课时训练5 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
1.可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )。
A.以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B.以尿素为唯一氮源的培养基中加二苯胺试剂
C.以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D.以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
解析:细菌合成的脲酶可以催化尿素分解形成氨。氨会使培养基的碱性增强,pH升高。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂,培养某种细菌后,如果pH升高,指示剂变红,则说明该细菌能产生脲酶分解尿素。
答案:A
2.关于微生物的培养,下列叙述错误的是( )。
A.细菌一般在30~37 ℃的温度下培养1~2 d
B.放线菌一般在25~28 ℃的温度下培养5~7 d
C.霉菌一般在25~28 ℃的温度下培养3~4 d
D.不同种类的微生物,一般需要相同的培养温度和培养时间
解析:不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和时间。
答案:D
3.
在培养基中加入尿素(唯一氮源),以分离出能分解尿素的细菌,这种加入尿素的培养基在功能上属于( )。
A.选择培养基 B.固体培养基
C.液体培养基 D.半固体培养基
解析:题中的培养基能分离出以尿素为唯一氮源的细菌,故从功能上讲是一种选择培养基。
答案:A
4.需要在火焰旁操作的有( )。
①土壤取样 ②称取土壤 ③稀释土壤溶液 ④涂布平板 ⑤微生物的培养
A.①②③④⑤ B.②③④⑤
C.③④⑤ D.②③④
解析:除了土壤取样和微生物的培养不便于在火焰旁进行外,其他均要在火焰旁进行,以防止杂菌污染。
答案:D
5.以下关于分解尿素的细菌的说法,正确的是( )。
A.能分解尿素的原因是能合成分泌蛋白酶
B.以尿素作为唯一的碳源
C.环境中含有大量的尿素诱导该细菌产生了分解尿素的特性
D.以尿素为唯一氮源且添加了酸碱缓冲剂的培养基培养该菌后不会使酚红指示剂变红
解析:A项:酶具有专一性,分解尿素的细菌之所以能分解尿素是因为能合成分泌脲酶。B项:该菌能以葡萄糖作为碳源。C项:环境中含有大量的尿素对分解尿素的性状起了选择作用而非诱导作用。D项:该菌产生脲酶把尿素分解为氨后,使pH升高,酚红指示剂变红,但添加酸碱缓冲剂后,阻止了pH的升高,因此培养基不再使酚红指示剂变红。
答案:D
6.稀释涂布平板法分离分解尿素的细菌时使用的涂布器应保存在体积分数为70%的酒精中,取出后又要放在酒精灯火焰上引燃,这两步分别属于什么技术?( )
A.灭菌、灭菌 B.消毒、消毒
C.灭菌、消毒 D.消毒、灭菌
解析:消毒和灭菌是不同的。往往消毒比较温和,仅仅消灭危害健康的致病菌;而灭菌就比较强烈,如高压蒸汽、灼烧等,它是杀死一切菌。因此本题前者属消毒,后者属灭菌。
答案:D
7.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是( )。
A.菌落 B.细菌形态
C.细菌体积 D.细菌结构
解析:细菌个体非常小,不易直接观察,而不同细菌菌落的形态特征不同,且可用肉眼观察,常作为鉴定菌种的依据。
答案:A
8.下列关于微生物分离和培养的叙述,错误的是( )。
A.微生物培养前,需对培养基进行消毒
B.测定土壤样品中的细菌数目,常用菌落计数法
C.分离土壤中不同的微生物,要采用不同的稀释度
D.分离能分解尿素的细菌,要以尿素作为培养基中唯一氮源
解析:微生物培养前,需对培养基进行灭菌处理,要将所有微生物杀死;当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的一个菌落,来源于样品稀释液中的一个活菌;土壤中各类微生物的数量是不同的,为获得不同类型的微生物,就需要按不同的稀释度进行分离,同时还应当有针对性地提供选择培养条件。
答案:A
9.测定土壤中不同微生物的数量,要选用不同倍数的稀释液进行平板培养,请选出培养细菌时所用的稀释倍数( )。
①102 ②103 ③104 ④105 ⑤106
A.①②③ B.②③④
C.③④⑤ D.①④⑤
解析:土壤中细菌的数量非常多,一般选取的稀释倍数比较高。
答案:C
10.实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应,用3种细菌在事先准备好的琼脂平板上画3条等长的平行线(3条线均与图中的链霉素带接触),将平板置于37 ℃条件下恒温培养3天,结果如下图所示。从实验结果分析,以下叙述不正确的是( )。
