的质粒的示意图，若要将目的基因插入到质粒上的A处，则切割基因时可用的是( )
A．HindⅢ B．EcoRⅠ
C．EcoB D．PstⅠ
【答案】C
【解析】A处有3处(BamHⅠ、EcoB、ClaⅠ)限制酶的切点，只有使用EcoB限制酶切割时，才能让目的基因插入到A处且使原有基因失活。
变式训练1：下列关于限制酶的叙述中，错误的是( )
A．它能在特定位点切割DNA分子
B．同一种限制酶切割不同的DNA分子产生的黏性末端能够很好地进行碱基配对
C．它能任意切割DNA，从而产生大量DNA片段
D．每一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列
【答案】 C
【解析】 限制酶是基因工程的重要工具之一；每种限制酶只能识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点上切割DNA分子；同一种限制酶切割不同的DNA分子产生的黏性末端能进行互补配对。
二、 基因工程操作程序
例2：真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。已知在人体中基因A(有内含子)可以表达出某种特定蛋白(简称蛋白A)。回答下列问题：
(1)某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是__________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(2)若用家蚕作为表达基因A的受体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________作为载体，其原因是__________________________________。
(3)若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体。因为与家蚕相比，大肠杆菌具有______________________________________(答出两点即可)等优点。
(4)若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是________________(填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”)。
(5)艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是________________________________________________________________________。
【答案】 (1)基因A有内含子，在大肠杆菌中，其初始转录产物中与内含子对应的RNA序列不能被切除，无法表达出蛋白A (2)噬菌体 噬菌体的宿主是细菌，而不是家蚕 (3)繁殖快、容易培养 (4)蛋白A的抗体
(5)DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体
【解析】(1)从人的基因组文库中获得的基因A中含有内含子，而大肠杆菌属于原核生物，不能切除基因A初始转录产物中与内含子对应的RNA序列，故基因A在大肠杆菌中无法表达出蛋白A。(2)由于病毒对宿主细胞的感染具有特异性，噬菌体只能寄生在细菌细胞中，不能感染家蚕细胞，故应选用可感染家蚕的昆虫病毒作为载体。(3)与真核生物相比，大肠杆菌等原核生物具有繁殖快、容易培养、遗传物质相对较少等优点。(4)检测基因A是否翻译出蛋白A，一般用抗原—抗体杂交的方法，即用蛋白A的抗体与从细胞中提取的蛋白质进行杂交，观察是否出现杂交带。(5)肺炎双球菌转化实验的实质是S型细菌的DNA进入R型细菌体内，并可在R型细菌体内完成表达，这证明了DNA可以从一种生物个体转移到另一种生物个体，为基因工程奠定了基础。
变式训练2：2,4－D作为除草剂在农田中大量使用，研究认为它是某种淋巴癌的致病因子。为降低2,4－D的危害，科研人员通过基因工程技术构建了能高效降解2,4－D的基因工程菌。请回答下列问题：
(1)在农业生产上常会使用________浓度2,4－D对麦田进行除草，在杀死杂草的同时却不会对小麦生长造成损害，原因是_____________________________________________。
(2)从被2,4－D污染的土壤中得到能降解2,4－D的细菌，从该细菌中提取RNA，构建____________文库，进一步获得目的基因。
(3)PCR技术扩增目的基因的过程：含目的基因的DNA受热变性后解旋为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在________________酶作用下进行延伸，如此重复循环多次，使目的基因的量呈____________形式扩增。
(4)一个基因表达载体的组成中要有标记基因，标记基因的作用是鉴别受体细胞中__________________。欲知基因工程成功与否，需要进行________水平的检测，有时还需进行____________水平的鉴定。
【答案】(1)高 不同植物对2,4－D的敏感程度不同 (2)cDNA(部分基因) (3)热稳定DNA聚合酶(或Taq) 指数 (4)是否含有目的基因 分子 个体生物学(个体)
【解析】(1)2,4－D是生长素类似物，利用不同植物对其敏感程度不同，可用其除去麦田杂草。(2)从工程菌中提取RNA构建成的基因文库是部分基因文库(cDNA文库)。(3)PCR技术用热稳定DNA聚合酶(Taq酶)延伸，多次循环，目的基因的量呈指数(2n)增长。(4)标记基因的作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，欲知基因工程成功与否，需要进行分子水平的检测，有时还需要进行个体生物学水平的鉴定。
三、 基因工程与蛋白质的关系
例3：已知生物体内有一种蛋白质(P)，该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质(P1)不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
(1)从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的____________________进行改造。
