课题1 微生物的实验室培养
★课题目标
（一）知识与技能
了解有关培养基的基础知识；掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术
（二）过程与方法
分析实验思路的确定和形成的原因，分析实验流程，对比前面的实验设计，归纳共性，分析差异，增加印象
（三）情感、态度与价值观
形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神
★课题重点
无菌技术的操作
★课题难点
无菌技术的操作
★教学方法
启发式教学
★教学工具
多媒体课件
★教学过程
（一）引入新课
在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中的微生物来自于制作过程中的自然感染。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题。
（二）进行新课
1．基础知识
1．1 培养基的种类包括 固体 培养基和 液体 培养基等。
〖思考1〗琼脂是从红藻中提取的 多糖 ，在配制培养基中用作为 凝固剂 。
【补充】培养基的类型及其应用：
1．2 培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 四类营养成分。
〖思考2〗从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？
C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的97％以上。
【补充】碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。
氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。
1．3 培养基除满足微生物生长的 pH 、 特殊营养物质 和 氧气 等要求。
【补充】生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。
〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供 糖 、 维生素 和 有机氮 等营养物质。
〖思考4〗培养乳酸杆菌时需要添加 维生素 ，培养霉菌时需要将培养基pH调节为 酸性 ，培养细菌时需要将pH调节为 中性或微碱性 。
活动2：阅读“无菌技术”，讨论回答下列问题：
1．4 获得纯净培养物的关键是 防止外来杂菌的入侵 。
1．5 无菌技术包括：
（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。
1．6 比较消毒和灭菌（填表）
〖思考5〗无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是 防止感染实验操作者 。
1．7 消毒方法：
（1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法；
（2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法（作简要介绍）；
（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。
（4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒；
（5）饮水水源用 氯气 进行消毒。
1．8灭菌方法：
（1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法；
（2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ；
（3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌锅 。
（4）表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯 。
〖思考6〗对接种环灭菌时要用酒精灯的 充分燃烧 层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。
〖思考7〗利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是避免妨碍热空气流通。
〖思考8〗物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是 有利于锅内温度升高 ；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 100k Pa，温度为 121℃ ，并维持 15～30 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至 零 时打开锅盖，其目的是防止 容器中的液体暴沸 。
【补充】培养基的配制原则：
①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。
③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
2．实验操作
2．1 计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。
2．2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。
2．3 溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
2．4 调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。
2．5 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。
2．6 倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：
①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；
②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；
③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。
④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。
〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？
不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
〖思考4〗配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。
〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。
2．7 接种
2．7．1微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。
2．7．2平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：
①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。
②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。
③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。
④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。
⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。
⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。
⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。