A.链霉素能阻止结核菌的生长
B.链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效
C.链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效
D.链霉素可以用于治疗伤寒病人
解析:从图中可以看出,这是含有链霉素的选择培养基,接种的3种细菌中,霍乱菌和结核菌都可以被杀灭,并且链霉素对结核菌杀灭的有效程度大于霍乱菌。而伤寒菌照常生长不受影响,所以选项D错误。
答案:D
11.下列有关土壤中微生物的分离与计数的说法,错误的是( )。
A.因为土壤中各类微生物的数量不同,所以,为获得不同类型的微生物要按不同的稀释倍数进行分离
B.测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量,选用的稀释范围不同
C.如果得到了3个或3个以上菌落数目在30~300的平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进行菌落的计数
D.牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显小于选择培养基的数目,说明选择培养基已筛选出一些细菌菌落
解析:样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落的数目。实际操作中,通常选用一定稀释范围的样品液进行培养,以保证获得菌落在30~300之间适于计数的平板。测定土壤中细菌的数量,一般选用104、105和106倍的稀释液;测定放线菌的数量一般选用103、104和105倍的稀释液;测定真菌的数量,一般选用102、103和104倍的稀释液。将菌液稀释相同的倍数,在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目,从而说明选择培养基的筛选作用。
答案:D
12.马丁培养基是实验室常用的培养基之一。下表为马丁培养基的化学成分,据此回答下列问题。
成分
含量
成分
含量
KH2PO4·3H2O
0.1 g
葡萄糖
1 g
MgSO4·7H2O
0.05 g
蛋白胨
0.5 g
0.1%孟加拉红溶液
0.33 mL
琼脂
1.5~2 g
2%去氧胆酸钠溶液
2 mL
H2O
100 mL
链霉素溶液(1×104 μ/mL)
0.33 mL
—
(1)该培养基中加入了链霉素,能抑制细菌和放线菌,但真菌可以在上面生长,因此培养基是一种 培养基。?
(2)葡萄糖能给微生物生长提供 和 。?
(3)蛋白胨能给微生物生长提供 和 。?
(4)培养基中KH2PO4·3H2O可给微生物提供含 的无机盐。?
(5)琼脂的作用是作为 。?
解析:链霉素能抑制细菌和放线菌生长,真菌可以在上面生长,因此该培养基是一种选择培养基。葡萄糖是一种含碳的有机物,既可给微生物提供碳源,又可给微生物提供能源。该培养基蛋白胨可以给微生物提供氮源和维生素。
答案:(1)选择 (2)碳源 能源 (3)氮源 维生素 (4)K、P (5)凝固剂
13.探究如何从土壤中分离自生固氮菌并计数。
实验原理:农田的表层土壤中,自生固氮菌的含量比较多。将用表层土制成的稀泥浆,接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下,只有自生固氮菌才能生长繁殖。
材料用具:农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9 mL无菌水的大试管若干、无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿、盛90 mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱。
方法步骤:
(1)倒平板。分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板,应在 操作。?
(2)制备土壤稀释液。取土样10 g加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。用无菌移液管吸取上清液 1 mL,转至9 mL无菌水的大试管中,依次稀释到107倍稀释度。为实现无菌操作,试管口和移液管应在离火焰 cm处。?
(3)涂布。按照由107~103稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布,每个稀释度下,无氮培养基应至少涂布 个平板,牛肉膏蛋白胨培养基涂布 个平板。?