(2)以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因，所获得的基因表达是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括______________的复制，以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：_____________________________________。
(3)蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________________________________________________________________________
和____________________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。
【答案】 (1)氨基酸序列(或结构)(其他答案合理也可)
(2)P P1 DNA和RNA(或遗传物质) DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质(或转录、反转录、翻译)
(3)设计蛋白质的结构 推测氨基酸序列 功能
【解析】 (1)由题干信息可知，改造蛋白质的功能可以通过改变蛋白质的结构来实现。(2)依据蛋白质工程的定义及题中信息可知，获得P1基因的途径有修饰现有(P)基因或合成新(P1)基因。中心法则的全部内容包括DNA的复制，RNA的复制、转录、反转录和翻译。(3)蛋白质工程的基本途径：从预期蛋白质功能出发―→设计预期的蛋白质结构―→推测应有的氨基酸序列―→找到相对应的脱氧核苷酸序列。通过蛋白质工程合成的蛋白质还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，看是否达到人们的需求。
变式训练3：胰岛素可以用于治疗糖尿病，但是胰岛素被注射到人体后，会堆积在皮下，并要经过较长的时间才能进入血液中，而进入血液的胰岛素又容易被分解，因此，治疗效果受到影响。如图是用蛋白质工程设计速效胰岛素的生产过程，请据图回答有关问题：
(1)构建新的蛋白质模型是蛋白质工程的关键，图中构建新的胰岛素模型的主要依据是________________________________________________________________________。
(2)人工合成的DNA与________结合后，被转移到________________________中才能得到准确表达。
(3)若要利用大肠杆菌生产速效胰岛素，需用到的生物工程有____________、____________和发酵工程。
(4)图解中从新的胰岛素模型到新的胰岛素基因的基本思路是什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
【答案】 (1)蛋白质的预期功能 (2)载体 大肠杆菌等受体细胞 (3)蛋白质工程 基因工程 (4)根据新的胰岛素中氨基酸的序列，推测出其脱氧核苷酸序列，然后利用DNA合成仪来合成出新的胰岛素基因
【解析】 (1)蛋白质工程的目标是根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质结构进行分子设计，因此，图中构建新的胰岛素模型的依据是预期胰岛素，即速效胰岛素的功能。(2)人工合成的目的基因与载体结合后，被导入受体细胞中才能得以表达。(3)利用蛋白质工程生产自然界中原本不存在的蛋白质，需对原有的胰岛素进行改造，根据新的胰岛素中氨基酸的序列推测出其基因中的脱氧核苷酸序列，人工合成新的胰岛素基因，得到目的基因，改造好的目的基因需通过基因工程将其导入受体细胞获得工程菌，再利用工程菌进行发酵，从而获取大量产品，因此该过程涉及蛋白质工程、基因工程和发酵工程。(4)由新的蛋白质模型到构建新的基因，其基本设计思路是根据新的蛋白质中的氨基酸序列，推测出基因中的脱氧核苷酸序列，然后用DNA合成仪直接合成出新的基因。
四、 转基因技术的安全性和生物武器
例4：转基因生物的安全性引起人们争论的技术原因是( )
①转移基因的功能往往未知
②转移基因的结构往往未知
③外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的
④外源基因往往是异种生物的基因
A．①② B．②③ C．③④ D．①③
【答案】 C
【解析】由于科学水平的限制，目前科学家对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制了解有限；转移的基因虽然功能已知，但不少是异种生物的基因；外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的。因此，在转基因生物中，有时候会出现意想不到的后果，引起人们在食物安全、生物安全和环境安全三个方面的激烈争论。
变式训练4：生物技术安全性和伦理问题是社会关注的热点。下列叙述错误的是( )
A．应严格选择转基因植物的目的基因，避免产生对人类有害的物质
B．当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验，但不反对治疗性克隆
C．反对设计试管婴儿的原因之一是有人滥用此技术选择性设计婴儿
D．生物武器是用微生物、毒素、干扰素及重组致病菌等来形成杀伤力
【答案】D
【解析】 培育转基因植物时，要根据目的基因的产物是否对人类有害来确定该目的基因能否用于转基因植物的培育，A项正确；克隆人会给社会带来伦理上的问题，所以当今社会的普遍观点是禁止克隆人的实验；治疗性克隆对于一些重大疾病的治疗具有积极的意义，所以并不反对治疗性克隆，B项正确；科学地设计试管婴儿对于治疗不孕不育及一些难治之症具有积极的意义，但有人却滥用此技术选择性设计婴儿，所以设计试管婴儿遭到反对，C项正确；干扰素并不能用于制造生物武器，多用于治疗一些病毒性疾病，D项错误。
1.根据基因工程的有关知识,回答下列问题:
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段,其末端类型有
和 。?
