《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学设计
【教学目标】
1.能用生物与环境相适应的观点，提出分离、计数目标菌的思路（生命观念、科学思维）。
2.能按照科学探究的要求设计出分离、计数目标菌的方案（科学思维）。
3.能依据方案运用无菌操作技术和分离、培养方法初步分离出目标菌并测定数量（科学探究）。
4.能应用筛选目的菌株的技术应对现实生活中的问题（社会责任）。
【教学重点与难点】
教学重点：对土样的选取和选择培养基的配置；
教学难点：对分解尿素的细菌的计数。
【教学思路】
提出课题→讨论思路→设计方案→实施方案→展示交流
【教学过程】
导入：
播放种植过程中植物所需肥料小视频，引入尿素在农业上的重要用途，介绍土壤中能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的原理是能够合成分解尿素的酶，以此帮助植物吸收促进其生长的营养成分。
一.提出课题、讨论思路、设计方案
1.提出课题：
借助视频中真实情景激发学生参与探究的动机，由兴趣小组成员代表主动提出课题“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”。
2.讨论思路：
巩固基础知识，合成脲酶的细菌能够将尿素分解成氨。而菌株筛选的原理是根据微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等分离微生物，需造成有利于目的菌株生长的环境，而抑制大多数微生物生长。筛选分解尿素的细菌可以配制以尿素为唯一氮源的培养基，只有合成脲酶的微生物才能生长，不能合成脲酶的微生物无法生长。计数的原理是在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。可用稀释涂布法计数。
由兴趣小组成员代表根据生物与环境相适应的观点主动提出解决问题的思路，教师引导同学们用科学思维论证合理、可行的设计思路。
3.设计方案：
由兴趣小组成员代表在查阅资料后主动提出探究方案，包括土壤取样、制备培养基、梯度稀释、涂布平板、培养与观察等环节。教师引导同学们交流方案的合理性和可操作性，制定出在实验室条件下可实施的方案。
二.实施方案（实验操作）
1.土壤取样与制备培养基：
从肥沃、湿润的土壤中取样。先用灭菌小铲子铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的灭菌的信封中。制备培养基依次经过计算、称量、溶解、定容、调pH、分装、包扎等步骤，得以尿素为唯一氮源的选择培养基和LB对照培养基。采用高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20min。倒平板时注意无菌操作。
由兴趣小组成员课前转备好固体平板，并录制详细的操作过程。
教师引导同学们欣赏操作视频，学习操作技能，大胆质疑，总结归纳每一步骤操作要点。
2.梯度稀释：
在火焰旁称取土壤10g，放入盛有90mL无菌水的三角瓶中，振荡使土样与水充分混合。将细菌分散，制成101倍土样稀释液。用微量移液器移取0.1mL土壤悬液注入盛有0.9mL无菌水的小离心管中，吹吸三次，充分混匀，制成102倍土壤稀释液。依次类推，制成103、104、105、106倍土壤稀释液。
由小组代表合作完成操作演示环节，一人操作，另一人解说过程及注意事项。演示完毕可向同学提问，并回答同学对实验操作的质疑。
教师组织演示小组与同学的互动，采用AirPlay技术将操作过程实时投放至大屏幕供同学们观察操作细节，引导同学思考“在梯度稀释操作中，是如何体现无菌操作的”，总结归纳梯度稀释操作的注意事项及结果。
3.涂布平板：
按照由106～104稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作，不必更换微量移液器枪头。如下图：
备注：
★图中前三行平板是选择培养基，第四行平板为LB培养基，以判断选择培养基是否具有筛选作用；要有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和LB培养基，以验证培养基中是否含有杂菌。
★由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，可以选择较为宽泛的范围103～107倍的稀释液。
★实验时要对所用的平板、小离心管作好标记。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
由小组代表合作完成操作演示环节，一人操作，另一人解说过程及注意事项。演示完毕可向同学提问，并回答同学对实验操作的质疑。
教师组织演示小组与同学的互动，采用AirPlay技术将操作过程实时投放至大屏幕供同学们观察操作细节，引导同学思考“为什么采用涂布分离法？测定微生物数量的常用方法还有哪些”、“为什么要涂布104、105、106三个稀释度的菌悬液？为什么要设置重复？为什么要设置对照”等问题串，总结归纳涂布平板操作的注意事项及结果。
4.微生物的培养与观察：
将涂布好的培养皿倒置于30～37℃的恒温培养箱中培养1～2d，每隔24h比较LB培养基和选择培养基中菌落的数量、特征等，并做好记录。
三.计数与课题成果评价
为了保证结果准确，一般选择菌落数为30-300个的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。
计算公式：每克样品中含菌落数＝(C÷V)×M。
C：代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数。
V：代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)。
M：代表稀释倍数。
评价分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落；
评价分析样品的稀释操作是否成功；
评价分析重复组的结果是否一致。
此环节发给每个小组前期预实验中兴趣小组涂布的不同稀释度的选择培养基和对照培养基菌落生长情况的彩色照片，以小组合作探究的方式练习对每个平板的菌落计数，并且推算每克土壤样品中分解尿素细菌的菌落数。计算完毕后上台展示交流。
教师组织学生总结、评价、反思探究活动成功或失败原因。
课堂小结：
随堂测试及课后作业：
1.判断选择培养基是否起到选择作用，设置对照（ ）
A.未接种的选择培养基
B.未接种的LB培养基
C.接种了的LB培养基
D.接种了的选择培养基
2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是( )
A.CO2和N2 B.葡萄糖和NH3
C.CO2和尿素 D.葡萄糖和尿素
3.下列说法不正确的是（ ）
A.科学家从70-80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶
B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值
C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度
D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。
作业：导学案基础能力及巩固提升部分习题。
说在最后：
经过本节课的学习，你已具备了分离目的菌种的思路和实验操作技能。坚持学好生物这门实验学科，定能在科研之路上越走越远，为中国经济的发展做出自己卓越的贡献！
【板书设计】
课题2 土壤中分解尿素细菌的分离与计数
提出问题