(4)培养。放入恒温箱内,在适宜温度条件下培养3~4 d。一般每隔 h统计一次,选取 时的记录作为结果,这样可以防止 。?
(5)细菌的计数。当菌落数目稳定时,选取菌落数在 的平板进行计数。如果测试的平均值为50,则每克样品中的菌株数是 。(稀释度是105)?
(6)预期结果。相同稀释度下,牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数 (填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。理由是 ?
。?
解析:要分离自生固氮菌,采用选择培养基分离的方法,缺乏氮源的培养基可用来分离自生固氮微生物,而其他微生物因缺乏氮源不能生长。实验步骤一般是:配制无氮培养基→灭菌→倒平板→系列稀释→涂布平板→培养→观察并计数。实验中要注意无菌操作和设计对照等。
答案:(1)酒精灯火焰旁 (2)1~2 (3)3 1 (4)24 菌落数目稳定 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
(5)30~300 5×107
(6)多于 无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌,而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存
14.某化工厂的污水池中,含有一种有害的、难以降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基,成功地筛选到了能高效降解化合物A的细菌(“目的菌”)。请分析回答下列问题。
(1)培养基中加入化合物A的目的是筛选 ,这种培养基属于 培养基。?
(2)“目的菌”生长所需的氮源和碳源是来自培养基中的 ,实验需要振荡培养,由此推测“目的菌”的代谢类型是 。?
(3)培养若干天后,应选择培养瓶中化合物A含量 的培养液,接入新的培养液中连续培养,使“目的菌”的数量 。?
(4)可采用 的方法将“目的菌”接种到固体培养基上,通过 法对“目的菌”的数量进行统计,通常需要对菌落数为 的平板进行计数。?
(5)实验结束时,使用过的培养基应该进行 处理后,才能倒掉。?
解析:(1)培养基中加入的磷酸盐、镁盐以及微量元素,不能作为碳源和氮源,可推测加入的化合物A提供微生物生存所需的碳源和氮源,这样可以筛选出能够降解化合物A的微生物,这种培养基为选择培养基。(2)化合物A提供氮源和碳源,振荡可以增加培养基中氧气的含量,说明该微生物的代谢类型为异养需氧型。(3)培养若干天应该向消耗化合物A的培养基中加入新的培养液连续培养,使“目的菌”的数量逐渐增多。(4)可采用稀释涂布平板法将“目的菌”接种到固体培养基上,通过计数平板中的菌落数推算出活菌的个数,通常应该对菌落数为30~300的平板进行计数,然后求其平均值作为活菌数。(5)实验结束后对所使用的培养基应该进行灭菌处理,防止污染环境和感染操作者本身。
答案:(1)“目的菌” 选择 (2)化合物A 异养需氧型
(3)减少 增加 (4)稀释涂布平板 活菌计数 30~300 (5)灭菌
专题2 微生物的培养与应用
课题2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、【课题目标】
（一）知识与技能
利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数
???（二）过程与方法
分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性
（三）情感、态度与价值观
形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯
二、【课题重点】
对土样的选取和选择培养基的配制
三、【课题难点】
对分解尿素的细菌的计数
四、【教学方法】
启发式教学
五、【教学工具】
多媒体课件
六、【教学过程】
（一）引入新课
上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。
（二）进行新课
1．基础知识
1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为 氨和CO2 ，这是因为细菌能合成 脲酶 。
1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为 热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物 ，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是 人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长 。
点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。
〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是 葡萄糖 ，提供氮源的的是 尿素 ，琼脂的作用是 凝固剂 。
〖思考2〗该培养基对微生物 具有 （具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是 只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长 。
1．3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是 稀释涂布平板法 。除此之外， 显微镜直接计数 也是测定微生物数量的常用方法。
【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。
公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量