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下:
为使运载体与目的基因相连,含有目的基因的DNA除可用EcoRⅠ切割外,还可用另一种限制性核酸内切酶切割,该酶必须具有的特点是? 。?
(3)按其来源不同,基因工程中所使用的DNA连接酶有两类,即 DNA连接酶和 DNA连接酶。?
(4)反转录作用的模板是 ,产物是 。若要在体外获得大量反转录产物,常采用 技术。?
(5)基因工程中除质粒外, 和 也可作为运载体。?
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌,一般情况下,不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞,原因是? 。?
【答案】(1)平末端 黏性末端
(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同
(3)T4 E.coli
(4)mRNA 单链DNA PCR(多聚酶链式反应)
(5)动植物病毒 λ噬菌体的衍生物
(6)未处理的大肠杆菌吸收质粒(外源DNA)的能力极弱
【解析】(1)限制性核酸内切酶可以将DNA分子切成两种类型的末端,平末端和黏性末端。
(2)为使两种不同酶切割之后能够相连接,所产生的黏性末端必须
相同。
(3)E.coli DNA连接酶可以连接黏性末端,T4DNA连接酶可以连接两种末端。
(4)反转录是以mRNA为模板逆转录先合成单链DNA,再合成双链DNA,常利用PCR技术进行大量扩增。
(5)基因工程中可以选用质粒、λ噬菌体的衍生物及动植物病毒做
载体。
(6)当受体细胞是细菌时,为了增大导入的成功率,常用Ca2+处理,得到感受态细胞,此时细胞壁和细胞膜的通透性增大,容易吸收重组质粒。
2.含有限制酶的细胞中通常还具有相应的甲基化酶,这两种酶对DNA分子有相同的作用序列,但具有不同的催化功能。甲基化酶可以对DNA序列进行修饰,使限制酶不能对这一序列进行识别和切割。回答下列问题:
(1)目前,基因工程中使用的限制酶主要是从 生物中分离纯化获得的。构建“基因组文库”和“DNA文库”的过程中需要使用DNA连接酶的是 (填“基因组文库”“DNA文库”或“基因组文库和cDNA文库”)。?
(2)含有某种限制酶的细胞,可以利用限制酶切割外源DNA,但不破坏细胞自身的DNA,其原因可能有① ;② ? 。?
(3)利用PCR扩增目的基因的过程由高温变性(90～95 ℃)、低温复性(55～60 ℃)、适温延伸(70～75 ℃)三个步骤构成一个循环,为使得DNA聚合酶能够重复利用,选用的酶应在 ℃处理后仍然具备催化活性。?
(4)在PCR扩增目的基因时,为实现序列中的腺嘌呤被放射性同位素标记,反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的 (填“腺嘌呤核糖核苷酸”“dATP”或“ATP”)。?
【答案】(1)原核 基因组文库和cDNA文库
(2)①细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列 ②甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰
(3)90～95(或95)
(4)dATP
【解析】(1)限制酶主要是从原核生物中分离纯化出来的。两者的构建过程中均将目的基因与载体连接后导入受体菌群,因此均需用到DNA连接酶。
(2)限制酶不切割原核细胞自身的DNA的原因在于细胞自身的DNA分子没有该限制酶的识别序列;甲基化酶对细胞自身的DNA分子进行了修饰。
(3)PCR扩增目的基因时需要耐高温的TaqDNA聚合酶,因此选用的酶应在90～95(或95)℃处理后仍然具备催化活性。
(4)PCR扩增目的基因时,所需原料为四种dNTP,由此可知反应体系中添加的原料应包括碱基已被标记的dATP。
3.回答下列问题:
(1)博耶(H.Boyer)和科恩(S.Coben)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。该研究除证明了质粒可以作为载体外,还证明了?? (答出两点即可)。?
(2)体外重组的质粒可通过Ca2+参与的 方法导入大肠杆菌细胞;而体外重组的噬菌体DNA通常需与 组装成完整噬菌体后,才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞,在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中,可作为重组噬菌体宿主细胞的是
。?