⑧将平板倒置放在培养箱中培养。
〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。
2．7．3 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。
2．7．4 系列稀释操作：
①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。
②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。
③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。
〖思考8〗操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。
3．结果分析与评价
3．1 培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。
3．2 在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。
3．3 培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。
〖思考9〗在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。
〖思考10〗频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是
A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHC O3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。
答案：D
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是
A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。
答案：B
☆综合应用
例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
编号
成分
含量
①
粉状硫
10g
②
（NH4）2SO4
0.4g
③
K2HPO4
4.0g
④
MgSO4
9.25g
⑤
FeSO4
0.5g
⑥
CaCl2
0.5g
⑦
H2O
100ml
（1）右表培养基可培养的微生物类型
是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。
如不想浪费此培养基，可再加入 ，
用于培养 。
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培
养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共有 类。
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化
后分装前，要进行的是 。
（6）右表中各成分重量确定的原则是 。
（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。
解析：对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于合成培养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基中加入了过量食盐，就可以成为金黄色葡萄球菌鉴别培养基，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基就还需要加入有机碳源。该培养基若加入（CH2O），培养基中就有了碳源，但除去成分②，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝固剂，需要加入常见的凝固剂——琼脂。
答案：⑴自养型微生物 ⑵含碳有机物 金黄色葡萄球菌 ⑶固氮微生物 ⑷3 ⑸调整pH ⑹依微生物的生长需要确定 ⑺琼脂（或凝固剂）
（五）巩固练习
1．不可能作为异养微生物碳源的是
A．牛肉膏 B．含碳有机物 C．石油 D．含碳无机物
2．根瘤菌能利用的营养物质的组别是
A．NH3，（CH2O），NaCl B．N2，（CH2O），CaCl2
C．铵盐，CO2，NaCl D．NO2，CO2，CaCl2
3．配制培养基的叙述中正确的是
A．制作固体培养基必须加入琼脂 B．加入青霉素可得到放线菌
C．培养自生固氮菌不需氮源 D．发酵工程一般用半固体培养基
4．自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是
A．碳源 B．氮源 C．无机盐 D．特殊营养物质
5．下表是有关4种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的概述。其中正确的是( )
生 物
硝化细菌
根瘤菌
酵母菌
谷氨酸棒状杆菌
能 源
氧化NH3
N2的固定
分解糖类等有机物
光 能
碳 源
C02
糖类
糖类
糖类
氮 源
NH3
N2
NH4+、NO3-
尿 素
代谢类型
自养需氧型
异养需氧型
异养兼性厌氧型
自养需氧型
A．根瘤菌、谷氨酸棒状杆菌 B．硝化细菌、酵母菌
C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌 D．硝化细菌、根瘤菌
6．甲、乙、丙是三种微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ种正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是 （ ）
粉状硫
10g
K2HPO4
4g
FeSO4
0.5g
蔗糖
10g
（NH4）2SO4
0.4g
H2O
100ml
MgSO4
9.25g
CaCl2
0.5g
Ⅰ
+
+
+
+
-
+
+
+
Ⅱ
+
+
+
-
+
+
+
+
Ⅲ
+
+
+
+
+
+
+
+
A、甲、乙、丙都是异养微生物
B、甲、乙、丙都是自养微生物、丙是异养微生物
C、甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物
D、甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物
7．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是
A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的
B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子
C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利
D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足。
8．某一种细菌株要从环境中提取现成的亮氨酸（20种氨基酸中的一种）才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。根据实验年目的，选用的培养基类型是（ ）
注：Ｌ—亮氨酸 Ｓ—链霉素 “＋”—加入 “—”—不加入
如：Ｌ—：不加亮氨酸 Ｓ＋：加入链霉素
选项
筛选出不需要亮氨酸的菌株
筛选出抗链霉素的菌株
筛选出不需要亮氨酸的抗链霉素的菌株
Ａ
Ｌ＋ Ｓ＋
Ｌ— Ｓ—
Ｌ＋ Ｓ－
Ｂ
Ｌ－ Ｓ—
Ｌ＋ Ｓ＋
Ｌ— Ｓ＋
Ｃ
Ｌ— Ｓ＋
Ｌ＋ Ｓ＋
Ｌ— Ｓ—
Ｄ
Ｌ＋ Ｓ—
ｌ— Ｓ—
Ｌ＋ Ｓ＋
9．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在
A．加入氮源和杀菌剂的培养基上 B．不加入氮源和不加杀菌剂的培养基上
C．加入氮源，不加杀菌剂的培养基上 D．不含氮源和杀菌剂的培养基上
10．酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是
A．碳源供应太充足 B．细胞会发生质壁分离