1．4 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于 样品稀释液中一个活菌 。通过统计 平板上的菌落数 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30～300 的平板进行计数。
〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是 （平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数 。
〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是 恰当的稀释度 。
〖思考5〗第 二 位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。
1．5统计的菌落数比活菌的实际数目 低 。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是 一个 菌落。因此，统计结果一般用 菌落数 来表示。
1．6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
1．7对照实验是指除了 被测试 的条件外，其他条件都 相同 的实验。满足该条件的称为 对照组，未满足该条件的称为 实验 组。
〖思考6〗请设计本实验的对照实验组：
方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。
方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。
2．实验设计
2．1 实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。
2．2 根据图示2－7填写以下实验流程：
2．3 土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。
2．4 分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。
2．5 培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。
2．6 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。
点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。
2．7菌落的特征包括 形状、大小、隆起程度、颜色 等方面。
〖思考8〗土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。
2．9 实验过程
1）取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。
2）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。
3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。
4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。
5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。
〖思考9〗在研究未知微生物时务必规范操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。
3．结果分析与评价
3．1 对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助 生物化学 的方法。
3．2 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的 脲酶 将尿素分解成了 氨 。氨会使培养基的碱性 增强 ，PH 升高 。因此，我们可以通过检测培养基 pH 变化来判断该化学反应是否发生。
3．3 在以 尿素 为唯一氮源的培养基中加入 酚红 指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变 红 ，说明该细菌能够 分解尿素 。
〖思考10〗测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现 黑 色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。你认为在该实验中至少应取 三 个水样。
（三）课堂总结、点评
（四）实例探究
例1．对细菌群体生长规律测定的正确的表述是
A．在液体培养基上进行 B．至少接种一种细菌
C．接种一个细菌 D．及时补充消耗的营养物质
解析：细菌群体生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。
答案：A
例2．在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是
A．调整期 B．对数期 C．稳定期 D．衰亡期
解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pH已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。
答案：C
☆综合应用
例3．（2005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。
⑴青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的 代谢产物。
⑵在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛， 和 比较稳定。