(3)真核生物基因(目的基因)在大肠杆菌细胞内表达时,表达出的蛋白质可能会被降解。为防止蛋白质被降解,在实验中应选用 的大肠杆菌作为受体细胞,在蛋白质纯化的过程中应添加 的抑制剂。?
【答案】(1)体外重组的质粒可以进入受体细胞;真核生物基因可在原核细胞中表达
(2)转化 外壳蛋白(或答噬菌体蛋白) 细菌
(3)蛋白酶缺陷型 蛋白酶
【解析】(1)将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌中,该过程利用的技术是基因工程。该研究除了证明质粒可作为载体外,还证明了体外重组的质粒可以进入受体细胞,真核生物基因可在原核细胞中表达等。
(2)重组质粒导入大肠杆菌细胞可采用Ca2+参与的转化方法;体外重组噬菌体要通过将体外重组的噬菌体DNA和外壳蛋白(或噬菌体蛋白)进行组装获得;因为噬菌体是专门寄生在细菌中的病毒,所以宿主细胞选用细菌。
(3)为防止蛋白质被降解,在实验中应选用蛋白酶缺陷型的大肠杆菌作为受体细胞;在蛋白质纯化过程中,为防止目的蛋白质被降解,需要添加蛋白酶的抑制剂。
4.某种荧光蛋白(GFP)在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光,这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达,某科研团队将某种病毒的外壳蛋白(L1)基因连接在GFP基因的5′末端,获得了L1GFP融合基因(简称为甲),并将其插入质粒P0,构建了真核表达载体P1,其部分结构和酶切位点的示意图如下,图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。
回答下列问题:
(1)据图推断,该团队在将甲插入质粒P0时,使用了两种限制酶,这两种酶是 。使用这两种酶进行酶切是为了保证 ,也是为了保证 ? 。?
(2)将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后,若在该细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了 和 过程。?
(3)为了获得含有甲的牛,该团队需要做的工作包括:将能够产生绿色荧光细胞的 移入牛的 中、体外培养、胚胎移植等。?
(4)为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中,某同学用PCR方法进行鉴定,在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的 (填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”)作为PCR模板。?
【答案】(1)E1和E4 甲的完整 甲与载体正确连接
(2)转录 翻译
(3)细胞核 去核卵母细胞
(4)核DNA
【解析】(1)由题意可知,L1基因和GFP基因合成了L1GFP融合基因(简称为甲),题图中显示了四个酶切位点,当将L1GFP融合基因插入质粒P0时,可用E1和E4限制酶进行酶切,用这两种酶进行酶切不会破坏甲的完整性,同时能保证甲按照正确的方向与载体连接。(2)若在牛皮肤细胞中观察到了绿色荧光,则说明L1GFP融合基因得到表达,即目的基因在受体细胞中通过转录和翻译合成了荧光蛋白。(3)为了获得含有甲的牛,可将含有目的基因的细胞的细胞核移入牛的去核卵母细胞中,然后进行体外培养、胚胎移植等。(4)利用PCR技术扩增目的基因,可以检测目的基因是否存在。PCR扩增的模板是DNA。
5.黑麦草中含有拮抗除草剂草甘膦的基因，该基因编码抗草甘膦酶，从而使草甘膦失去对植物的毒害作用。2015年8月，中国科学院和北京奥瑞金种业有限公司通过转基因技术获得了抗除草剂草甘膦的玉米新品种。培育新品种过程中用到了PCR技术(如图所示)，请回答下列问题：
(1)应从______________(填“cDNA文库”或“基因组文库”)中选取拮抗除草剂草甘膦的基因，体外获得大量拮抗除草剂草甘膦基因要利用PCR技术，其中的物质A为__________。?
(2)基因工程操作的核心是____________________________。若需要对转入拮抗除草剂草甘膦基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做________实验。?
(3)若实验现象不理想，为提高抗草甘膦酶活性需利用________工程设计和改造抗除草剂草甘膦的________。?
【答案】(1)cDNA文库 引物
(2)基因表达载体的构建 喷洒草甘膦
(3)蛋白质 基因
【解析】(1)拮抗除草剂草甘膦基因属于真核生物的基因，需从cDNA文库中获得。体外获得大量拮抗除草剂草甘膦基因要利用PCR技术，该技术的原理为DNA双链复制，延伸过程中以DNA每条链为模板，需要引物的加入。
(2)基因工程操作的核心是基因表达载体的构建。若需要对转入拮抗除草剂草甘膦基因的玉米进行个体生物学水平的鉴定，需要对玉米做喷洒草甘膦的实验。
(3)若想提高抗草甘膦酶活性需用蛋白质工程设计和改造抗除草剂草甘膦基因。
6.香港大学的研究人员将某印度芥菜的HMGS基因编码的蛋白质的第359位氨基酸“丝氨酸”替换成“丙氨酸”后形成s359a蛋白,通过一定的方法获得新HMGS基因,然后将其导入番茄细胞,获得类胡萝卜素增加111%的转基因番茄,该番茄具有强抗氧化性。请回答下列问题:
(1)请按照蛋白质工程的原理写出获得新HMGS基因的基本途径:?