C．改变了酵母菌的pH值 D．葡萄糖不是酵母菌的原料
答案：DACAC CDBBB
★课余作业
１、收集生活中与微生物有关的实例，并通过所学知识对其进行解释
２、我们打针输液时，首先要用酒精擦拭针刺处，为什么？
★教学体会
本节课可以通过生产实例导入，使学生认识在微生物的培养过程中，保持培养物纯净的重要性。在课堂上可以跳出教材，充分发挥学生的主动性，让学生收集列举更多的生产生活中的实例，从中体会培养物纯净的重要性。当时由于微生物的微观性和危害性，一定要教育学生培养良好的卫生习惯。
★资料袋
微生物的特点
1.个体微小，结构简单
在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。
2.繁殖快
生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。
3.代谢类型多，活性强。
4.分布广泛
有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。
5.数量多
在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。
6.易变异
相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。
所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。
课时训练4 微生物的实验室培养
1.下列可以作为自养微生物氮源的是( )。
A.N2、尿素
B.牛肉膏、蛋白胨
C.尿素、酵母粉
D.铵盐、硝酸盐
解析:自养微生物需要吸收的是自然界中的无机物,包括无机碳源和无机氮源。尿素、牛肉膏、蛋白胨、酵母粉均不能作为自养微生物的氮源,铵盐、硝酸盐可以作为自养微生物的氮源。
答案:D
2.下列叙述正确的是( )。
A.培养基是为微生物的生长繁殖提供营养的基质
B.培养基只有两类:液体培养基和固体培养基
C.固体培养基中加入少量水即可制成液体培养基
D.微生物在固体培养基上生长时,可以形成肉眼可见的单个细菌
解析:培养基是微生物生长繁殖的营养基质。按培养基的形态分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。固体培养基是液体培养基中加入凝固剂后制成的,加水不能再变成液体培养基。单个细菌用肉眼看不见,肉眼可见的是培养基上形成的菌落。
答案:A
3.下列操作与消毒、灭菌无关的是( )。
A.接种前用火焰灼烧接种环
B.接种前用酒精擦拭双手
C.将平板放入培养箱中培养
D.接种要在酒精灯的火焰旁完成
解析:灼烧接种环、酒精擦拭双手及接种时在火焰旁完成都是为了消毒、灭菌、避免杂菌污染。将平板放入培养箱中培养,则与消毒、灭菌无关。
答案:C
4.下列有关细菌培养的叙述,正确的是( )。
A.在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌
B.在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长
C.向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长
D.在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动
解析:A项,在琼脂固体培养基上长出的单个菌落是由一种细菌增殖而来的;B项,青霉素能破坏细菌等原核生物的细胞壁而抑制细菌的增殖,对真菌没有明显作用;C项,破伤风杆菌是厌氧菌,通入氧气会抑制其生长;D项,半固体培养基中可以观察细菌的运动。
答案:D
5.下列有关平板划线法的操作,错误的是( )。
A.将接种环放在火焰上灼烧
B.将已冷却的接种环伸入菌液中沾取一环菌液
C.沾取菌液和划线要在火焰旁进行
D.接种环划线要将最后一区的划线与第一区的划线相连
解析:为了避免杂菌污染,沾取菌液和划线要在火焰旁进行。每次划线之前都要对接种环进行灼烧灭菌,划线操作结束仍需灼烧接种环。灼烧接种环之后,要冷却后才能伸入菌液,以免温度太高,杀死菌种。进行平板划线时不能将最后一区的划线与第一区的划线相连。
答案:D
6.微生物培养过程中,肉眼鉴别金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的重要依据是( )。
A.细菌的大小、形状、颜色 B.菌落的大小、形状、颜色
C.有无鞭毛 D.培养基的不同
解析:微生物的鉴别和分离,一般要用固体培养基,由于不同微生物在固体培养基上长出菌落的形状、颜色等各不相同,所以可以作为鉴别的标准。而一个细菌细胞很小,肉眼无法看到其颜色、形状等。
答案:B
7.用培养液培养三种细菌,让它们在三支不同的试管中生长,右图显示了细菌的生长层,如果此时往三支试管中通入氧气,则细菌的繁殖速度将是( )。
A.甲不变,乙减慢,丙加快
B.甲加快,乙加快,丙减慢
C.甲减慢,乙减慢,丙加快
D.甲减慢,乙加快,丙减慢
解析:甲试管内的细菌在试管上部,为好氧菌,乙试管内的细菌均匀分布,为兼性厌氧菌,丙试管内的细菌在试管底部,为厌氧菌。向试管内通入氧气,能够促进兼性厌氧菌和好氧菌的繁殖,抑制厌氧菌的繁殖。
答案:B
8.外科手术器械和罐头食品的灭菌,都要以能够杀死什么为标准?( )
A.球菌 B.杆菌
C.螺旋菌 D.芽孢
解析:灭菌是采用强烈的理化因素杀死所有的微生物,包括芽孢和孢子。
答案:D
9.下列有关稀释涂布平板法的叙述,错误的是( )。
A.首先将菌液进行一系列的梯度稀释
B.然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面
C.适宜条件下培养
D.结果都可在培养基表面形成单个的菌落
解析:稀释涂布平板法是将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面,进行培养。用不同稀释度的菌液接种,只有在稀释度足够高的菌液里,聚集在一起的微生物被分散成单个细胞,才能够在培养基表面形成单个菌落,而不是所有培养基上均可出现单个菌落。
答案:D
10.高中生物学实验中,在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是( )。
A.将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中
B.将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上
C.将转基因植物叶片接种到无菌培养基上
D.将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上
解析:植物组织培养中的外植体必须在严格的无菌环境中进行培养,而且操作的各环节都要注意严格灭菌,必须无菌操作,C项正确。葡萄酒的制作原理是利用酵母菌无氧发酵产生酒精,在无氧条件下大部分微生物都不能生存,随着发酵的进行,酒精浓度增大,也有杀菌作用;制作腐乳时,主要是将毛霉等微生物接种在豆腐上,此过程的加盐、加卤汤等操作均有一定的杀菌作用;选择培养基只能允许目的菌生长,会抑制其他杂菌生长。因此不进行严格无菌操作时,A、B、D选项的情况比C选项的情况受影响要小。
答案:C
11.下列关于细菌的叙述中,正确的是( )。
A.不同种类细菌的生长均需要相同碳源
B.常用液体培养基分离获得细菌单菌落
C.在加入青霉素的培养基中,细菌仍可大量繁殖
D.培养基中含有高浓度NaCl有利于金黄色葡萄球菌的筛选
解析:自养型细菌可以利用无机碳源,异养型细菌只能利用有机碳源,A项错误。分离细菌并获得单菌落需要固体培养基,B项错误。青霉素能杀死细菌,在加入青霉素的培养基中,细菌不会大量繁殖,C项错误。金黄色葡萄球菌有耐高浓度食盐的特点,可以用含高浓度NaCl的培养基筛选金黄色葡萄球菌,D项正确。
答案:D
12.为了获得纯度高的大肠杆菌,需要对大肠杆菌进行培养和分离。培养大肠杆菌一般用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。
(1)培养大肠杆菌,配制固体培养基的基本步骤:计算→称量→ → →倒平板。?
(2)称量时,由于牛肉膏比较黏稠,可以用 挑取,放在 上称量。由于牛肉膏和蛋白胨 ,称量时动作要迅速,称量后要及时盖上瓶盖。?