讨论思路
设计方案
实施方案
展示交流
《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》评测练习
【课程标准】
获得纯净的微生物培养物是发酵工程的基础。
1.阐明在发酵工程中灭菌是获得纯净的微生物培养物的前提。
2.阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品与无菌区域不被微生物污染的技术。
3.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。
4.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。
5.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
【学习目标】
1.运用生物与环境相适应的观点，提出分离、计数目标菌的思路。
2.按照科学探究的要求设计出分离、计数目标菌的方案。
3.依据方案运用无菌操作技术和分离、培养方法初步分离出目标菌并测定数量。
4.应用筛选目的菌株的技术应对现实生活中的问题。
【评测练习】
一、单选题
1.下列生物学实验操作，能够顺利达到实验目的的是（ ）
A.在固体培养基上涂布稀释的大肠杆菌培养液获得单菌落
B.在接种酵母菌的新鲜葡萄汁中通入无菌空气制作果酒
C.土壤浸出液接种于牛肉膏蛋白胨培养基上筛选分解尿素的细菌
D.在分离土壤中的尿素分解菌实验中，采集的土样经高温灭菌后，可以用于制取土壤稀释液
2.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是（ ）
①加尿素②不加尿素③加琼脂④不加琼脂⑤加葡萄糖
⑥不加葡萄糖⑦加硝酸盐⑧不加硝酸盐
A.①③⑤⑦ B.①③⑤⑧
C.②④⑥⑧ D.①④⑥⑦
3.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B.以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
4.下列就“土壤中分解尿素的细菌的分离与计数”实验的有关叙述，不正确的是（ ）
A.经高压蒸汽灭菌的培养基所倒平板和接种后培养时的平板均要倒置[来源:Zxxk.Com]
B.同一稀释度下至少要涂布三个平板并且要培养到菌落数稳定时计数
C.在稀释度足够高时，所形成的单个菌落中所有细胞的遗传信息必定相同[来源:Zxxk.Com]
D.在相同培养条件下，未接种的培养基表面无菌落生长说明培养基没有被杂菌污染
5.在以尿素作为唯一氮源的培养基上大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌；在培养基中加入10%酚可以抑制细菌和霉菌。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出( )
A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
B.分解尿素的细菌、大肠杆菌、放线菌
C.分解尿素的细菌、霉菌、放线菌
D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌
6.欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中不正确的是（ ）
A.将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释
B.用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌
C.同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板
D.可将未接种的培养基在相同条件下培养作为空白对照
7.关于统计微生物数目，说法错误的是（ ）[来源:学§科§网]
A.因为土壤中各类微生物的数量不同，所以为获得不同类型的微生物，要按不同的稀释倍数进行分离
B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释度范围不同
C.只有得到了3个或3个以上菌落数目在30-300的平板，才说明系列稀释操作成功
D.每次统计菌落数目，应选取菌落数目稳定时的记录作为结果
8.在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。产生A同学结果的原因可能有（ ）
①土样不同 ②培养基污染 ③操作失误 ④没有设置对照
A.①②③ B.②③④ C.①③④ D.①②③④
9.下列关于微生物的分离和培养的叙述中，正确的是( )
A.进行微生物培养前，需对培养瓶进行消毒处理
B.对细菌的分离和计数可用平板划线法和稀释涂布平板法
C.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染
D.用含刚果红的尿素培养基筛选鉴别出能分解尿素的菌株
10.下图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析正确的是（ ）
A.3号试管的稀释倍数为103倍
B.4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数恰为5号试管的10倍
C.5号试管的结果表明每克土壤中的菌株数为1.7×109个
D.该实验方法统计得到的结果往往会比实际活菌数目要高
二、非选择题
11.在肉牛产业中，常在饲料中加入一定量的尿素，因其有瘤胃，在瘤胃中生活着多种微生物，其中许多微生物以尿素作为唯一氮源。某同学设计了如下实验，对能分解尿素的细菌进行分离和计数。
(1)图中弧线箭头上“?”的具体操作是____________________。
(2)进行培养基配制和灭菌时,灭菌与调节pH的先后顺序是______________；纯化菌种时为了得到单一菌落,常采用的接种方法是_______________________________。
(3)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入_______________。培养后,若出现_________色,说明其中含有能够分解尿素的细菌。
(4)在实验中,当菌落数目稳定时，应选取____________方法计数；研究者每隔24小时统计一次菌落数目,并选取菌落数目稳定时的记录作为结果,这样可以防止___________。
12.下图是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，回答有关问题：
（1）图中选择培养基应以尿素为唯一___________；鉴别培养基还需添加____________作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，由于尿素被分解成的____________使培养基的碱性增强，pH升高，其菌落周围的指示剂将变成____________色。
（2）在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品液0.1mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是____________，每克土壤样品中的细菌数量为____________×108个。
（3）与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较________，其原因是________________。