⑶对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后， ，再计算发酵罐中菌体的总重量。
解析：青霉菌属于真菌，其代谢类型应为异养需氧型，而青霉素作为它的代谢产物，并不是它生长、繁殖所必需的，所以青霉素应属于次级代谢产物。在测定培养基上青霉菌菌体的生长情况时，常用的方法有两种：一种是测量青霉菌的细胞数目，另一种是测重量，取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，称菌体的湿重，或烘干后称干重，再由此计算出其中的细胞总重量。在细菌生长的四个主要时期中，因为处于对数期的细菌代谢旺盛，个体的形态和生理特性比较稳定，常作为生产用的菌种和科研的材料。
答案：⑴异养需氧型 次级 ⑵对数 个体的形态生理特性 ⑶称菌体的湿重（称烘干后的重量）
（五）巩固练习
1．在一个“淀粉—琼脂”培养基的5个圆点位置，分别用不同方法处理，将此实验装置放在37℃恒温箱中，保温处理24h后，将碘液滴在培养基的5个圆点上，其实验结果记录于下表：（C）
淀粉圆点
实验处理方法
碘液处理后的颜色反应
①
新鲜唾液与盐酸混合
蓝黑色
②
经过煮沸的新鲜唾液
蓝黑色
③
接种面包霉
棕黄色
④
只有新鲜的唾液
？
⑤
只有一定浓度的蔗糖溶液
？
请指出④和⑤所发生的颜色反应，以及③接种的面包霉的分泌物分别是
A．棕黄色、棕黄色、淀粉酶 B.蓝黑色、棕黄色、麦芽糖酶
C．棕黄色、蓝黑色、淀粉酶 D.棕黄色、蓝黑色、麦芽糖酶
2．实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是 （ ）
A．链霉素能阻止结核菌的生长 B．链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效
C．链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效 D．链霉素可以用于治疗伤寒病人
3.利用生物工程生产啤酒、味精、胰岛素、酸奶的常用菌种分别是
A．酵母菌、枯草杆菌、大肠杆菌、乳酸菌
B．酵母菌、大肠杆菌、青霉菌、乳酸菌
C．酵母菌、谷氨酸棒状杆菌、大肠杆菌、乳酸菌
D．黄色短杆菌、酵母菌、大肠杆菌、乳酸菌
4．下列操作不属于微生物的分离步骤的是
A． 稀释 B．划线或涂布 C．接斜面 D．培养
5．影响微生物生长的主要环境因素是
A．阳光、温度、水分 B．温度、水分、PH C．水分、PH、氧 D．温度、PH、氧
6.下列微生物的产物中没有菌种特异性的一组是
A．氨基酸、核苷酸、多糖、色素
B. 多糖、脂类、维生素、抗生素、氨基酸
C．核苷酸、多糖、维生素、毒素、抗生素
D．核苷酸、维生素、多糖、脂类、氨基酸
7．微生物代谢的人工控制是指
A.改变微生物的遗传特性 B.控制发酵时的温度
C.调节发酵过程中的pH，氧气通入量 D.包括A、B、C三项
8．在微生物群体生长规律的测定中，不可能发生的是
A.繁殖 B.生存斗争 C.种间斗争 D.种内斗争
9．与调整期长短有关的因素中，可缩短调整期的一组是
①用与菌种相同的培养基 ②营养丰富的培养基 ③稳定期获得的菌种 ④对数期获得的菌种 ⑤接种时间提前 ⑥接种量加大 ⑦接种量减小 ⑧接种种类加大
A、①③⑤⑦ B、②③⑤⑦ C、①④⑥ D、②④⑤⑥⑧
10．微生物群体生长善的测定方法可以是
①测定样品的细胞数目 ②测定次级代谢产物的总产量
③测定培养基中细菌的体积 ④测定样品的细胞重量
⑤测定初级代谢产物的总产量
A.②④ B.①④ C.①③⑤ D.②③④
答案：1—5 CDCCD 6—10 DDCCB
七、【课余作业】
某生物小组以空气中细菌含量为指标，调查校园内不同区域（教室、草场、校长室、卫生间）的空气质量状况。请你写出完整的实验调查方案。
八、【教学体会】
本节课可以从尿素在农业上的重要应用切入，介绍能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的作用是能够合成分解尿素的酶。在教学过程中，可以联系生产生活实际，使学生对尿素以及分解尿素的细菌形成一定的感性认识。同时通过课题背景的介绍，可以进行STS教育。对于实验中的对照原则，可以指导学生分组讨论，在掌握微生物分离技术的同时巩固实验设计的基本原则。
九、【资料袋】
选择培养基
选择培养基的含义是：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。
在培养基中加入某种化学物质可以做到这一点，如加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养的培养成分的基础上加入的。
培养基中的营养成分的改变也可达到分离微生物的目的。如培养基中缺乏氮源时，可以分离固氮微生物，因为非固氮微生物不能在此培养基上生存。当培养基的某种营养成分为特定化学成分时，也具有分离效果。如石油是唯一碳源时，可以抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，达到分离能消除石油污染的微生物的目的。改变微生物的培养条件， 也可以达到分离微生物的目的，如将培养基放在高温环境中培养只能得到耐高温的微生物。
课件38张PPT。专题2 微生物的培养与应用 课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数尿素最初是从人的尿液中发现的。当时，人们普遍相信有机物只能由有生命活力的生物产生，而无法通过化学方法合成。但是，在1828年，德国化学家维勒成功地通过无机物的化学反应合成了尿素，揭开了历史上人工合成有机物的新篇章。此后，尿素的生产走向了工业化，尿素也逐步成为农业生产中重要的氮肥。据研究发现，植物根系上存在着运输硝酸根离子(NO)和铵根离子(NH)的载体，据此可以推测尿素并不能直接被农作物吸收。
请思考：
1．尿素能为土壤中的尿素分解菌提供哪类营养物质？