(3)在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上的大肠杆菌能生长,说明培养基含有?
等大肠杆菌生长所需的营养要素。
(4)微生物纯化培养可以通过多种接种方法如 和 等,使大肠杆菌在固体培养基上形成单个 ,从而获得纯菌株。?
解析:考查微生物纯化培养的基础知识。配制牛肉膏蛋白胨培养基的基本步骤:计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。称量时,可用玻璃棒挑取,放在称量纸上称量,称量时动作要迅速。牛肉膏蛋白胨培养基中含有大肠杆菌所需要的碳源、氮源、无机盐、水等营养要素,所以常用来培养大肠杆菌。微生物纯化培养的接种方法最常用的是平板划线法和稀释涂布平板法,可使大肠杆菌在固体培养基上形成单个菌落,从而获得纯菌株。
答案:(1)溶化 灭菌
(2)玻璃棒 称量纸 容易吸潮
(3)碳源、氮源、无机盐、水
(4)平板划线法 稀释涂布平板法 菌落
13.下表为某微生物培养基的配方,请回答下列问题。
成分
含量
成分
含量
NaNO3
3 g
K2HPO4
1 g
KCl
0.5 g
MgSO4·7H2O
0.5 g
FeSO4
0.01 g
(CH2O)
30 g
青霉素
0.1万单位
H2O
1 000 mL
(1)该培养基未加入凝固剂 ,依据物理性质,该培养基属于 培养基。?
(2)该培养基中的碳源是 ,因为该物质是有机物,因此也可给培养的微生物提供 。?
(3)根据该培养基的配方,所培养的微生物的代谢类型是 。?
(4)该培养基不适合培养细菌,因为青霉素可以抑制细菌的生长,但真菌可以在上面生存,因此由其功能上看该培养基可看作是一种 培养基。?
解析:(1)依物理性质划分,培养基分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基,该培养基没有加凝固剂琼脂且水的含量很多,所以应是液体培养基。(2)(CH2O)是糖类,既可作碳源,也可提供能源。(4)青霉素对培养的微生物有限制和选择作用,所以该培养基可看作是一种选择培养基。
答案:(1)琼脂 液体 (2)(CH2O) 能源 (3)异养型
(4)选择
14.有些细菌可分解原油,从而消除由原油泄漏造成的土壤污染,某同学欲从污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答下列问题。
(1)在筛选过程中,应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上,从功能上讲,该培养基属于 培养基。?
(2)纯化菌种时,为了得到单菌落,常采用的接种方法有两种,即 和 。?
(3)为了筛选出高效菌株,可比较单菌落周围分解圈的大小,分解圈大说明该菌株的降解能力 。?
(4)通常情况下,在微生物培养过程中,实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、 和 。无菌技术要求实验操作应在酒精灯 附近进行,以避免周围环境中微生物的污染。?
解析:(1)实验目的是筛选出可以降解原油的高效菌株,因此在筛选的时候应该用以原油为唯一碳源的选择培养基,这样只有能够分解原油的微生物才能在该培养基上生长,从而筛选出降解原油的微生物。
(2)纯化分离微生物的方法有两种:平板划线法和稀释涂布平板法。
(3)微生物降解原油后会形成透明圈,分解圈越大说明该菌株的降解能力越强。
(4)常用的灭菌方法有灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。
答案:(1)原油 选择 (2)平板划线法 稀释涂布平板法 (3)强 (4)干热灭菌 高压蒸汽灭菌 火焰
15.(2014四川理综,10)有机农药苯磺隆是一种除草剂,长期使用会污染环境。研究发现,苯磺隆能被土壤中某些微生物降解。分离降解苯磺隆的菌株和探索其降解机制的实验过程如图甲、乙所示。
图甲
图乙
(1)微生物生长繁殖所需的主要营养物质有碳源、水、 四类,该实验所用的选择培养基只能以苯磺隆作为唯一碳源,其原因是 。?
(2)与微生物培养基相比,植物组织培养的培养基常需添加生长素和 ,这些植物激素一般需要事先单独配制成 保存备用。?
(3)纯化菌株时,通常使用的划线工具是 。划线的某个平板培养后,第一划线区域的划线上都不间断地长满了菌,第二划线区域所划的第一条线上无菌落,其他划线上有菌落。造成划线无菌落可能的操作失误有 。?
(4)为探究苯磺隆的降解机制,将该菌种的培养液过滤离心,取上清液做图乙所示实验。该实验的假设是 ,该实验设计是否合理?为什么? ?
。?