? 。?
(2)下图的4种质粒中,E表示EcoRⅠ的切割位点,将这些质粒用EcoRⅠ充分切割后,产生的线性双链DNA片段的种类分别为 个,接着将新HMGS基因分别与这4组酶切产物、DNA连接酶在适宜环境下混合,编号为1、2、3、4组,结果发现除第 组外,其余3组都有含新HMCS基因的基因表达载体(重组质粒)出现。基因表达载体的组成除目的基因和标记基因外,还包括 及复制原点。?
(3)若质粒3是农杆菌的Ti质粒,则图示E所处的位置在Ti质粒上的 ,将含新HMGS基因的重组Ti质粒的农杆菌导入番茄细胞,成功获得含新HMGS基因的转基因番茄,将其果实色素提取法分离后,用 法分离,可发现滤纸条上 (填颜色)的条带比第4组的宽。?
【答案】(1)从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列(或者从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因))
(2)3、2、1、0 4 启动子和终止子
(3)TDNA 纸层析 橙黄色和黄色
【解析】(1)蛋白质工程的原理为从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列(基因),由此可写出获得新HMGS基因的基本途径:从s359a蛋白的功能出发→设计s359a蛋白的结构→将HMGS蛋白的第359位丝氨酸替换成丙氨酸→找到并改造HMGS基因的脱氧核苷酸序列。
(2)图中质粒1、2、3、4的切割位点分别为3、2、1、0,用EcoRⅠ充分切割后,产生的线性双链DNA片段的种类分别为3、2、1、0。第4组无EcoRⅠ切割位点,因此无法构建基因表达载体。基因表达载体的组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子以及复制原点。
(3)Ti质粒上的TDNA可将目的基因转移到受体细胞且整合到受体细胞染色体的DNA上。色素的提取方法为纸层析法。新HMGS基因导入番茄细胞,获得类胡萝卜素增加,因此滤纸条上橙黄色和黄色的条带比第4组的宽。
7.人抗凝血酶Ⅲ是人体血液中一种重要的抗凝血因子,具有抑制血液中凝血酶活性的作用,利用人工合成的人抗凝血酶Ⅲ对治疗抗凝血酶缺失症有显著效果。下图表示利用乳腺生物反应器生产人抗凝血酶Ⅲ的过程。
回答下列问题:
(1)乳腺生物反应器是指将目的基因与 的启动子等调控组件重组在一起,通过显微注射导入哺乳动物受精卵,最终获得转基因动物。转基因动物进入哺乳期后,可以通过分泌乳汁来生产所需要的药品。若将上述过程中受体细胞改为大肠杆菌,生产出来的人抗凝血酶Ⅲ往往不具有生物活性,原因是 ? 。?
(2)人抗凝血酶Ⅲ基因导入受精卵需要“分子运输车”(载体)。“分子运输车”应具备的条件是?? 。?
(3)完成过程②所需的技术是 ;早期胚胎能够在代孕羊体内存活的原因是 ? 。?
(4)为了能从乳汁中分离出人抗凝血酶Ⅲ,需要对转基因羊进行性别鉴定,在胚胎移植前,最好取囊胚中 的细胞进行性别鉴定。转基因羊只有乳腺细胞分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ,其根本原因是 ? 。?