2．采用哪种培养基能分离出土壤中的尿素分解菌？
1．原理
人为提供有利于__________________生长的条件(包括营养、________、pH等)，同时抑制或阻止其他________生长。
2．途径
用________培养基筛选。
在微生物学中，将允许__________________的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称为________培养基。用其培养的目的是从众多微生物中________所需要的微生物。
一、筛选菌株
目的菌株 温度 微生物 选择 特定种类 选择 分离 二、统计菌落数目的方法和注意事项
1．常用方法：稀释涂布平板法
(1)统计依据：
①当样品的________足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个________。
②通过统计平板上的________来推测样品中大约含有的活菌数。
稀释度 活菌 菌落数 (2)计算公式：每克样品中的菌株数＝__________。
C：代数某一稀释度下平板上生长的_____________。
V：代表涂布平板时所用的稀释液的________。
M：代表________。
(C÷V)×M 平均菌落数 体积 稀释倍数 (3)注意事项：
①一般选择菌落数在________的平板进行计数。
②统计菌落数往往比活菌的实际数目________。
③统计结果一般用________而不是用________来表示。
④设置对照：目的是排除实验组中____________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。
30～300 低 菌落数 活菌数 非测试因素 2．计数方法
利用________直接计数。
显微镜 三、实验设计
1．土壤取样
从富含________、酸碱度接近中性的________土壤中取样。取样时，一般要铲去表层土，在距地表的________ cm的土壤层取样。
2．样品的稀释
样品的________直接影响平板上生长的__________，选用一定稀释范围的样品液进行培养，保证菌落数在________之间，便于计数。
有机质 潮湿 3～8 稀释度 菌落数目 30～300 3．细菌的培养与观察
将培养基平板________于30～37 ℃温室中培养1～2 d，每隔__________统计一次________数目，最后选取数目________时的记录作为结果。
4．细菌的计数
当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中的细菌数目。
倒置 24 h 菌落 稳定 30～300 平均值 一、筛选菌株——选择培养基
1．目的
从众多的微生物中分离所需要的微生物。
2．方法
(1)在培养基中加入某种化学物质。例如，加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌；加入高浓度的食盐可以得到金黄色葡萄球菌。这里的加入是在培养成分的基础上加入。
(2)改变培养基中的营养成分。例如，缺乏氮源时可以分离固氮微生物；石油作为唯一碳源时，可以分离出能消除石油污染的微生物。
(3)改变微生物的培养条件。例如，将培养基放在高温环境中培养可以得到耐高温的微生物。
例1 本课题使用的培养基的配方如下：请分析后回答：
(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是________和________。
(2)该培养基为____________培养基(按物理状态分)，理由是______________。
(3)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，又是如何进行选择的？___________________________________________________
________________________________________________________________________。
解析：碳源是提供碳元素的物质，氮源是提供氮元素的物质。所以碳源是葡萄糖，氮源是尿素。该培养基的配方中含有凝固剂——琼脂，因此，配制的一定为固体培养基。绝大多数生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此这种培养基对微生物有选择作用。选择的原则是只有能够利用尿素的微生物才能够生长。
答案：(1)葡萄糖 尿素 (2)固体 含有凝固剂琼脂
(3)有选择作用。此配方中尿素是唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长
变 式
训 练1．用来判断上述选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是( )
A．未接种的选择培养基
B．未接种的牛肉膏蛋白胨培养基
C．接种了的牛肉膏蛋白胨培养基
D．接种了的选择培养基
解析：将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照。对照遵循的是单一变量原则，所以与选择培养基一样接种、培养。
答案：C
变 式
训 练二、实验过程
1．菌株计数
微生物生长量的测定有计数法、重量法、生理指标法等，但是一般使用计数法，计数法可分为直接计数法和间接计数法。二者比较如下：
注：①400、1 000是常数。2．实验设计原则
(1)设立重复组：
统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。
(2)设立两种对照组：
①判断培养基中是否有杂菌污染，需将未接种的选择培养基同时进行培养。
②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结论。
3．实验结果分析
特 别
提 醒①在设计实验时，一定要涂布至少3个平板作为重复组；