解析:(1)微生物生长繁殖所需营养物质有碳源、氮源、水和无机盐四类。该实验是要分离能降解苯磺隆的菌株,所以以苯磺隆作为唯一碳源。
(2)植物组织培养所用的植物激素是生长素和细胞分裂素,应先将这两种植物激素单独配制成母液保存备用。
(3)进行菌株纯化时,常用的划线工具是接种环。用接种环进行第二区域划线前需灼烧灭菌,灭菌后的接种环温度过高,若不经冷却立即进行划线操作,会使第一条线上无活菌存在。另外,若划线未从第一区域末端开始,也会导致题述的划线无菌落现象。
(4)据图可知,该实验的假设为该微生物产生的分解苯磺隆的物质是蛋白质,该实验的设计不合理,因为缺少空白对照实验。
答案:(1)氮源和无机盐 只有能利用苯磺隆的微生物能正常生长繁殖
(2)细胞分裂素 母液
(3)接种环 ①接种环灼烧后未冷却;②划线未从第一区域末端开始
(4)目的菌株能分泌降解苯磺隆的蛋白质 不合理,缺少空白对照
专题2 微生物的培养与应用
课题2.1 微生物的实验室培养
一、【课题目标】
（一）知识与技能
了解有关培养基的基础知识；掌握培养基的制备、高压蒸汽灭菌和平板划线法等基本操作技术
???（二）过程与方法
分析实验思路的确定和形成的原因，分析实验流程，对比前面的实验设计，归纳共性，分析差异，增加印象
（三）情感、态度与价值观
形成勇于实践、严谨求实的科学态度和科学精神
二、【课题重点】
无菌技术的操作
三、【课题难点】
无菌技术的操作
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中的微生物来自于制作过程中的自然感染。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题。
（二）进行新课
1．基础知识
1．1 培养基的种类包括 固体 培养基和 液体 培养基等。
〖思考1〗琼脂是从红藻中提取的 多糖 ，在配制培养基中用作为 凝固剂 。
【补充】培养基的类型及其应用：
1．2 培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 四类营养成分。
〖思考2〗从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？
C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的97％以上。
【补充】碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。
氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。
1．3 培养基除满足微生物生长的 pH 、 特殊营养物质 和 氧气 等要求。
【补充】生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。
〖思考3〗牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供 糖 、 维生素 和 有机氮 等营养物质。
〖思考4〗培养乳酸杆菌时需要添加 维生素 ，培养霉菌时需要将培养基pH调节为 酸性 ，培养细菌时需要将pH调节为 中性或微碱性 。
活动2：阅读“无菌技术”，讨论回答下列问题：
1．4 获得纯净培养物的关键是 防止外来杂菌的入侵 。
1．5 无菌技术包括：
（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行 清洁和消毒 ；
（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行 灭菌 ；
（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在 酒精灯火焰附近 旁进行；
（4）避免已灭菌处理的材料用具与 周围物品 相接触。
1．6 比较消毒和灭菌（填表）
〖思考5〗无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是 防止感染实验操作者 。
1．7 消毒方法：
（1）日常生活经常用到的是 煮沸 消毒法；
（2）对一些不耐高温的液体，则使用 巴氏 消毒法（作简要介绍）；
（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增强消毒效果，然后使用 紫外线 进行物理消毒。
（4）实验操作者的双手使用 酒精 进行消毒；
（5）饮水水源用 氯气 进行消毒。
1．8灭菌方法：
（1）接种环、接种针、试管口等使用 灼烧 灭菌法；
（2）玻璃器皿、金属用具等使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ；
（3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌锅 。
（4）表面灭菌和空气灭菌等使用 紫外线 灭菌法，所用器械是 紫外灯 。
〖思考6〗对接种环灭菌时要用酒精灯的 充分燃烧 层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。
〖思考7〗利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是避免妨碍热空气流通。
〖思考8〗物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是 有利于锅内温度升高 ；随后关闭排气阀继续加热，气压升至 100k Pa，温度为 121℃ ，并维持 15～30 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至 零 时打开锅盖，其目的是防止 容器中的液体暴沸 。
【补充】培养基的配制原则：
①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。
②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。
③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。
2．实验操作
2．1 计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。
2．2 称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。
2．3 溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。
2．4 调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。
2．5 灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。
2．6 倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。
其过程是：
①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；
②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；