【答案】(1)乳腺蛋白基因 大肠杆菌不含内质网和高尔基体,不能对蛋白质进行加工和修饰
(2)自我复制的能力;有一个或多个限制酶的切割位点;带有标记基因;分子大小适宜
(3)早期胚胎培养 受体对外来胚胎一般不发生免疫排斥
(4)滋养层 人抗凝血酶Ⅲ基因只能在乳腺细胞中选择性表达(或基因的选择性表达)
【解析】(1)该过程中目的基因是人抗凝血酶Ⅲ基因,利用基因工程技术最终通过分泌乳汁来生产所需要的人抗凝血酶,因此应该将该目的基因与乳腺蛋白基因的启动子等调控组件重组在一起。若将受体细胞改为大肠杆菌,由于大肠杆菌没有内质网和高尔基体,不能对蛋白质进行加工和修饰,因此生产出来的人抗凝血酶Ⅲ往往不具有生物活性。
(2)基因工程中,作为运输目的基因的载体必须具备的条件有:自我复制的能力、有一个或多个限制酶的切割位点、带有标记基因、分子大小适宜等。
(3)过程②表示早期胚胎培养技术;由于受体细胞对外来胚胎一般不发生免疫排斥,因此早期胚胎能够在代孕羊体内存活。
(4)用囊胚期胚胎进行性别鉴定时,可用分割针分割部分滋养层细胞进行性别鉴定;由于人抗凝血酶Ⅲ基因只能在乳腺细胞中选择性表达,所以转基因羊只有乳腺细胞分泌的乳汁中含有人抗凝血酶Ⅲ。
8.苜蓿是目前我国种植最广的豆科牧草,但是病菌往往威胁着苜蓿的生长。为提高产量,研究人员将溶菌酶基因(LYZ基因)和绿色荧光蛋白基因(GFP基因)连接为LYZ—GFP基因,利用农杆菌转化法将其导入苜蓿细胞中,并通过组织培养成功获得了抗病植株。图1表示Ti质粒,其中Vir区的基因产物是TDNA转移的必备条件;图2表示含有LYZ—GFP基因的DNA片段。图中箭头表示相关限制酶的酶切位点。回答下列问题:
(1)构建含有LYZ—GFP基因的重组质粒时,应选用限制酶 进行切割,原因是 。?
(2)据图分析,在培育转基因苜蓿植株过程中,应选择LYZ—GFP基因中的GFP基因为标记基因,而不选择质粒中原有的卡那霉素抗性基因为标记基因,这种做法的优点是? 。?
(3)在组织培养过程中,对愈伤组织进行显微检测,若 ,则表明细胞中GFP基因存在并表达。?
(4)选择含有GFP基因的愈伤组织为材料,用PCR技术扩增并检测LYZ基因,需选用一段 合成引物,该过程所用到的酶必须具有 的特性。?
(5)对该苜蓿植株进行病菌接种实验,通过观察其抗病程度可以进行个体生物学水平的鉴定,原因是? 。?
【答案】(1)Ⅰ和Ⅲ(对Ti质粒和含有LYZ—GFP基因的片段) 选择限制酶Ⅰ和限制酶Ⅲ能获取LYZ—GFP基因,不会破坏质粒中的Vir区的基因,使目的基因的插入位点位于TDNA片段上
(2)LYZ—GFP基因在TDNA片段上,能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上,便于追踪检测LYZ基因的表达情况
(3)观察到绿色荧光
(4)LYZ基因的核苷酸序列 耐高温(或“热稳定”)
(5)LYZ基因能够表达出溶菌酶,溶菌酶能够杀灭病菌,表现出抗病
特性
【解析】(1)构建含有LYZ—GFP基因的重组质粒时,含有LYZ—GFP基因的片段有三个酶切位点,基因两侧没有相同限制酶,应该使用双酶切法,限制酶Ⅲ为必选。根据图1结合农杆菌转化法的原理,所用限制酶切割位点必须在TDNA片段上,限制酶Ⅰ虽然会切断Ti质粒本身的四环素抗性基因,但是GFP基因、卡那霉素抗性基因都可以作为标记基因。所以应选择限制酶Ⅰ和Ⅲ。限制酶Ⅱ会破坏质粒中的Vir区的基因,不可选用。
(2)若LYZ—GFP基因在TDNA片段上,就能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上,便于追踪检测LYZ基因的表达情况,这是选用GFP基因为标记基因的优点。而卡那霉素抗性基因不在TDNA片段上,不能整合到苜蓿细胞染色体的DNA上,所以相对不宜选用。
(3)GFP基因的表达产物是绿色荧光蛋白,对愈伤组织进行显微检测时,若观察到绿色荧光,则表明细胞中的GFP基因存在并表达。
(4)进行PCR技术扩增并检测LYZ基因的前提,要有一段已知的LYZ基因的核苷酸序列以便合成引物。PCR扩增过程使用的DNA聚合酶具有耐高温或热稳定的特性。
(5)LYZ基因能够表达出溶菌酶,溶菌酶是免疫活性物质,能够杀灭病菌。因此转基因成功的苜蓿植株会表现出抗病特性。