②在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，如果差别过大，则意味着操作有误，需要重新实验。
例2 用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是( )
A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230
B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238
C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163
D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233解析：在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B不正确。C项虽涂布了三个平板，但是，其中一个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将三个平板的计数值用来求平均值。
答案：D
2．用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是( )
A．菌落数量最多的平板
B．菌落数量最少的平板
C．菌落数量适中的平板
D．取若干个平板菌落数量的平均值
变 式
训 练解析：用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌体数的真实值。
答案：D变 式
训 练对照实验是指除了被测试条件之外，其他条件都相同的实验。其目的是比照实验组，排除任何其他可能的原因对实验结果产生影响，从而证明所测试的条件确实能引起某种结果，提高实验结果的可信度。
三、设置对照常用的对照方式有四种：空白对照、自身对照、相互对照和条件对照。空白对照就是不给对照组任何处理，如本实验中可以将一只培养皿(内有培养基)置于培养箱内“培养”，作为对照组，它可以检测出培养基是否被污染(目的是排除这种可能)；自身对照是指对照组和实验组在同一对象上进行，也就是说把对象分成几部分，分别给予不同的处理；相互对照是指不设对照组，几个实验组相互比较；条件对照是指给予对照组一种被证明为有效因素的处理，例如研究者正在研究一种新的抗衰老药物，实验组使用这种药物，条件对照组就用已经被证明有抗衰老作用的维生素E来处理。如果实验结果相同，则说明该药物有抗衰老作用，否则就证明没有。
例3 (双选)下列培养基为选择培养基的是( )
A．牛肉膏蛋白胨培养基
B．分解尿素的微生物培养基
C．筛选纤维素分解菌的培养基
D．发酵工程所用的液体培养基解析：选择培养基是指能允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。
答案：BC
3．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是( )
A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
变 式
训 练解析：鉴定分解尿素的细菌在培养基中加酚红指示剂是最好的方法。加入二苯胺鉴定DNA，苏丹Ⅲ鉴定脂肪，双缩脲试剂鉴定蛋白质。
答案：A
变 式
训 练专题二 课题2
一、选择题
1．下列能选择出分解尿素的细菌的培养基是 ( )
A．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H4O、葡萄糖、尿素、琼脂、水
B．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H4O、葡萄糖、琼脂、水
C．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H4O、尿素、琼脂、水
D．KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H4O、牛肉膏、蛋白胨、琼脂、水
[答案] A
[解析] 根据题意可知，该培养基中必须要有尿素，故可排除B、D；而培养基中必须含有有机物作为碳源，又可排除C，故只有A符合题意。
2．某同学在101、102、103倍稀释液的平均菌落数为2760、295、和46，则菌落总数(个/mL)为 ( )
A．2.76×104 B．2.95×104
C．3.775×104 D．4.6×104
[答案] C
3．在做分离分解尿素的细菌实验时，A同学从对应106培养基上筛选出大约150个菌落，而其他同学只选择出大约50个菌落。A同学的结果产生原因可能有
( )
①由于土样不同 ②由于培养基污染
③由于操作失误 ④没有设置对照
A．①②③ B．②③④
C．①③④ D．①②③④
[答案] A
4．请选出下列正确的步骤 ( )
①土壤取样
②称取10g土壤放入盛有90g无菌水的锥形瓶中
③吸取0.1mL进行平板涂布
④依次稀释101、102、103、104、105、106、107稀释度
A．①→②→③→④ B．①→③→②→④
C．①→④→②→③ D．①→②→④→③
[答案] D
二、非选择题
5．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将他们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。步骤如下：
A．制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液
B．为了得到更加准确的结果，你选用________(稀释混合平板法、稀释涂布平板法)接种样品
C．适宜温度下培养
结果分析：
(1)测定的大肠杆菌数，再对应稀释倍数的106的培养基，得到以下几种统计结果，正确可信的是
A．一个平板，统计的菌落数是23
B．两个平板，统计的菌落数是22和26，取平均值24