③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。
④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。
〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。
〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。
〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？
不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。
〖思考4〗配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。
〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。
2．7 接种
2．7．1微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。
2．7．2平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：
①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。
②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。
③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。
④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。
⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。
⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。
⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。
⑧将平板倒置放在培养箱中培养。
〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。
〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。
2．7．3 稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。
2．7．4 系列稀释操作：
①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。
②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。
③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。
〖思考8〗操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。
3．结果分析与评价
3．1 培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。
3．2 在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。
3．3 培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。
〖思考9〗在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。
〖思考10〗频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是
A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量
C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量
解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHC O3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。
答案：D
例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是
A.防止杂菌污染 B.消灭杂菌
C.培养基和发酵设备都必须灭菌 D.灭菌必须在接种前
解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。
答案：B
☆综合应用
例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：
编号
成分
含量
①
粉状硫
10g
②
（NH4）2SO4
0.4g
③
K2HPO4
4.0g
④
MgSO4
9.25g
⑤
FeSO4
0.5g
⑥
CaCl2
0.5g
⑦
H2O
100ml
（1）右表培养基可培养的微生物类型
是 。
（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。
如不想浪费此培养基，可再加入 ，
用于培养 。
（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培
养基可用于培养 。
（4）表中营养成分共有 类。
（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化
后分装前，要进行的是 。
（6）右表中各成分重量确定的原则是 。
（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是 。
解析：对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于合成培养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基中加入了过量食盐，就可以成为金黄色葡萄球菌鉴别培养基，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基就还需要加入有机碳源。该培养基若加入（CH2O），培养基中就有了碳源，但除去成分②，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝固剂，需要加入常见的凝固剂——琼脂。
答案：⑴自养型微生物 ⑵含碳有机物 金黄色葡萄球菌 ⑶固氮微生物 ⑷3 ⑸调整pH ⑹依微生物的生长需要确定 ⑺琼脂（或凝固剂）
（五）巩固练习
1．不可能作为异养微生物碳源的是
A．牛肉膏 B．含碳有机物 C．石油 D．含碳无机物
2．根瘤菌能利用的营养物质的组别是
A．NH3，（CH2O），NaCl B．N2，（CH2O），CaCl2
C．铵盐，CO2，NaCl D．NO2，CO2，CaCl2
3．配制培养基的叙述中正确的是
A．制作固体培养基必须加入琼脂 B．加入青霉素可得到放线菌
C．培养自生固氮菌不需氮源 D．发酵工程一般用半固体培养基
4．自养型微生物与异养型微生物的培养基的主要差别是
A．碳源 B．氮源 C．无机盐 D．特殊营养物质
5．下表是有关4种生物的能源、碳源、氮源和代谢类型的概述。其中正确的是( )
生 物
硝化细菌
根瘤菌
酵母菌
谷氨酸棒状杆菌
能 源
氧化NH3
N2的固定
分解糖类等有机物
光 能
碳 源
C02
糖类
糖类
糖类
氮 源
NH3
N2
NH4+、NO3-
尿 素
代谢类型
自养需氧型
异养需氧型
异养兼性厌氧型
自养需氧型
A．根瘤菌、谷氨酸棒状杆菌 B．硝化细菌、酵母菌
C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌 D．硝化细菌、根瘤菌
6．甲、乙、丙是三种微生物，下表Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是用来培养微生物的三种培养基。甲、乙、丙都能在Ⅲ种正常生长繁殖；甲能在Ⅰ中正常生长繁殖，而乙和丙都不能；乙能在Ⅱ中正常生长繁殖，甲、丙都不能。下列说法正确的是 （ ）
粉状硫
10g
K2HPO4
4g
FeSO4
0.5g
蔗糖
10g
（NH4）2SO4
0.4g
H2O
100ml
MgSO4
9.25g
CaCl2
0.5g
Ⅰ
+
+
+
+
-
+
+
+
Ⅱ
+
+
+
-
+
+
+
+
Ⅲ
+
+
+
+
+
+
+
+
A、甲、乙、丙都是异养微生物
B、甲、乙、丙都是自养微生物、丙是异养微生物
C、甲是固氮微生物、乙是自养微生物、丙是异养微生物
D、甲是异养微生物、乙是固氮微生物、丙是自养微生物
7．微生物（除病毒外）需要从外界吸收营养物质并通过代谢来维持正常的生长和繁殖。下列有关微生物营养的说法正确的是
A．乳酸菌与硝化细菌所利用的碳源物质是相同的
B．微生物生长中不可缺少的一些微量的无机物称为生长因子
C．培养基中的营养物质浓度越高对微生物的增殖越有利
D．生长因子一般是酶或核酸的组成成分，微生物本身合成这些生长因子的能力往往不足。
8．某一种细菌株要从环境中提取现成的亮氨酸（20种氨基酸中的一种）才能生长，此菌株对链霉素敏感。实验者用诱变剂处理此菌株，想筛选出表中细菌菌株类型。根据实验年目的，选用的培养基类型是（ ）
注：Ｌ—亮氨酸 Ｓ—链霉素 “＋”—加入 “—”—不加入
如：Ｌ—：不加亮氨酸 Ｓ＋：加入链霉素
选项
筛选出不需要亮氨酸的菌株
筛选出抗链霉素的菌株
筛选出不需要亮氨酸的抗链霉素的菌株
Ａ
Ｌ＋ Ｓ＋
Ｌ— Ｓ—
Ｌ＋ Ｓ－
Ｂ
Ｌ－ Ｓ—
Ｌ＋ Ｓ＋
Ｌ— Ｓ＋
Ｃ
Ｌ— Ｓ＋
Ｌ＋ Ｓ＋
Ｌ— Ｓ—
Ｄ
Ｌ＋ Ｓ—
ｌ— Ｓ—
Ｌ＋ Ｓ＋
9．要将从土壤中提取的自生固氮菌与其他的细菌分离出来，应将它们接种在
A．加入氮源和杀菌剂的培养基上 B．不加入氮源和不加杀菌剂的培养基上
C．加入氮源，不加杀菌剂的培养基上 D．不含氮源和杀菌剂的培养基上
10．酵母菌培养液中常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，原因是
A．碳源供应太充足 B．细胞会发生质壁分离
C．改变了酵母菌的pH值 D．葡萄糖不是酵母菌的原料
答案：DACAC CDBBB
七、【课余作业】
１、收集生活中与微生物有关的实例，并通过所学知识对其进行解释
２、我们打针输液时，首先要用酒精擦拭针刺处，为什么？
八、【教学体会】
本节课可以通过生产实例导入，使学生认识在微生物的培养过程中，保持培养物纯净的重要性。在课堂上可以跳出教材，充分发挥学生的主动性，让学生收集列举更多的生产生活中的实例，从中体会培养物纯净的重要性。当时由于微生物的微观性和危害性，一定要教育学生培养良好的卫生习惯。
九、【资料袋】
微生物的特点
1.个体微小，结构简单
在形态上，个体微小，肉眼看不见，需用显微镜观察，细胞大小以微米和纳米计量。
2.繁殖快
生长繁殖快，在实验室培养条件下细菌几十分钟至几小时可以繁殖一代。
3.代谢类型多，活性强。
4.分布广泛
有高等生物的地方均有微生物生活，动植物不能生活的极端环境也有微生物存在。
5.数量多
在局部环境中数量众多，如每克土壤含微生物几千万至几亿个。
6.易变异
相对于高等生物而言，较容易发生变异。在所有生物类群中，已知微生物种类的数量仅次于被子植物和昆虫。微生物种内的遗传多样性非常丰富。
所以微生物是很好的研究对象，具有广泛的用途。
课件39张PPT。专题2 微生物的培养与应用 课题1 微生物的实验室培养科学家在南极数百英尺的冰层下面，在没有光和氧气的环境中，发现了一种微生物。据推测，它们已经生存了150万年之久。基因检测显示，它们类似今天海洋环境中的微生物。科学家认为，这些微生物曾经生活在海洋里，150万～200万年前海洋被冰川截断形成像大池塘的水面，后来又被冰川覆盖。从此，这些微生物与世隔绝了。,
请思考：
1.微生物是如何获得能量维持生存的？
2.它们还需要哪些营养物质？
1．概念
人们按照微生物对__________的不同需求，配制出供其__________的营养基质。
2．种类
按照培养基的__________划分为______培养基和______培养基。一、培养基
营养物质 生长繁殖 物理状态 液体 固体 3．营养要素
各种培养基一般都含有水、________、________、__________，此外还要满足微生物生长对________、____________以及______的要求。
碳源 氮源 无机盐 pH 特殊营养物质 氧气 二、无菌技术
1．获得纯净培养物的关键是防止__________的入侵，具体操作如下：
(1)对实验操作的______、操作者的衣着和手进行______和______。
(2)将用于微生物培养的______、__________和________等器具进行灭菌。外来杂菌 空间 清洁 消毒 器皿 接种用具 培养基 (3)为避免周围环境中________的污染，实验操作应在__________________进行。
(4)实验操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与__________相接触。
微生物 酒精灯火焰附近 周围的物品 2．消毒和灭菌
(1)消毒是指使用较为________的物理或化学方法仅杀死物体表面或______________微生物(不包括芽孢和孢子)。常用的方法有________消毒法和____________消毒法。
(2)灭菌是指使用______的理化因素杀死物体内外______的微生物(包括芽孢和孢子)。常见的方法有：______灭菌、______灭菌、__________灭菌。
温和 内部一部分 煮沸 化学药剂 强烈 所有 灼烧 干热 高压蒸汽 三、大肠杆菌的纯化培养
牛肉膏蛋白胨 称量 灭菌 2．纯化大肠杆菌
(1)纯化培养方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上纯化大肠杆菌，最常用的方法有________________法和______________法。
(2)纯化培养的原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的________，即获得较纯的菌种。
(3)平板划线法：通过__________在琼脂固体培养基表面连续__________的操作，将聚集的菌种逐步________分散到培养基的表面。其具体操作是：
平板划线 稀释涂布平板 菌落 接种环 划线 稀释 ①将________放在火焰上燃烧，直到接种环烧红。