C．三个平板，统计的菌落数是21、5和52，取平均值26
D．四个平板，统计的菌落数是21、30、24和25，取平均值25
(2)一同学在稀释倍数的106的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌落数是(0.2mL)________。
(3)用这种方法测定密度，实际活菌数量比测得的数量________，因为________________________。
(4)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
________________________________________________________________________
[答案] 步骤B：稀释混合平板法。
结果分析：
(1)D (2)1.17×108
(3)多，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察的是一个菌落。
(4)不能；因为不能排除杂菌来自培养基或来自培养过程。
一、选择题
1．关于土壤取样的叙述错误的是 ( )
A．土壤取样，应选取肥沃湿润的土壤
B．先铲去表层土3cm左右，再取样
C．取样用的小铁铲和信封在使用前不用灭菌
D．应在火焰旁称取土壤
[答案] C
[解析] 在土壤取样过程中，取样用的小铁铲和信封在使用前也要灭菌。
2．PCR技术要求使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能忍受93℃左右的高温。如果请你寻找这种耐高温的酶，你会去哪里寻找 ( )
A．土壤中 B．海水中
C．热泉中 D．冷库中
[答案] C
[解析] 热泉中才可能有这种耐高温的酶。
3．需要在火焰旁操作的有 ( )
①土壤取样 ②称取土壤
③稀释土壤 ④涂布平板
⑤微生物的培养
A．①②③④⑤ B．②③④⑤
C．③④⑤ D．②③④
[答案] D
4．可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是 ( )
A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂
B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂
C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹红Ⅲ试剂
D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂
[答案] A
[解析] 以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。
二、非选择题
5．探究如何从土壤中分离自生固氮菌与计数。
实验原理 农田的表层土壤中，自生固氮菌的含量比较多。将用表土制成的稀泥浆，接种到无氮培养基上进行培养。在这种情况下，只有自生固氮菌才能生长繁殖。用这种方法，可以将自生固氮菌与其他细菌分离开来。
材料用具 农田的表层土壤、无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、盛9mL无菌水的大试管若干、无菌移液管、无菌涂布器、无菌培养皿，盛90mL无菌水的锥形瓶、酒精灯、恒温箱。
方法步骤
(1)倒平板。分别将无氮培养基、牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，应在________操作。
(2)制备土壤稀释液。取土样10g加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。用无菌移液管吸取上清液1mL，转至9mL无菌水的大试管中，依次稀释到107倍稀释度。为实现无菌操作，试管口和移液管应在离火焰________cm处。
(3)涂布。按照107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布。每个稀释度下，无氮培养基至少涂布________个平板，牛肉膏蛋白胨培养基涂布________个平板。
(4)培养。放入恒温箱内，在适宜温度条件下培养3d～4d。一般每隔________小时统计一次，选取________时的记录作为结果，这样可以防止________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
(5)细菌的计数。当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。如果测试的平均值为50，则每克样品中的菌落数是________。(稀释度是105)
(6)预期结果。相等稀释度下，牛肉膏蛋白胨平板上的菌落数________(填“多于”或“少于”)无氮培养基上的数目。理由是________________________________________________________________________
________________________________________________________________________。
[答案] (1)酒精灯火焰旁
(2)1～2
(3)3 1
(4)24 菌落数目稳定 因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目
(5)30～300 5×107
(6)多于 无氮培养基上可以生存和繁殖的只是土壤中的自生固氮菌，而牛肉膏蛋白胨培养基上几乎允许土壤中所有菌类的生存
[解析] 考查微生物的分离及计数。要分离自生固氮菌，采用选择培养基分离的方法，缺乏氮源的培养基可用来分离自生固氮微生物，而其他微生物因缺乏氮源不能生长。实验步骤一般是：配制无氮培养基→灭菌→倒平板→系列稀释→涂布平板→培养→观察并计数。实验中要注意无菌操作和设计对照等。