②在火焰旁冷却________，并打开棉塞。
③将试管口通过________。
④将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。
⑤将试管口通过火焰，并塞上棉塞。
⑥左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三到五条________线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。
接种环 接种环 火焰 平行 ⑦灼烧______，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。
⑧将平板______放入培养箱中培养。
(4)稀释涂布平板法：将菌液进行一系列的梯度______，然后将不同稀释度的菌液分别______到琼脂固体培养基的表面，进行培养。其操作步骤是：
①系列稀释(梯度稀释)操作：
接种环 倒置 稀释 涂布 酒精 表面 酒精 频繁使用的菌种 需长期保存的菌种 一、制备培养基
1．配制原则
(1)目的明确：不同微生物需求不同，根据培养目的进行配制。
(2)营养要协调：营养物质的浓度和比例要适宜。
(3)pH要适宜：为维持pH的相对恒定，可在培养基中加入缓冲剂，常用磷酸氢二钾或磷酸二氢钾。
2．培养基的营养成分及功能①对异养微生物来说，含C、H、O、N的化合物既是碳源又是氮源、能源。
②一些天然营养物质，如酵母膏、蛋白胨、动植物组织提取液等可为微生物提供生长因子。
③不同微生物对营养的需求不同，因此，首先根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。
④营养物质过少不能满足微生物的营养需要，过多对微生物的生长有抑制作用。
特 别
提 醒例1下列关于配制培养基的有关叙述中，正确的是( )
A．制作固体培养基必须加入琼脂
B．发酵工程中一般用液体培养基
C．氮源主要是为微生物提供能量
D．牛肉膏主要为微生物提供氮元素解析：制作固体培养基时必须加入凝固剂。琼脂是常用的凝固剂，但不是唯一的凝固剂，例如明胶也可作为凝固剂；发酵工程一般都是用液体培养基，原因是液体培养基便于调节pH、温度、溶氧等，而且液体培养基还能有利于微生物充分利用营养物质；氮源主要是作为微生物合成蛋白质和核酸的原料；牛肉膏主要为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素。
答案：B变式
训练1．下列制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的叙述，错误的是( )
A．操作顺序为计算、称量、溶化、倒平板、灭菌
B．将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯
C．将培养基冷却至50 ℃左右时进行倒平板
D．将平板冷却凝固约5～10 min后将平板倒过来放置
变式
训练解析：制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板，顺序不能颠倒。牛肉膏容易吸潮，所以当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。将培养基冷却至50 ℃，用手触摸锥形瓶感觉刚刚不烫手时倒平板，平板冷却后还需倒置。
答案：A
酒精消毒时，70%的酒精杀菌效果最好。原因是浓度过高，菌体表面蛋白质变性过快从而凝固成一层保护膜，乙醇分子不能渗入其中；浓度过低，杀菌能力减弱
特 别
提 醒例2 细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理方法，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌( )
A．接种针、手、培养基 B．高压锅、手、接种针
C．培养基、手、接种针 D．接种针、手、高压锅解析：高压蒸汽灭菌锅是灭菌的一个设备，通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧，可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环、接种针。
答案：C
2．下列操作与消毒和灭菌无关的是( )
A．接种前用火焰灼烧接种环
B．接种前用酒精擦拭双手
C．将平板倒置，放入培养箱中培养
D．接种在酒精灯的火焰旁完成
变 式
训 练解析：要建立“有菌观念”。接种用具、器皿、空气中都充满了微生物，都有污染的可能，必须严格地消毒、灭菌。A、B、D都是实验操作过程中常用的消毒和灭菌方法。将平板倒置，放入培养箱中培养与消毒、灭菌无关。
答案：C
变 式
训 练三、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基及纯化大肠杆菌
1．制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的过程2．纯化大肠杆菌操作过程中的注意事项
(1)平板划线法中几次灼烧接种环的目的：
(2)稀释涂布平板法操作比较复杂，且各个细节均需保证无菌操作，应特别注意：
①酒精灯与培养皿的距离要适宜。
②吸管头不要接触其他任何物体。
③吸管要在酒精灯火焰周围使用。
④涂布器末端浸在盛有70%酒精的烧杯中，取出时，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后将沾有少量酒精的涂布器在酒精灯火焰上引燃，注意防火。
①在稀释涂布平板操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。?
②每一稀释倍数菌液都至少要涂布三个平板，作为实验重复，求平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊者，应舍弃该实验数据，不进行统计、计算。?
③平板冷凝后，皿盖上会凝结成水珠。凝固后的培养基表面的温度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基造成污染。
特 别
提 醒例3 关于平板划线操作的叙述正确的是( )
A．使用已灭菌的接种环、培养皿，在操作过程中不需要再灭菌
B．打开含菌种的试管，需通过火焰灭菌，取出菌种后，需马上塞上棉塞
C．将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线即可
D．最后将平板倒置，放在培养箱中解析：使用已灭菌的接种环、培养皿，操作过程仍要灭菌；打开含菌种的试管需要通过火焰灭菌，取出菌种后含菌种的试管需要通过火焰灭菌后再塞好棉塞；将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线后盖上皿盖；最后应将平板倒置，放入培养箱中培养。
答案：D
3．稀释涂布平板法是微生物培养中的一种常用的接种方法。下列相关叙述错误的是( )
A．操作中需要将菌液进行一系列的浓度梯度稀释
B．需将不同稀释度的菌液分别涂布到固体培养基表面
C．不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个的菌落
D．操作过程中对培养基和涂布器等均需进行严格灭菌处理
变 式
训 练C
